Summary
Detta är ett protokoll för att härma Alzheimers sjukdom hos råttor genom utvärdering av rumsliga minnesförsämring, neuronala patologiska förändringar, neuronala beta-amyloid protein (Aβ) börda, och fibrillnystan aggregering, inducerad genom injektion av Aβ25-35 i kombination med aluminium klorid och rekombinant humant omvandla tillväxtfaktor-β1.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en oåterkallelig, progressiv hjärnsjukdom som sakta förstör minne och åtföljs av neuron förlust och struktur. Med ökningen av AD patienter världen över blivit av patologi och behandling av sjukdomen fokus i den internationella läkemedelsindustrin. Således, inrättandet av den djurmodell att efterlikna AD i laboratoriet är av stor betydelse.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att skapa en härma av AD i en råtta djur modell men intracerebroventricular injektion av amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombinerat med aluminium klorid (AlCl3) och anterodorsal thalamic nucleus injektion av rekombinant humant omvandla tillväxtfaktor-β1 (RHTGF-β1) till råttor. De relaterade markörerna för AD mättes, inklusive: rumsliga minne, neuronala struktur och underkonstruktion, neuronala Aβ och neurofibrillära trassel (NFT) produktion. Denna råtta modell visar nedsatt rumsliga minne, neuronala struktur och underkonstruktion patologiska förändringar, neuron intracellulära Aβ börda och NFT aggregering, och ger en nära härma av neuronala struktur och funktion sjukdomen med kliniska AD patienter. Således, den presenterade AD råtta modelprovides en värdefull i vivo -verktyg för att utforska nervcellernas funktion, neuronala patologi och drogkontroll av AD.
Introduction
Det är väl känt att AD är en kronisk och progressiv neurodegenerativ sjukdom, med gradvis minnesförlust som huvudsakliga kliniska syndrom. I allmän patologi finns det nervös vävnadsatrofi, neuron och synapsen förlust, samt neuronala subcellulär struktur och funktion störningar, som är alla involverade i utveckling och klinisk manifestation av AD1,2. Det har rapporterats att när djuren var intracerebroventricularly injiceras med Aβ, vissa neurotoxiska händelser inträffar i hjärnan som involverar neuron förlust, kalcium homeostasen avbrott, neuron apoptos och reaktivt syre arter överproduktion3. Men flera faktorer är inblandade i patogenesen av AD och således är det nödvändigt att upprätta en bättre modell av AD.
Ett detaljerat protokoll beskrivs här för att upprätta en i vivo härma annons modell genom intracerebroventricular injektion av Aβ25-35 och AlCl3, kombinerat med anterodorsal thalamic nucleus injektion av RHTGF-β1 till råttor. Denna råtta modelhighly härmar mänskliga nervcellernas funktion och histopathogenesis av annonsen, inklusive nedsatt minne, neuron förlust och struktur skador, apoptos, intracellulära Aβ börda och NFT aggregering4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 förhindrar att den deponerade Aβ bildar lösliga Aβ, och den RHTGF-β1 kan främja deponerade Aβ produktion och underlätta AD förekomst10. Denna attack från flera faktorer till neuron är enligt flera patogenesen av AD.
Hela experimentet spännas 86 dagar: figur 1 visar en tidslinje av experimentell design, med tiden peka av djur kirurgi, djurmodell screening, djur rumsliga minnestest och provberedning. Den första dagen i drift, var RHTGF-β1 microinjected in i anterodorsal thalamic cellkärnan. Den andra dagen av operation, var Aβ25-35 och AlCl3 microinjected i den laterala ventrikeln dagligen för 14 dagar på morgonen och 5 dagar på eftermiddagen, respektive. Alla råttor tilläts att återvinna för 45 dagar efter operationen. Morris vatten labyrinten användes till skärmen för framgångsrika modell råttor med nedsatt minne och att bedöma råttornas rumsliga minne. Råttorna genomgick 4 dagar av vatten labyrint utbildning med 2 prövningar per dag, och på dag 4 av utbildning, råttorna utvärderades med Morris vatten labyrint prestanda för försämrat minne. Alla råttor fortsatte att matas 37 dagar efter djurmodell screening. Det rumsliga minnet av råttor testades i Morris vatten labyrinten över 7 på varandra följande dagar, dag 79 till dag 85 efter operationen. Alla råttor offrades genom halshuggning på dag 86 för hjärnan provberedning.
Figur 1. Tidslinje av experimentell design. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Detta förfarande var i enlighet med föreskrifter av experimentella djur Administration utfärdat av den statliga kommittén för vetenskap och teknik i Kina den 31 okt 198811. Forskare bör följa de riktlinjer som fastställts och godkänts av deras institutionella och nationella djur reglerande organisationer.
