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Neuroscience

हिप्पोकैम्पस कुतर ब्रेन स्लाइसेस में Synapse घनत्व का मूल्यांकन

Published: October 6, 2017 doi: 10.3791/56153
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London
* These authors contributed equally

Summary

इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस स्लाइस में synapses सही पहचान और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल इस आलेख में उल्लिखित है ।

Abstract

मस्तिष्क में, synapses न्यूरॉन्स के बीच विशेष जंक्शनों हैं, शक्ति का निर्धारण और न्यूरॉनिंग संकेतन के प्रसार. synapses की संख्या कसकर विकास और न्यूरॉन परिपक्वता के दौरान विनियमित है. महत्वपूर्ण बात, synapse संख्या में घाटा संज्ञानात्मक रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए synapse संख्या का मूल्यांकन तंत्रिका का अभिन्ना अंग है. हालांकि, के रूप में synapses बरकरार मस्तिष्क में छोटे और उच्च कॉंपैक्ट हैं, निरपेक्ष संख्या के आकलन को चुनौती दे रहा है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि को आसानी से पहचान करने के लिए और हिप्पोकैम्पस में synapses का मूल्यांकन कुतर इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग । यह हिप्पोकैम्पस स्लाइस में पूर्व और postsynaptic प्रोटीन के सह स्थानीयकरण का विश्लेषण करके उच्च गुणवत्ता फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों में synapses का मूल्यांकन करने के लिए एक तीन कदम प्रक्रिया भी शामिल है. यह भी बताते है कि विश्लेषण कैसे किया जाता है और उत्तेजक और निरोधात्मक synapses दोनों से प्रतिनिधि उदाहरण देता है । इस प्रोटोकॉल synapses के विश्लेषण के लिए एक ठोस आधार प्रदान करता है और किसी भी संरचना और मस्तिष्क के समारोह की जांच अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

मानव मस्तिष्क लगभग 1014 synapses से बना है । Synapse संख्या कसकर विकास और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के परिपक्वता के दौरान विनियमित है । विकास के दौरान, synapse संख्या synaptogenesis और कार्यात्मक ंयूरॉंस नेटवर्क के रूप में छंटाई द्वारा संग्राहक है । सीखने और स्मृति synapse संख्या और शक्ति, एक synaptic potentiation और अवसाद के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के विनियमन द्वारा समर्थित है1। महत्वपूर्ण बात, परिपक्व synapses के स्थिरीकरण ंयूरॉंस नेटवर्क कनेक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, synapse घनत्व में घाटा neurodegenerative स्थितियों जैसे अल्जाइमर रोग (AD)2की प्रारंभिक अवस्था में सूचित किया गया है । इसलिए, synapse संख्या सही पहचान और मूल्यांकन करने की क्षमता मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति विज्ञान के आकलन के लिए मौलिक है ।

synapses के चरम घनत्व और कॉंपैक्ट प्रकृति यह बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों में उनकी सटीक संख्या का अनुमान लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । सीएनएस में रासायनिक synapses करीब apposition में दो न्यूरॉन्स के बने होते हैं, एक synaptic फांक3से अलग. पूर्व synaptic टर्मिनल, या synaptic bouton, एक axon से उभर और संचित बुलबुले होते हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर होते हैं जो एक synapse की विशिष्टता को परिभाषित करते हैं — अर्थात्, ग्लूटामेट और गामा-aminobutyric अम्ल (गाबा) उत्तेजक के लिए और क्रमशः निरोधात्मक synapses । बुलबुले के झिल्ली प्रत्येक न्यूरोट्रांसमीटर के लिए विशिष्ट vesicular ट्रांसपोर्टरों होते हैं: गाबा के लिए vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (vGlut) ग्लूटामेट और vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर (vGAT) के लिए । पोस्ट-synaptic टर्मिनल एक अत्यधिक सघन संरचना, रिसेप्टर्स, आसंजन अणुओं, और पाड़ प्रोटीन सहित कई प्रोटीन से बना है । उत्तेजक synapses में, पोस्ट-synaptic घनत्व-९५ प्रोटीन (PSD-९५) सबसे प्रचुर मात्रा में पाड़ प्रोटीन है4, मॉडुलन उत्तेजक एन मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए-) और α-एमिनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA-) रिसेप्टर समारोह, जबकि gephyrin लंगर निरोधात्मक रिसेप्टर्स निरोधात्मक पोस्ट करने के लिए-synaptic टर्मिनल5। कुल मिलाकर, प्रोटीन की विशिष्टता पूर्व और बाद synaptic अंतर और synapse उपप्रकारों की पहचान में सहायता डिब्बों ।

