Summary
נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.
Abstract
הסינפסות במוח, הם צמתי מיוחדים בין נוירונים, הקובע את הכוח ואת התפשטות אותות עצביים. המספר של הסינפסות מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות עצביים. חשוב לציין, גירעונות במספר סינפסה יכול להוביל בתפקוד הקוגניטיבי. לכן, הערכת מספר סינפסה היא חלק אינטגרלי של הנוירו-ביולוגיה. עם זאת, כפי הסינפסות קטן וקומפקטי במיוחד במוח שלם, ההערכה של המספר המוחלט הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה בקלות לזהות ולהעריך סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות מכרסמים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. הוא כולל הליך שלושה שלבים כדי להעריך את הסינפסות בתמונות באיכות גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית על-ידי ניתוח לוקליזציה שיתוף של חלבונים קדם ו postsynaptic בפרוסות בהיפוקמפוס. זה גם מסביר איך הניתוח מבוצע ונותן דוגמאות מייצגות של הסינפסות סינאפסות והן מעכבות. פרוטוקול זה מספק בסיס מוצק לניתוח של הסינפסות, ניתן להחיל על כל מחקר חוקר את המבנה והתפקוד של המוח.
Introduction
המוח האנושי מורכב כ 1014 הסינפסות. סינפסה מספר מוסדר בחוזקה במהלך ההתפתחות וההתבגרות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). במהלך פיתוח, סינפסה מספר הוא מווסת על ידי synaptogenesis וגיזום כדי ליצור רשתות עצביים פונקציונלי. למידה וזיכרון נתמכים על ידי ויסות סינפסה מספר כוח, תהליך המכונה potentiation סינפטית, דיכאון1. חשוב, הייצוב של הסינפסות בוגר הוא חיוני לשמירה על חיבורי הרשת העצבית. יתר על כן, גירעונות בצפיפות סינפסה דווחו כבר בשלבים מוקדמים של התנאים ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD)2. לכן, היכולת לזהות ולהעריך במדויק מספר סינפסה הוא היסוד ההערכה של המוח פיזיולוגיה פתולוגיה.
צפיפות קיצונית והטבע קומפקטי של הסינפסות להגיע מאתגר כדי להעריך את המספר המדויק שלהם באזורים במוח ללא פגע שני נוירונים בתמורה קרוב, מופרדים על-ידי שסוע סינפטית3עשויים כימי סינפסות מערכת העצבים. מסוף סינפטית מראש, או בוטון סינפטית, מגיח האקסון והיא מורכבת שלפוחית שהצטברו, המכילים נוירוטרנסמיטורים המגדירים יחודיות של סינפסה — כלומר, גלוטמט וגאמא אמינו בוטירית (GABA) עבור סינאפסות, מעכבות synapses, בהתאמה. הקרומים של השלפוחיות המוגלתיות מכילים ספיציפית כל עצבי vesicular מובילים: vesicular גלוטמט טרנספורטר (vGlut) עבור גלוטמט וטרנספורטר גאבא vesicular (vGAT) עבור GABA. הטרמינל הפוסט-סינפטית היא מבנה צפופה מורכב של חלבונים מרובות, כולל רצפטורים, מולקולות אדהזיה חלבונים לגרדום. הסינפסות סינאפסות, חלבונים צפיפות-95 פוסט-סינפטיים (PSD-95) הוא הנפוץ ביותר לגרדום חלבון4, להתכוונן סינאפסות N-methyl-D-aspartate(NMDA-), חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (נולד באמפא) קולטן לפעול, ואילו gephyrin עוגנים קולטנים מעכבות5מעכבות הפוסט-סינפטית מסוף. בסך הכל, יחודיות של חלבונים תאים טרום, פוסט-סינפטיים הסיוע בידול, זיהוי של סוגי סינפסה.
ניתן לבצע הערכת מספר סינפסה עם טכניקות שונות. הנפוץ ביותר הוא השימוש של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), המאפשרת הניתוח של הסינפסה באזורי המוח קומפקטי ללא פגע ועם בהגדלה ברזולוציה. עם זאת, טכניקה זו יקר מאוד, מחייב הכנת הדוגמא מסובך, זמן רב מאוד. טכניקות אחרות כוללות את השימוש במערך טומוגרפיה6, שבו יש חיסרון גדול בכך שהיא דורשת ציוד מיוחדים ויקרים כדי לבצע את הניתוח. יתר על כן, קווים הטרנסגניים לבטא מסוימות סינפטיים סמנים שימושיים-הערכת סינפסה מספר7, אבל הדור של שורות חדשות יכול להיות מגבילים ויקרות, ביטוי של חלבונים עלול לגרום לא רצויים את המטרה פנוטיפים.