Obs: Djur och regents: fyra månader gamla manliga Sprague-Dawley-råttor (300-350 g) levererades för detta experiment. Alla råttor var inrymt i grupper (fyra eller fem per bur) vid en temperatur på 23 ± 1 ° C med en 12-h ljus-mörker cykel. Mat och vatten inte fanns tillgängliga ad libitum. Råttorna var acklimatiserad till inhysa villkorar för 7 dagar innan förfarandet utfördes. Aβ25-35 var upplöst i 1% DMSO saltlösning till 1 mg/mL, och sonicated för 5 min i en ultraljud oscillator tills helt upplöst. AlCl3 och RHTGF-β1 upplöstes i saltlösning på 1% och 0,1 mg/mL, respektive. Kongorött, silvernitrat och andra kemikalier av analyskvalitet och köptes från vanliga kommersiella källor.
1. kirurgiska ingrepp
Obs: 20 manliga Sprague-Dawley-råttor var microinjected med blandats Aβ in i laterala ventrikeln och anterodorsal thalamic nucleus, och betecknas som den blandats Aβ-behandlade gruppen. En annan 20 råttor utsattes för samma operation men fick 0,1% DMSO saltlösning Mikroskop, och som betecknas som den simulerade manövrerade.
- Bedöva råttorna med 100% isofluran vid inandning och sedan hålla på en hjärna Stereotaxic apparatur.
- Raka pälsen på hjässan av huvudet med kirurgisk sax och desinficera med iodophor. Täck sedan, disponibel kirurgiska handduk på huvudet.
- Gör ett snitt på huvudet huden längs de median längsgående calvaria med kirurgisk bistouries och sax.
- Separera den subkutana vävnaden och fascia, torka den skalle calvarium med en steril torr bomull för att stoppa blödningen och markerar bregma med en tuschpenna.
- Hänvisa till råtta hjärnan Stereotaxic karta12; med tanke på bregma som ursprung, markera de tre punkterna, anterodorsal thalamic kärnan (ad) (posterior (P): 2,0 mm till bregma; lateralt (L): 1,4 mm till mittlinjen) för injicera RHTGF-β1 och en fästskruv, den laterala ventrikeln (LV) område ( posterior (P): 0.8 mm till bregma; lateral (L): 2,0 mm med mittlinjen) för att injicera Aβ25-35 och AlCl3, och den andra skruven fastställande plats (främre (F): 2,0 mm till bregma; lateralt (L): 1,5 mm med mittlinjen).
- Försiktigt borra tre hål 1 mm diameter med en flexibel ben borr, utsedda på ovanstående tre punkter av skallen (1.5. steg). Skruva inte djupare än nödvändigt för att undvika stickande hjärnvävnaden.
- Stoppa blödningen och rensa skallen ytan upprepade gånger med steril torr bomull.
- Infoga en nål kopplad till pumpen mikroinjektion, till hjärnan på 4,6 mm djup och försiktigt injicera 1 μl RHTGF-β1 (10 ng) till området ad. Bo nål 2 min efter injektion och långsamt dra ut nålen (kompletterande fil 1).
- Fixa två skruvar in i skallen, designerat i ad och den andra skruven fastställande plats av skallen (som designerades på 1.5. steg) med en liten skruvmejsel. Skruva inte djupare än nödvändigt för att undvika stickande hjärnvävnaden.
- Montera kanyl implantation systemet (Supplemental fil 2), infoga overksam kanylen i guide kanylen efter desinfektion med högt tryck.
- Infoga den rostfria slangar guide kanylen till hjärnan på 4,6 mm i LV område genom skallen hålet (kompletterande fil 3), med hjälp av kanyl innehavaren av råttornas stereotaxic apparater.
- Blanda protes basmaterialet med protes bas vatten vid baserat på 1,5 g per 1 mL, lägga pastan för att täcka guide kanyl plast sockeln och två skruvar för att immobilisera guide kanylen och tills locket hela huden snittet för att undvika hudinfektion.
- På operationsdagen 2, bedöva råttorna med isofluran inandning med hjälp av de små djur anestesi maskin. Dra ut dummy kanylen, infoga interna kanylen i guide kanylen och skruva fästskruven för att immobilisera inre kanylen.
- Ange den polyeten rör som länkar Mikroskop pumpen till interna kanylen och reglera den injektion-hastigheten till 1 μL/min. Microinject den Aβ25-35 eller AlCl3 till LV.
- Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 dagligen i 14 dagar på morgonen och 3 μL AlCl3 (1%) dagligen i 5 dagar på eftermiddagen under isofluran anestesi.
- Vänta 5 min efter avslutad injektion, försiktigt dra ut den inre kanylen och stick overksam kanylen igen i guide kanylen.
- Demontera kanyl implantation systemet på dag 15 post kirurgi (som motsvarar till den sista injektion dag Aβ25-35). Försiktigt ta bort protesen bas material fast med kirurgisk sax och pincett, skruva loss de två skruvarna, dra ut kanylen guide och desinficera såret med betadine. Fylla i hålet i skallen med bencement och suturera huden med en enkel avbrutna suturen metod.
