Summary
정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.
Abstract
두뇌, 시 냅 스는 강도와 신경 신호의 확산을 결정 하는 뉴런 사이의 특수 접합. 시 냅 스의 수 개발 및 신경 성숙 하는 동안 엄격 하 게 통제 된다. 중요 한 것은, 시 냅 스 숫자에 적자 인지 기능 장애 발생할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 숫자의 평가 신경 생물학의 중요 한 부분. 그러나, 시 냅 스는 그대로 뇌에 작고 매우 컴팩트한은, 절대 수의 평가 도전 이다. 이 프로토콜에는 쉽게 식별 하 고 hippocampal 설치류 조각 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여 시 냅 스를 평가 하는 방법을 설명 합니다. Hippocampal 조각에 사전 및 postsynaptic 단백질의 공동 지역화를 분석 하 여 높은-품질 confocal 현미경 이미지에 시 냅 스를 평가 하는 3 단계 절차를 포함 합니다. 그것은 또한 어떻게 분석 수행 되 고 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 대표적인 예제를 제공 합니다 설명 합니다. 이 프로토콜 시 냅 스의 분석에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 구조와 뇌의 기능을 조사 하 고 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
인간의 두뇌는 약 1014 시 냅 스로 구성 된다. 시 냅 스 수는 개발 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 성숙 동안 긴밀 하 게 통제 된다. 개발를 통해 시 냅 스 수는 변조 synaptogenesis 및 잘라내기 기능 신경 네트워크를 형성 하 여. 학습 및 메모리 시 냅 스 숫자와 강도, 시 냅 스 potentiation 및 우울증1이라는 프로세스의 규정에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 성숙한 시 냅 스의 안정화 신경 네트워크 연결을 유지 하기 위한 필수적입니다. 또한, 시 냅 스 밀도 적자 신경 조건 Alzheimer의 질병 (광고)2등의 초기 단계에서 보고 되었습니다. 따라서, 정확 하 게 파악 하 고 평가 하는 시 냅 스 수 능력은 두뇌 생리학과 병리학의 평가에 기본적 이다.
극단적인 밀도 시 냅 스의 소형 자연 그대로 뇌 영역에 그들의 정확한 수를 견적 하기 위하여 도전 합니다. CNS에 화학 시 냅 스는 가까운 apposition, 시 냅 스 갈라진된3으로 구분 된 두 개의 뉴런으로 이루어져 있습니다. 미리 시 냅 스 터미널 또는 시 냅 시스 bouton 축 삭에서 나온다 하 고 축적 된 소포 신경 전달 물질은 시 냅 스의 특이성을 정의 하는 포함 하는 구성 됩니다-즉, 조미료 및 감마-aminobutyric 산 (GABA)에 대 한 흥분 성의 고 금지 synapses, 각각. 소포 막 포함 각 신경 전달 물질에 기공을 전송기: 기공을 조미료 운송업 자 (vGlut) 조미료 및 GABA에 대 한 기공을 GABA 전송기 (vGAT). 시 냅 스 후 터미널 고집적 구조 수용 체, 접착 분자, 그리고 비 계 단백질을 포함 하 여 여러 단백질의 구성 이다. 흥분 성의 시 냅 스에서 시 냅 스 후 밀도 95 단백질 (PSD-95)는 가장 풍부한 비 계 단백질4, 흥분 성의 N-methyl-D-aspartate(NMDA-) 및 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA-) 수용 체 변조 기능, 반면 gephyrin 고정 억제 시 냅 스 후 터미널5에 억제 수용 체. 전반적으로, 사전 및 사후 시 냅 스 구획에 단백질의 특이성 차별화 및 시 냅 스의 식별에 도움이.
시 냅 스 숫자의 평가 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 가장 일반적인 전자 현미경 (EM), 높은 배율과 해상도 가진 콤팩트 하 고 그대로 두뇌 지역에서 시 냅 스의 분석을 가능 하 게의 사용 이다. 그러나,이 기술은 매우 비싼, 복잡 한 샘플 준비, 요구 하며 매우 시간이 소모 됩니다. 다른 기술은 배열 단층 촬영6, 특수 하 고 비싼 장비는 분석을 수행할 필요에 주요 불리는 사용을 포함 한다. 또한, 유전자 변형 라인 특정 시 냅 스 마커를 표현 냅 번호7을 평가에 유용 하지만 새로운 라인의 세대 수 제한 하 고 비용이 많이 드는, 그리고 단백질의 overexpression 대상에서 바람직하지 못한 될 수 있습니다. 고기입니다.