synapse संख्या का मूल्यांकन विभिन्न तकनीकों के साथ किया जा सकता है. सबसे आम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) का उपयोग है, जो उच्च आवर्धन और संकल्प के साथ कॉंपैक्ट और बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों में synapse के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । हालांकि, इस तकनीक बहुत महंगा है, जटिल नमूना तैयारी की आवश्यकता है, और बहुत समय लगता है । अंय तकनीकों सरणी टोमोग्राफी6, जो कि यह विशेष और महंगे उपकरणों के लिए विश्लेषण करने की आवश्यकता है में एक प्रमुख नुकसान है के उपयोग में शामिल हैं । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक विशिष्ट synaptic मार्करों व्यक्त लाइनों synapse संख्या7मूल्यांकन में उपयोगी होते हैं, लेकिन नई लाइनों की पीढ़ी प्रतिबंधात्मक और महंगा हो सकता है, और प्रोटीन के व्यक्त अवांछनीय बंद लक्ष्य में परिणाम हो सकता है phenotypes ।

इन सीमाओं के कारण और सादगी के लिए, कई शोधकर्ताओं ने कुल synaptic प्रोटीन के स्तर का परीक्षण करके synapse संख्या का मूल्यांकन । हालांकि, synapse नुकसान प्रोटीन में पर्याप्त परिवर्तन से पहले देखा जा सकता है, के रूप में संरचनात्मक synaptic के फैलाव में परिणाम पूर्व या पोस्ट-synaptic apposition, synaptic प्रोटीन की कोई गिरावट के साथ । इसके अलावा, विज्ञापन में, synaptic प्रोटीन के स्तर को कम कर रहे है synapse अध कि या ंयूरॉन मौत8,9के बाद । कुल स्तरों के ठहराव इस अंतर को सक्षम नहीं करता है । इस प्रकार, मस्तिष्क में synapse संख्या के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, सुलभ, और सटीक विधि विकसित करने की आवश्यकता है ।

इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे अच्छी तरह से पहचान करने के लिए और हिप्पोकैम्पस कुतर मस्तिष्क स्लाइस में इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर synapses की संख्या का निर्धारण । synapses पूर्व के colocalization द्वारा परिभाषित कर रहे है और पोस्ट synaptic मार्करों जो एक कबरा वितरण में दिखाई देते हैं । हम मस्तिष्क में Wnt सिग्नलिंग के अध्ययन के माध्यम से इस तकनीक की वैधता का प्रदर्शन करते हैं । Wnts गठन, उंमूलन, और synapses के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन स्रावित कर रहे हैं । Wnt झरना, Dickkopf-1 (Dkk1) के एक गुप्त प्रतिपक्ष के vivo में प्रेरण, synaptic निरोधात्मक के संरक्षण के दौरान उत्तेजक synapses हानि की ओर जाता है10. हम पहचान और हिप्पोकैम्पस स्लाइस में उत्तेजक और निरोधात्मक synapses की गिनती एक वयस्क माउस से Dkk1 व्यक्त करने और इस तकनीक के ऊतकों के अंय प्रकार के लिए हस्तांतरण पर प्रकाश डाला/

Protocol

< p class = "jove_content" > चूहों और चूहों का उपयोग कर सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी और अनुसूची 1 होम ऑफिस जानवरों (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम १९८६ के अंतर्गत शामिल प्रक्रियाओं का उपयोग कर आयोजित किया गया. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) नुस्खा तालिका में पाया जा सकता है 1 .

< p class = "jove_title" > 1. एक्यूट हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी

  1. माउस मस्तिष्क को जितनी जल्दी संभव हो निकालें, खोपड़ी को काटने के लिए एक रंग और तेज कैंची का प्रयोग करें, और इसे बर्फ में ठंडा करें, oxygenated (९५% हे 2 , 5% कं 2 ), उच्च-सुक्रोज ACSF (~ १०० मिलि).
  2. एक पेट्री डिश पर माउस ब्रेन प्लेस और सेरिबैलम और ललाट प्रांतस्था का एक छोटा सा खंड एक स्केलपेल से पहले hemisecting नीचे मस्तिष्क के midline के साथ हटा दें ।
  3. ओर दो गोलार्द्धों जगह है कि बस में कटौती और गोंद एक vibratome के मंच पर प्रत्येक गोलार्द्ध था ।
  4. कट २००-३०० & #181; m-ब्याज के पूर्ण क्षेत्र के मोटी वर्गों । हिप्पोकैंपस के मामले में, गोलार्द्ध प्रति लगभग 3-4 स्लाइस प्राप्त किया जाना चाहिए ।
  5. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, स्लाइसें oxygenated में जलमग्न एक कक्ष में स्थानांतरित (९५% O 2 , 5% सह 2 ) ACSF. मेन्टेन पर ३४ & #176; ग के लिए 30 min.
    नोट: संयोजक Dkk1 प्रोटीन के रूप में सक्रिय औषधीय एजेंटों के साथ स्लाइस के उपचार, इस स्तर पर किया जा सकता है टुकड़ा चैंबर में एजेंटों को जोड़कर ।
  6. एक तूलिका का उपयोग कर चैंबर से स्लाइस हटाने के लिए, उन्हें एक 24 अच्छी तरह से थाली में जगह है, और 4% paraformaldehyde (पीएफए) में 1 ज के लिए 20 मिनट के लिए फिक्स/कमरे के तापमान पर 4% सुक्रोज (RT).
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है, उपयुक्त संरक्षण पहनते हैं ।
  7. 1x पंजाब में तीन बार स्लाइस धो (10 मिनट प्रत्येक) ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां 1-2 दिनों के लिए ठहराया जा सकता है, जब तक स्लाइस 4 & #176 पर रखा जाता है, 1x में सी पंजाबियों में सी ।
< p class = "jove_title" > 2. Synaptic मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