- Utföra samma operation med gruppen sham manövrerade och microinject 0,1% DMSO saltlösning.
-
Postoperativ omvårdnad
- Hus 2 råttor per bur efter operation och ge mat för 30 dagar.
Obs: 18 råttor i simulerade manövrerade grupp överlevde (90% andelen framgångsrika driften) och 19 råttor i blandats-behandlade Aβ gruppen överlevde (95% framgång drift).
- Hus 2 råttor per bur efter operation och ge mat för 30 dagar.
2. screening för framgångsrika modell råttor och bedömning av rumsliga minne med Morris vatten labyrinten
-
Morris vatten labyrint
Obs: Morris vatten labyrinten användes för att bedöma råtta rumsliga minne13. Morris vatten labyrinten är en rostfritt stål cirkulär tank med diameter 120 cm och 50 cm djup. Vatten labyrint testet utfördes, baserat på ”gold standards” paradigmet beskrivs i Behavioral Neuroscience av J. Nunez14.- Svartmåla poolvattnet med flera droppar karamellfärg.
- Upprätthålla djup vatten på 31,5 cm och en temperatur på 23 ± 1 ° C.
- Ange en 1,5 cm runda transparent plexiglas plattform under vattenytan.
- Gällande att alla rumsliga signaler runt i vatten labyrinten är oföränderlig under vatten labyrint provningarna.
- Dela upp poolen i 4 lika kvadranter av imaginära linjer för beskrivande datainsamling.
- Placera den dolda plattformen i första kvadranten (Q1) av vatten labyrint.
- Fånga råtta simning beteenden (mätt som latens, bana eller korsning nummer) via en videokamera, över vatten labyrinten kopplad till en dator-baserad grafik analytiska programvara.
-
Screening för framgångsrika modell råttor att den blandats Aβ-behandlade gruppen
- På operationsdagen 45, utföra Morris vatten labyrinten utbildning 4 dagar skärm för framgångsrika modell råttor med nedsatt minne och samla screening förhållandet (SR).
Obs: SR definieras som den genomsnittliga svarstiden av varje blandats Aβ-behandlade råttor och den simulerade manövrerade gruppen råttor att hitta dolda plattformen under vatten ytan på dag 4 av vatten labyrint utbildning. ”A” är genomsnittlig fördröjning av varje blandats Aβ-behandlade råttor att hitta dolda plattformen och ”B” är genomsnittlig fördröjning av den simulerade manövrerade gruppen råttor att hitta dolda plattformen, på dag 4 av vatten labyrint utbildning, i följande ekvation:
När SR var större än 0,2 för en blandats Aβ-behandlade råttan, betraktades råttan som en framgångsrik modell råtta med försämrat minne blandats Aβ-behandlade råtta15. Intraday minne var beräknat till uppgifter om 2 prövningar av det genomsnittliga värdet av råttor att hitta dolda plattformen. Processen för Morris vatten labyrint testet var konstruerade så att råttorna tilläts att simma i den labyrint vattentank och söka efter de dolda plattformen inom 60 s. Om en råtta inte fick reda på den dolda plattformen inom 60 s, då råttan sattes på plattformen med handen av försöksledaren. När en råtta nått på dolda plattformen (självständigt eller assisterad), råtta var låt stanna där för 20 s. Sedan råttan var bort från tanken och får en fysisk återhämtning för 10 s mellan de 2 prövningarna.
- På operationsdagen 45, utföra Morris vatten labyrinten utbildning 4 dagar skärm för framgångsrika modell råttor med nedsatt minne och samla screening förhållandet (SR).
3. neuron undersökning
- På 86 inlägg dagkirurgi, under isofluran anestesi, avliva råttorna genom halshuggning (figur 1).
- Sätter hjärnan på is och försiktigt separera de två hjärnhalvorna på raphe. Ta vänster hjärnhalva av optic chiasma och fix i 4% formaldehyd för ljus microcopy observation av neuron hematoxylin och eosin (han), kongorött eller silvernitrat fläckar (se avsnitt 4-6). Fixa det högra hjärnhalva hippocampus CA1 området i 2,5% glutaraldehyd för elektron microcopy observation (avsnitt 7).
- Bearbeta hjärnan för ljus/elektron microcopy provpreparering, som tidigare beskrivits16,17.
4. neuron han färgning
- Deparaffinize varje bild (20 min varje) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% och 70% alkohol) till destillerat vatten i dragskåp.
- Fläcken för 3 min med hematoxylin (0,5% w/v), och skölj sedan med kranvatten för att ta bort den obundna färgämnen från bilder.
- Skölj med 0,1% saltsyra i alkohol för 1 s för att ta bort färgen på ofärgade atomkärnor.
- Uppslukas av 0,5% ammoniaklösning i 2 min tills den bakgrund vänder ljus blå.
- Fläcken för 1 min med 1% eosin.
- Torka för 5 min med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% och 100% alkohol).