בשל מגבלות אלה, פשטות, חוקרים רבים להעריך מספר סינפסה על-ידי בדיקת רמות חלבונים סינפטיים הכולל. עם זאת, אובדן סינפסה יכול להיות שנצפו לפני שינויים משמעותיים חלבון, כתוצאות שיפוץ מבניות סינפטית במהלך פיזור תמורה מראש או הפוסט-סינפטית, עם אין השפלה של חלבונים סינפטיים. יתר על כן, במודעה, רמות חלבונים סינפטיים הן ניוון סינפסה הבאים מופחתת או מוות עצביים8,9. כימות של רמות הכולל אינו מאפשר הבחנה זו. לפיכך, יש צורך לפתח שיטה מדויקת, נגיש ואמין על ההערכה של מספר סינפסה במוח.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד לזהות ולקבוע את המספר של הסינפסות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס ביסודיות. הסינפסות מוגדרים על-ידי colocalization של סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים המופיעים הפצה punctate. נדגים את תוקפו של טכניקה זו דרך המחקר של חגיגת איתות במוח. Wnts הם חלבונים המופרש חשוב עבור צורה, חיסול, תחזוקה של הסינפסות. אין ויוו אינדוקציה של אנטגוניסט המופרש של המפל ונ ט, Dickkopf-1 (Dkk1), מוביל לירידה סינפטית סינאפסות תוך שמירה על סינפסות מעכבות ההיפוקמפוס10. אנחנו להמחיש את זיהוי וספירה של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות העכבר למבוגרים לבטא Dkk1 וסמן את transferability של טכניקה זו לסוגים אחרים של רקמות/תרבות ההכנות.
Protocol
כל הניסויים באמצעות עכברים וחולדות אושרו, שנערך באמצעות לוח זמנים 1 הליכים מכוסה תחת חוק משרד הפנים חיות (וצפייה) 1986. ניתן למצוא את המתכון נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) טבלה 1-
1. הכנה חריפה פרוסה בהיפוקמפוס
- מסירים את המוח העכבר מהר ככל האפשר, באמצעות מרית, מספריים לחתוך את הגולגולת, ולמקם אותו תוך קר כקרח, חמצן (95% או 2, 5% CO 2), חנה המבר בסוכרוז (~ 100 מ"ל).
- מקום במוח העכבר על צלחת פטרי ולהסיר את המוח הקטן, קטע קטן של קליפת חזיתית עם איזמל לפני hemisecting את האמצע של המוח-
- למקם את שתי האונות בצד שהיה מכריתת והדבק האונה כל לבמה של vibratome.
- לחתוך 200-300 סעיפים מיקרומטר בעובי של האזור מלא עניין. במקרה של ההיפוקמפוס, כ 3-4 פרוסות לכל האונה צריכה להתקבל.
- באמצעות פיפטה פלסטיק של פסטר, להעביר את הפרוסות אל. התא שקועים מחומצן (95% או 2, 5% CO 2) חנה המבר. לשמור על 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
הערה: הטיפול של פרוסות עם סוכנים תרופתי פעיל, כגון חומרים Dkk1, ניתן לבצע בשלב זה על-ידי הוספת הסוכנים לתא פרוסה. - להסיר את הפרוסות מן החדר באמצעות מברשת, למקם אותם לתוך צלחת 24-ובכן, תקן עבור 20 דקות ל- 1 h ב- 4% paraformaldehyde (סוכרוז PFA)/4% בטמפרטורת החדר (RT).
התראה: PFA רעיל, ללבוש הגנה הולמת. - לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- X 1 PBS (10 דקות כל אחד).
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן 1-2 ימים, כל עוד הפרוסות נשמרים ב 4 ° C ב- 1 X PBS-
2. Immunofluorescence עבור סמני סינפטית
הערה: ניתן למצוא את המתכונים של כל מאגרי להשתמש בטבלה מס ' 2-
- להחליף את PBS עם מאגר חוסם/permeabilizing (טבלה 2) הבארות פרוסה, דגירה-RT עבור 4-6 ח'
- לדלל הנוגדן שפן polyclonal נגד vGlut1-1:2,000 לדילול במאגר חוסם/permeabilization.
