Summary
Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.
Abstract
Beyinde, sinapslar arasındaki güç ve nöronal sinyal yaymak belirlenmesi, özel kavşaklar vardır. Sinapsların sayısı sıkıca geliştirme ve nöronal olgunlaşma sırasında düzenlenir. Önemlisi, açıkları sinaps sayısı için bilişsel işlev bozukluğu neden olabilir. Bu nedenle, sinaps sayısı değerlendirilmesi Nörobiyoloji ayrılmaz bir parçasıdır. Ancak, sinapslarda sağlam beynini küçük ve çok sık olarak, mutlak sayı değerlendirilmesi zordur. Bu iletişim kuralı kolayca tanımlamak ve sinapslarda ayirt mikroskobu kullanılarak Hipokampal kemirgen dilimleri içinde değerlendirmek için bir yöntem açıklanır. Bu yüksek kaliteli confocal mikroskobu görüntülerde sinapslarda Hipokampal dilimleri öncesi ve postsinaptik proteinlerin co yerelleştirme analiz ederek değerlendirmek için üç adım yordam içerir. Nasıl analiz gerçekleştirilir ve eksitatör ve inhibitör sinapslarda temsilcisi örnekler verir da açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı sinapslarda analiz için sağlam bir temel sağlar ve araştırma yapısı ve işlevi beynin herhangi bir araştırma için uygulanabilir.
Introduction
İnsan beyni yaklaşık 1014 sinapslarda oluşur. SYNAPSE numarası sıkı bir şekilde geliştirilmesi ve merkezi sinir sistemi (MSS) olgunlaşma sırasında düzenlenir. Geliştirme sinaps sayısı modüle synaptogenesis ve işlevsel nöron ağları oluşturmak için budama. Öğrenme ve hafıza synapse numarası ve gücü, sinaptik kullanılmasının muhtemelen ve depresyon1bilinen bir işlem Yönetmeliği tarafından desteklenir. Önemlisi, olgun sinapslarda istikrar nöronal ağ bağlantıları korumak için önemlidir. Ayrıca, açıkları synapse yoğunluğundaki nörodejeneratif koşulları Alzheimer hastalığı (Ah)2gibi erken aşamalarında bildirilmiştir. Bu nedenle, doğru bir şekilde belirlemek ve synapse numarası değerlendirmek için yetenek değerlendirme beyin fizyolojisi ve patoloji esastır.
Aşırı yoğunluk ve kompakt sinapslarda doğası yapmak o sağlam beyin alanlarda onların kesin sayısını tahmin etmek zor. MSS kimyasal sinapslar yakın appozisyon, bir sinaptik yarık3tarafından ayrılmış iki nöronlarda yapılır. Önceden sinaptik terminal veya sinaptik bouton, bir akson ortaya çıkar ve bir synapse özgüllük tanımlamak nörotransmitter içeren birikmiş veziküller oluşur — Yani, Glutamat ve gama - aminobütirikasit (GABA) için uyarıcı ve inhibitör synapses, anılan sıraya göre. Veziküller zarı veziküler taşıyıcılar için her nörotransmitter belirli içerir: Glutamat ve GABA veziküler GABA ışınlama (vGAT) için veziküler Glutamat ışınlama (vGlut). Post sinaptik terminal reseptörleri, adezyon molekülleri ve İskele proteinler de dahil olmak üzere birden çok proteinlerin oluşan son derece yoğun bir yapıdır. Eksitatör sinapslarda içinde post sinaptik yoğunluğu-95 protein (PSD-95) eksitatör N-methyl-D-aspartate(NMDA-) ve α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA-) reseptör modülasyonlu en bol iskele protein4olur işlev, ise inhibitör Post sinaptik terminal5inhibitör reseptörler gephyrin tutturur. Genel olarak, öncesi ve sonrası sinaptik bölmeleri protein özgüllük yardım farklılaşma ve synapse alt türlerinden tanımlaması.