- Rensa i xylen och montera med hartsartade monteringsmedium.
- Observera och räkna de levande nervcellerna han fläcken per 0,125 mm i de mittersta CA1 av hippocampus och 0.0352 mm2 i hjärnbarken vid 400 x förstoring med ett optiskt mikroskop av en person som blinda för experimentell design.
5. kongorött färgning för testmetoder Neuron Aβ börda
- Deparaffinize varje bild (20 min) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% och 70% alkohol) till destillerat vatten i dragskåp.
- Fläcken i 20 min med kongorött arbetar lösning (0,5 g kongorött, metylalkohol 80 mL, 20 mL glycerinum).
- Skölj med destillerat vatten i 5 min.
- Differentiera snabbt med alkalisk 80% alkohollösning (0,2 g alkohol/100 mL kaliumhydroxid) för 3 s.
- Skölj två gånger, var och en för 5 min med destillerat vatten.
- Motfärg i Gills hematoxylin för 3 min.
- Skölj i vatten i 2 min.
- Doppa i ammoniak vatten (tillsätt några droppar ammoniumhydroxid till kranvatten och blanda väl) för 30 s eller tills avsnitten blir blå.
- Skölj i vatten i 5 min.
- Torka med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% och 100% alkohol).
- Rensa i xylen och montera med hartsartade monteringsmedium.
- Observera och räkna cellerna färgas med kongorött vid 400 x förstoring med ett optiskt mikroskop av en person som blinda för experimentell design.
6. silvernitrat färgning för testmetoder Neuron NFT bildandet
- Deparaffinize varje bild (20 min) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% och 70% alkohol) till destillerat vatten i dragskåp.
- Uppslukas av 20% lösning av silvernitrat och tak agent i 20 min i mörker.
- Tvätta i destillerat vatten två gånger, 5 min varje gång.
- Uppslukas av silver ammoniaklösning. Släppa ammoniaklösning i 20% lösning av silvernitrat och Lägg tills lösningen går från grumlighet till förtydligande. Samtidigt rör om lösningen med en glasstav för 15 min och sedan sätta i den 1% utspädd ammoniumhydroxid i 2 min.
- Placera bilden i utveckla fungerande lösningen för 3-7 min tills det svarta blocket i axonet kan observeras.
- Fördjupa i 0,1% utspädd ammoniaklösning för 1 min och skölj sedan med vatten för 1 min.
- Kasta med 5% natrium tiosulfat i 2 min och skölj sedan med vatten i 5 min.
- Torka med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% och 100% alkohol).
- Rensa i xylen och montera med hartsartade monteringsmedium.
- Observera och registrera cellen för silvernitrat fläcken vid 400 x förstoring med ett optiskt mikroskop av en person som blinda för experimentell design.
7. Hippocampus Neuron ultrastruktur mätning
- Skär råtta hippocampus CA1 i flera tärningar (1 x 1 x 1 mm3) och placera i 2,5% glutaraldehyd för 2 h vid 4 ° C.
- Skölj kuber med PBS tre gånger (pH 7,2, 10 min för varje gång).
- Fixa kuber i 1% osmic syra för 2 h vid 4 ° C.
- Skölj kuber i dubbel destillerat vatten 3 x (10 min för varje gång).
- Torka med gradient alkohol 50%, 70% och 90% (10 min för varje), 100% två gånger (15 min för varje gång).
- Ersätt med propylenoxid två gånger (15 min för varje gång), propylen oxid: kåda på 1:1 (60 min för varje gång vid rumstemperatur) och propylen oxid: harts 1:4 (60 min för varje gång vid rumstemperatur). Blötlägg i harts (120 min, vid rumstemperatur).
- Bädda in i EPON 812 och polymerisera (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
- Skär i semithin avsnitt (1 µm), färga av metylenblått och lokalisera under mikroskopet.
- Fläcken avsnitten ultratunna (50 nm) med uranyl-o-acetat och leda citrat.
- Pröva under en JEM-1400 elektronmikroskop och samla bilder.
Representative Results
Alla data presenteras som medelvärde ± SEM. SAS/STAT paketet användes för att beräkna den statistiska analysen. Grupp skillnaderna i latens att hitta dolda plattformen i minne förvärv och nytt lärande minnestest analyserades av tvåvägs variansanalys (ANOVA) med upprepad åtgärder. Grupp skillnaderna i sonden rättegången och antalet neuroner analyserades av envägs ANOVA följt av Duncans multipel-range test. p < 0.05 ansågs statistiskt signifikant18.