< p class = "jove_content" > नोट: प्रयुक्त सभी बफ़र्स के व्यंजनों तालिका 2 में पाया जा सकता है ।

  1. ब्लॉक/permeabilizing बफर ( तालिका 2 ) में टुकड़ा कुओं और आरटी पर 4-6 ज.
    2. के लिए मशीन के साथ पंजाब की जगह
  2. vGlut1 के खिलाफ polyclonal गिनी पिग एंटीबॉडी को पतला करने में एक 1:2000 कमजोर पड़ने में अवरुद्ध/permeabilization बफर.
    नोट: vGlut1 पूर्व synaptic उत्तेजक टर्मिनल दृश्य के लिए एक मार्कर है । पोस्ट-synaptic उत्तेजक synapse पहचान के लिए, PSD के खिलाफ एक polyclonal एंटीबॉडी का उपयोग करें-९५ और एक ही समाधान में 1:500 पतला । प्रत्येक कुआं में ३०० & #181; L की न्यूनतम मात्रा का प्रयोग करें । हिप्पोकैंपस के संरचनात्मक स्थान की पहचान करने के लिए, एक एंटीबॉडी का उपयोग करें जो कि MAP2 या Tubulin जैसे न्यूरॉन संरचना की पहचान भी कर सकता है । चुनाव के synaptic मार्करों के लिए सभी प्राथमिक एंटीबॉडी के सही सांद्रता बाहर काम (पूर्व और पोस्ट-synaptic) और ताजा अवरुद्ध/permeabilizing बफर में पतला.
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान रात भर में स्लाइसें (या 1-2 दिन के लिए) पर 4 & #176; C. जोरदार आंदोलन के साथ एक हिलती मंच का प्रयोग करें ।
  4. पंजाब में तीन बार स्लाइस धो (10 मिनट प्रत्येक) ।
  5. बफर अवरुद्ध में उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी 1:500 पतला । उदाहरण के लिए, vGlut1 गिनी पिग एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, एक विशिष्ट के लिए गिनी पिग घटक ( जैसे, संयुग्मित गधा विरोधी गिनी-पिग) fluorophore को पहचानता है कि एक द्वितीयक एंटीबॉडी लागू होते हैं । जब PSD-९५ खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग कर, एक द्वितीयक एंटीबॉडी कि खरगोश घटक पहचानता है लागू ( उदा, गधा विरोधी खरगोश) संयुग्मित एक अलग विशिष्ट fluorophore.
  6. के लिए इस समाधान में स्लाइसें मशीन 2-3 एच पर आरटी. सुनिश्चित करें कि स्लाइसें प्रकाश से सुरक्षित हैं, के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश संवेदनशील हैं ।
  7. पंजाब में तीन बार स्लाइस धो (10 मिनट प्रत्येक) ।
  8. ध्यान से एक तूलिका का उपयोग कर 24-खैर प्लेट से स्लाइस हटाने और उंहें समान रूप से पूर्व लेबल कांच स्लाइड पर जगह है । प्रत्येक स्लाइस के शीर्ष पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें और फिर धीरे स्लाइस के शीर्ष पर एक गिलास coverslip जगह है । हवा के बुलबुले के गठन से बचें । पर्याप्त बढ़ते मध्यम (300-400 & #181; L) का उपयोग करने के लिए ध्यान रखें, क्योंकि अपर्याप्त राशि के कारण शुष्क स्लाइस हो सकते हैं.
  9. RT पर 1-2 दिन की एक ंयूनतम के लिए सूखी छोड़ और प्रकाश से सुरक्षित स्लाइड रखें ।
  10. की स्लाइड्स पर स्टोर 4 & #176; c अल्पावधि में, लेकिन लंबी अवधि के भंडारण के लिए, उन पर रखें-20 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 3. फोकल छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. इमेजिंग का उपयोग कर फोकल लेसर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी.
    1. हिप्पोकैंपस के क्षेत्र की पहचान ( eg, कोर्नु ammonis 1 और 3 (CA1, CA3) या dentate गाइरस (डीजी)) द्वारा एक 10x या 20x उद्देश्य के माध्यम से ।
    2. एक 40x या 63x तेल-विसर्जन उद्देश्य के लिए परिवर्तन करने के लिए सुनिश्चित करें कि स्लाइस एनाटॉमी सतत neurites और संगठित संरचना की पहचान करके बरकरार है । एक संदर्भ के रूप में एक ंयूरॉन मार्कर, जैसे MAP2, का प्रयोग करें (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
    3. बाद में, स्विच करने के लिए एक 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य (NA = ~ १.३-१.४) और इष्टतम संकेत और कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए सेटिंग्स समायोजित करें । एक उच्च/low-contrast विकल्प का उपयोग कर किसी भी पिक्सेल के संतृप्ति से बचने के लिए प्रत्येक लेजर की तीव्रता सेट करें ।
      नोट: ये सेटिंग प्रयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप पर निर्भर करती है, लेकिन तालिका का संदर्भ लें जो लेजर पावर सेटिंग्स के लिए सामग्री < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ , र < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, १०२४ x १०२४-पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करें । सेटिंग्स एक ही प्रयोग की विभिन्न स्थितियों भर में स्थिर रहना चाहिए. यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त ज़ूम लागू किया जा सकता है ।
    4. गहराई का मूल्यांकन जहां धुंधला भी है और हासिल की छवि के ढेर से कम 8 equidistant (२५० एनएम) विमानों । फिर 3 आसंन प्रतिनिधि छवियों को प्रति टुकड़ा ब्याज की एक ही क्षेत्र से ढेर ले ।
      नोट: गहराई एक स्लाइस से दूसरे में भिन्न हो सकती है लेकिन हमेशा स्लाइस की सतह से लगभग 2-5 & #181; m होना चाहिए.
    5. में अधिग्रहण दोहराने शर्त प्रति ंयूनतम 3 स्लाइस और उपचार समूह के प्रति 6-8 पशुओं से ।
  2. इमेज एनालिसिस.
    नोट: एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (सामग्री की तालिका देखें) । ध्यान दें कि कुछ सिस्टम एक लाइसेंस की आवश्यकता है, जबकि अंय स्वतंत्र हैं, जैसे ImageJ । सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया 3 डी में खाते में चित्र stack के सभी विमानों को लेने के द्वारा छवियों का विश्लेषण करना चाहिए । इमेज एनालिसिस (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) में प्रयुक्त साफ्टवेयर के विवरण के लिए सामग्री की तालिका का संदर्भ लें ।