이러한 제한으로 인해, 편의상 많은 연구자 총 시 냅 스 단백질 수준을 검사 하 여 시 냅 스 수를 평가 합니다. 그러나, 냅 손실 시 냅 스 단백질의 저하 없이 전처리 또는 후 시 냅 스 apposition의 분산에 구조 시 냅 스 개장 결과로 단백질, 상당한 변경 전에 관찰할 수 있습니다. 또한, 광고, 시 냅 스 단백질 수준에 감소 다음 냅 변성 또는 신경 죽음8,9. 총 레벨의 정량화는이 구별을 사용 하지 않습니다. 따라서, 뇌의 시 냅 스 숫자의 평가 대 한 안정적이 고, 정확한 방법을 개발 하는 필요가 있다.
이 문서에서는, 우리는 철저 하 게 파악 하 고 hippocampal 설치류 두뇌 조각에서 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여 시 냅 스의 수를 결정 하는 방법을 설명 합니다. 시 냅 스는 punctate 분포에 표시 되는 사전 및 사후 시 냅 스 마커의 colocalization에 의해 정의 됩니다. Wnt 신호는 뇌에서의 연구를 통해이 기술의 타당성을 설명 합니다. Wnts는 은닉 단백질의 형성, 제거, 및 시 냅 스의 유지 보수에 대 한 중요 한. Wnt 캐스케이드, Dickkopf-1 (Dkk1)의 secreted 적의 비보에 유도 마10억제 시 냅 스를 유지 하면서 흥분 성의 시 냅 스 손실에 지도 한다. 우리는 식별 및 Dkk1을 표현 하는 성인 마우스에서 hippocampal 조각에 흥분 성의 억제 시 냅 스의 수 하 고이 기술 조직/문화 준비의 다른 종류의 양도 강조.
Protocol
모든 실험 쥐 및 쥐를 사용 하 여 승인 하 고 일정 1 절차를 사용 하 여 실시 적용 홈 오피스 동물 (과학적인 절차) 행위 1986. 표 1에서 인공 척수 (실제) 제조 법을 찾을 수 있습니다.
1. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비
- 쥐의 뇌를 주걱을 사용 하 여 가능한 한 빨리 제거 하 고 날카로운가 위로 잘라 두개골, 그리고 얼음에, 산소 (95% O 2, 5% CO 2), 높은 자당 실제 (~ 100 mL).
- 마우스 뇌 페 트리 접시에 놓고 소 뇌와 뇌의 중간 아래로 hemisecting 전에 메스와 담당의 작은 부분을 제거.
- 그냥 컷은 측면에 두 개의 반구를 놓고 접착제는 vibratome의 단계에 각 반구.
- 는 200-300 µ m 두께 부분의 완전 한 관심 영역을 잘라. 반구 당 약 3-4 조각, 해 마의 경우 취득 해야.
- 챔버 산소 (95% O 2, 5% CO 2)에 잠긴 조각 전송 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 실제. 30 분에 대 한 34 ° C에서 유지
참고: 재조합 Dkk1 단백질 등 활성 약리 에이전트와 함께 조각의 치료에서 수행할 수 있습니다이 단계 슬라이스 챔버에 에이전트를 추가 하 여. - 그림 붓을 사용 하 여 상공에서 슬라이스를 제거, 24-잘 접시에 그들을 배치 그리고 4 %paraformaldehyde 1 시간 20 분 수정 (실 온 (RT)에서 PFA)/4% 자당.
주의: PFA는 독성, 적절 한 보호 착용. - 씻어 슬라이스 1 X PBS (각 10 분)에 세 번.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 1-2 일 동안으로 슬라이스 1 X PBS에 4 ° C에 보관 됩니다.
2. 시 냅 스 표식에 대 한 면역 형광
참고: 표 2에서 사용 하는 모든 버퍼의 요리법을 찾을 수 있습니다.
