Summary
זהו פרוטוקול לחקות מחלת אלצהיימר אצל חולדות על ידי הערכה של ליקוי זיכרון מרחבי, שינויים פתולוגיים עצביים, בטא עמילואיד עצביים חלבון (Aβ) נטל ושילב מצבור קשרים neurofibrillary, המושרה על ידי ההזרקה של Aβ25-35 עם אלומיניום trichloride, האדם רקומביננטי צורה של גורם גדילה-β1.
Abstract
מחלת אלצהיימר (AD) היא מחלה מוחי בלתי הפיך, מתקדמת לאט הורס זיכרון, מלווה השינוי ואובדן של מבנה הנוירון. עם העלייה של חולי אלצהיימר ברחבי העולם, פתולוגיה וטיפול המחלה הפכה מוקד בתעשיית התרופות הבינלאומי. לפיכך, הקמת המודל החייתי לחקות לספירה במעבדה הוא בעל חשיבות רבה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט להקמת של חיקוי של AD, חיה עכברוש דגם למרות intracerebroventricular הזרקה של עמילואיד ביתא חלבון 25-35 (Aβ25-35) בשילוב עם אלומיניום trichloride (alcl מערכתיות3) גרעין דפנות התלמוס anterodorsal הזרקה של האדם רקומביננטי צורה של גורם גדילה-β1 (RHTGF-β1) חולדות. הקריטריונים הקשורים של המודעה נמדדו, לרבות: זיכרון מרחבי, מבנה עצביים, בתיוג, Aβ עצביים וייצור neurofibrillary קשרים (NFT). מודל זה עכברוש מדגים ליקוי זיכרון מרחבי, מבנה עצביים, שינויים פתולוגיים בתיוג, נוירון תאיים Aβ נטל, צבירת NFT, ומספק של חיקוי קרוב של ההפרעה העצבית מבנה ותפקוד לזה של ניסויים קליניים חולי אלצהיימר. לפיכך, הציג לספירה עכברוש modelprovides כלי יקר ויוו עבור חקר תפקוד פתולוגיה עצביים, והתרופות הקרנה של AD.
Introduction
זה ידוע כי המודעה היא מחלה כרונית ומתקדמת ניווניות, עם אובדן זיכרון הדרגתי סינדרום קליני הראשי. פתולוגיה כללית, יש ניוון רקמות עצבים, נוירון, אובדן סינפסה, ובכליות עצביים subcellular מבנה ותפקוד, אשר כולם מעורבים פיתוח, ביטוי קליני של המודעה1,2. הוא דיווח כי חיות היו intracerebroventricularly מוזרק עם Aβ, כמה אירועים העצבים מתרחשים במוח מעורבים נוירון אובדן, הפרעה הומאוסטזיס סידן, נוירון אפופטוזיס, מתערובת של מינים חמצן תגובתי3. עם זאת, גורמים רבים מעורבים בפתוגנזה של AD, לכן חיוני להקים מודל טוב יותר של המודעה.
פרוטוקול מפורט מתואר כאן להקמת ויוו מחקים לספירה מודל באמצעות הזרקת intracerebroventricular של Aβ25-35 ו alcl מערכתיות3, בשילוב עם הזרקת גרעין דפנות התלמוס anterodorsal של RHTGF-β1 חולדות. Modelhighly העכברוש הזה מחקה תפקוד האדם, histopathogenesis של AD, כולל ליקוי זיכרון, נוירון הפסד, נזק מבנה, אפופטוזיס, תאיים Aβ נטל ' NFT צבירת4,5,6 , 7 , 8 , 9. alcl מערכתיות3 מונעת את Aβ הופקדו ויוצרים Aβ מסיסים, ו RHTGF-β1 יכול לקדם ייצור Aβ הופקדו וכדי להקל על התרחשות לספירה10. זו מתקפה של מספר גורמים על הנוירון הוא על פי רב בפתוגנזה של המודעה.
הניסוי כולו המורחב 86 ימים: איור 1 מראה ציר זמן של הנבחנים, עם נקודת הזמן של הניתוח בעלי חיים, המודל החייתי ההקרנה, מבחן זיכרון מרחבי חיים הכנת הדוגמא. ביום הראשון של המבצע, RHTGF-β1 היה microinjected לתוך הגרעין דפנות התלמוס anterodorsal. ביום השני של המבצע, Aβ25-35 ו- alcl מערכתיות3 היו microinjected לתוך החדר הלטראלי מדי יום במשך 14 ימים רצופים בבוקר ו- 5 ימים עוקבים אחר הצהריים, בהתאמה. כל העכברושים הורשו להתאושש במשך 45 ימים לאחר הניתוח. מבוך המים מוריס שימש על המסך עבור מודל מוצלח חולדות עם ליקוי זיכרון כדי להעריך את הזיכרון המרחבי של חולדות. העכברים עברו 4 ימים רצופים של מבוך המים באמצעות 2 מבחנים ליום, ביום 4 אימונים, החולדות הוערכו עם ביצועים מבוך המים מוריס תדיריל זיכרון. כל העכברושים המשיך להיות מוזן 37 ימים לאחר ההקרנה במודל חיה. הזיכרון המרחבי של חולדות נבחנה בתוך מבוך המים מוריס מעל 7 ימים רצופים, מיום 79 ליום 85 לאחר הניתוח. כל העכברושים הוקרבו ע י עריפת ראשו ביום 86 עבור הכנת הדוגמא המוח.
איור 1. ציר הזמן של הנבחנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
הליך זה היה בהתאם לתקנות של ניסיוני חיה המינהל שהונפקו על ידי המדינה ועדת המדע, הטכנולוגיה של סין ב 31 באוקטובר 198811. מדענים צריך בצע את ההנחיות הוקמה ואושרו על-ידי שלהם הלאומית ולמוסדות רגולטוריות ארגונים בעלי חיים.
