Summary
Ett protokoll för att korrekt identifiera och analysera synapserna i hippocampus skivor med hjälp av immunofluorescens beskrivs i denna artikel.
Abstract
Synapser är specialiserade korsningar mellan nervceller, fastställande av styrka och spridningen av nervcellernas signalering i hjärnan. Antalet synapser är hårt reglerad under utveckling och nervcellernas mognad. Ännu viktigare, kan underskott i synapsen nummer leda till kognitiv dysfunktion. Utvärdering av synaps nummer därför en integrerad del av neurobiologi. Synapser är små och mycket kompakta i intakt hjärnan, är dock bedömningen av absoluta antalet utmanande. Det här protokollet beskriver en metod för att enkelt identifiera och utvärdera synapser i hippocampus gnagare skivor med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Den innehåller en trestegsprocess för att utvärdera synapser i hög kvalitet konfokalmikroskopi bilder genom att analysera samtidig localizationen av pre- och postsynaptiska proteiner i hippocampus skivor. Det förklarar också hur analysen utförs och ger representativa exempel från både retande och hämmande synapser. Detta protokoll ger en solid grund för analys av synapser och kan tillämpas på någon forskning som undersöker struktur och funktion av hjärnan.
Introduction
Den mänskliga hjärnan består av ungefär 1014 synapser. Synaps nummer är hårt reglerad under utvecklingen och mognaden av det centrala nervsystemet (CNS). Hela utveckling, synaps nummer moduleras av synaptogenes och beskärning bildar funktionella neuronala nätverk. Inlärning och minne stöds av regleringen av synaps nummer och styrka, en process som kallas synaptisk potentiering och depression1. Viktigt, är stabiliseringen av mogen synapser väsentliga för att upprätthålla neuronala nätverksanslutningar. Underskott i synapsen densitet har dessutom rapporterats på de tidiga stadierna av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD)2. Därför är förmågan att korrekt identifiera och utvärdera synaps nummer grundläggande för bedömningen av hjärnans fysiologi och patologi.
Den extrema densitet och kompakta karaktär av synapser gör det utmanande för att uppskatta deras exakt antal i intakt hjärnområden. Kemiska synapser i CNS är gjorda av två nervceller i nära apposition, åtskilda av en synaptisk kluven3. Den pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, framträder från ett axon och består av ackumulerade blåsor, som innehåller signalsubstanser som definierar en synaps specificitet — nämligen glutamat och gamma - aminosmörsyra (GABA) för retande och hämmande synapser, respektive. Membranen i blåsor innehåller vesikulär transportörer specifika för varje signalsubstans: vesikulära glutamat transportör (vGlut) för glutamat och vesikulär GABA transportör (vGAT) för GABA. Efter synaptic terminalen är en mycket tät struktur som består av flera proteiner, inklusive receptorer, adhesionsmolekyler och byggnadsställning proteiner. I retande synapser är efter synaptisk densitet-95 protein (PSD-95) den vanligast förekommande byggnadsställning protein4, modulerande excitatoriska N-methyl-D-aspartate(NMDA-) och α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA-) receptor funktion, medan gephyrin ankare hämmande receptorer till hämmande efter synaptic terminal5. Totalt, specificiteten av proteiner till pre- och post synaptic fack stöd i differentiering och identifiering av synaps undertyper.
Utvärdering av synaps nummer kan utföras med olika tekniker. Det vanligaste är användningen av elektronmikroskopi (EM), som möjliggör analys av synapsen i kompakt och intakt hjärnområden med hög förstoring och upplösning. Men denna teknik är mycket dyrt, kräver komplicerade provberedning och är mycket tidskrävande. Andra metoder inkluderar användning av array tomografi6, som har en stor nackdel eftersom det kräver specialiserade och dyra utrustning att utföra analysen. Dessutom transgena linjerna uttrycker specifika synaptic markörer är användbara utvärdera synaps nummer7, generering av nya linjer kan vara restriktiva och dyrt men överuttryck av proteiner kan resultera i oönskade off-target fenotyper.