Sinaps sayısı değerlendirilmesi farklı teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Elektron mikroskobu (EM), kompakt ve sağlam beyin alanlarda yüksek büyütme ve çözünürlük ile sinaps analizini sağlayan kullanımı yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu teknik çok pahalı, karmaşık numune hazırlama için ve çok zaman alıcıdır. Diğer teknikleri Çözümlemeyi gerçekleştirmek için özel ve pahalı donanımları gerektirir ki büyük bir dezavantajı vardır dizi tomografi6, kullanımını içerir. Ayrıca, transgenik hatları belirli sinaptik işaretleri ifade synapse sayı7, değerlendirilmesi yararlı, ancak yeni satırlar nesil kısıtlayıcı ve pahalı olabilir ve proteinlerin overexpression istenmeyen off-hedefini neden olabilir fenotipleri.
Bu sınırlamalar nedeniyle ve basitlik için pek çok araştırmacı sinaps sayısı toplam sinaptik protein düzeyleri incelenerek değerlendirin. Ancak, sinaps kaybı protein, önemli değişiklikler önce öncesi ya da sonrası sinaptik appozisyon, dağılma sinaptik proteinler hiçbir bozulma ile sinaptik remodeling sonuçlarında yapısal olarak görülebilir. Ayrıca, reklam, azaltılmış aşağıdaki synapse dejenerasyonu veya nöronal ölüm8,9sinaptik protein düzeyleri vardır. Toplam düzeyleri miktar bu ayrım etkinleştirmez. Böylece, beyin sinaps sayısında değerlendirilmesi için bir güvenilir, erişilebilir ve doğru yöntem geliştirmek için gerek yoktur.
Bu makalede, biz iyice tanımlamak ve Hipokampal kemirgen beyin dilimler halinde ayirt mikroskobu kullanılarak sinapslarda sayısını belirlemek nasıl açıklar. Sinapsların colocalization öncesi ve sonrası sinaptik işaretlerinin punctate bir dağıtım içinde görünen tarafından tanımlanır. Biz bu teknik Wnt sinyal beyinde incelenmesi yoluyla geçerliliğini göstermek. Wnts salgılanan proteinler önemli oluşumu, ortadan kaldırılması ve sinapslarda bakımı için önemlidir. Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), salgılanan antagonist vivo içinde indüksiyon Hipokampus10inhibitör sinapslarda koruyarak eksitatör sinaptik kaybına neden. Kimlik ve Dkk1 ifade bir yetişkin fareden Hipokampal dilimleri eksitatör ve inhibitör sinapslarda sayısını göstermek ve doku/kültür ürünleri diğer türleri için bu teknik Aktarılabilirliği vurgulayın.
Protocol
tüm fare ve sıçanlar kullanarak deneyler kabul edildi ve programı 1 yordamları kullanarak yapılan kapalı ev ofis hayvanlar (bilimsel yordamlar) Yasası 1986. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tarifi-ebilmek bulunmak Tablo 1 ' de.
1. akut Hipokampal dilim hazırlık
- fare beyin bir spatula kullanarak, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde kaldırmak ve keskin makas kafatası kesip içinde buz gibi yer, (% 95'i O 2, % 5 CO 2), oksijenli yüksek-Sükroz ACSF (~ 100 mL).
- Fare beyin üzerinde Petri kabına yerleştirin ve beyincik ve frontal korteks beynin orta hat aşağı hemisecting önce bir neşter ile küçük bir bölümünü kaldırmak.
- İki hemisferlerin sadece kesildi yanına koyun ve bir vibratome sahneye her hemisphere tutkallayın.
- 200-300 µm kalınlığında kesitler ilgi tam bölgesinin kesti. Hippocampus söz konusu olduğunda, yaklaşık 3-4 dilim başına Yarımküre alınmalıdır.
- Plastik Pasteur pipet kullanarak oksijenli (% 95'i O 2 ' de, % 5 CO 2) batık bir odasına dilimleri transfer ACSF. 30 dk. 34 ° C'de korumak
Not: Dilimleri tedavi rekombinant Dkk1 proteinler gibi etkin farmakolojik ajanlar ile bu aşamada dilim odasına aracıları ekleyerek gerçekleştirilebilir. - Dilimleri bir fırça kullanarak odasından kaldırın, onları 24-şey plaka yerleştirin ve düzeltmek için % 4 paraformaldehyde içinde 1 h 20 min (PFA)/4% Sükroz, oda sıcaklığında (RT).
Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek. - Yıkama dilimleri üç kez 1 X PBS (10 dk her).
Not: dilimleri 1 X PBS 4 ° C'de tutulur sürece protokol burada 1-2 gün boyunca, duraklatılmış.
2. Sinaptik işaretçileri için ayirt
Not: kullanılan tüm arabellekleri tarifleri Tablo 2 ' de bulunabilir.
- Dilim wells PBS engelleme/permeabilizing arabellek (Tablo 2) ile değiştirin ve RT için 4-6 h., kuluçkaya
- VGlut1 adlı bir 1:2,000 seyreltme engelleme/permeabilization tampon karşı poliklonal eskiden şiling şimdi domuz antikor sulandırmak.
Not: vGlut1 önceden sinaptik uyarıcı terminal görüntüleme için bir belirtecidir. Post sinaptik uyarıcı synapse kimlik için PSD-95 ve seyreltik 1:500 karşı poliklonal antikor aynı çözüm içinde kullanın. 300 µL en küçük bir birim her kuyuya kullanın. Hipokampüs anatomik konumunu belirlemek için de MAP2 veya tübülin gibi nöronal yapıyı tanımlayabilir bir antikor kullanın. İş dışarı doğru seçim (öncesi ve sonrası sinaptik) sinaptik işaretçileri için tüm birincil antikorlar konsantrasyonları ve taze engelleme/permeabilizing tampon seyreltik. - Birincil antikor çözüm dilimleri gecede (veya 1-2 gün) 4'te kuluçkaya ° C. kullanım titreyen bir platform ile beraber güçlü hareket.
- Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.
- Uygun ikincil antikorlar 1:500 engelleme arabelleği sulandırmak. Örneğin, vGlut1 eskiden şiling şimdi domuz antikor kullanırken, belirli bir fluorophore Birleşik eskiden şiling şimdi domuz bileşeni (Örneğin, eşek anti-guinea-pig) tanır ikincil bir antikor geçerlidir. PSD-95 tavşan antikor kullanırken, farklı bir özel fluorophore için Birleşik tavşan bileşeni (Örneğin, eşek Anti-tavşan) tanır ikincil bir antikor geçerlidir.
- İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi 2-3 h RT. dilimleri gelen ışık, korunmasını sağlamak için bu çözüm dilimleri kuluçkaya.
- Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.
- Dikkatle dilimleri bir fırça kullanarak 24-şey plaka kaldırmak ve eşit olarak önceden etiketli cam slaytlar koyun. Montaj orta her dilimin üzerine bir damla ekleyin ve sonra yavaşça dilimlerin üstünde bir cam coverslip yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Yeterli montaj orta (300-400 µL), kullanmak için yeterli bir miktar dilim kurumaya yol açabilir gibi dikkat.
- İçin en az 1-2 gün RT, Kuru ve ışıktan korunan slaytlar tutmak için bırakın.
- Kısa vadeli, ancak uzun süreli depolama için slaytları 4 ° C, depolama, -20 et ° C.
3. Confocal resim alma ve analiz
- confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak Imaging.
- Yansıması Hipokampus bölgesi tanımlamak (Örneğin, 1 ve 3 (CA1, CA3) cornu ammonis veya dentat gyrus (DG)) 10 x veya 20 x hedefi.
- Değişim 40 x veya 63 x petrol-daldırma amaç dilim anatomi sürekli neurites belirleyerek sağlamdır ve yapısı düzenlenmiş emin olmak için. MAP2 gibi nöronal bir işaretleyici ( şekil 1A) başvurmak.
- Daha sonra petrol-daldırma amaç x 60 geçin (NA ~1.3 - 1.4 =) ve en iyi sinyal ve kontrast elde etmek için her kanal ayarlarını. Bir yüksek- / düşük kontrast seçeneğini kullanarak herhangi bir piksel doygunluk kaçınmak için her lazer yoğunluğunu ayarlamak.