הערה: בעלי חיים, חברי ההנהלה: חולדות ספראג-Dawley זכר בן 4 חודשים (300-350 גר') סופקו על הניסוי הזה. כל העכברושים שוכנו בקבוצות (ארבעה או חמישה לכל כלוב) בטמפרטורה של 23 ± 1 ° C עם מחזור בהירה-כהה 12-h. מזון ומים היו זמינים ad libitum. העכברושים היו התאקלם תנאי דיור 7 ימים לפני ההליך בוצע. Aβ25-35 היה מומס 1% דימתיל סולפוקסיד תמיסת מלח כדי 1 מ"ג/מ"ל, sonicated במשך 5 דקות, מכשיר אולטראסאונד מעקב עד התפרקה לחלוטין. Alcl מערכתיות3 ו- RHTGF-β1 היו מומס תמיסת מלח ב 1% ל- 0.1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. קונגו אדום, כסף חנקתי, וחומרים כימיים אחרים היו של כיתה אנליטית, נרכשו ממקורות מסחריים רגילים.
1. ניתוח
הערה: חולדות ספראג-Dawley זכר 20 היו microinjected עם Aβ ללא הפרדות הצבע לתוך החדר הלטראלי ו anterodorsal גרעין דפנות התלמוס, כמנהל הקבוצה שערכת שטופלו Aβ. עוד חולדות 20 עברו את אותה הפעולה אך קיבלו 0.1% דימתיל סולפוקסיד מלוחים microinjection, כמנהל הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים.
- להרדים את החולדות עם 100% איזופלוריין על ידי שאיפה, ואז לרסן על מנגנון Stereotaxic במוח.
- לגלח את הפרווה על הקודקוד של הראש עם מספריים כירורגיים ולחטא עם iodophor. לאחר מכן, כיסוי חד פעמי כירורגי מגבת על הראש.
- לעשות חתך על העור ראש לאורך calvaria האורך החציוני עם bistouries כירורגית ומספריים.
- להפריד את הרקמה התת עורית ואת fascia, לנגב את קליפת הגולגולת הגולגולת עם כותנה יבשה סטרילית עבור עצירת הדימום, ולסמן את bregma עם עט מרקר.
- להפנות החולדה המוח Stereotaxic מפה12; בהתחשב bregma בתור נקודת המוצא, לסמן שלוש נקודות, גרעין דפנות התלמוס anterodorsal (ad) (אחוריים (P): 2.0 מ מ כדי bregma; לרוחב (L): 1.4 מ"מ עד האמצע) עבור הזרקת RHTGF-β1 ותיקון בורג אחד, (אזור הסופרפוזיציה החדר (LV) אחוריים (P): 0.8 מ"מ עד bregma; צדדי (L): 2.0 מ"מ עד האמצע) עבור הזרקת Aβ25-35, AlCl3 את הבורג השני מתקן המקום (קבלה (נ): 2.0 מ מ כדי bregma; לרוחב (L): 1.5 מ"מ עד האמצע).
- בעדינות לקדוח שלושה חורים בקוטר 1 מ"מ עם תרגיל עצם גמיש, שנקבע ב לעיל שלוש נקודות של הגולגולת (1.5. שלב). . אל תהרוס עמוק יותר ממה שצריך להימנע דקירה על רקמת המוח.
- לעצור את הדימום, לנקות את השטח הגולגולת שוב ושוב עם כותנה יבשה סטרילית.
- להכניס מחט לקשר את משאבת מיקרו-הזרקה, למוח ב 4.6 מ מ עומק ולהזריק בעדינות 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) לאזור לספירה. תשהו המחט 2 דקות לאחר ההזרקה, לאט להוציא את המחט (1 קובץ משלים).
- לתקן את שני הברגים לתוך הגולגולת, המיועד הנקודות של ad, את הבורג השני מתקן את המקום של הגולגולת (אשר נקבעו ב- 1.5. שלב) עם מברג קטן. . אל תהרוס עמוק יותר ממה שצריך להימנע דקירה על רקמת המוח.
- להרכיב מערכת השרשה בצינורית (2 קובץ משלים), להכניס את הצינורית דמה הצינורית מדריך לאחר חיטוי על ידי בלחץ גבוה.
- הכנס את הצינורית מדריך צינורות פלדת אל המוח מ"מ 4.6 לאזור LV דרך החור בגולגולת (3 קובץ משלים), עם העזרה של מחזיק בצינורית של המנגנון stereotaxic של החולדות.
- מערבבים את החומר הבסיסי של שיניים תותבות עם שיניים תותבות בסיס מים ביחס של 1.5 גרם לכל 1 מ"ל, לשים את העיסה כדי לכסות את המעמד מדריך בצינורית פלסטיק, שני הברגים שיתק את הצינורית מדריך, עד כיסוי החתך בעור כל הימנעות הדלקת בעור.
- ביום 2 של הפעולה, להרדים את החולדות עם שאיפה איזופלוריין באמצעות מכונת ההרדמה חיה קטנה. למשוך את הצינורית דמה, להכניס את הצינורית הפנימית הצינורית מדריך, ולעזאזל עם הבורג תיקון כדי לשתק את הצינורית הפנימית.
- הגדר צינור פוליאתילן המקשר המשאבה microinjection הצינורית הפנימית ולווסת את מהירות הזרקת μL 1/Microinject Aβ25-35 או AlCl3 כדי LV. מינימלית
- Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 מדי יום למשך 14 ימים בבוקר ו 3 μL alcl מערכתיות3 (1%) מדי יום במשך 5 ימים בשעות אחר הצהריים תחת הרדמה איזופלוריין.
- המתן 5 דקות לאחר שסיים את הזריקה, ברכות למשוך החוצה את הצינורית הפנימית, להכניס את הצינורית דמה שוב הצינורית מדריך.
- לפוסט היום 15 ניתוח (התואם האחרון יום זריקה של Aβ25-35) לפרק את המערכת השרשה בצינורית. בעדינות להסיר שיניים תותבות הבסיס המוצק גשמי עם מספריים כירורגיים, מלקחיים, לפרק את שני הברגים, להוציא את הצינורית מדריך, לחטא את הפצע עם betadine. למלא את החור בגולגולת עם מלט עצם, תפר את העור עם שיטה פשוטה תפר קטע.