På grund av dessa begränsningar och för enkelhet utvärdera många forskare synaps nummer genom att undersöka totalt synaptic proteinnivåer. Synaps förlust kan dock observeras före betydande förändringar i protein, som strukturella synaptic remodeling resultat i utspridningen av före eller efter synaptic apposition, med ingen nedbrytning av synaptic proteiner. Vidare i annons är synaptic proteinnivåer reducerad följande synaps degeneration eller neuronala dödsfall8,9. Kvantifiering av totala nivåer aktiverar inte denna åtskillnad. Således finns det ett behov av att utveckla en tillförlitlig, tillgänglig och korrekt metod för utvärdering av synaps nummer i hjärnan.
I den här artikeln beskrivs hur man noggrant identifiera och fastställa antalet synapser med hjälp av immunofluorescens mikroskopi i hippocampus gnagare hjärnan skivor. Synapserna definieras av colocalization av pre- och post synaptic markörer som visas i en punktuell fördelningen. Vi visar giltigheten av denna teknik genom studier av Wnt-signalering i hjärnan. WNTS är utsöndras proteiner viktiga för bildandet, eliminering och underhåll av synapser. I vivo induktion av en utsöndrade antagonist i Wnt kaskad, Dickkopf-1 (Dkk1), leder till excitatoriska synaptic förlust samtidigt hämmande synapser i hippocampus10. Vi illustrera identifiering och räkning av retande och hämmande synapser i hippocampus skivor från en vuxen mus som uttrycker Dkk1 och markera överförbarheten av denna teknik till andra typer av vävnadsodling/preparat.
Protocol
alla de experiment med möss och råttor godkändes och genomfördes med schema 1 förfaranden omfattas enligt Home Office djur (vetenskapliga förfaranden) act 1986. Konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) receptet finns i tabell 1.
1. akut Hippocampus Slice förberedelse
- ta bort musen hjärnan så snabbt som möjligt, med hjälp av en spatel och skarp sax att klippa skallen, och placera den i iskall, syresatt (95% O 2, 5% CO 2), hög-sackaros ACSF (~ 100 mL).
- Placera musen hjärnan på en petriskål och ta bort lillhjärnan och en liten del av främre hjärnbarken med en skalpell innan hemisecting ner mittlinjen av hjärnan.
- Placera de två hjärnhalvorna på den sida som var bara klippa och limma varje halvklotet på scenen av en vibratome.
- Skär 200-300 µm tjocka delar av regionen komplett av intresse. Vid hippocampus, cirka 3-4 skivor per halvklotet bör utverkas.
- Använda en plast Pasteur-pipett, överföra skivor till en kammare som nedsänkt i syresatt (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Underhåll på 34 ° C i 30 min.
Obs: Behandling av skivor med farmakologiska ämnen, såsom rekombinant Dkk1 proteiner, kan utföras i detta skede genom att lägga till agenter i slice kammaren. - Ta bort skivor från kammaren med en pensel, placera dem i en 24-well platta och fixa i 20 min till 1 h i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA)/4% sackaros vid rumstemperatur (RT).
Försiktighet: PFA är giftiga, bära lämpliga skydd. - Tvätta skivor tre gånger i 1 X PBS (10 min varje).
Obs: Protokollet kan pausas här för 1-2 dagar, så länge skivor förvaras vid 4 ° C i 1 X PBS.
2. Immunofluorescens för Synaptic markörer
Obs: recept av alla buffertar används återfinns i tabell 2.
- Ersätta PBS med blockering/permeabilizing buffert (tabell 2) i slice brunnarna och inkubera vid RT för 4-6 h.
- Späd den polyklonala marsvin antikroppen mot vGlut1 vid en 1:2,000 spädning i blockering/permeabilisering buffert.
Obs: vGlut1 är en markör för pre synaptic excitatoriska terminal visualisering. För efter synaptic excitatorisk synaps identifiering, Använd en polyklonala antikroppar mot PSD-95 och utspädd 1: 500 i samma lösning. Använda en minsta volym på 300 µL i varje brunn. För att identifiera anatomiska placeringen av hippocampus, Använd en antikropp som kan också identifiera den neuronala strukturen, såsom MAP2 eller Tubulin. Träna rätt koncentrationerna av alla primära antikroppar på synaptic markörer av val (före och efter synaptic) och späd i färska blockering/permeabilizing buffert. - Inkubera skivor i primär antikropp lösning över natten (eller 1-2 dagar) vid 4 ° C. användning en skakar plattform med kraftfulla rörelse.