- 슬라이스 우물에서 차단/permeabilizing 버퍼 (표 2)와 함께 PBS를 대체 하 고 4-6 헤에 대 한 RT에서 품 어
- 차단/permeabilization 버퍼에 1:2,000 희석에 vGlut1에 대 한 기니 돼지 polyclonal 항 체 희석.
참고: vGlut1은 미리 시 냅 스의 흥분 성의 터미널 시각화에 대 한 마커입니다. 동일한 솔루션에 PSD-95와 희석 1: 500에 대하여 polyclonal 항 체 포스트 시 냅 시스 흥분 성의 냅 식별을 위해 사용. 각 우물에서 300 µ L의 최소 볼륨을 사용 합니다. 해 마의 해 부 위치를 식별, 또한 MAP2 등 Tubulin 신경 구조를 식별할 수 있는 항 체를 사용 합니다. 운동 선택 (사전 및 사후 시 냅 스)의 시 냅 스 표식에 대 한 모든 기본 항 체의 정확한 농도 신선한 차단/permeabilizing 버퍼에 희석. - 4에서 하룻밤 (또는 1-2 일에 대 한) 기본 항 체 솔루션에 슬라이스를 품 어 ° C. 사용 활발 한 움직임으로 떨고 플랫폼.
- PBS (각 10 분)에서 조각 세 번 씻어.
- 희석 블로킹 버퍼에서 적절 한 2 차 항 체 1: 500. 예를 들어 vGlut1 기니 돼지 항 체를 사용 하면 인식 하는 기니 피그 구성 요소 (예: 당나귀 안티-guinea-돼지) 특정 fluorophore에 활용 된 이차 항 체를 적용 합니다. PSD-95 토끼 항 체를 사용 하 여, 이차 항 체는 토끼 구성 요소 (예: 당나귀 안티 토끼) 다른 특정 fluorophore에 활용 된 인식 적용.
- 이차 항 체는 빛에 민감한 조각, 빛에서 보호 되는 실시간 확인에서 2-3 시간이 솔루션에서 분할 영역을 품 어.
- PBS (각 10 분)에서 조각 세 번 씻어.
- 신중 하 게 그림 붓을 사용 하 여 24-잘 접시에서 슬라이스를 제거 하 고 균등 하 게 사전 이라는 유리 슬라이드에 그들을 배치. 각 조각 위에 장착 매체의 한 방울을 추가 하 고 부드럽게 조각 위에 유리 coverslip 장소. 기포의 형성을 하지 마십시오. 부족 한 금액 조각 건조으로 이어질 수 있습니다 하는 충분 한 설치 매체 (300-400 µ L)을 사용 하 여 돌.
- 를 최소 1-2 일 RT에 대 한 건조 하 고 빛 으로부터 보호 하는 슬라이드를 계속 두고.
- 장기 저장을 위한 단기에 4 ° C에서 슬라이드를 저장,-20에서 그들을 계속 ° c.
3. 공초점 이미지 수집 및 분석
- confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미징.
- 이미지 수를 해 마의 영역을 식별 (예: 1 고 3 (CA1, CA3) 뿔 ammonis 또는 (DG)가 뇌) 10 배 또는 20 배 목표.
- 변경 40 x 또는 63 x 기름 침수 목적 확인 슬라이스 해부학 그대로 연속 neurites 식별 하 여 조직 구조를. MAP2, 같은 신경 마커를 사용 하 여 참조 ( 그림 1A)로.
- 이후에, 기름 침수 목표 x 60으로 전환 (NA ~1.3-1.4 =) 및 각 채널에 대 한 최적의 신호 및 대비 설정을 조정 합니다. 높은 / 낮은 콘트라스트 옵션을 사용 하 여 픽셀의 채도 피하기 위해 각 레이저의 강도 설정.
참고: 이러한 설정을 사용 하 고, 현미경에 의존 하지만 그림 2, 그림 3에서 사용 되는 레이저 전원 설정에 대 한 테이블의 자료를 참조 하 고 그림 4. 최상의 결과 얻으려면 1024 x 1024 픽셀의 해상도 사용 합니다. 설정을 통해 같은 실험의 다른 조건을 일정 유지 됩니다. 필요한 경우 추가 확대 적용 될 수 있다. - 깊이가 얼룩을 평가 하 고 적어도 8 등거리의 이미지 스택을 취득 (250 nm) 비행기. 3 인접 한 대표 이미지 스택을 슬라이스 당 관심의 동일한 지역에서 걸릴.