    1. सभी synaptic puncta और न्यूरॉन मार्कर, जो मैन्युअल रूप से अनुकूलित कर रहे हैं की पहचान करने के लिए एक कस्टम आधारित तीव्रता थ्रेसहोल्ड प्रोटोकॉल का उपयोग करें और सॉफ्टवेयर के भीतर चयनित [इस में इस्तेमाल किया विशिष्ट सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें प्रोटोकॉल].
      नोट: सॉफ्टवेयर प्रत्येक fluorophore के लिए एक न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता की पहचान करता है और प्रत्येक मान्यता प्राप्त वस्तु के लिए तीव्रता का एक प्रतिशत एसोसिएट्स. ध्यान दें कि तीव्रता का प्रतिशत fluorophore इस्तेमाल किया और synaptic मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के अनुसार भिंन होगा ।
      2. synaptic मार्करों के लिए
    2. , सुनिश्चित करें कि आकार फिल्टर (& #62; ०.१ & #181; m 3 र & #60; ०.८ & #181; m 3 ) सॉफ्टवेयर के भीतर चयनित और छवि के लिए लागू कर रहे हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए पैरामीटर्स समायोजित करें कि चयनित ऑब्जेक्ट्स अधिव्याप्त नहीं हैं । किसी भी ऑब्जेक्ट को बाहर रखें जो बहुत बड़े हों या बहुत छोटे माने गए हों synaptic puncta (देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र बी ).
      नोट: एक बार अनुकूलित, एक ही दहलीज मूल्यों तो एक दिए गए प्रयोग के भीतर सभी छवियों के लिए लागू कर रहे हैं.
    3. मतलब संख्या, तीव्रता, और व्यक्तिगत synaptic puncta की मात्रा (पूर्व या पोस्ट synaptic) अनुकूलित सीमा प्रोटोकॉल सॉफ्टवेयर के भीतर चयनित का उपयोग कर । छवि फ़ील्ड के वॉल्यूम के लिए puncta संख्या को सामान्य करें (मोटे तौर पर १६,९२८ & #181; m 3 यहां उपयोग किए गए सिस्टम में) । synaptic puncta तीव्रता संदर्भ न्यूरॉन मार्कर की तीव्रता को सामान्य.
      नोट: Synapses दोनों पूर्व और पोस्ट-synaptic मार्करों के बीच सह-स्थानीयकरण के रूप में परिभाषित किया गया है । एक बार पूर्व के लिए दहलीज प्रोटोकॉल और पोस्ट-synaptic puncta जave स्थापित किया गया है, सॉफ्टवेयर synaptic puncta के सह स्थानीयकरण 1 पिक्सेल या एक ही विमान में अधिक के ओवरलैप के रूप में की पहचान करनी चाहिए ।
      नोट: सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, पुष्टि करें कि नमूनों के सभी सेट सामान्यता और प्रसरण की एकरूपता का पालन करते हैं, जैसा कि Lilliefords और & #967; 2-परीक्षण, क्रमशः द्वारा निर्धारित किया गया है. एक सामांय वितरण और विचरण की एकरूपता दिखा नमूने पैरामीट्रिक परीक्षणों के साथ विश्लेषण किया जाना चाहिए, जैसा कि नीचे वर्णित है । उदाहरण के लिए, उत्तेजक synaptic puncta विश्लेषण ब्लॉकिंग और प्रतिकृति के साथ एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग किया जाना चाहिए । प्रत्येक व्यक्ति का प्रयोग एक ब्लॉक के रूप में माना जाना चाहिए; आमतौर पर, वहां तीन स्वतंत्र प्रयोग, प्रत्येक शर्त से 1-3 चूहों के साथ प्रत्येक रहे हैं ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg"/>
चित्रा 1: छवि विश्लेषण का उपयोग synaptic puncta का विश्लेषण software. & #160; ( A ) तीव्रता थ्रेशोल्ड प्रोटोकॉल अनुकूलन का स्क्रीनशॉट । दिया गया उदाहरण PSD-९५ के लिए है, जिसमें चयनित puncta का एक निर्धारित आकार है & #62; ०.१ & #181; m 3 र & #60; ०.८ & #181; m 3 और वर्तमान छोटा अधिव्याप्त ऑब्जेक्ट्स । ध्यान दें कि दिखाया छवि एक फोकल विमान synaptic puncta और सटीक पैरामीटर चयन के आसान दृश्य को सक्षम करने के लिए है । ( बी ) सॉफ्टवेयर से विश्लेषण उत्पादन के स्क्रीनशॉट (अनुकूलित प्रोटोकॉल के चयन के बाद) । मात्रा के आधार पर रॉ synaptic puncta संख्या माप का एक उदाहरण । ये मान तो किसी स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के लिए निर्यात किए जाते हैं । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg"/>
चित्रा 2: स्लाइस और synaptic puncta के लिए पैरामीटर सेटिंग्स की गुणवत्ता की जांच. ( एक ) प्रतिनिधि फोकल छवियां (40x हित के क्षेत्र के उद्देश्य): CA1 परत radiatum (sr) और एक oriens टुकड़ा की परत हिप्पोकैम्पस (सू) MAP2 धुंधला से पहचान कर रहे हैं । केल बार = & #160; 2 & #181; m. ( B ) फोकल छवियां (60x उद्देश्य और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर एक अतिरिक्त 1.3 x आवर्धन) CA1 परत radiatum के साथ उत्तेजक मार्करों-vGlut1 (हरा) और PSD-९५ (लाल)-हिप्पोकैम्पस स्लाइस से । स्पष्ट पूर्व और पोस्ट-synaptic puncta की पहचान नोट करें । Puncta से बड़ा ०.८ & #181; m 3 ठहराव (सफेद तीर) से बाहर रखा गया है । स्केल बार = & #160; 2 & #181; m (C) फोकल छवियां (60x उद्देश्य और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर एक अतिरिक्त 1.3 x आवर्धन) CA1 परत radiatum के साथ, उत्तेजक मार्करों के साथ-vGlut1 (हरा)-से cryostat-कट हिप्पोकैम्पस वर्गों पूरे दिमाग से पीएफए में फिक्स्ड । बड़े छेद और अनियमित, झुरमुट vGlut1 धुंधला की उपस्थिति ध्यान दें । केल बार = & #160; 2 & #181; मी. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target = "blank" > इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Representative Results