- Tvätta skivor tre gånger i PBS (10 min varje).
- Späd den lämpliga sekundära antikroppar 1: 500 i blockerande buffert. Till exempel när du använder vGlut1 marsvin antikroppen, gäller en sekundär antikropp som känner igen komponenten marsvin (t.ex. åsna anti-guinea-pig) konjugerat till en specifik fluorophore. När du använder PSD-95 kanin antikroppen, gäller en sekundär antikropp som känner igen den kanin komponent (t.ex. åsna anti kanin) konjugerat till en olika specifika fluorophore.
- Inkubera sektorerna i denna lösning för 2-3 h på RT. se till att skivor är skyddade från ljus, som sekundära antikroppar är ljuskänsligt.
- Tvätta skivor tre gånger i PBS (10 min varje).
- Försiktigt bort skivor från 24-väl plattan med hjälp av en pensel och placera dem jämnt på förhand märkta glasskivor. Lägg en droppe av monteringsmedium ovanpå varje skiva och sedan försiktigt placera ett täckglas ovanpå skivor. Undvika att bildningen luftbubblor. Var noga med för att använda tillräckligt monteringsmedium (300-400 µL), eftersom ett otillräckligt belopp kan leda till torka skivor.
- Låt torka i minst 1-2 dagar på RT och hålla bilderna skyddas från ljus.
- Lagra bilderna vid 4 ° C på kort sikt, men för långsiktig lagring, hålla dem vid -20 ° C.
3. Confocal bild förvärv och analys
- Imaging använder confocal microscopy för laserscanning.
- Identifiera regionen i hippocampus att avbildas (t.ex. den cornu ammonis 1 och 3 (CA1, CA3) eller dentate gyrus (GD)) med hjälp av en 10 x eller 20 x mål.
- Förändring till en 40 x eller 63 x Oljeimmer mål att se till att skiva anatomi är intakt genom att identifiera kontinuerlig neuriter och ordnad struktur. Använda en neuronal markör, såsom MAP2, som referens ( figur 1A).
- Därefter, växla till en 60 x Oljeimmer mål (NA = ~1.3 - 1,4) och justera inställningarna för varje kanal för att få optimal signalöverföring och kontrast. Ange intensiteten i varje laser för att undvika några pixlar med en hög / låg kontrast alternativ mättnad.
Obs: Dessa inställningen kommer att bero på mikroskopet används, men hänvisa till Tabellen för material för laser power inställningarna som används i figur 2, figur 3, och Figur 4. Använd en 1024 x 1024-upplösning för bästa resultat. Inställningarna bör förbli konstant under de olika villkor för samma experiment. Ytterligare zoom kan tillämpas om krävs. - Utvärdera det djup där färgningen är även och förvärva bildstaplar av minst 8 ekvidistanta (250 nm) flygplan. Sedan ta 3 intilliggande representativa bilder stackar från samma område av intresse per segment.
Obs: Djupet kan variera från en sektor till en annan men bör alltid vara ungefär 2-5 µm från ytan av slice. - Upprepa förvärvet i minst 3 skivor per tillstånd och från 6-8 djur per behandlingsgrupp.
- Bildanalys.
Obs: Använd en automatiserad bild analys programvara (se Tabell för material). Observera att vissa system kräver en licens, medan andra är gratis, såsom ImageJ. Den programvara som används måste analysera bilderna i 3D genom att beakta alla plan av stacken avbildas. Se Tabell för material för detaljerna i den programvara som används i bildanalys ( figur 1).- Använda en anpassad-baserat intensitet tröskel protokoll att identifiera alla synaptic puncta och neuronala markörer, som är optimerad och valt inom programvaran manuellt [se Tabell av material för den specifika programvara som används i detta protokoll].
Obs: Programvaran identifierar en lägsta och högsta intensitet för varje fluorophore och associates en procentandel av intensitet för varje erkänd objekt. Observera att andelen intensitet varierar enligt fluorophore används och antikroppen mot synaptic markören. - För synaptic markörer, se till att storlek filter (> 0.1µm 3 och < 0.8µm 3) väljs i mjukvaran och tillämpas på bilden. Justera parametrarna för att säkerställa att de markerade objekten inte överlappar. Utesluta alla objekt som är för stor eller för liten för att anses vara synaptic puncta (se figur 2B).