- לבצע את אותה הפעולה עם קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים, microinject 0.1% דימתיל סולפוקסיד תמיסת מלח.
-
הנקה לאחר הניתוח
- בית שני עכברושים לכל הכלוב לאחר ניתוח, מספקים מזון למשך 30 יום.
הערה: חולדות 18 בשיעור המופעלים שאם קבוצה שרד (90% ההצלחה של המבצע), חולדות 19 בקבוצה שערכת שטופלו Aβ שרד (שיעור 95% הצלחה של הניתוח).
- בית שני עכברושים לכל הכלוב לאחר ניתוח, מספקים מזון למשך 30 יום.
2. סינון עבור מודל מוצלח חולדות והערכה של זיכרון מרחבי עם מבוך המים מוריס
-
מבוך המים מוריס
הערה: מבוך המים מוריס שימש כדי להעריך את העכברוש זיכרון מרחבי13. מבוך המים מוריס הוא טנק מפלדת עגול בקוטר 120 ס מ, עומק 50 ס מ. הבדיקה מבוך מים בוצעה, בהתבסס על הפרדיגמה "סטנדרטים זהב" המתואר פסיכוביולוגיה מאת ג'יי נונייז14.- להשחיר את המים בבריכה עם מספר טיפות של צבע מאכל.
- לשמור על העומק של המים ב- 31.5 ס מ ואת הטמפרטורה ב 23 ± 1 ° C.
- הגדר פלטפורמה פלקסיגלס שקוף עגול 1.5 ס מ מתחת לפני המים.
- לשמור על כי כל הסימנים המרחבי במבוך מים הם מחזוריים במהלך הבדיקות מבוך מים.
- לחלק את הבריכה הגזרות שווה 4 על-ידי קווים דמיוניים לאיסוף נתונים תיאוריים.
- מקם את הפלטפורמה מוסתרים ברבע הראשון (Q1) של מבוך המים.
- ללכוד את החולדה שחייה התנהגויות (נמדד על ידי השהיית, מסלול או מעבר מספר) באמצעות מצלמת וידאו, מעל המבוך המים קשורה תוכנה אנליטית גרפיקה מבוססת מחשב.
-
הקרנה של מודל מוצלח חולדות לקבוצה שערכת שטופלו Aβ
- ביום 45 של ניתוח, לבצע מבוך המים מוריס הדרכה 4 ימים רצופים המסך עבור מודל מוצלח חולדות עם ליקוי זיכרון ולאסוף את יחס הקרנה (SR).
הערה: SR מוגדר ההשהיה הממוצעת של כל עכברוש שטופלו Aβ שערכת, הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים של חולדות למצוא פלטפורמה מוסתר מתחת למים לעלות על יום 4 מים מבוך הכשרה. "A" הוא ההשהיה הממוצעת של כל עכברוש שערכת שטופלו Aβ למצוא את הפלטפורמה מוסתרים והוא "B" ההשהיה הממוצעת של קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים של חולדות למצוא פלטפורמה מוסתרים, ביום 4 של מבוך המים הכשרה, המשוואה הבאה:
SR היה גדול יותר 0.2 אחד שערכת העכברוש שטופלו Aβ, העכברוש נחשב חולדה מודל מוצלח עם זיכרון לקוי של עכברים שטופלו Aβ שערכת15. ביצועי הזיכרון יומי מחושב על הנתונים של 2 מבחנים לפי הערך הממוצע של חולדות למצוא פלטפורמה מוסתרים. התהליך של הבדיקה מבוך המים מוריס תוכנן כך העכברושים הורשו לשחות בו מיכל מבוך המים ואת החיפוש עבור פלטפורמת מוסתרים בתוך 60 s. אם עכברוש לא מצא את הפלטפורמה מוסתרים בתוך 60 s, אז העכברוש היה לשים על הרציף עם היד של הנסיין. כאשר יגיע חולדה על פלטפורמת מוסתר (באופן עצמאי או בסיוע), העכברוש היה לתת נשארים שם 20 s. לאחר מכן, העכברוש היה להסיר את הטנק ואסור החלמה פיזית במשך 10 s בין 2 מבחנים.
- ביום 45 של ניתוח, לבצע מבוך המים מוריס הדרכה 4 ימים רצופים המסך עבור מודל מוצלח חולדות עם ליקוי זיכרון ולאסוף את יחס הקרנה (SR).
3. נוירון בדיקה
- על יום 86 שלאחר ניתוח, תחת הרדמה איזופלוריין, המתת חסד העכברושים ע י עריפת ראשו (איור 1).
- לשים את המוח על הקרח ולהפריד בעדינות את שתי ההמיספרות-raphe. קח האונה השמאלית של הראייה בהיקף, תיקון ב- 4% פורמלדהיד להשגחה microcopy האור של נוירון hematoxylin ואאוזין (HE), קונגו אדום או כסף חנקתי כתם (ראה סעיפים 4-6). לתקן אזור ההיפוקמפוס CA1 האונה הימנית ב- 2.5% גלוטראלדהיד להשגחה microcopy אלקטרון (סעיף 7).
- תהליך המוח להכנת מדגם microcopy אור/אלקטרונים, כפי שתואר לעיל16,17.
4. נוירון הוא מכתים
- Deparaffinize כל שקופית (20 דקות כל אחד) עם אלכוהול מעבר צבע (100%-95%, 90%, 80%, 70% אלכוהול) כדי מים בשכונה fume מזוקקים.
- כתם למשך 3 דקות עם hematoxylin (0.5% w/v) ולאחר מכן לשטוף עם מי ברז כדי להסיר את הצבע לא מאוגד שקופיות.
- לשטוף עם 0.1% חומצה הידרוכלורית באלכוהול 1 s כדי להסיר את הצבע של גרעינים וללא רבב.
- לטבול בתמיסה אמוניה 0.5% למשך 2 דקות עד הרקע הכחול הבהיר פונה.
- כתם על 1 דקות עם 1% אאוזין.
- מייבשים במשך 5 דקות עם אלכוהול מעבר צבע (70%, 80%, 90%, 95% ו- 100% אלכוהול).