Synapse हानि neurodegenerative रोगों में जल्दी होता है जैसे कि विज्ञापन और पार्किंसंस रोग2,11,12. हालांकि, इन घाटे अंतर्निहित आणविक तंत्र खराब समझ में रहते हैं । Wnt सिगनलिंग में कमियों को AD13,14,15,16,17के साथ संबद्ध किया गया है । Wnts में राज कर रहे हैं नच और synapse गठन में एक अनिवार्य भूमिका निभाते हैं और synaptic ट्रांसमिशन18,19,20,21के मॉडुलन । हाल ही में, हम परिपक्व तंत्रिका प्रणाली10,22में synaptic रखरखाव के प्रमुख नियामकों के रूप में Wnts की पहचान की । सही आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के हिप्पोकैंपस में synapses पर संकेत Wnt के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और फोकल माइक्रोस्कोपी का लाभ लिया synapse संख्या में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए. हमने स्वस्थ स्लाइस की पहचान की जिसमें संरचना को अच्छी तरह से संरक्षित किया गया (चित्र 2a) । इसके अलावा, synaptic puncta के चयन को ध्यान से परिभाषित किया गया था, जो शायद एग्रीगेट प्रोटीन (चित्र बी. सी.) का प्रतिनिधित्व करने वाले बड़े दाग़ी ऑब्जेक्ट्स के बहिष्करण के साथ । यह कसौटी सभी छवियों के लिए लागू किया गया था, एक ही सख्त विश्लेषण मापदंडों के साथ ।