Not: Bu ayar kullanılan mikroskobunun bağlıdır ancak Şekil 2 ' de, şekil 3, kullanılan lazer güç ayarlarını için Malzemeler tablo bakın ve Şekil 4. En iyi sonuçlar için 1024 x 1024 piksel çözünürlük kullanın. Ayarları aynı deneyi farklı koşullar sabit kalması gerekir. Gerekirse ek zum yöneticilerini. - Boyama nerede bile derinliği değerlendirmek ve görüntü yığınları en az 8 eşit uzaklıkta edinme (250 nm) uçaklar. O zaman dilim başına ilgi aynı alan 3 bitişik temsilcisi görüntüleri yığınları almak.
Not: Derinlik bir dilimden diğerine farklı olabilir ama her zaman dilimi yüzeyinden yaklaşık 2-5 µm olmalıdır. - En az 3 dilim koşul başına ve tedavi grubu başına 6-8 hayvanlardan edinme yineleyin.
- Görüntü analizi.
Not: otomatik görüntü analiz yazılımı kullanın (bkz. Tablo malzeme). Diğerleri gibi ImageJ ücretsizdir, ancak Not bazı sistemleri bir lisans gerektirir. Kullanılan yazılım görüntüsü yığının tüm uçaklar dikkate alarak görüntüleri 3D analiz gerekir. Görüntü analizi ( şekil 1) kullanılan yazılım ayrıntıları için Malzemeler tablo bakın.- Tüm sinaptik puncta ve el ile en iyi duruma getirilmiş ve yazılım içinde seçili nöronal işaretleyicileri tanımlamak için
- kullanım yoğunluğu özel tabanlı eşik Protokolü [Bu içinde kullanılan belirli yazılımlar için Tablo malzemeleri görmek protokol].
Not: Yazılımın her fluorophore için bir minimum ve maksimum yoğunluk tanımlar ve yoğunluk tanınan her nesne için bir yüzdesi ilişkilendirir. Yoğunluk yüzdesi kullanılan fluorophore göre değişiklik gösterir Not ve sinaptik marker karşı antikor. - Sinaptik işaretler için boyut filtreleri olun (> 0.1µm 3 ve < 0.8µm 3) yazılım içinde seçilir ve görüntüye uygulanan. Seçili nesneleri değil örtüşen emin olmak için parametreleri ayarlayın. Çok büyük veya çok küçük sinaptik puncta dikkate alınması gereken herhangi bir nesne hariç (bkz. şekil 2B).
Not: en iyi duruma getirilmiş bir kez aynı eşik değerleri daha sonra verilen deney içinde tüm görüntüleri uygulanır. - Ölçmek ortalama sayısı, yoğunluk ve bireysel sinaptik puncta (öncesi ya da sonrası sinaptik) hacmi yazılım içinde seçilen en iyi duruma getirilmiş eşik protokolleri kullanarak. Resim alanı (kabaca 16,928 µm 3 ' te burada kullanılan sistem) hacmi puncta sayıya normalleştirmek. Sinaptik puncta yoğunluğu için başvuru nöronal marker yoğunluğunu normalleştirmek.
Not: Sinapslarda öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri arasındaki ortak yerelleştirme olarak tanımlanır. Bir kez öncesi ve sonrası sinaptik puncta h eşik iletişim kurallarıAve oldu kurulmuş, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sinaptik puncta co lokalizasyonu örtüşme 1 piksel veya daha fazla tek bir uçağı olarak belirlemelidir.
Not: istatistiksel analiz için tüm örnekleri kümesi normallik ve varyans, polimerlerin takip Lilliefords ve χ2 testleri, sırasıyla belirlenen onaylayın. Bir normal dağılım ve varyans polimerlerin gösteren örnekleri aşağıda açıklandığı gibi parametrik testler ile analiz edilmelidir. Örneğin, bir tek yönlü ANOVA kullanarak engelleme ve çoğaltma eksitatör sinaptik puncta analiz yapılmalıdır. Her bireysel deney bir taşı olarak düşünülmesi gereken; genellikle, çoğu üç bağımsız deneyler, her biri 1-3 fareler her durum.