참고: 깊이 한 조각에서 다른 다를 수 있습니다 있지만 항상 조각의 표면에서 약 2-5 µ m 이어야 한다. - 상태 및 치료 그룹 당 6-8 동물에서 적어도 3 조각에 수집을 반복.
- 이미지 분석.
참고: 사용 하는 자동된 이미지 분석 소프트웨어 (재료의 표 참조). 반면 다른 사람 자유롭다, ImageJ 같은 일부 시스템 라이센스를 필요로 하는 참고. 사용 하는 소프트웨어 스택 몇 군데의 모든 비행기를 고려 하 여 3d에서 이미지를 분석 해야 합니다. 이미지 분석 ( 그림 1)에서 사용 하는 소프트웨어의 세부 사항에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.- 사용자 정의 기반 강도 임계값 프로토콜을 사용 하 여 모든 시 냅 스 puncta와 신경 마커는 수동으로 최적화 된 소프트웨어 내에서 선택 된 식별 하 [이 사용 하는 특정 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조 프로토콜].
참고: 소프트웨어 각 fluorophore에 대 한 최소 및 최대 강도 식별 하 고 각 인식된 개체에 대 한 강도의 비율 연결. 강도의 비율 fluorophore 사용에 따라 달라 집니다와 시 냅 스 표식에 대 한 항 체. - 시냅틱 표식 크기 필터 확인 (> 0.1µm 3와 < 0.8µm 3) 소프트웨어에서 선택 되 고 이미지에 적용. 선택한 개체 중복 하지는 보장 하기 위해 매개 변수를 조정 합니다. 너무 크거나 너무 작은 시 냅 스 puncta 간주 하는 모든 개체를 제외 ( 그림 2B 참조).
참고: 최적화, 일단 같은 임계값 값 다음 이미지에 적용 됩니다 모든 주어진된 실험 내. - 계량 평균 개수, 강도, 및 개별 시 냅 스 puncta (전처리 또는 후 시 냅 스)의 볼륨 소프트웨어 내에서 선택 된 최적화 된 임계값 프로토콜을 사용 하 여. 이미지 필드 (대략 16,928 µ m 3에서 여기에서 사용 하는 시스템)의 볼륨을 puncta 번호를 정상화. 참조 신경 마커의 강도를 시 냅 스 puncta 강도 표준화.
참고: 시 냅 스는 사전 및 사후 시 냅 스 마커 사이 공동 지역화로 정의 됩니다. 일단 사전 및 포스트 시 냅 스 puncta h에 대 한 임계값 프로토콜ave 되었습니다 설립, 소프트웨어 1 픽셀의 또는 단일 면에서 더 오버랩으로 시 냅 스 puncta의 공동 지역화를 식별 한다.
참고: 통계 분석에 대 한 확인 샘플의 모든 세트 정상 및 분산의 동질성에 따라 각각 Lilliefords와 χ 2 테스트에 의해 결정 합니다. 아래와 같이 정규 분포 및 분산의 동질성을 보여주는 샘플 파라 메 트릭 테스트와 분석 되어야 합니다. 예를 들어 흥분 성의 시 냅 스 puncta 분석 차단 및 복제는 단방향 ANOVA를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 각 개별 실험 블록;으로 고려 되어야 한다 일반적으로, 1-3 마우스 각 조건에서 각각 3 개의 독립적인 실험 있다.
- 사용자 정의 기반 강도 임계값 프로토콜을 사용 하 여 모든 시 냅 스 puncta와 신경 마커는 수동으로 최적화 된 소프트웨어 내에서 선택 된 식별 하 [이 사용 하는 특정 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조 프로토콜].