הערה: vGlut1 הוא סמן קדם סינפטיים הדמיית מסוף סינאפסות. עבור זיהוי סינפסה סינאפסות הפוסט-סינפטית, להשתמש עם נוגדנים polyclonal נגד PSD-95, שבערך שתדללו הפתרון אותו. השתמש נפח מינימלי של 300 µL כל טוב. כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההיפוקמפוס, השתמש נוגדן זה ניתן לזהות את מבנה עצביים, כגון MAP2 או טובולין. לסדר את ריכוזי הנכון לכל הנוגדנים העיקרי עבור הסמנים סינפטית של בחירה (קדם, הפוסט-סינפטית) ורכים במאגר טריים חוסם/permeabilizing. - דגירה הפרוסות בפתרון נוגדן ראשוני למשך הלילה (או 1-2 ימים) ב-4 ° C. שימוש פלטפורמה חזק עם תנועה נמרצת.
- לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).
- לדלל את שבערך נוגדנים משניים המתאימים במאגר חסימה. לדוגמה, בעת השימוש הנוגדן שפן vGlut1, להחיל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב שפן (למשל, החמור אנטי-guinea-חזיר) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים. בעת השימוש הנוגדן ארנב PSD-95, החל נוגדנים משניים מזהה את הרכיב הארנב (למשל, החמור נגד הארנב) מצומדת כדי fluorophore ספציפיים שונים.
- דגירה הפרוסות בפתרון זה עבור 2-3 h-ודא RT. כי הפרוסות מוגנים מפני האור, כמו נוגדנים משניים הם רגיש אור.
- לרחוץ את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS (10 דקות כל אחד).
- בזהירות להסיר את הפרוסות מהצלחת 24-ובכן שימוש במכחול ולמקם אותם באופן שווה על גבי מדרון זכוכית עם תוויות ברורות מראש. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית מעל כל פרוסה ולאחר מכן מקם בעדינות coverslip זכוכית מעל הפרוסות. למנוע היווצרות של בועות אוויר. שמור לשימוש מספיק הרכבה בינונית (300-400 µL), כמו כמות לא מספקת עלולה להוביל לייבש פרוסות.
- השאירו יבש למשך תקופה מינימלית של 1-2 ימים ב- RT ולשמור את השקופיות מוגן מפני אור.
- לאחסן את השקופיות ב 4 ° C בטווח הקצר, אבל לאחסון לטווח ארוך, לשמור אותם ב-20 מעלות צלזיוס
3. ייבוא תמונות וניתוח קונאפוקלית
- הדמיה באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
- לזהות את האזור של ההיפוקמפוס לדימות (למשל, ammonis cornu 1 ו- 3 (CA1, CA3) או הפיתול משוננת (ג'י)) באמצעות 10 x או 20 x המטרה. המטרה שמן-טבילה
- שינוי סימן x 40 או 63 x כדי לוודא האנטומיה פרוסה לא נפגע על-ידי זיהוי רציפה neurites ומאורגן מבנה. להשתמש את סמן עצביים, כגון MAP2, כהפניה ( איור 1 א').
- לאחר מכן לעבור 60 x שמן-טבילה אובייקטיבי (NA = ~1.3 - 1.4) והתאם את ההגדרות לכל ערוץ כדי להשיג אופטימלי איתות והחדות. להגדיר את עוצמת הלייזר כל כדי למנוע את הרוויה של פיקסלים באמצעות אפשרות גבוהה- / עם ניגודיות נמוכה.
הערה: אלה ההגדרה תלויה המיקרוסקופ משמש, אלא להפנות הטבלה של חומרים הגדרות צריכת החשמל הלייזר בשימוש איור 2, איור 3, ו- איור 4. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש ברזולוציה 1024 x 1024 פיקסלים. ההגדרות צריכים להישאר קבועה לאורך כל תנאי אחר אותו ניסוי. יכול להיות מיושם זום נוספים אם יש צורך. - להעריך את עומק ההכתמה איפה אפילו ולרכוש אוספי תמונות לפחות 8 קו מקביל (250 ננומטר) מטוסים. אז קח 3 ערימות סמוכים להחליפן בתמונות מאותו עניין לחתיכה.