- kullanım yoğunluğu özel tabanlı eşik Protokolü [Bu içinde kullanılan belirli yazılımlar için Tablo malzemeleri görmek protokol].
Resim 1: sinaptik puncta görüntü analizi kullanılarak analizi yazılım. (a) Screenshot yoğunluğu eşik Protokolü özelleştirme. PSD-95, seçili puncta tanımlı bir boyutu var örnek verilmiştir olduğunu > 0,1 µm 3 ve < 0.8 µm 3 ve mevcut simge durumuna küçültülmüş örtüşen nesneler. Görüntü gösterilen bir confocal uçak daha kolay görsel olarak sinaptik puncta ve doğru parametre seçimi etkinleştirmek olduğunu unutmayın. (B) (en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı yelpazesi aşağıdaki) yazılım çıktı analizi ekran görüntüsü. Ham sinaptik puncta numara ölçümleri birim üzerinde temel bir örnek. Bu değerler daha sonra bir elektronik tablo yazılımı ihraç edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: kalite kontrol sinaptik puncta dilim ve parametre ayarları. (A) temsilcisi confocal görüntüleri (40 x amaç) bölgenin ilgi: CA1 stratum radiatum (sr) ve tabaka oriens (yani) Hipokampal bir dilim tanımlanır MAP2 boyama tarafından. Ölçek çubuğu 2 µm. (B) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ve PSD-95 (kırmızı),-Hipokampal dilimleri üzerinden. Net öncesi ve sonrası sinaptik puncta tanımlaması unutmayın. Puncta 0.8 µm 3 daha büyük miktar (beyaz ok) hariç. Ölçek çubuğu 2 µm (C) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ile-tüm beyin üzerinden cryostat kesimli Hipokampal bölümlerden PFA içinde sabit. Büyük delikler ve düzensiz, olmalı vGlut1 boyama varlığını unutmayın. Ölçek çubuğu 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Representative Results
SYNAPSE kaybı oluşur AD gibi nörodejeneratif hastalıklarda erken ve Parkinson hastalığı2,11,12. Ancak, bu açıkları temel moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Wnt sinyal içinde eksiklikleri reklam13,14,15,16,17ile ilişkilendirilmiştir. Wnts salgılanan glikoproteinlerin ve synapse oluşumu ve sinaptik iletimi18,19,20,21modülasyon önemli bir rol oynamak. Son zamanlarda, Wnts olgun sinir sistemi10,22sinaptik bakım anahtar düzenleyiciler olarak tanımlanan. Doğru bir şekilde genetik fareler Hipokampus sinapslarda üzerinde Wnt sinyal etkisi çalışma için biz bir beyin dilim hazırlık ve confocal mikroskobu synapse numarasındaki değişiklik değerlendirmek için kullandı. Biz sağlıklı dilimleri yapısı iyi tespit (şekil 2A) korunmuş. Ayrıca, sinaptik puncta yelpazesi dikkatle, muhtemelen toplanan proteinler (şekil 2B) temsil eden büyük lekeli nesneleri dışlama ile tanımlanmıştır. Bu ölçüt tüm görüntülerle aynı sıkı analiz parametrelerini uygulandı.
Biz yetişkin salgılanan Wnt antagonisti Dkk1 ifadesi indükler bir transgenik modeli sistemi kullanılan fare (iDkk1) tetrasiklin altında kontrol (bakınız Tablo reçetesi)10,22. Biz yetişkin Hipokampus Wnt sinyal abluka eksitatör synapse kaybı özellikle bölgede CA1 stratum radiatum (şekil 3) tetikler gösterdi. Şekil 3A temsilcisi confocal görüntüleri eksitatör öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri gösterilmektedir (vGlut1 ve PSD-95, sırasıyla) onların ilgili denetimlerin yanı sıra iki hafta için Dkk1 ifade iDkk1 farelerin Hipokampal dilimleri üzerinden satın aldı. Biz bu görüntüleri Volocity yazılım kullanarak analiz ve vGlut1 ve PSD-95-etiketli puncta takip iDkk1 farelerin Hipokampus CA1 bölgesindeki co yerelleştirme tarafından sayısal eksitatör sinapslarda sayısı önemli bir azalma gösterdi iki haftadır Dkk1, indüksiyon (şekil 3B, * p < 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). CA1 stratum radiatum eksitatör sinaps puncta numarası 1000 µm3 başına 500 denetim farelerde iDkk1 farelerde 300'e düşürüldü. Buna ek olarak, indüklenen Dkk1 ifade inhibitör sinapslarda (öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri vGAT ve gephyrin, arasında ortak yerelleştirme sırasıyla, olarak tanımlanır) şekil 4A-B gösterilen sayısını etkilemez mi (p > 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına).