- ברור קסילן והר שרפי הרכבה בינונית.
- להתבונן ולספור את הנוירונים החיים של הכתם הוא לכל מ מ 0.125 CA1 האמצעי של ההיפוקמפוס, לכל מ מ 0.03522 בקליפת בהגדלה גדולה של 400 x עם מיקרוסקופ אופטי על-ידי אדם עיוור על עיצוב ניסיוני.
5. אדום קונגו צביעת עבור Assaying נוירון Aβ נטל
- Deparaffinize כל שקופית (20 דקות) עם אלכוהול מעבר צבע (100%-95%, 90%, 80%, 70% אלכוהול) כדי מים בשכונה fume מזוקקים.
- כתם כעשרים דקות עם קונגו אדום עובד פתרון (0.5 ג'י קונגו באדום, 80 מ ל מתיל אלכוהול, glycerinum 20 מ ל).
- יש לשטוף במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- להבדיל במהירות עם פתרון 80% אלכוהול אלקליין (0.2 גרם אלכוהול/100 מ"ל אשלגן הידרוקסידי) עבור 3 s.
- לשטוף פעמיים, כל אחד, חמש דקות עם מים מזוקקים.
- Counterstain ב hematoxylin של גיל למשך 3 דקות.
- לשטוף במי ברז למשך 2 דקות.
- לטבול במים אמוניה (בתוספת של מספר טיפות של. אמוניה מימית כדי הקש מים ומערבבים היטב) ב-30 s או עד הסעיפים כחולות.
- לשטוף במי ברז למשך 5 דקות.
- מייבשים עם אלכוהול מעבר צבע (70%, 80%, 90%, 95% ו- 100% אלכוהול).
- ברור קסילן והר שרפי הרכבה בינונית.
- להתבונן ולספור את התאים מוכתם קונגו אדום בהגדלה גדולה של 400 x, עם מיקרוסקופ אופטי על-ידי אדם עיוור על עיצוב ניסיוני.
6. חנקת הכסף צביעת עבור Assaying נוירון NFT היווצרות
- Deparaffinize כל שקופית (20 דקות) עם אלכוהול מעבר צבע (100%-95%, 90%, 80%, 70% אלכוהול) כדי מים בשכונה fume מזוקקים.
- לטבול 20% חנקת הכסף פתרון והסוכן הגבלת התכיפות כעשרים דקות בחושך.
- לשטוף במים מזוקקים פעמיים, 5 דקות כל פעם.
- לטבול בתמיסה אמוניה כסף. טיפה אמוניה פתרון בתוך תמיסת כסף חנקתי 20%, וכן להוסיף עד הפתרון הולך מעכירות הבהרה. במקביל מערבבים את הפתרון עם מוט זכוכית למשך 15 דקות, ואז מכניסים 1% בדילול אמוניה מימית למשך 2 דקות.
- מקם את השקופית לתוך הפתרון עובד בפיתוח עבור 3-7 דקות עד הבלוק השחור ב האקסון יכול להיות שנצפו.
- לטבול הפתרון אמוניה 0.1% בדילול 1 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים במשך 1 דקה.
- להיפטר עם 5% נתרן תיוסולפט למשך 2 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים במשך 5 דקות.
- מייבשים עם אלכוהול מעבר צבע (70%, 80%, 90%, 95% ו- 100% אלכוהול).
- ברור קסילן והר שרפי הרכבה בינונית.
- לצפות, להקליט התא עבור כסף חנקתי הכתם בהגדלה גדולה של 400 x עם מיקרוסקופ אופטי על-ידי אדם עיוור על עיצוב ניסיוני.
7. בהיפוקמפוס נוירון Ultrastructure מדידה
- חותכים ההיפוקמפוס עכברוש CA1 לקוביות מספר (1 x 1 x מ מ 13) ולמקם גלוטראלדהיד 2.5% עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את הקוביות עם PBS שלוש פעמים (pH 7.2, 10 דקות כל פעם).
- לתקן את הקוביות בחומצה osmic 1% עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הקוביות במים מזוקקים כפול 3 x (10 דקות כל פעם).
- מייבשים עם אלכוהול הדרגתיות 50%, 70% ו- 90% (10 דקות לכל אחד), 100% פעמיים (15 דקות כל פעם).
- החלף מאת פרופילן אוקסיד פעמיים (15 דקות כל פעם), פרופילן אוקסיד: שרף-1:1 (60 דקות במשך כל זמן בטמפרטורת החדר), ושרף פרופילן אוקסיד: 1:4 (60 דקות במשך כל זמן בטמפרטורת החדר). משרים שרף (120 דקות, בטמפרטורת החדר).
- להטביע EPON 812, פולימריזציה (5 שעות/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
- לחתוך את החלקים semithin (1 מיקרומטר), כתם על ידי מתילן כחול, בתרגום מתחת למיקרוסקופ.
- כתם הסעיפים דקים (50 ננומטר) עם uranyl-o-אצטט והפניות ציטראט.
- לבדוק תחת מיקרוסקופ אלקטרונים ג'ים-1400 ותמונות לאסוף.
Representative Results
כל הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± החבילה ב- SEM SAS/סטטיסטיקה שימש לחישוב ניתוח סטטיסטי. קבוצה הבדלי זמן השהיה כדי למצוא את הפלטפורמה מוסתרים מבחן למידה מחדש זיכרון של זיכרון רכישת נותחו על ידי דו-כיווני השונות (ANOVA) באמצעים חוזרות ונשנות. ההבדלים קבוצה החללית המשפט ומספר הנוירונים נותחו על ידי חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן מרובה-טווח של דאנקן. p < 0.05 נחשב סטטיסטית18.