हम टेट्रासाइक्लिन नियंत्रण के तहत वयस्क चूहों (iDkk1) में गुप्त Wnt विरोधी Dkk1 की अभिव्यक्ति लाती है कि एक ट्रांसजेनिक मॉडल प्रणाली का इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें)10,22. हम प्रदर्शन किया है कि Wnt की नाकाबंदी वयस्क हिप्पोकैंपस में संकेतन उत्तेजक synapse नुकसान विशेष रूप से CA1 परत radiatum क्षेत्र में (चित्रा 3) । चित्रा 3 ए उत्तेजक पूर्व के प्रतिनिधि फोकल छवियों को दिखाता है और बाद synaptic मार्करों (vGlut1 और PSD-९५, क्रमशः) iDkk1 दो सप्ताह के लिए Dkk1 व्यक्त चूहों के हिप्पोकैम्पस स्लाइस से हासिल की, साथ ही उनके संबंधित नियंत्रण । हम Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन छवियों का विश्लेषण और उत्तेजक synapses की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया, सह द्वारा मात्रा-vGlut1 के स्थानीयकरण-और PSD-९५-puncta चूहों के CA1 हिप्पोकैंपस क्षेत्र में iDkk1 के बाद लेबल दो सप्ताह के लिए Dkk1 की प्रेरण (चित्र बी, * पी & #60; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 6 चूहों) । CA1 की परत radiatum में उत्तेजक synapse puncta संख्या प्रति १,००० µm3 को नियंत्रण चूहों में iDkk1 चूहों में ३०० से घटाकर ५०० कर दिया गया । इसके विपरीत, प्रेरित Dkk1 अभिव्यक्ति निरोधात्मक synapses की संख्या को प्रभावित नहीं किया (पूर्व और पोस्ट synaptic मार्करों vGAT और gephyrin के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा की पहचान की, क्रमशः), के रूप में चित्र 4a-B (p & #62; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 3 चूहों) ।

महत्वपूर्ण बात, हम स्लाइस और इन मजबूत परिणाम उत्पंन करने के लिए आवश्यक पशुओं की उचित संख्या का अनुमान करने के लिए एक सांख्यिकीय बिजली विश्लेषण प्रदर्शन किया । R का उपयोग कर, हम गणना कि लगभग ३५ स्लाइस प्रति शर्त (3 छवियां x 3 स्लाइस x 6 पशु = ३६) एक बड़े प्रभाव आकार का पता लगाने के लिए (f = ०.४) ८०% विश्वास (पावर = ०.८) के साथ एक-तरफ़ा ANOVA में ब्लॉकिंग और प्रतिकृति के साथ, जैसा चरण 3.2.6 में वर्णित है ।

Figure 3
चित्रा 3: iDkk1 चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में उत्तेजक synapses का झड़ना. (क) प्रतिनिधि CA1 परत radiatum शो उत्तेजक synapses, vGlut1 और PSD के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा की पहचान की फोकल छवियां-९५ (सफेद तीर) । निचला फलक हाइलाइट किए गए आयत की उच्चतर आवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टियां = 2 µm. (B) नियंत्रण और iDkk1 के बीच उत्तेजक synapses का प्रतिशत, सामग्री की तालिका में उल्लेखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग मात्रा था (* p & #60; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 6 चूहों) । डेटा ± SEM प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: iDkk1 चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में निरोधात्मक synapses अपरिवर्तित हैं. (क) निरोधात्मक synapses की CA1 परत radiatum के प्रतिनिधि फोकल छवियों को vGAT और gephyrin (सफेद तीर) के बीच सह-स्थानीयकरण द्वारा पहचाना जाता है. निचला फलक हाइलाइट किए गए आयत की उच्चतर आवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टियां = 2 µm. (B) नियंत्रण और iDkk1 चूहों के बीच निरोधात्मक synapses का प्रतिशत, जैसे मात्रा उपयोग Volocity सॉफ्टवेयर (p & #62; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 3 चूहों) । डेटा ± SEM प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