Screening för framgångsrika modell råttor med minnesförsämring för den blandats Aβ-behandlade gruppen:
Resultaten i figur 2AA1 och 2AA2 visar att den simulerade manövrerade gruppen råttor alltid simmade fritt och blandats Aβ-behandlade gruppen råttorna (figur 2AB1, AB2) alltid simmade runt pool omkretsen i adaptiv simning i den Morris vatten labyrint. Under de fyra dagarna av screening för minne nedskrivningar modell råtta hade alla råttor successivt minskande gånger att hitta dolda plattformen (latency) (figur 2B). Dag 4 Morris vatten labyrint utbildning, om SR var mer än 0,2 (som baserades på fördröjning av varje blandats Aβ-behandlade råttor och den simulerade manövrerade gruppen råttor för att hitta dolda plattformen) och sedan blandats Aβ-behandlade råtta ansågs en framgångsrik modellen råtta med försämrat minne. 18 av de 19 råttor (94.70%) som överlevde operationen gått den framgångsrika modell screening. 6 råttor av varje grupp valdes för följande experiment.
Figur 2 . Screening för framgångsrika modell råttor med minnesnedsättning i den blandats Aβ-behandlade gruppen använda Morris vatten labyrint utbildning. (A), adaptiv simning banan för råttor i Morris vatten labyrinten. (AA1–AA2) Simulerade manövrerade grupp; (AB1–AB2) Blandats Aβ-behandlade gruppen. (B) Genomsnittlig latens att hitta dolda plattformen för 4 dagar prövningens screening i Morris vattnet labyrint utbildning för sham manövrerade och den blandats Aβ-behandlade gruppen. Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ orsakade råtta minne förvärv och minne åter lära funktionsnedsättningar:
Rat minne förvärvet bestämdes av positionering navigering rättegången dag 1 och 2 Morris vatten labyrint test, vilket motsvarade 79 och 80 inlägg dagkirurgi. Under de 2 dagarna av förvärvet minne rättegång uppvisade alla råttor gradvis minskande latens för att hitta dolda plattformen. I figur 3visas latenser i blandats Aβ-behandlade gruppen för att hitta dolda plattformen var 360.67% 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) större än de i gruppen sham manövrerade på dag 1 och 2 i Morris vattnet labyrint test, respektive. Detta indikerar att den blandats Aβ kan inducera förvärv minnesförsämring hos råttor.
Den råtta minne åter lära var analyseras av återföringen rättegång på dag 4, 5 och 6 Morris vatten labyrint test, som motsvarade till 82, 83 och 84 inlägg dagkirurgi. I figur 3visas latenser i blandats Aβ-behandlade gruppen för att hitta dolda plattformen var 306.20%, 650.16% och 936.92% längre tid än de i gruppen sham manövrerade (F (1, 5) = 138.76, p < 0,01). Detta visar att den blandats Aβ kan höja minnet åter inlärning leverfunktion hos råttor (figur 3).
Figur 3 . Blandats Aβ orsakade råtta minne förvärv och minne åter lära nedskrivningar. Positionering navigering rättegången användes för att utvärdera minne förvärv av 2 på varandra följande dagar simning prestation på dag 1 och 2 i Morris vatten labyrint test. Dessa utfördes på 79 och 80 inlägg dagkirurgi. Återföringen rättegång användes för att utvärdera minne åter lära genom 3 dagar simning poäng på dag 4, 5 och 6 i Morris vatten labyrint test, som motsvarade till dag 82, 83 och 84 i operationen. Linje graf tomterna visar Genomsnittlig latens att hitta dolda plattformen för varje grupp på dag 1, 2, 4, 5 och 6 i Morris vatten labyrint test. Data analyserades av tvåvägs ANOVA (dag x grupp) med upprepade mätningar. Menar ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, jämfört med Sham manövrerade. Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ orsakade råtta försämrat minne lagring:
Rat minne lagring mättes genom sonden rättegången dag 3 Morris vatten labyrint test, som motsvarade till dagkirurgi 81 inlägg. I 1 dag minne lagring rättegång, den blandats Aβ-behandlade gruppen tog mindre simning tid, simning avstånd och passerar nummer i Q1 inom 60 s, som motsvarade till 32.14%, 30.11% och 78.95% (p < 0,01), respektive, än den simulerade manövrerade grupp (figur 4A, 4B). Dessa resultat visar att den blandats Aβ kan producera försämrat minne lagring hos råttor.
Figur 4 . Blandats Aβ produceras råtta försämrat minne retention. Sonden rättegången användes för att utvärdera minne lagring av 1 dag simning prestation på dag 3 i Morris vatten labyrint test, som genomfördes på dagkirurgi 81 inlägg. (A) simning tid, simning avstånd och passerar nummer i Q1 inom 60 s i sonden rättegången (ingen plattform). Data analyserades av envägs ANOVA med flera-range test. Menar ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, vs. gruppen Sham manövrerade. (B), simning banan för råttor i sonden rättegången. (A) Sham manövrerade grupp, visar större simning tid och avstånd i målet kvadranten (Q1). (B) blandats Aβ-behandlade gruppen, visar mindre simning tid och avstånd i målet kvadranten (Q1). Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ påverkat råtta simhastighet:
Råttan simning hastighet beräknades genom synliga plattformen rättegång på dag 7 av Morris vatten labyrint test, som motsvarade till dag 85 post kirurgi. Råttan simning hastighet, baserat på beräkningen av simning avstånd och tid att kliva på plattformen, varje grupp i poolen var inte signifikant. De individuella skillnaderna i råtta simning hastighet kunde därför uteslutas, vilket indikerar att motivation och motorik var i huvudsak intakt i alla råttor (figur 5).