הקרנה של חולדות מודל מוצלח עם ליקוי זיכרון עבור הקבוצה שערכת שטופלו Aβ:
התוצאות איור 2AA1 ו 2AA2 מראים כי הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים של חולדות תמיד שחה בחופשיות, החולדות שערכת קבוצה שטופלו Aβ (איור 2AB1, AB2) תמיד שחה למתחם הבריכה בשחייה מסתגלת ב מבוך המים מוריס. 4 ימי הקרנה עבור זיכרון ליקוי במודל חולדות, היה כל העכברושים פוחתת בהדרגה פעמים למצוא פלטפורמה מוסתר (השהיה) (איור 2B). ביום 4 של מוריס מים מבוך הכשרה, אם SR היה יותר מ- 0.2 (שהתבסס על ההשהיה של כל עכברוש שערכת שטופלו Aβ וקבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים של חולדות למציאת פלטפורמה מוסתר), אז העכברוש שערכת שטופלו Aβ נחשב מוצלח במודל חולדה עם ליקוי זיכרון. 18 מתוך 19 חולדות (94.70%) שרד את הניתוח עבר העכברושים ההקרנה. 6 דגם מוצלח של כל קבוצה נבחרו על הניסויים הבאים.
איור 2 . הקרנת עבור מודל מוצלח חולדות עם ליקוי זיכרון בקבוצה שטופלו Aβ שערכת באמצעות המים מוריס מבוך אימונים. (א) השחייה מסתגלת מסלול של חולדות בתוך מבוך המים מוריס. (AA2AA1–) קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים; (AB1–AB2) קבוצת שטופלו Aβ ללא הפרדות הצבע. (B) השהיה מתכוון למצוא את הפלטפורמה מוסתרים 4 ימים רצופים של המשפט ההקרנה במים מוריס מבוך להכשרת הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים וקבוצת שטופלו Aβ ללא הפרדות הצבע. איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ שערכת גרם עכברוש זיכרון הרכישה וזיכרון מחדש ליקויי למידה:
עכברוש זיכרון הרכישה נקבע על-ידי המשפט ניווט מיקום ביום 1 ו- 2 של הבדיקה מבוך המים מוריס, אשר תאמו לניתוח פוסט יום 79, 80. במהלך 2 ימי זיכרון הרכישה במשפט, כל העכברושים הציג השהיה הפוחתת בהדרגה כדי למצוא את הפלטפורמה מוסתרים. כפי שמוצג באיור3, השהיות ארוכות יותר של קבוצת שטופלו Aβ שערכת למציאת פלטפורמה מוסתרים היו 360.67% ל- 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) גדולים יותר מאלה של קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים ביום 1 ו- 2 של המים מוריס מבוך מבחן, בהתאמה. אפשרות זו מציינת Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום ליקוי זיכרון הרכישה אצל חולדות.
העכברוש זיכרון מחדש למידה היה לבדיקה בעקבות המהפך למשפט ביום 4, 5 ו- 6 של הבדיקה מבוך המים מוריס, אשר תאמו לניתוח פוסט יום 82, 83, 84. כפי שמוצג באיור3, השהיות ארוכות יותר של קבוצת שטופלו Aβ שערכת למציאת פלטפורמה מוסתרים היו 306.20%, 650.16% ו- 936.92% זמן רב יותר מאשר אלה של קבוצת המופעלים דמה (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01). זה מדגים Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לרומם את הזיכרון מחדש למידה ליקוי בחולדות (איור 3).
איור 3 . Aβ שערכת גרם עכברוש זיכרון הרכישה וזיכרון מחדש למידה לקויות. המשפט ניווט מיקום שימש כדי להעריך את זיכרון הרכישה על ידי 2 ימים רצופים שחייה ההישג ביום 1 ו- 2 במבחן מבוך המים מוריס. אלה בוצעו על ניתוח פוסט יום 79, 80. ניסיון ההיפוך שימש כדי להעריך את זיכרון לימוד מחדש על-ידי 3 ימים רצופים שחייה הציון ביום 4, 5 ו- 6 בבחינה מבוך המים מוריס, אשר תאמו יום 82, 83, 84 של הפעולה. גרף קו מראים ההשהיה מתכוון למצוא פלטפורמת המוסתרים עבור כל קבוצה ביום 1, 2, 4, 5 ו- 6 במבחן מבוך המים מוריס. הנתונים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני (יום x קבוצה) באמצעים חוזרות ונשנות. זאת אומרת ± ב- SEM. n = 6. ** p < 0.01, לעומת קבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ שערכת גרם עכברוש ליקוי זיכרון השמירה:
שימור זיכרון עכברוש נמדדה על ידי ניסיון בדיקה ביום השלישי של המבחן מבוך המים מוריס, אשר תאמו לניתוח פוסט יום 81. ב- 1 יום זיכרון השמירה למשפט, הקבוצה שערכת שטופלו Aβ לקח פחות שחייה זמן לשחות מרחק, חוצה מספר ב- Q1 בתוך 60 s, אשר תאמו 32.14% 30.11%, 78.95% (p < 0.01), בהתאמה, מאשר אלו של קבוצת המופעלים דמה (איור 4א, 4B). תוצאות אלו מראות כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לייצר ליקוי זיכרון שמירה אצל חולדות.
איור 4 . Aβ ללא הפרדות הצבע המופק ליקוי השמירה זיכרון עכברוש. המשפט בדיקה שימש כדי להעריך את שימור זיכרון על ידי 1 יום שוחים ההישג ביום 3 הבדיקה מבוך המים מוריס, אשר נערך על ניתוח פוסט יום 81. (א) שחייה זמן לשחות מרחק, חוצה מספר ב- Q1 בתוך 60 s במשפט בדיקה (לא רציף). הנתונים נותחו על ידי חד-כיווני אנובה עם הבדיקה מרובות-טווח. זאת אומרת ± ב- SEM. n = 6. ** p < 0.01, לעומת הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. (B) שחיה המסלול של חולדות במשפט בדיקה. (א) המופעלים שאם הקבוצה, מציג מרחק וזמן שחייה גדולה יותר ברביע היעד (Q1). (B) שטופלו Aβ שערכת קבוצת, מציג פחות שחייה הזמן והמרחק ברביע היעד (Q1). איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ שערכת השפיעו על מהירות שחייה חולדה:
העכברוש שחייה מהירות מחושב על ידי פלטפורמת גלוי למשפט ביום 7 של מוריס מים מבוך הבדיקה, אשר תאמו היום 85 לתגובה. העכברוש מהירות, המבוסס על חישוב לשחות מרחק וזמן לצעוד על הרציף של כל קבוצה בבריכת שחייה לא היתה שונה באופן משמעותי. לכן, ההבדלים הבודדים עכברוש שחייה מהירות יכול להיות נשלל, אשר מציין כי מוטיבציה וכישורים מוטוריים היו למעשה ללא שינוי כל העכברושים (איור 5).