उच्च सुक्रोज ACSF अवयव एकाग्रता नोट्स
nacl ७५ एमएम
NaHCO3 25 एमएम
kcl २.५ एमएम
णः2पो4, 2H2O १.२५ एमएम
Kynurenic अम्ल १.२५ एमएम
पाइरुविक अम्ल 2 मिमी
edta ०.१ एमएम
CaCl2 1 मिमी समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें
MgCl2 4 मिमी समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें
D-ग्लूकोज 25 एमएम
सुक्रोज १०० एमएम
जलमग्न चेम्बर ACSF अवयव
nacl १२५ एमएम
NaHCO3 25 एमएम
kcl २.५ एमएम
णः2पो4, 2H2O १.२५ एमएम
CaCl2 1 मिमी समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें
MgCl2
1 मिमी समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें D-ग्लूकोज 25 एमएम

तालिका 1: ACSF संरचना ।

अवरुद्ध/permeabilizing बफ़र एकाग्रता नोट्स
गधा सीरम 10%
ट्राइटन-X ०.५०%
pbs 1x
10x पंजाब ७.४ को पीएच
nacl १.३७ मीटर
kcl 27 एमएम
णः2पो4 १०० एमएम
KH2पो4 18 एमएम
4% पीएफए/4% सुक्रोज ७.४ को पीएच
pbs 1x 10x से पतला
पीएफए १.३३ मीटर
सुक्रोज ११७ एमएम

तालिका 2: immunofluorescent धुंधला करने के लिए उपयोग किए गए बफ़र्स ।

Discussion

synapse संख्या का सटीक मूल्यांकन तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के लिए आवश्यक है । यहां, हम कैसे एक मॉडल प्रणाली के रूप में हिप्पोकैम्पस स्लाइस की CA1 परत radiatum क्षेत्र में synapses के घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए दिखाते हैं । मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व के साथ हिप्पोकैंपस में Wnt की कमी के प्रभाव पर हमारे हाल ही में अनुसंधान लेख में प्रदर्शन किया है और जहां हम भी एकल द्वारा synapse संख्या-खंड EM10मूल्यांकन । synapse नुकसान की भयावहता एकल अनुभाग EM और मस्तिष्क टुकड़ा विधि के बीच समान है यहां वर्णित10। इस प्रकार, इस खोज सटीकता और तकनीक की विश्वसनीयता को दर्शाता है ।

महत्वपूर्ण बात, दोनों एकल धारा EM और immunostaining synapses की एक सीमा, के रूप में यहां प्रस्तुत किया है, के लिए सही एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निरपेक्ष synapse संख्या का अनुमान अक्षमता है । दरअसल, यह महत्वपूर्ण है किसी भी वैश्विक रूपात्मक परिवर्तन की पहचान, के रूप में कुल मात्रा में परिवर्तन synaptic संख्या को प्रभावित कर सकता है । एक और सीमा है कि कुछ एंटीबॉडी बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों धुंधला पर कम कुशल हैं, आंशिक रूप से synaptic कनेक्शन के चरम घनत्व के कारण । हम vGlut1 और gephyrin के इस स्लाइस तैयार करने और बाद में पीएफए निर्धारण का उपयोग कर के उच्च गुणवत्ता वाले धुंधला अनुभव पीएफए में पूरे मस्तिष्क के तत्काल निर्धारण की तुलना में 1 एच की एक अधिकतम के लिए, (चित्रा 2c) । बाद में, ऊतक में छेद के साथ झुरमुट synaptic धुंधला करने के लिए नेतृत्व किया । बहरहाल, vGlut1 एंटीबॉडी प्रवेश अभी भी दोनों तरीकों (माइक्रोन के दसियों के एक जोड़े) में प्रतिबंधित है । हम इस सीमा को दूर नहीं किया, यहां तक कि वृद्धि हुई एंटीबॉडी गर्मी के साथ, लेकिन एंटीबॉडी प्रवेश प्रदान कुल गहराई है कि छवि है से अधिक है, अंतिम परिणाम पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए । इसके अलावा, विशेष देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि धुंधला भी पूरे अधिग्रहीत ढेर भर में है लिया जाना चाहिए ।