Obs: När optimerad, samma tröskelvärdena tillämpas sedan på alla bilder inom ett visst experiment. - Kvantifiera den barnantalet, intensitet och volym av enskilda synaptic puncta (före eller efter synaptic) med protokollen optimerad tröskel valt inom programvaran. Normalisera puncta numret till volymen av bildfältet (ungefär 16 928 µm 3 i systemet används här). Normalisera synaptic puncta intensiteten till intensiteten av referens neuronala markören.
Obs: Synapser definieras som samtidig lokaliseringen mellan både före och efter synaptic markörer. En gång tröskel protokollen för pre- och post synaptic puncta hAve varit etablerad, programvaran bör identifiera samtidig localizationen av synaptic puncta som överlappningen 1 pixel eller mer i ett enda plan.
Obs: För statistisk analys, bekräfta att alla uppsättningar av prover följer normalitet och homogenitet av avvikelse som bestäms av Lilliefords och χ2-test, respektive. Prover visar en normalfördelning och homogenitet varians bör analyseras med parametriska tester, som beskrivs nedan. Till exempel bör excitatoriska synaptic puncta analys utföras med en envägs ANOVA med blockering och replikering. Varje enskilt experiment bör betraktas som ett block; vanligtvis finns det tre oberoende experiment, vardera med 1-3 möss från varje skick.
- Använda en anpassad-baserat intensitet tröskel protokoll att identifiera alla synaptic puncta och neuronala markörer, som är optimerad och valt inom programvaran manuellt [se Tabell av material för den specifika programvara som används i detta protokoll].
figur 1: analys av synaptic puncta med hjälp av bildanalys programvara. (A) skärmdump av protokollet för anpassning av intensitet tröskel. Exemplet är för PSD-95, där den valda puncta ha definierade storleken > 0.1 µm 3 och < 0,8 µm 3 och nuvarande minimerade överlappande objekt. Observera att bilden som visas är för en confocal planet för att möjliggöra enklare visualisering av synaptic puncta och korrekt parameter urval. (B) skärmdump av den analys som utdata från programmet (efter valet av optimerad protokollet). Ett exempel på raw synaptic puncta antal mätningar baserat på volymen. Dessa värden exporteras sedan till ett kalkylprogram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 2: kvalitetskontroll skiva och parameter inställningar för synaptic puncta. (A) representativa confocal bilder (40 x-objektiv) i regionen av intresse: de CA1 stratum radiatum (sr) och stratum oriens (så) Hippocampus bitens identifieras av MAP2 färgning. Skalstapeln = 2 µm. (B) Confocal bilder (60 x mål och en ytterligare 1,3 X förstoring på programvaran förvärvet) av den CA1 stratum radiatum, med retande markörer-vGlut1 (grön) och PSD-95 (röd)-från Hippocampus skivor. Observera identifiering av klart före och efter synaptic puncta. Puncta större än 0,8 µm 3 undantas från kvantifiering (vita pilar). Skalstapeln = 2 µm (C) Confocal bilder (60 x mål och en ytterligare 1,3 X förstoring på programvaran förvärvet) av den CA1 stratum radiatum, med retande markörer-vGlut1 (grön)-från kryostaten-cut Hippocampus sektioner från hela hjärnor fast i PFA. Notera förekomsten av stora hål och oregelbundna, sammanklibbade vGlut1 färgning. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Representative Results
Synaps förlust uppstår tidigt i neurodegenerativa sjukdomar som AD och Parkinsons sjukdom2,11,12. De molekylära mekanismerna bakom dessa underskott kvarstår dock dåligt förstådd. Brister i Wnt signalering har förknippats med AD13,14,15,16,17. WNTS är utsöndras glykoproteiner och spelar en viktig roll i synapsen bildandet och moduleringen av synaptisk transmission18,19,20,21. Nyligen har identifierat vi Wnts som viktiga regulatorer av synaptic underhåll i mogna nervsystemet10,22. Att noggrant studera effekterna av Wnt-signalering på synapser i hippocampus av genetiskt modifierade möss, drog vi fördel av en hjärna slice förberedelse och konfokalmikroskopi att utvärdera förändringar i synapsen nummer. Vi identifierat friska skivor där strukturen var väl bevarade (figur 2A). Dessutom definierades val av synaptic puncta noggrant, med undantag av stora färgade objekt som förmodligen representerar aggregerade proteiner (figur 2B). Detta kriterium tillämpades på alla bilder, med samma strikta analysparametrar.