הערה: העומק עשוי להשתנות מפרוסה אחת לאחרת, אבל תמיד צריך להיות כ- 2-5 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה. - חוזר הרכישה לפחות 3 פרוסות לכל תנאי, מבעלי 6-8 לכל קבוצה הטיפול.
- ניתוח תמונה.
הערה: השתמש תוכנה ניתוח תמונה אוטומטית (ראה את הטבלה של חומרים). שימו לב כי חלק ממערכות דורשים רישיון, ואילו אחרים הם חינם, כגון ImageJ. התוכנה ששימשה יש לנתח את התמונות ב- 3D תוך התחשבות כל המטוסים של המחסנית עם תמונה. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים של התוכנה ששימשה בניתוח התמונה ( איור 1).- שימוש מותאם אישית המבוסס על עוצמת סף פרוטוקול כדי לזהות כל puncta סינפטית של סמנים עצביים, אשר באופן ידני אופטימיזציה ו נבחר בתוך התוכנה [ראה את הטבלה של חומרים עבור התוכנה ספציפיים השתמשו בזה פרוטוקול].
הערה: התוכנה מזהה את עוצמת מינימום ומקסימום עבור כל fluorophore ומשייך אחוז של העוצמה עבור כל אובייקט מוכר. שימו לב: האחוז של עוצמת ישתנה בהתאם fluorophore להשתמש, הנוגדן נגד דה מרקר סינפטית. - עבור סמני סינפטית, ודא כי גודל מסננים (> 0.1µm 3, < 0.8µm 3) נבחרים בתוך התוכנה ו להחיל על התמונה. כוונן את הפרמטרים כדי להבטיח האובייקטים שנבחרו לא חופפות. לא לכלול כל אובייקט גדול מדי או קטן מדי כדי להיחשב puncta סינפטית (ראה איור 2B).
הערה: לאחר אופטימיזציה, ערכי סף זהים יוחלו על כל התמונות בתוך ניסוי נתון. - לכמת את המספר אומר בעוצמה, נפח של הפרט puncta סינפטית (קדם או הפוסט-סינפטית) באמצעות פרוטוקולים הסף ממוטבת נבחר בתוך התוכנה. לנרמל את מספר puncta לנפח של שדה התמונה (בערך 16,928 מיקרומטר 3 במערכת המשמש כאן). לנרמל את העוצמה puncta סינפטית ללחץ של דה מרקר עצביים הפניה.
הערה: הסינפסות מוגדרים לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש והן הפוסט-סינפטית. פעם הסף פרוטוקולים עבור h puncta מראש, הפוסט-סינפטיתave כבר הוקמה, התוכנה עליך לזהות לוקליזציה משותף של puncta סינפטית כמו החפיפה של 1 פיקסל או יותר מטוס בודד.
הערה: עבור ניתוח סטטיסטי, לאשר כי כל הערכות של דגימות בצע נורמליות והומוגניות השונות, כפי שנקבע על-ידי Lilliefords במבחני χ2, בהתאמה. צריך להיות מנותח דגימות מראה של התפלגות נורמלית והומוגניות השונות עם בדיקות פרמטרית, כמתואר להלן. לדוגמה, ניתוח puncta סינפטית סינאפסות צריכה להתבצע באמצעות חד-כיווני אנובה עם חסימת ושכפול. ניסוי בודדות צריך להיחשב בלוק; בדרך כלל, ישנם 3 ניסויים עצמאי, כל אחד עם 1-3 עכברים מן כל תנאי-
- שימוש מותאם אישית המבוסס על עוצמת סף פרוטוקול כדי לזהות כל puncta סינפטית של סמנים עצביים, אשר באופן ידני אופטימיזציה ו נבחר בתוך התוכנה [ראה את הטבלה של חומרים עבור התוכנה ספציפיים השתמשו בזה פרוטוקול].