हमारे अध्ययन में, हम निरोधात्मक synapses से उत्तेजक भेद करना चाहता था । नतीजतन, हम vGlut1/PSD-95 और vGAT/gephyrin, क्रमशः चुना, के रूप में इन प्रोटीन अत्यधिक वयस्क माउस हिप्पोकैंपस में व्यक्त कर रहे है और प्रत्येक synapse उपप्रकार4,5के लिए विशिष्ट हैं । अंय उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic मार्करों synapse एनएमडीए के लिए AMPA और उत्तेजक रिसेप्टर्स के लिए GABAA और निरोधात्मक रिसेप्टर्स सहित प्रत्येक synapses, पर समृद्ध रिसेप्टर्स के रूप में प्रत्येक संबंधित synapse, की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय न्यूरोट्रांसमीटर या neuromodulators भी हमारे प्रोटोकॉल के साथ की पहचान की जा सकती है, सुनिश्चित करना है कि विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, के रूप में striatum22में dopaminergic synapses के लिए दिखाया गया । इसके अलावा, प्रत्येक स्लाइस की मोटाई को कम करने के लिए १२० µm आंशिक रूप से तीव्र स्लाइस के साथ प्राप्त नमूनों की कम मात्रा को दूर कर सकते हैं, जो इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड के रूप में छोटे मस्तिष्क संरचनाओं में अध्ययन के लिए अनिवार्य है.

हमारे प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों और विकारों के अध्ययन में लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, striatum में (पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े मस्तिष्क के एक क्षेत्र), vGlut2/psd-95 या vGlut1/psd-95 का एक संयोजन synapses या afferents से आने वाले प्रांतस्था से उत्तेजक thalamus के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रमशः२२.

अंत में, हम एक विश्वसनीय विधि पूर्व का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों में synapses की संख्या की जांच करने के लिए और पोस्ट-synaptic मार्करों एक synapse को परिभाषित करने के लिए पता चला है । महत्वपूर्ण कदम अच्छी हिप्पोकैम्पस स्लाइस, पीएफए में 1 ज तक का एक निर्धारण समय, पर्याप्त बढ़ते माध्यम के आवेदन, विश्वसनीय एंटीबॉडी, उचित छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें, और कड़े synaptic puncta का पता लगाने की तैयारी शामिल हैं । अंततः, इस विधि अपेक्षाकृत जल्दी है और आसानी से किसी भी प्रयोगशालाओं कि एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग किया है द्वारा प्रतिलिपि है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम MRC, यूरोपीय संघ FP7, ARUK, वेलकम ट्रस्ट, और पार्किंसंस ब्रिटेन द्वारा समर्थित किया गया था । हम भी अपनी पांडुलिपि और पद्धति पर रचनात्मक इनपुट के लिए फोकल छवियों और प्रयोगशाला के सदस्यों के उसके योगदान के लिए सुश्री Johanna Buchler शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000S
Primary antibody Millipore AB5905 vGlut1 (1:2000)
Primary antibody Thermo Scientific MA1-046 PSD-95 (1:500)
Primary antibody Synaptic Systems 131 004 vGAT (1:500)
Primary antibody Synaptic Systems 147011 Gephyrin (1:500)
Primary antibody Abcam ab5392 MAP2 (1:10000)
Secondary antibody Jackson Laboratories 706-545-148 Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)
Secondary antibody Abcam ab175470 Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)
Mounting medium SouthernBiotech 00-4958-02 Fluoromount-G
Confocal Microscope Olympus NA FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.
Analysis software PerkinElmer NA Volocity
Scalpel Swann-Morton 203 No 11
Super Glue Loctite 1446875
95% O2, 5% CO2 BOC NA Cylinder
24-well plate Corning 3524
Glass slides Thermo 7107 08-1.0mm thick
Petri Dish Corning 430167
iDkk1 mice N/A N/A Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for solutions:
NaCl Sigma V800372
KCl Sigma P9333
Na2HPO4 Sigma 255793
KH2PO4 Sigma P9791
Ca2Cl Sigma 223506
Mg2Cl Sigma M9272
NaH2PO4 Sigma 71505
Kynurenic acid Sigma K3375
NaHCO3 Sigma S5761
Pyruvic acid Sigma 107360
EDTA Sigma E6758
D-Glucose Sigma G5767
Sucrose Sigma S8501
Triton-X Sigma T8787
Donkey Serum Millipore S30-100ml
PFA Sigma P6148

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२८ न्यूरॉन्स synapses ब्रेन स्लाइस इम्यूनोफ्लोरेसेंस हिप्पोकैंपस माउस चूहा vGlut1 PSD-९५ vGAT gephyrin
हिप्पोकैम्पस कुतर ब्रेन स्लाइसेस में Synapse घनत्व का मूल्यांकन
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McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., … More

McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (128), e56153, doi:10.3791/56153 (2017).

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