Vi använde transgena modellsystem som inducerar uttryck av den utsöndrade Wnt antagonisten Dkk1 i vuxen möss (iDkk1) under tetracyklin styra (se Tabell för material)10,22. Vi visat att blockaden av Wnt-signalering i vuxen hippocampus utlöser excitatorisk synaps förlust särskilt i regionen CA1 stratum radiatum (figur 3). Figur 3A illustrerar representativa confocal bilder av excitatoriska pre- och post synaptic markörer (vGlut1 och PSD-95, respektive) förvärvade från Hippocampus skivor av iDkk1 möss uttrycker Dkk1 för två veckor, samt deras respektive kontroller. Vi analyserade dessa bilder som använder Volocity programvara och uppvisade en betydande minskning av antalet retande synapser, kvantifieras av samtidig localizationen av vGlut1 - och PSD-95-märkt puncta i regionen CA1 i hippocampus iDkk1 möss efter den induktion av Dkk1 för två veckor (figur 3B, * p < 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 möss per genotyp). I den CA1 stratum radiatum sänktes excitatorisk synaps puncta antalet per 1000 µm3 från 500 i kontroll möss till 300 i iDkk1 möss. Däremot påverkade inte inducerade Dkk1 uttryck antalet hämmande synapser (identifieras av samtidig lokaliseringen mellan före och efter synaptic markörer vGAT och gephyrin, respektive), som visas i figur 4A-B (p > 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 möss per genotyp).
Ännu viktigare, utfört vi en statistisk power-analys för att uppskatta lämpligt antal skivor och djur som krävs för att generera dessa robusta resultat. Använda R, vi beräknas att cirka 35 skivor per tillstånd behövdes (3 bilder x 3 skivor 6 djur = 36) att upptäcka en stor effekt storlek (f = 0,4) med 80% konfidensgrad (power = 0,8) i en envägs ANOVA med blockering och replikering, som beskrivs i steg 3.2.6.
Figur 3: förlust av retande synapser i hippocampus skivor från iDkk1 möss. (A) representativa confocal bilder av de CA1 stratum radiatum Visa retande synapser, identifieras genom samtidig lokalisering mellan vGlut1 och PSD-95 (vita pilar). Den nedre panelen representerar en högre förstoring av den markerade rektangeln. Skala barer = 2 µm. (B) andelen retande synapser mellan kontroll och iDkk1 kvantifierades med programvara som nämns i Tabell för material (* p < 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 möss per genotyp). Uppgifterna är representerade ± SEM. Denna siffra har ändrats från referens10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: hämmande synapser är oförändrade i hippocampus skivor från iDkk1 möss. (A) representativa confocal bilder av den CA1 stratum radiatum hämmande synapser identifieras genom samtidig lokaliseringen mellan vGAT och gephyrin (vita pilar). Den nedre panelen representerar en högre förstoring av den markerade rektangeln. Skala barer = 2 µm. (B) andelen hämmande synapser mellan kontroll och iDkk1 möss, som kvantifieras med hjälp av Volocity programvara (p > 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 möss per genotyp). Uppgifterna är representerade ± SEM. Denna siffra har ändrats från referens10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Hög sackaros ACSF komponenter | Koncentration | Anteckningar |
| NaCl | 75 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2,5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| Kynurensyra | 1,25 mM | |
| Pyrodruvsyra | 2 mM | |
| EDTA | 0,1 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Lägg till efter syresättning av lösning |
| MgCl2 | 4 mM | Lägg till efter syresättning av lösning |
| D-glukos | 25 mM | |
| Sackaros | 100 mM | |
| Nedsänkt kammare ACSF komponenter | ||
| NaCl | 125 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2,5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Lägg till efter syresättning av lösning |
| MgCl2 |
Tabell 1: ACSF sammansättning.
| Blockera/permeabilizing buffert | Koncentration | Anteckningar |
| Åsnan serum | 10% | |
| Triton-X | 0,50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | pH till 7,4 | |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 27 mM | |
| NaH2PO4 | 100 mM | |
| KH2PO4 | 18 mM | |
| 4% PFA/4% sackaros | pH till 7,4 | |
| PBS | 1 x | Späd från 10 x |
| PFA | 1,33 M | |
| Sackaros | 117 mM |
Tabell 2: Buffertar används för Immunofluorescerande färgning.