Önemlisi, dilimleri ve hayvanlar sağlam bu sonuçlar üretmek için gereken uygun sayısını tahmin etmek için bir istatistiksel güç analizi yapılır. R kullanarak, biz koşul başına yaklaşık olarak 35 dilimleri ihtiyaç vardı hesaplanır (3 resim x 3 dilim x 6 hayvanlar 36 =) bir büyük etkisi boyutu algılamak için (f = 0,4) % 80 güven ile (güç 0.8 =) engelleme ve çoğaltma ile tek yönlü ANOVA içinde açıklandığı gibi adım 3.2.6.
Şekil 3: iDkk1 fareler gelen Hipokampal dilimleri içinde eksitatör sinapslarda kaybı. VGlut1 ve PSD-95 (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum gösteri eksitatör sinapslarda,(a)temsilcisi confocal görüntüleri. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm denetimi ve iDkk1 arasındaki eksitatör sinapslarda yüzdesi sayısal Malzemeler tablo içinde belirtilen yazılım kullanarak. (B) = (* p < 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: inhibitör sinapslarda iDkk1 fareler Hipokampal dilimler halinde değişmeden. (A)temsilcisi confocal görüntülerini inhibitör sinapslarda vGAT ve gephyrin (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm. (B) = Volocity yazılımını kullanarak sayısal olarak kontrol ve iDkk1 fareler arasında inhibitör sinapslarda yüzdesi (p > 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Yüksek Sükroz ACSF bileşenleri | Konsantrasyon | Notlar |
| NaCl | 75 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| Kynurenic asit | 1,25 mM | |
| Pirüvik asit | 2 mM | |
| EDTA | 0,1 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Çözüm oxygenation sonra Ekle |
| MgCl2 | 4 mM | Çözüm oxygenation sonra Ekle |
| D-glikoz | 25 mM | |
| Sükroz | 100 mM | |
| Batık odası ACSF bileşenleri | ||
| NaCl | 125 mM | |
| NaHCO3 | 25 mM | |
| KCl | 2.5 mM | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 mM | |
| CaCl2 | 1 mM | Çözüm oxygenation sonra Ekle |
| MgCl2 |
Tablo 1: ACSF kompozisyon.
| Arabellek engelleme/permeabilizing | Konsantrasyon | Notlar |
| Eşek serum | % 10 | |
| Triton-X | % 0.50 | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | pH 7,4 için | |
| NaCl | 1.37 M | |
| KCl | 27 mM | |
| NaH2PO4 | 100 mM | |
| KH2PO4 | 18 mM | |
| %4 PFA/4% sükroz | pH 7,4 için | |
| PBS | 1 x | 10 x sulandırmak |
| İNGİLTERE'DE YILIN | 1.33 M | |
| Sükroz | 117 mM |
Tablo 2: immünfloresan boyama için kullanılan arabellekleri.
Discussion
Sinaps sayısı kesin değerlendirilmesi Nörolojik alana esastır. İşte, sinapslarda Hipokampal dilimleri CA1 stratum radiatum bölgede yoğunluk bir modeli sistem olarak değerlendirileceği nasıl göstermektedir. Mevcut yöntemler açısından önemi bizim son araştırma makalesinde Wnt eksikliği oluşur ve nerede Ayrıca synapse sayı değerlendirilip etkisi tek bölüm EM10tarafından gösterilmiştir. Sinaps zarar büyüklüğü tek bölüm EM ve beyin dilimli arasında benzer yöntem açıklanan burada10. Böylece, bu bulgu doğruluk ve güvenilirlik-in teknik gösterir.