איור 1: ניתוח של puncta סינפטית באמצעות ניתוח תמונה תוכנת. (א) צילום מסך של עוצמת סף פרוטוקול ההתאמה האישית. הדוגמה בהתחשב מיועד PSD-95, שבה puncta שנבחר יש גודל מוגדר של > מיקרומטר 0.1 3 ו < 0.8 מיקרומטר 3 ו נוכח ממוזער לאובייקטים חופפים. שימו לב כי התמונה המוצגת עבור מטוס קונאפוקלית אחד לאפשר את החזיית קל יותר puncta סינפטית ומבחר פרמטר מדויק. צילום מסך של ניתוח פלט מתוך התוכנה (בעקבות הבחירה של פרוטוקול ממוטב) (B). דוגמה של raw puncta סינפטית מספר מדידות בהתבסס על הכמות. ערכים אלה מיוצאים ואז תוכנת הגיליון האלקטרוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בדיקת איכות של ההגדרות פרוסה של פרמטר עבור סינפטית puncta. (א) נציג קונאפוקלית תמונות (40 x המטרה) באזור עניין: CA1 שכבה radiatum (sr) של הרובד oriens (כך) על נתח בהיפוקמפוס מזוהים על-ידי MAP2 מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. (B) קונאפוקלית תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-(ירוק) vGlut1 ו- PSD-95 (אדום)-מ פרוסות בהיפוקמפוס. הערה הזיהוי של puncta ברור מראש, פוסט-סינפטיים. Puncta גדול יותר מיקרומטר 0.8 3 אינם נכללים כימות (החצים הלבנים). סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר (ג) Confocal תמונות (60 x אובייקטיבית, 1.3 נוספים של X הגדלה על התוכנה רכישה) של radiatum הרובד CA1, עם סמנים סינאפסות-vGlut1 (ירוק)-ממקטעים בהיפוקמפוס cryostat-גזור מן המוח כולו קבוע בכדורגלן. הערה על הימצאות חורים גדולים והוא vGlut1 לא סדיר, גושית מכתים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Representative Results
סינפסה אובדן מתרחשת בשלב מוקדם של מחלות ניווניות כגון AD ו מחלת פרקינסון2,11,12. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס גירעונות אלה נשארים ממעטים להבין. ליקויים ונ ט איתות קושרו עם AD13,14,15,16,17. Wnts glycoproteins המופרש, לשחק תפקיד חיוני סינפסה היווצרות של אפנון הסינאפסית18,19,20,21. לאחרונה, אנחנו מזוהות Wnts מפתח סמביוזה סינפטית תחזוקת מערכת העצבים בוגרת10,22. לחקור באופן מדויק את ההשפעה של חגיגת איתות על סינפסות ההיפוקמפוס של עכברים מהונדסים, לקחנו יתרון של המוח פרוסה הכנה ו מיקרוסקופיה קונפוקלית להעריך את השינויים במספר סינפסה. זיהינו פרוסות בריא שבו המבנה היה נשמר (איור 2 א). יתר על כן, הבחירה של puncta סינפטית בקפידה הוגדרה, בדחיקת אובייקטים מוכתם גדולים כנראה המייצג מצטברים חלבונים (איור 2B). קריטריון זה הוחל על כל התמונות, עם הפרמטרים באותו ניתוח קפדני.
השתמשנו מערכת מודל הטרנסגניים שגורם הביטוי של אנטגוניסט ונ ט Dkk1 מופרשים למבוגרים עכברים (iDkk1) תחת טטרציקלין לשלוט (ראה הטבלה של חומרים)10,22. להדגים כי המצור על חגיגת איתות בהיפוקמפוס למבוגרים מפעיל סינפסה סינאפסות אובדן במיוחד באזור CA1 שכבה radiatum (איור 3). איור 3A מדגים להחליפן בתמונות קונאפוקלית של סינאפסות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים (vGlut1 ו- PSD-95, בהתאמה) שנרכש בהיפוקמפוס פרוסות של עכברים iDkk1 לבטא Dkk1 שבועיים, כמו גם הפקדים המתאימים שלהם. אנו ניתח את התמונות האלה באמצעות תוכנת Volocity, הדגימו הפחתה משמעותית במספר של הסינפסות סינאפסות, לכמת על ידי לוקליזציה משותף של vGlut1 ו- PSD-95-שכותרתו puncta באזור CA1 ההיפוקמפוס של עכברים iDkk1 בעקבות אינדוקציה של Dkk1 במשך שבועיים (איור 3B, * p < 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). ב- radiatum הרובד CA1, צומצם המספר puncta סינפסה סינאפסות לכל מיקרומטר 1,0003 בין 500 בעכברים שליטה ל-300 בעכברים iDkk1. לעומת זאת, ביטוי Dkk1 מושרה לא השפיע על המספר של הסינפסות מעכבות (המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים vGAT gephyrin, בהתאמה), כפי שמוצג באיור 4A-B (p > 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ).