איור 5 . Aβ שערכת השפיע על מהירות שחייה חולדה. העכברוש שחייה מהירות מחושב על-ידי הפלטפורמה גלוי למשפט ביום 7 של הבדיקה מבוך המים מוריס, אשר נערך ביום 85 לאחר הניתוח. העכברוש שחייה מהירות של כל קבוצה לא היתה שונה באופן משמעותי. הנתונים נותחו על ידי חד-כיווני אנובה עם הבדיקה מרובות-טווח. זאת אומרת ± ב- SEM. n = 6. איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ ללא הפרדות הצבע נגרם שינוי מורפולוגי עצביים חולדה:
כל העכברושים נהרגו על ידי עריפת ראש ביום 86 של ניתוח. בדיקה ויזואלית מצא כי משטח צהוב או דק או מכווצת קליפת הופיע אצל כמה חולדות שטופלו Aβ ללא הפרדות הצבע. לעומת הקבוצה המופעלים דמה (איור 6AA2), מיקרוסקופ אופטי התבוננות בקבוצה שטופלו Aβ שערכת על ידי הוא מוכתם, נמצאו שינויים פתולוגיים נוירון בהיפוקמפוס, כגון ניוון neurofibrillary, neuronophagia, pyknosis גרעיני, גרעיני margination (איור 6AB2). חוץ מזה, החלק של קליפת בקבוצה שטופלו Aβ שערכת חשף נמק colliquative טיפוסי, אשר התאפיינה שיבשו קרום התא, גרעינים מפוצלים, תאים דלקתיים נרחב בחדירת (אזור נמק איור 6A B3). אפשרות זו מציינת כי Aβ ללא הפרדות הצבע עלול לגרום עצביים פציעות פתולוגיים מבניים בחולדות.
בנוסף שינויים פתולוגיים של מבנה עצביים, לעומת הקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים, הרוזן נוירון משמעותי גם ירדו היפוקמפוס, קליפת המוח (למעט המדגם נמק colliquative) של שערכת קבוצת שטופלו Aβ. המספר נוירון היה 63.86% (p < 0.01) נמוך יותר מזה של המופעלים שאם קבוצה hippocampal CA1 מקטעים של 0.125 מ מ ו- 55.46% (p < 0.01) התחתון בסעיפים קליפת המוח של 0.0352 mm2 (איור 6B), מה שמרמז כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום ספירת נוירון ירד.
איור 6 . Aβ ללא הפרדות הצבע נגרם שינוי מורפולוגי עצביים עכברוש. (א) להחליפן בתמונות של נוירונים בקליפת המוח בהיפוקמפוס ולתקן מוחין מוכתם הוא. (A1–B1) ההיפוקמפוס 40 x; (A2–B2) ההיפוקמפוס CA1 400 x; (A3–B3) X 400 קליפת המוח. (A1–A3) קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים; (B1–B3) קבוצת שטופלו Aβ שערכת; נוירון מראה מסומן אובדן, ניוון neurofibrillary (←), neuronophagia (←), הגרעין pyknosis (↗), הגרעין margination (↙) של ההיפוקמפוס, נמק colliquative טיפוסי (★), שיבשו ממברנות הסלולר, מספר גדול של תאים דלקתיים הסתננו בקליפת בחלק של הקבוצה שערכת שטופלו Aβ. סרגל קנה מידה של A1, B1 = 10 מיקרומטר; סרגל קנה מידה של A2, B2 A3, B3 = 100 מיקרומטר. (B) מספרים של נוירונים עם הכתם הוא היפוקמפוס, קליפת המוח, אשר נמנו תחת מיקרוסקופ אור (400 x). כל אמצעי אחסון מייצגת זאת אומרת ± SEM משדות visual 9 3 דגימות עצמאית (n = 3). ** p < 0.01, לעומת קבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
מיקרוסקופ אלקטרונים ציין את ultrastructure subcellular של נוירונים בהיפוקמפוס. המבנה התחתי של נוירונים בהיפוקמפוס בקבוצה שערכת שטופלו Aβ (איור 7 ב1 – B4) נהרסו באופן משמעותי, מציג נפיחות מיטוכונדריאלי ומורחבים cristae שבירה, צפיפות אלקטרונים מיטוכונדריאלי מוגברת, מחוספס רשתית תוך-פלזמית, depolymerized polyribosomes polymicrotubules, יש צפיפות postsynaptic (PSD), lysosomes משניים רבים ו lipofuscin משקעים בתוך הציטופלסמה, בהשוואה לקבוצת המופעלים דמה (איור 7 א1 – A4). קרום גרעיני היה גס ולא שקועות, euchromatin היה מרוכז, שפגע בסימני, הרבדים מיאלין היו רופפים או ניוון, ולא אקסונים פנימי וסיבים היו הקלוש. תוצאות אלה מדגימים Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לייצר נזק מבנה תת נוירון בחולדות.