Figur 5 . Blandats Aβ påverkat råtta simhastighet. Råttan simning hastighet beräknades av synliga plattformen rättegång på dag 7 Morris vatten labyrint test, som genomfördes på dag 85 efter operationen. Råttan simning hastighet av varje grupp var inte signifikant. Data analyserades av envägs ANOVA med flera-range test. Menar ± SEM. n = 6. Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ orsakade råtta neuronala morfologisk förändring:
Alla råttor dödades genom halshuggning på dag 86 av kirurgi. Den visuella inspektionen fann att en gul yta eller en tunn eller kollapsade hjärnbarken verkade i flera blandats Aβ-behandlade råttor. Jämfört med sham manövrerade gruppen (figur 6AA2), målat optisk mikroskopi observation av den blandats Aβ-behandlade gruppen av han, hittade Hippocampus neuron patologiska förändringar, såsom neurofibrillära degeneration, neuronophagia, nukleära Pyknos och nukleära margination (figur 6AB2). For resten, delen av hjärnbarken i den blandats Aβ-behandlade gruppen avslöjade typiska colliquative nekros, som präglades av störd cellmembran, fragmenterade kärnor och omfattande inflammatoriska celler infiltration i den nekrotiska region ( Figur 6A B3). Detta indikerar att den blandats Aβ kan resultera i neuronala strukturella patologiska skador hos råttor.
Förutom patologiska förändringar av neuronala struktur, jämfört med sham manövrerade gruppen, minskade också avsevärt antalet neuron i hippocampus och hjärnbarken (förutom colliquative nekros provet) av den blandats Aβ-behandlade gruppen. Neuron var 63.86% (p < 0,01) lägre än för sham manövrerade grupp i hippocampus CA1 sektioner av 0,125 mm och 55.46% (p < 0,01) lägre i hjärnbarken delar av 0.0352 mm2 (figur 6B), vilket antyder att den blandats Aβ kan resultera i en minskad neuron räkna.
Figur 6 . Blandats Aβ orsakade råtta neuronala morfologisk förändring. (A) representativa bilder av hippocampus och cerebral kortikala nervceller som färgas med han. (A1–B1) Hippocampus 40 x; (A2–B2) Hippocampus CA1 400 x; (A3–B3) Cerebrala cortex 400 x. (A1–A3) Simulerade manövrerade grupp; (B1–B3) Blandats Aβ-behandlade gruppen; visar neuron märkt förlust, neurofibrillära degeneration (→), neuronophagia (←), nukleära Pyknos (↗), nukleära margination (↙) i hippocampus, typiska colliquative nekros (★), stört cellulära membran, stort antal inflammatoriska celler infiltrerat i hjärnbarken i en del av den blandats Aβ-behandlade gruppen. Skalstapeln A1 , B1 = 10 µm; Skalstapeln av A2, A3, B2, B3 = 100 µm. (B) antalet nervceller med han fläcken i hippocampus och hjärnbarken, som räknades under ett ljusmikroskop (400 x). Varje volym representerar medelvärde ± SEM från 9 visuella fält av 3 oberoende stickprov (n = 3). ** p < 0,01, jämfört med Sham manövrerade. Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Elektronmikroskopi observerade den subcellulär ultrastruktur av hippocampus nervceller. Underkonstruktionen i hippocampus nervceller i den blandats Aβ-behandlade gruppen (figur 7B1 – B4) förstördes betydligt, visar mitokondriell svullnad och cristae brott, ökad mitokondriell elektrontätheten, vidgade grov endoplasmatiska nätverket, depolymerized polyribosomes och polymicrotubules, vissa postsynaptiska densitet (PSD), många sekundära lysosomer och lipofuscin sediment i cytoplasman, jämfört med sham manövrerade gruppen (figur 7A1 – A4). Det nukleära membranet var rå och sjunkna, euchromatin var kondenserad och denatureras, myelinskidan lagren var löst eller degeneration, och inre axoner och fibrer var försvagat. Dessa resultat visar att den blandats Aβ kan producera neuron understrukturen skador hos råttor.