Önemlisi, bir tek-bölüm EM ve burada anlatılan gibi immunostaining sinapslar, belirli beyin bölgesi için mutlak synapse numarası doğru tahmin yetersizlik kısıtlamasıdır. Gerçekten de, Toplam hacim değişiklikleri sinaptik numarası etkileyebilir gibi Genel morfolojik değişiklikleri belirlemek önemlidir. Belirli antikor olduğu gibi beyin bölgeleri, sinaptik bağlantıları aşırı yoğunluk nedeniyle kısmen boyama daha az verimli başka bir kısıtlamadır. Biz vGlut1 ve gephyrin en fazla 1 h, hemen tüm beyin PFA (şekil 2C) ve fiksasyonu ile karşılaştırıldığında bu dilim hazırlık ve sonraki PFA fiksasyon kullanarak daha yüksek kalitede boyama deneyimli. İkincisi olmalı sinaptik, delik doku ile boyama için yol açtı. Yine de, vGlut1 antikor penetrasyon hala her iki yöntem (mikron onlarca birkaç) sınırlıdır. Biz bu sınırlamayı aşmak değil, bile ile artan antikor kuluçka ama antikor penetrasyon sağlayarak yansıma toplam derinlik büyük, sonuç üzerinde herhangi bir etkisi olmalı. Ayrıca, özel boyama bile tüm alınan yığını olması için özen gösterilmelidir.
Bizim çalışmada, ayırt etmek inhibitör sinapslarda gelen eksitatör istedik. Bu proteinler yüksek yetişkin fare Hipokampus ifade edilir ve her synapse alt türü4,5' e özgü sonuç olarak, biz vGlut1/PSD-95 ve vGAT/gephyrin, sırasıyla, seçti. Diğer eksitatör ve inhibitör sinaptik işaretleri NMDA ve AMPA reseptör için de dahil olmak üzere her sinaps, zenginleştirilmiş reseptörleri gibi ilgili her synapse tanımlamak için kullanılan eksitatör ve inhibitör sinapslarda GABAA reseptörleri. Diğer nörotransmitter veya neuromodulators da belirli antikor dopaminerjik sinapslarda striatum22için gösterildiği gibi kullanılabilir, sağlamak bizim protokol ile tespit edilebilir. Ayrıca, 120 µm için her dilim kalınlığı azaltmak kısmen düşük miktar olan amigdala gibi küçük beyin yapıları araştırmaları zorunludur akut dilimleri ile elde edilen örneklerin üstesinden gelebilir.
Bizim Protokolü'nün gelecekteki uygulamalar farklı beyin bölgeleri ve bozuklukları çalışmada uygulamaya olabilir. Örneğin, striatum (Parkinson hastalığı ile ilişkili beyin bölgesi), vGlut2/PSD-95 veya vGlut1/PSD-95 afferents korteks veya talamus gelen gelen eksitatör sinapslarda arasında ayırt etmek için kullanılabilir, sırasıyla22.
Sonuç olarak, biz bir synapse tanımlamak için öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri kullanarak beyin dokularında sinapslarda sayısını incelemek için güvenilir bir yöntem göstermiştir. Kritik adımlar iyi Hipokampal dilimler, en fazla 1 saat PFA, yeterli montaj orta uygulanması, güvenilir antikor, uygun görüntü alma ayarları ve sıkı sinaptik puncta algılama kullanımı bir fiksasyon zaman hazırlanması içerir. Sonuçta, bu yöntem nispeten hızlı ve confocal mikroskop erişiminiz olan herhangi bir laboratuar tarafından kolayca tekrarlanabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser MRC, AB FP7, ARUK, Wellcome Trust ve Parkinson İngiltere tarafından desteklenmiştir. Biz de onun katkı confocal görüntülerin ve el yazması ve metodoloji yapıcı kendi giriş için laboratuara üyeleri için Bayan Johanna Buchler teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