그림 1: 이미지 분석을 사용 하 여 시 냅 스 puncta의 분석 소프트웨어. 강도 임계값 프로토콜 사용자 지정의 (A) 스크린샷. PSD-95, 선택 된 puncta의 정의 된 크기를가지고 있는 예는 > 0.1 µ m 3와 < 0.8 µ m 3와 현재 최소화 겹치는 개체. 참고 표시 된 이미지는 시 냅 스 puncta와 정확한 매개 변수 선택의 쉽게 시각화 수 있도록 한 confocal 비행기. (B) 소프트웨어 (최적화 된 프로토콜의 선택에 따라)에서 출력 하는 분석의 스크린샷. 볼륨에 따라 원시 시 냅 스 puncta 숫자 측정의 예입니다. 이러한 값은 스프레드시트 소프트웨어 다음 내보내집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시 냅 스 puncta에 대 한 슬라이스 및 매개 변수 설정의 품질 확인. (A) 대표 confocal 이미지 (40 x 목표)의 관심 영역: CA1 지층 radiatum (sr) 및 지층 oriens (그래서) hippocampal 조각의 식별 됩니다 MAP2 얼룩에 의해. 눈금 막대 2 µ m. (B) 공초점 이미지 = (객관적이 고 추가 1.3 X x 60 확대 수집 소프트웨어에)의 CA1 지층 radiatum 흥분 성의 마커-vGlut1 (녹색)와 PSD-95 (레드)-hippocampal 조각에서. 분명 사전 및 포스트 시 냅 스 puncta의 식별 note 0.8 µ m 3 보다 큰 Puncta는 정량화 (흰색 화살표)에서 제외 됩니다. 눈금 막대 2 µ m (C) Confocal 이미지 = (객관적이 고 추가 1.3 X x 60 확대 수집 소프트웨어에) 흥분 성의 마커-vGlut1 (녹색)으로 CA1 지층 radiatum의-전체 두뇌에서 cryostat 컷 hippocampal 섹션에서 PFA에서 수정 되었습니다. 큰 구멍 및 불규칙 한, 이멀전의 vGlut1 얼룩이 지기의 존재 note 눈금 막대 = 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Representative Results
냅 손실 발생 초기에 광고 같은 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병2,,1112. 그러나, 이러한 적자를 기본 분자 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. Wnt 신호 결함 광고13,14,15,,1617와 연결 되었습니다. Wnts glycoproteins 분 비 되며, 시 냅 스 형성 및 시 냅 스 전송18,19,,2021의 변조에서 필수적인 역할. 최근에, 우리는 성숙한 신 경계10,22에 시 냅 스 유지 보수의 주요 레 귤 레이 터로 Wnts 식별. Wnt 신호 유전자 변형된 쥐의 해 마에서 시 냅 스에 영향을 정확 하 게 공부 우리 뇌 슬라이스 준비와 confocal 현미경 검사 법 평가 시 냅 스 수에 변화를의 이용을 했다. 우리 건강 한 조각 구조 했다 잘 식별 (그림 2A)을 보존. 또한, 시 냅 스 puncta의 선택은 신중 하 게 정의 되었다, 아마 집계 된 단백질 (그림 2B)를 대표 하는 대형 스테인드 개체의 제외와 함께. 이 표준 같은 엄격한 분석 매개 변수가 모든 이미지에 적용 되었습니다.
우리 secreted Wnt 적 Dkk1 성인의 식을 유도 하는 유전자 변형 모델 시스템 사용 항생물질에서 마우스 (iDkk1) 제어 ( 재료의 표참조)10,22. 우리는 성인 해 마에서 Wnt 신호 봉쇄 CA1 지층 radiatum 지역 (그림 3)에서 특별히 흥분 성의 냅 손실 유발 시연 했다. 그림 3A 에서는 흥분 성의 사전 및 포스트 시 냅 스 마커의 대표 confocal 이미지 (vGlut1 및 PSD-95, 각각) 2 주, 뿐만 아니라 그들의 각각 컨트롤 Dkk1을 표현 하는 iDkk1 마우스 hippocampal 조각에서 인수. 우리 Volocity 소프트웨어를 사용 하 여 이러한 이미지를 분석 하 고 다음 iDkk1 쥐의 해 마의 CA1 영역의 vGlut1 및 PSD-95-표시 된 puncta의 공동 지역화 하 여 계량 하는 흥분 성의 시 냅 스의 수에 있는 뜻깊은 감소를 보여주었다는 2 주 동안 Dkk1의 유도 (그림 3B, * p < 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 6 마우스 유전자 당)입니다. CA1 지층 radiatum 1000 µ m3 당 흥분 성의 냅 puncta 수는 300 iDkk1 쥐에서 통제 쥐에 있는 500에서 감소 되었다. 반면, 유도 Dkk1 식 억제 시 냅 스 (됨으로 사전 및 포스트 시 냅 스 마커 vGAT와 gephyrin, 사이 공동 지역화로 각각), 그림 4A-B 에서처럼 수 미치지 않았다 (p > 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 3 쥐 유전자 당)입니다.