Figur 7 . Subcellulär struktur av hippocampus neuron bedömas av elektron mikroskopisk observation. A1 -A4: Sham manövrerade grupp. Skalstapeln av A1 = 4 µm, 12, 000 x; Skalstapeln a2 = 3 µm, 15, 000 x; Skalstapeln a3 = 5 µm, 10, 000 x; Skalstapeln a4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1–B4) Blandats Aβ-behandlade gruppen. (B1) Neuron och nukleära Pyknos (←), euchromatin kondens eller degeneration (#), astrocyt foten svälla (*), hög elektronen täthet mitokondrier (▲), myelinskidan lager lös eller dämpning (→); (B2) Större Fredsgenomförande, hög elektronen täthet mitokondrier (▲), myelinskidan lager lös eller dämpning (), större sekundär lysosomer (↑), pericyter Pyknos, pericyter euchromatin kondens eller degeneration (☆), astrocyt foten svälla (*), hög elektrondensitet mitokondrierna (▲), mer lipofuscin (↓), myelinskidan lager lös eller dämpning (→). B4: mer stimulerande neurotransmittorn (#), hög elektronen täthet eller skada membranet mitokondrier (▲), mindre mås. Skalstapeln B1 , B2 = 10 µm, 5, 000 x; Skalstapeln av B3 = 5 µm, 8, 000 x; Skalstapeln av B4 = 1 µm, 40, 000 x. Figur har ändrats från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ orsakade Aβ börda i råtta neuron:
Kongorött färgning användes för att upptäcka Aβ bördan på nervceller. Resultaten visar att den blandats Aβ särskilt kan inducera den intracellulära Aβ bördan i råtta hippocampus och hjärnbarken (figur 8A). Det positiva tal av celler med Aβ röd färgas av kongorött i hippocampus och hjärnbarken blandats Aβ-behandlade gruppen är 8,05 och 4.09 gånger (p < 0,01) större än den simulerade manövrerade gruppen (figur 8B). Detta visar att blandats Aβ kan öka neuron Aβ börda hos råttor.
Figur 8 . Blandats Aβ orsakade Aβ börda i råtta neuron. (A) representativa bilder av positiva Aβ neuron färgas av kongorött i hippocampus och cerebral kortikal. ()A1–B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2–B2) Cerebrala cortex 400 x. (A1–A2) Simulerade manövrerade grupp; (B1–B2) Blandats Aβ-behandlade gruppen, visar mer Aβ positiva celler färgas av kongorött. Skalstapeln = 10 µm, 400 x. (B) positiva tal av Aβ nervceller färgas av kongorött i hippocampus och hjärnbarken, som räknades under ett ljusmikroskop (400 x). Varje volym representerar medelvärde ± SEM från 9 visuella fält av 3 oberoende stickprov (n = 3). ** p < 0,01, jämfört med Sham manövrerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Blandats Aβ orsakade NFT nedfall i råtta neuron:
Silvernitrat färgning användes för att upptäcka NFT nedfall i nervceller. Resultaten visar att blandats Aβ märkbart kan orsaka intracellulära NFT avsättning hos råtta hippocampus och hjärnbarken (figur 9A). Det positiva tal av celler med NFT brun färgas av silvernitrat i hippocampus och hjärnbarken blandats Aβ-behandlade gruppen är 9,75 och 4.82 gånger (p < 0,01) större än den simulerade manövrerade gruppen (figur 9B ). Detta visar att den blandats Aβ kan öka neuron NFT aggregationen i råttor.
Figur 9 . Blandats Aβ orsakade NFT aggregation i råtta neuron. (A) representativa bilder av positiva NFT nervceller färgas av silvernitrat i hippocampus och hjärnbarken. (A1–B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2–B2) Cerebrala cortex 400 x. (A1–A2) Simulerade manövrerade grupp; (B1–B2) Blandats Aβ-behandlade gruppen. visar den mer NFT positiva cellen färgas av silvernitrat i blandats-behandlade gruppen. Skalstapeln = 10 µm, 400 x. (B) positiv NFT nervceller antal färgas av silvernitrat i hippocampus och hjärnbarken, som räknades under ett ljusmikroskop (400 x). Varje volym representerar medelvärde ± SEM från 9 visuella fält av 3 oberoende stickprov (n = 3). ** p < 0,01, jämfört med Sham manövrerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det är väl känt att förlusten av inlärning och minne är stora kliniska symptom i AD patienter2. Proceduren som beskrivs här är ett in-vivo -Metod för att studera AD; Vi har anpassat ett tidigare publicerade protokoll som testat en medicin för att lindra minne underskott och neuronala skador i en råtta modell4. Våra protokoll ger viktiga detaljer att erhålla värdefulla data, samt en hög överlevnad av djur som framgångsrikt modell drift, minne underskott, neuron skador, Aβ börda och NFT nedfall, att efterlikna AD (i nuvarande experimentet, överlevnaden ”och framgångsrika modell drift är mer än 90%). Dessa framgångsrika modell råttor användes för att mäta deras rumsliga minne med Morris vatten labyrint test. Den positionering navigering-Studien fann att den blandats Aβ kan orsaka råtta minnesförsämring förvärv; sonden rättegången fann att den blandats Aβ kan minska råtta minne lagring; och återföring rättegång fann att den blandats Aβ kan resultera i råtta re inlärning leverfunktion. Dessa Morris vatten labyrint testdata visar att den blandats Aβ kan inducera råtta rumsliga minne. Sammantaget skapade injicera råttor intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombination med AlCl3 och TGF-β1 en genomförbar och trovärdig i vivo AD-liknande djurmodell för laboratoriet.