חשוב לנו לבצע ניתוח עוצמה סטטיסטית כדי להעריך מספר מתאים של פרוסות וחיות הנדרש להפקת תוצאות חזקות אלו. באמצעות R, אנו מחושב כ 35 פרוסות לכל תנאי היו נחוצים (3 תמונות x 3 פרוסות x 6 חיות = 36) כדי לזהות גודל האפקט גדול (f = 0.4) עם 80% ביטחון (כוח = 0.8) אנובה בכיוון אחד עם חסימת ושכפול, כפי שמתואר בשלב 3.2.6.
איור 3: אובדן של סינאפסות סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של CA1 שכבה radiatum הצג סינאפסות הסינפסות, המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGlut1 ל- PSD-95 (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) האחוז של סינאפסות הסינפסות בין שליטה iDkk1 הייתה לכמת באמצעות תוכנה המוזכרים בטבלה של חומרים (* p < 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 6 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הסינפסות מעכבות הם ללא שינוי בפרוסות בהיפוקמפוס של עכברים iDkk1. (א) נציג תמונות קונאפוקלית של radiatum הרובד CA1 של הסינפסות מעכבות המזוהה על-ידי לוקליזציה שיתוף בין vGAT לבין gephyrin (החצים הלבנים). החלונית התחתונה מייצג של הגדלה גבוהה יותר של המלבן המסומן. גודל ברים = 2 מיקרומטר. (B) אחוז מעכבות הסינפסות בין עכברים iDkk1 ובקרה, כפי לכמת באמצעות תוכנת Volocity (p > 0.05; מבחן Kruskal-איי ווליס; 3 עכברים לכל גנוטיפ). הנתונים הם מייצגים ± ב- SEM... איור זה השתנה בין התייחסות10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סוכרוז גבוהה חנה המבר רכיבים | ריכוז | הערות |
| NaCl | 75 מ מ | |
| NaHCO3 | 25 מ מ | |
| אשלגן כלורי | 2.5 מ מ | |
| 2PO NaH4, 2 H2O | 1.25 מ מ | |
| חומצה Kynurenic | 1.25 מ מ | |
| פירובט | 2 מ מ | |
| EDTA | 0.1 מ מ | |
| CaCl2 | 1 מ מ | להוסיף לאחר חמצון של פתרון |
| MgCl2 | 4 מ מ | להוסיף לאחר חמצון של פתרון |
| D-גלוקוז | 25 מ מ | |
| סוכרוז | 100 מ מ | |
| תא המשוקע רכיבים כלנית חדד | ||
| NaCl | 125 מ מ | |
| NaHCO3 | 25 מ מ | |
| אשלגן כלורי | 2.5 מ מ | |
| 2PO NaH4, 2 H2O | 1.25 מ מ | |
| CaCl2 | 1 מ מ | להוסיף לאחר חמצון של פתרון |
| MgCl2 |
טבלה 1: חנה המבר ההרכב.
| מאגר חוסם/permeabilizing | ריכוז | הערות |
| סרום חמור | 10% | |
| טריטון-X | 0.50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | ה-pH ל 7.4 | |
| NaCl | 1.37 מטר | |
| IC. | 27 מ מ | |
| 2PO NaH4 | 100 מ מ | |
| 2פו ח'4 | 18 מ מ | |
| 4% סוכרוז PFA/4% | ה-pH ל 7.4 | |
| PBS | 1 x | לדלל מ 10 x |
| כדורגלן | 1.33 מ' | |
| סוכרוז | 117 מ מ |
טבלה 2: מאגרים המשמשים immunofluorescent מכתים.
Discussion
הערכת סינפסה מספר מדויק חיוני בתחום מדעי המוח. כאן, אנו מראים כיצד להעריך את הצפיפות של סינפסות האזור radiatum CA1 שכבה של פרוסות בהיפוקמפוס כמערכת מודל. המשמעות לגבי שיטות קיימות מומחש במאמר מחקר האחרונות שלנו על ההשפעה של מחסור ונ ט בהיפוקמפוס, שבו אנו גם מוערכים סינפסה מספר EM יחיד-סעיף10. סדר הגודל של אובדן סינפסה דומים בין יחיד-סעיף EM פרוסות המוח של השיטה המתוארת כאן10. לפיכך, ממצא זה מדגים את הדיוק והאמינות של הטכניקה.