중요 한 것은, 우리는 조각 및 동물 이러한 강력한 결과 생성 하는 데 필요한 적절 한 수를 추정 하는 통계 전력 분석 수행. R를 사용 하 여, 조건 당 약 35 조각 필요 했다 계산 (3 이미지 x 3 조각 x 6 동물 = 36) 큰 효과 크기를 감지 하 (f = 0.4) 80% 신뢰와 (전력 = 0.8) 차단 및 복제 일방통행 ANOVA에 설명 된 대로 단계에서 3.2.6.
그림 3: iDkk1 쥐에서 hippocampal 조각에 흥분 성의 시 냅 스의 손실. (A)는 CA1 지층 radiatum 쇼 흥분 성의 시 냅 스, vGlut1 및 PSD-95 (흰색 화살표) 사이 공동 지역화 식별의 대표적인 confocal 이미지. 하단 패널은 강조 표시 된 사각형의 높은 확대를 나타냅니다. 스케일 바 = 2 µ m. (B) 제어 및 iDkk1 사이 흥분 성의 시 냅 스의 비율 테이블의 자료 에 언급 한 소프트웨어를 사용 하 여 계량 했다 (* p < 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 6 마우스 유전자 당)입니다. 데이터는 대표 ± SEM. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 억제 시 냅 스는 iDkk1 마우스에서 hippocampal 조각에서 변경 되지 않습니다. (A) vGAT와 gephyrin (흰색 화살표) 사이 공동 지역화로 식별 되는 억제 시 냅 스의 CA1 지층 radiatum의 대표 confocal 이미지. 하단 패널은 강조 표시 된 사각형의 높은 확대를 나타냅니다. 스케일 바 = 2 µ m. (B) 제어 및 iDkk1 마우스, Volocity 소프트웨어를 사용 하 여 정량으로 사이 억제 시 냅 스의 백분율 (p > 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 3 쥐 유전자 당)입니다. 데이터는 대표 ± SEM. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 높은 자당 실제 구성 요소 | 농도 | 노트 |
| NaCl | 75 m m | |
| NaHCO3 | 25 m m | |
| KCl | 2.5 m m | |
| NaH2포4, 2 H2O | 1.25 m m | |
| Kynurenic 산 | 1.25 m m | |
| Pyruvic 산 | 2 mM | |
| EDTA | 0.1 m m | |
| CaCl2 | 1mm | 솔루션의 산소 후 추가 |
| MgCl2 | 4 m m | 솔루션의 산소 후 추가 |
| D-포도 당 | 25 m m | |
| 자당 | 100 m m | |
| 잠긴된 챔버 실제 구성 요소 | ||
| NaCl | 125 mM | |
| NaHCO3 | 25 m m | |
| KCl | 2.5 m m | |
| NaH2포4, 2 H2O | 1.25 m m | |
| CaCl2 | 1mm | 솔루션의 산소 후 추가 |
| MgCl2 |
표 1: 실제 구성입니다.
| 차단/permeabilizing 버퍼 | 농도 | 노트 |
| 당나귀 세럼 | 10% | |
| 트리톤-X | 0.50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | pH 7.4 | |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 27 mM | |
| NaH2포4 | 100 m m | |
| KH2포4 | 18 m m | |
| 4 %PFA/4% 자당 | pH 7.4 | |
| PBS | 1 x | 10 배 희석 |
| PFA | 1.33 M | |
| 자당 | 117 m m |
표 2: 완충기 immunofluorescent 얼룩에 사용입니다.
Discussion
시 냅 스 숫자의 정확한 평가 신경 과학의 분야에 필수적 이다. 여기, 우리는 모델 시스템으로 hippocampal 조각의 CA1 지층 radiatum 지역에서 시 냅 스의 밀도 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 기존의 방법에 관하여 의미는 단일 섹션 안에10여 Wnt 결핍 해 마에서 고 우리는 또한 시 냅 스 수를 평가의 효과에 우리의 최근 연구 기사에 보여 줍니다. 시 냅 스 손실의 크기는 단일 섹션 안에 두뇌 슬라이스 유사 방법 설명10. 따라서,이 정확성과 기술의 신뢰성을 보여 줍니다.