איור 7 . מבנה subcellular של נוירון בהיפוקמפוס מוערך על ידי התבוננות מיקרוסקופית אלקטרונים. A1 -A4: קבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. סרגל קנה מידה של A1 = 4 מיקרומטר, 12, 000 x; סרגל קנה מידה של A2 = מיקרומטר 3, 15, 000 x; סרגל קנה מידה של A3 = מיקרומטר 5, 10, 000 x; סרגל קנה מידה של A4 = 1 מיקרומטר, 35, 000 x. (B1–B4) קבוצת שטופלו Aβ ללא הפרדות הצבע. (B1) נוירון, הגרעין pyknosis (←), euchromatin עיבוי או ניוון (#), התנפחות הרגל אסטרוציט (*), המיטוכונדריה צפיפות אלקטרונים גבוהה (▲), שכבות מעטפת המיאלין רופף או הנחתה (←); (B2) GFAP רבתי, המיטוכונדריה צפיפות אלקטרונים גבוהה (▲), שכבות מעטפת המיאלין רופף או הנחתה:, גדול יותר משני lysosomes (↑), pericytes pyknosis, pericytes euchromatin עיבוי או ניוון (☆), אסטרוציט הרגל נהדר (*), צפיפות אלקטרונים גבוהה המיטוכונדריה (▲), יותר lipofuscin (↓), שכבות מעטפת המיאלין רופף או הנחתה (←). B4: עצבי מעוררים יותר (#), אלקטרון גבוהה צפיפות או פציעה ממברנה המיטוכונדריה (▲), פחות synapsis. סרגל קנה מידה של B1, B2 = 10 מיקרומטר, 5, 000 x; סרגל קנה מידה של B3 = מיקרומטר 5, 8, 000 x; סרגל קנה מידה של B4 = 1 מיקרומטר, 40, 000 x. איור שונתה מ 4 הפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ שערכת גרם Aβ נטל בנוירונים חולדה:
צביעת קונגו אדום נעשה שימוש כדי לזהות את העומס Aβ על הנוירונים. התוצאות מציגות Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום בעיקר הנטל Aβ תאיים עכברוש היפוקמפוס, קליפת המוח (איור 8א). המספר החיובי של תאים עם Aβ אדום מוכתמת קונגו אדום היפוקמפוס, קליפת המוח של הקבוצה שטופלו Aβ שערכת הן 8.05 - של 4.09 פי (0.01 <p ) גדולים יותר מאלה של קבוצת המופעלים דמה (איור 8ב'). זה מדגים כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול להגביר נוירון נטל Aβ אצל חולדות.
איור 8 . Aβ שערכת גרמה Aβ נטל של החולדה הנוירונים. (א) נציג תמונות של נוירון Aβ חיובי מוכתם על ידי קונגו אדום בהיפוקמפוס ולתקן מוחין קורטיקלית. (A1–B1) ההיפוקמפוס CA1 400 x; (A2–B2) X 400 קליפת המוח. (A1–A2) קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים; (B1–B2) קבוצת שטופלו Aβ שערכת, מראה Aβ יותר חיובית תאים מוכתמת קונגו אדום. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר, 400 x. (B) מספרים חיוביים של נוירונים Aβ מוכתמת קונגו אדום היפוקמפוס, קליפת המוח, אשר נמנו תחת מיקרוסקופ אור (400 x). כל אמצעי אחסון מייצגת זאת אומרת ± SEM משדות visual 9 3 דגימות עצמאית (n = 3). ** p < 0.01, לעומת קבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Aβ שערכת גרם NFT התצהיר בנוירונים חולדה:
כסף חנקתי מכתים שימש לגילוי התצהיר NFT בנוירונים. התוצאות הראה כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול באופן ניכר לגרום התצהיר NFT תאיים בחולדה היפוקמפוס, קליפת המוח (איור 9א). המספר החיובי של תאים עם NFT חום מוכתם על ידי כסף חנקתי היפוקמפוס, קליפת המוח של הקבוצה שטופלו Aβ שערכת הן 9.75 - ו 4.82 פי (0.01 <p ) גדולים יותר מאלה של קבוצת המופעלים דמה (איור 9B ). זה מדגים כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול להגביר את המצבור NFT נוירון בחולדות.
איור 9 . Aβ שערכת גרמה NFT צבירה של החולדה הנוירונים. (א) להחליפן בתמונות של נוירונים NFT חיובי מוכתמת. חנקת הכסף ההיפוקמפוס, קליפת המוח. (A1–B1) ההיפוקמפוס CA1 400 x; (A2–B2) X 400 קליפת המוח. (A1–A2) קבוצת המופעלים באמצעות העמדת פנים; (B1–B2) קבוצת שטופלו Aβ ללא הפרדות הצבע. מציג את NFT יותר חיובית תא מוכתמת. חנקת הכסף בקבוצה שטופלו שערכת. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר, 400 x. נוירונים (B) NFT חיובי מוכתמת. המספרים של כסף חנקתי ההיפוקמפוס, קליפת המוח, אשר נמנו תחת מיקרוסקופ אור (400 x). כל אמצעי אחסון מייצגת זאת אומרת ± SEM משדות visual 9 3 דגימות עצמאית (n = 3). ** p < 0.01, לעומת קבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
זה ידוע כי האובדן של למידה וזיכרון הם סימפטומים קליניים עיקריים לספירה חולים2. ההליך המתואר כאן היא שיטה ויוו ללמוד לספירה; אנחנו הסתגלו פרוטוקול שפורסמו בעבר נבדקו תרופות כדי להקל על הזיכרון גירעונות ופגיעות עצביים עכברוש דגם4 פרוטוקול שלנו מספק פרטים חשובים כדי לקבל נתונים יקרי ערך, כמו גם שיעור הישרדות גבוהה של בעלי החיים בהצלחה מודל הפעולה זיכרון גירעונות, נוירון פציעות, Aβ נטל, התצהיר NFT, כדי לחקות את המודעה (בשלבי הניסוי הנוכחי, שיעור ההישרדות קצב דגם מוצלח של המבצע יותר מ- 90%). אלה חולדות מודל מוצלח שימשו כדי למדוד את הזיכרון המרחבי שלהם עם הבדיקה מבוך המים מוריס. המשפט ניווט מיקום מצא כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום עכברוש ליקוי זיכרון הרכישה; המשפט בדיקה מצא Aβ ללא הפרדות הצבע יכול להקטין עכברוש שימור זיכרון; ומצאתי ההיפוך למשפט כי Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום עכברוש מחדש למידה ליקוי. אלה מים מוריס מבוך לבדוק נתונים מראים Aβ ללא הפרדות הצבע יכול לגרום זיכרון מרחבי עכברוש. בסך הכל, מזריק חולדות intracerebroventricularly Aβ25-35 בשילוב עם alcl מערכתיות3 ו- TGF-β1 יצר ריאלי ואמינה ויוו לספירה דמוי חיות מודל עבור המעבדה.