חשוב, מגבלה של יחיד-סעיף EM והן immunostaining הסינפסות, כפי שהוצג כאן, היא חוסר היכולת לאמוד במדויק את מספר סינפסה מוחלטת עבור אזור מסוים במוח. אכן, חשוב לזהות שינויים מורפולוגיים הכללית, כפי שינויי הנפח הכולל יכול להשפיע מספר סינפטית. מגבלה נוספת היא כי נוגדנים מסוימים הם פחות יעילים צביעת אזורים במוח ללא פגע, חלקית עקב הצפיפות הקיצונית של קשרים סינפטיים. שחווינו באיכות גבוהה יותר כתמים של vGlut1, gephyrin באמצעות זו פרוסה והכנה קיבוע PFA עוקבות לכל היותר 1 h, לעומת הקיבעון מיידית של המוח כולו בכדורגלן (איור 2C). האחרון הובילו גושית סינפטית מכתים, עם חורים ברקמה. למרות זאת, החדירה נוגדן vGlut1 הוא עדיין מוגבל בשתי השיטות (כמה עשרות מיקרונים). אנחנו לא להתגבר על מגבלה זו, אפילו עם נוגדן מוגברת דגירה, אבל מתן החדירה נוגדן הוא גדול יותר עומק סה כ זה הוא עם תמונה, צריכה להיות כל השפעה על התוצאה הסופית. יתר על כן, טיפול מיוחד יש לנקוט על מנת להבטיח כי ההכתמה אפילו במהלך רכשה הערימה כולה.
במחקר שלנו, רצינו להבחין סינאפסות בין הסינפסות מעכבות. כתוצאה מכך, בחרנו vGlut1/PSD-95 ו- vGAT/gephyrin, בהתאמה, כפי חלבונים אלה באים לידי ביטוי מאוד בהיפוקמפוס עכבר מבוגרים והם ספציפיים עבור כל סוג של סינפסה4,5. סמנים אחרים סינפטית סינאפסות יכול השתמשו כדי לזהות כל סינפסה המתאימים, כגון קולטנים מועשר ב כל סינפסה, כולל קולטני NMDA, אמפא סינאפסות, קולטני GABAA הסינפסות מעכבות. גם להיות מזוהה עם פרוטוקול שלנו, ולהבטיח כי נוגדנים ספציפיים זמינים, כפי שמוצג עבור וכולינרגיים הסינפסות סטריאטום22נוירוטרנסמיטרים או neuromodulators אחרים. בנוסף, הפחתת עובי כל פרוסה 120 מיקרומטר יכול חלקית להתגבר על כמות נמוכה של דגימות שהושג עם פרוסות חריפה, אשר הכרחי ללימודי מוח קטן מבנים כגון האמיגדלה.
ניתן ליישום יישומים עתידיים של פרוטוקול שלנו במחקר של אזורים שונים במוח והפרעות. לדוגמה, ב- סטריאטום (אזור של המוח הקשורים עם מחלת פרקינסון), שילוב של vGlut2/PSD-95 או vGlut1/PSD-95 יכול לשמש כדי להבדיל בין הסינפסות סינאפסות מ afferents מגיע קליפת או התלמוס, בהתאמה22.
לסיכום, אנחנו הראו שיטה אמינה כדי לבדוק את המספר של הסינפסות ברקמות המוח באמצעות סמנים מראש ו פוסט-סינפטיים להגדרת סינפסה. שלבים קריטיים כוללות הכנת פרוסות בהיפוקמפוס טוב, זמן קיבעון של עד 1 h מחברים, היישום של מדיום מספיק הרכבה, השימוש של נוגדנים אמין, הגדרות רכישת תמונה המתאימה, וזיהוי מחמירים puncta סינפטית. בסופו של דבר, בשיטה זו הוא מהיר יחסית והוא לשחזור בקלות על ידי כל מעבדות יש גישה מיקרוסקופ קונפוקלי.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי MRC את האיחוד האירופי FP7, ARUK, טרסט, בבריטניה פרקינסון. כן נרצה להודות גב' ג'ואנה סרויה שלה התרומה של תמונות קונאפוקלית ואנשי המעבדה לקלט בונה שלהם על כתב היד, מתודולוגיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