중요 한 것은, 단일 섹션 EM 및 immunostaining 시 냅 스, 여기에 제시의 한계 특정 뇌 영역에 대 한 절대 시 냅 스 수를 정확 하 게 예측 하는 무 능력 이다. 실제로, 그것은 중요 하다 어떤 글로벌 형태학 상 변화를 식별 하 총 볼륨에서 변경 시 냅 스 수 영향을 미칠 수입니다. 또 다른 한계는 특정 항 체는 얼룩이 그대로 뇌 영역, 부분적으로 시 냅 스 연결의 극단적인 조밀도 때문에 비효율적입니다. 우리는 높은 품질의 vGlut1 및 gephyrin 1 h, PFA (그림 2C)에 전체 뇌의 즉시 고정에 비해 최대이 슬라이스 준비와 후속 PFA 고정을 사용 하 여 얼룩을 경험 했다. 후자의 이멀전의 시 냅 스 얼룩, 조직에 있는 구멍으로 이끌어 냈다. 그럼에도 불구 하 고, vGlut1 항 체 침투는 여전히 두 방법 (몇 수십 미크론)에 제한 됩니다. 우리가이 한계를 극복 하지 않았다, 심지어 증가 항 체 외피, 하지만 항 체 침투를 제공 하는 몇 군데는 총 깊이 보다 큰, 최종 결과에 아무런 영향을 주지 해야한다. 또한, 특별 한 주의 얼룩을 전체 인수 스택을 통해도 취해야 한다.
우리의 연구에서 우리 싶 구별 억제 시 냅 스에서 흥분 성의. 따라서, 우리는 선택 vGlut1/PSD-95 및 vGAT/gephyrin, 각각이 단백질 높은 성인 마우스 해 마로 표현 하 고 각 시 냅 스 하위4,5에. 다른 흥분 성의 억제 시 냅 스 마커 각 각 시 냅 스, 대 한 AMPA와 NMDA 수용 체를 포함 하 여, 각 시 냅 스에 농축 하는 수용 체 등을 식별 하기 위해 사용 되었을 수 흥분 성의 및 GABAA 수용 체 억제 시 냅 스에 대 한. 다른 신경 전달 물질 또는 neuromodulators 또한 dopaminergic 시 냅 스가22대와 같이 특정 항 체를 사용할 수는 확인 우리의 프로토콜을 확인할 수 있습니다. 또한, 각 슬라이스 120 μ m의 두께 감소는 편도 같은 작은 뇌 구조에서 연구에 대 한 긴급 급성 조각으로 얻은 샘플의 낮은 수량 부분적으로 극복할 수 있다.
우리의 프로토콜의 미래 응용 프로그램 서로 다른 뇌 영역 및 장애의 연구에서 구현 될 수 있습니다. 예를 들어가 (파 킨 슨 병 관련 된 뇌의 영역)에서 vGlut2/PSD-95 또는 vGlut1/PSD-95의 조합을 사용할 수 피 질 또는 시상에서 오는 afferents에서 흥분 성의 시 냅 스를 각각22.
결론적으로, 우리 정의 시 냅 스를 사전 및 포스트 시 냅 스 마커를 사용 하 여 뇌 조직에 시 냅 스의 수를 검사 하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타났습니다. 중요 한 단계는 PFA, 충분 한 설치 매체의 응용 프로그램, 믿을 수 있는 항 체, 적절 한 이미지 수집 설정 및 엄격한 시 냅 스 puncta 검색을 사용 하 여 최대 1 h의 고정 시간 좋은 hippocampal 조각의 준비를 포함합니다. 궁극적으로,이 메서드는 상대적으로 빠른 이며 confocal 현미경에 액세스할 모든 실험실에 의해 쉽게 재현할 수입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome 신뢰, 그리고 파 킨 슨 병의 영국에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 양 요한 나 Buchler 공초점 이미지의 그녀의 공헌과 원고와 방법론에 그들의 건설적인 입력에 대 한 연구소의 구성원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