Tidigare studier har visat att hjärnvolymen hos AD-patienter är 10% mindre än för friska individer. Olika förtvinar kan hittas i hjärnhalva genom visuell observation. Graden av kortikal atrofi är positivt relaterat till minne nedskrivningar19. I histologin stör det stora antalet neuron förlust och svår morfologisk patologi direkt Minnesfunktionen i AD patienter20. I den aktuella studien hittade ljus/elektron mikroskopisk observation att råttorna microinjected med blandats Aβ visas dramatiska neuropatologiska förändringar, inklusive förlust av neuron och neuronala och subcellulär struktur störningar. Detta resultat bekräftar råtta rumsliga minne sjukdomen framkallas av blandats Aβ och liknar tillståndet i AD patienter.
Det är väl känt att hjärnan Aβ bördan och NFT aggregering anses den viktigaste histopathogenic dragen i AD. De kan förstöra den neuronala strukturen, störa den neurala signalering, störa nervcellernas funktion och resultera i avancerad demens17. Den nuvarande djurmodell hittade Aβ börda och NFT aggregation i hjärnan, som håller med AD patienten staten. Därför kan de nuvarande neuron skadorna hos råttor inducerade av blandats Aβ användas som en modell för att studera neuronala patologi och behandlingsstrategi av AD.
Följande är exempel på screening läkemedelseffekter i AD råtta modeller: Zhao et al., rapporterade att båda flavonoider från Scutellaria stjälkar och blad (SSF) och Scutellaria barbata (SBF) kan dämpa råtta minnesförsämring och apoptos induceras av blandats Aβ8,9. Guo et al., rapporterade också att SBF kan hämma NFT aggregering och tau protein över fosforylering vid Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 och Thr231 sida, och minskar GSK-3β, CDK5 och PKA protein och mRNA uttryck i blandats Aβ-behandlade råttor21 . Samtidigt, Shang et al., har också rapporterat att SBF kan undertrycka de Astrocyten och mikroglia spridning, och lägre Aβ1-40, Aβ1-42, och β-site APP klyva enzym 1 (BACE1) mRNA uttryck i hjärnan av blandats Aβ råttor22. Baserat på ovanstående resultat, är vår djurmodell en fördel över andra AD-liknande modell, som innebär mer nervcellernas funktion och struktur sjukdom.
När det gäller andra AD-liknande modell, enda intracerebroventricular injektion av Aβ till råttor kan orsaka råtta minne underskott, neuron förlust och neurogliocyte spridning, men kan eller kan inte ha Aβ och NFT nedfall23. Råttor som utsätts för hög dos Al verkar ha en hög framgång, härma AD och en kostnadseffektiv djurmodell, med försämrat minne, neuron förlust, neurogliocyte spridning, och senila plack (SP) och NFT aggregering i hjärnan. Men den höga dosen av Al kan orsaka råtta lever skador och anorexi, tillsammans med minskade vikt24. År råtta är en annan AD-liknande modell. År råttorna visar minne underskott, neuronala struktur/underkonstruktion patologiska förändringar, lipofuscin nedfall, men utan Aβ börda och NFT aggregering. Råttor i mer än 24 månader anses åldern för denna modell, och därför kräver en längre period av utfodring och därmed kostnaden är högre17,25. SAMP8 och APP transgena möss är den närmaste härma till AD och de är de mest perfekta modeller för att utreda AD. Men både djurmodeller prissätts högre och är begränsat till användning i laboratorium26,27. Vår modell av blandats Aβ-behandlade djurmodell jämfört med de ovan djurmodeller, och har en lägre kostnad och hög prestanda, vilket gör det ett idealiskt verktyg för att studera AD.
Avslutningsvis intracerebroventricular injektion av Aβ25-35 kombinerat med AlCl3 och TGF-β1 till råttor ger en värdefull i vivo djurmodell för att bättre förstå den rumsliga minnesförsämring, neuronala skador, Aβ börda och NFT nedfall underliggande AD. Denna modell ger en snabb och relativt enkla experimentella protokoll med en hög djur överleva hastighet och hög modell framgångsrika andelen drift, samt en hög frekvens av dubbelarbete, vilket visade sig vara mer ekonomisk. Den nuvarande djurmodell är en effektiv modell för att efterlikna AD och kan ytterligare validera sig av som används för att efterlikna olika andra sjukdomar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes av Hebei provinsiella naturvetenskap Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsiella administrationen av traditionell kinesisk medicin (nr 05027) och det viktiga ämne byggprojektet Hebei Provincial College, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Denture base material | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China | 20170609 |
References
- Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
- Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
- Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).
- Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
- Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
- Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
- Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
- Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
- Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
- Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
- Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
- Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
- Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
- Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
- Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
- Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
- Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
- Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
- Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
- Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
- Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
- Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
- Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
- Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).