Discussion
En noggrann utvärdering av synaps nummer är viktigt inom neurovetenskap. Här visar vi hur man ska värdera tätheten av synapser i CA1 stratum radiatum regionen Hippocampus skivor som modellsystem. Betydelse med avseende på befintliga metoder demonstreras i vår senaste forskningartikeln som om effekten av Wnt-brist i hippocampus och där vi också utvärderat synaps nummer av singel-avsnitt EM10. Omfattningen av synaps förlust är liknande mellan singel-avsnitt EM och hjärnan-skiva metod beskrivs här10. Således visar detta konstaterande exaktheten och tillförlitligheten av tekniken.
Viktigt, är en begränsning av både singel-avsnitt EM och immunfärgning synapser, som presenteras här, oförmågan att exakt beräkna absoluta synaps numret för en specifik hjärnan region. Faktiskt, det är viktigt att identifiera eventuella globala morfologiska förändringar, eftersom förändringar i total volym kunde påverka synaptic nummer. En annan begränsning är att vissa antikroppar är mindre effektiva på färgning intakt hjärnregioner, delvis på grund av den extrema tätheten av synapsförbindelser. Vi upplevde högre kvalitet färgning av vGlut1 och gephyrin med denna skiva förberedelse och efterföljande PFA fixering för högst 1 h, jämfört med direkta upptagning av hela hjärnan i PFA (figur 2 c). Det senare ledde till klampade synaptic färgning, med hål i vävnaden. VGlut1 antikropp genomträngningen är dock fortfarande begränsad i båda metoderna (ett par av tiotals mikrometer). Vi övervinna inte denna begränsning, även med ökad antikropp inkubation, men ger antikropp penetration är större än det totala djupet som är avbildade, bör det finnas ingen påverkan på slutresultatet. Dessutom bör särskild försiktighet iakttas så att färgningen är även under hela förvärvade stacken.
I vår studie ville vi skilja excitatoriska från hämmande synapser. Följaktligen valde vi vGlut1/PSD-95 och vGAT/gephyrin, respektive, som dessa proteiner uttrycks mycket i vuxen mus hippocampus och är specifika för varje synaps subtyp4,5. Andra retande och hämmande synaptisk markörer kunde ha använts för att identifiera varje respektive synapsen, såsom receptorer berikad på varje synaps, inklusive NMDA- och AMPA-receptorer för retande och GABAA receptorer för hämmande synapser. Andra neurotransmittorer eller neuromodulators kan också identifieras med våra protokoll, och säkerställer att specifika antikroppar finns, som visas för dopaminerga synapser i striatum22. Dessutom kan att minska tjockleken på varje skiva till 120 µm delvis övervinna den låga mängden produktproverna med akut skivor, vilket är absolut nödvändigt för studier i lilla hjärnstrukturer såsom amygdala.
Framtida tillämpningar av våra protokoll kan genomföras i studien av olika hjärnområden och störningar. Till exempel i striatum (en region av hjärnan vid Parkinsons sjukdom), skulle en kombination av vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 kunna användas för att skilja mellan de retande synapserna från afferenter kommer från cortex eller thalamus, respektive22.
Sammanfattningsvis har vi visat en tillförlitlig metod att undersöka antalet synapser i hjärnan vävnader med pre- och post synaptic markörer för att definiera en synaps. Kritiska steg inbegripa förberedelse av bra Hippocampus skivor, en fixering tid av upp till 1 h i PFA, tillämpningen av tillräckligt monteringsmedium, användning av tillförlitliga antikroppar, lämplig bild förvärv inställningar och stränga synaptic puncta upptäckt. Slutligen, denna metod är relativt snabbt och är enkelt reproducerbar av alla laboratorier som har tillgång till en confocal Mikroskop.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust och Parkinson UK. Vi vill också tacka Ms. Johanna Buchler för hennes bidrag av confocal bilder och medlemmarna i lab för deras konstruktiva synpunkter på manuskriptet och metodik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