מחקרים קודמים הראו כי עוצמת הקול במוח של חולי אלצהיימר הוא 10% פחות מזה של אנשים בריאים. מתנוון שונים ניתן למצוא בחצי הכדור מוחי באמצעות התבוננות חזותי. מידת ניוון קליפתי קשורה באופן חיובי ליקוי זיכרון19. בהיסטולוגיה, המספר הגדול של פתולוגיה מורפולוגי חמור ואובדן של נוירון להפריע ישירות את פונקצית זיכרון לספירה חולים20. במחקר הנוכחי, התבוננות מיקרוסקופית אור/אלקטרונים מצא כי החולדות microinjected עם Aβ שערכת מוצגים השינויים הדרמטיים neuropathological, לרבות אובדן נוירון, ובהפסקות עצביים ומבנה subcellular. תוצאה זו אם יאשר ההפרעה בזיכרון המרחבי עכברוש שנגזרות Aβ שערכת, והיא דומה למצב של חולי אלצהיימר.
זה ידוע כי המוח Aβ נטל של צבירת NFT נחשבים התכונות החשובות ביותר histopathogenic לספירה. הם יכולים להרוס את המבנה עצביים להפריע האיתות העצבי, לשבש את תפקוד, לגרום סניליות מתקדמת17. המודל בעלי חיים נוכח גילו Aβ נטל NFT צבירת במוח, אשר מסכימים עם המדינה החולה לספירה. לכן, הפציעות נוירון נוכח בחולדות שנגזרות שערכת Aβ יכול לשמש כמודל ללמוד אסטרטגיית טיפול של AD לפתולוגיה עצביים.
להלן דוגמאות של הקרנת השפעות סמים במודלים עכברוש לספירה: זאו. et al., דיווחו כי שני פלבנואידים מ קערורית גבעולים ועלים (SSF) barbata קערורית (SBF) יכול להחליש עכברוש זיכרון וירידה אפופטוזיס המושרה על ידי 8,שערכת Aβ9. גואו. et al., גם דיווחו SBF יכול לעכב NFT צבירת זרחון יתר של חלבון טאו בצד Ser199 ', ' Ser214 ', ' Ser202 ', Ser404, Thr231, ירידה בביטוי חלבונים ו mRNA GSK-3β, CDK5 ו- PKA אצל חולדות שטופלו Aβ שערכת21 . במקביל, שאנג. et al., דיווחו גם כי SBF יכול לדכא את התפשטות אסטרוציט ו מיקרוגלייה, ואת התחתונה Aβ1-40, Aβ1-42, ו β-אתרים יישום. ביקוע אנזים 1 (BACE1) ביטוי mRNA במוח Aβ שערכת חולדות22. על סמך התוצאות לעיל, המודל החייתי שלנו יש יתרון על מודל אחר, כמו AD, בהם מעורבים יותר תפקוד, הפרעות במבנה.
בנוגע דגם AD-כמו אחרים, הזרקת intracerebroventricular יחיד של Aβ חולדות עלולים לגרום עכברוש זיכרון הגירעונות הנוירון אובדן, התפשטות neurogliocyte, אבל ייתכן או אולי אין התצהיר Aβ ו NFT23. חולדות נחשפים במינון גבוה Al מופיעים יש אחוזי הצלחה גבוהים לחקות לספירה, מודל בעלי חיים חסכוני, עם ליקוי זיכרון, אובדן נוירון, התפשטות neurogliocyte, ואת סנילי פלאק (SP) NFT צבירת במוח. עם זאת, המינון הגבוה של Al ועלול לגרום לפציעות עכברוש בכבד, אנורקסיה, מלווה עם ירידה במשקל24. העכברוש בגילאי הוא דגם AD-כמו עוד. העכברושים בגילאי להפגין זיכרון גירעונות, שינויים פתולוגיים מבנה עצביים/בתיוג, lipofuscin התצהיר, אבל ללא Aβ נטל NFT צבירה. חולדות של יותר מ- 24 חודשים של גיל נחשב יישון של מודל זה, לכן זה דורש פרק זמן ארוך יותר של האכלה, ובכך העלות היא17,גבוהה יותר25. SAMP8 ו APP העכברים הטרנסגניים החיקוי הכי קרוב לספירה והוא גם הכי אידיאלי מודלים עבור חוקרים לספירה. אבל שני הדגמים בעלי חיים מתומחרות גבוה יותר מוגבלים לשימוש במעבדה26,27. המודל שלנו של המודל החייתי שטופלו Aβ שערכת לעומת הדגמים בעלי חיים לעיל, כולל עלות נמוכה יותר, ביצועים גבוהים, שהופך אותו כלי אידיאלי ללמוד לספירה.
לסיכום, intracerebroventricular הזרקה של Aβ25-35 בשילוב alcl מערכתיות3 ו- TGF-β1 חולדות מציע ערך ויוו חיות מודל כדי להבין טוב יותר את ליקוי זיכרון מרחבי, פציעות עצביים, Aβ נטל, ומשקעים NFT כבסיס לספירה. מודל זה מספק מהיר ולשרוד נסיוני יחסית פשוטה עם חיים גבוהה קצב, מודל גבוה שיעור מוצלח של המבצע, כמו גם שיעור גבוה של שכפול, אשר הראו כלכלית יותר. המודל בעלי חיים בהווה מודל יעיל כדי לחקות את המודעה, יכול עוד יותר לאמת עצמה על ידי בשימוש לחקות אחרים מחלות שונות.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט נתמך על ידי הביי מחוזי מדעי הטבע קרן (מס ' C2009001007, H2014406048), הממשל הביי מחוזי של הרפואה הסינית המסורתית (מספר 05027), את נושא מפתח הבנייה של הביי מחוזי המכללה, סין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Denture base material | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China | 20170609 |
References
- Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
- Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
- Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).
- Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
- Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
- Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
- Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
- Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
- Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
- Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
- Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
- Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
- Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
- Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
- Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
- Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
- Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
- Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
- Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
- Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
- Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
- Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
- Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
- Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).
