Summary
Si tratta di un protocollo per imitare la malattia di Alzheimer in ratti dalla valutazione di danno di memoria spaziale, cambiamenti patologici di un neurone, un neurone amiloide beta proteina (Aβ) onere, e l'aggregazione di grovigli neurofibrillari, indotta tramite l'iniezione di Aβ25-35 combinato con tricloruro di alluminio e ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-β1.
Abstract
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia irreversibile, progressiva del cervello che lentamente distrugge la memoria ed è accompagnata dal cambiamento di struttura e perdita del neurone. Con l'aumento dei pazienti dell'annuncio in tutto il mondo, la patologia ed il trattamento della malattia è diventato un fuoco nell'industria farmaceutica internazionale. Perciò, l'istituzione del modello animale per imitare AD in laboratorio è di grande importanza.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per stabilire un mimo di annuncio in un animale di ratto però modello intracerebroventricular iniezione di amiloide beta proteina 25-35 (Aβ25-35) combinato con tricloruro di alluminio (AlCl3) e nucleo thalamic anterodorsal iniezione di ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-β1 (RHTGF-β1) ai ratti. Sono stati misurati i marcatori correlati dell'annuncio, tra cui: memoria spaziale, struttura di un neurone e sottostruttura, Aβ neuronale e grovigli neurofibrillary (NFT) produzione. Questo modello di ratto dimostra la compromissione della memoria spaziale, struttura di un neurone e alterazioni patologiche di sottostruttura, onere Aβ intracellulare del neurone e aggregazione NFT e fornisce un mimic stretto del disordine struttura e funzione neuronale a quella di clinica Pazienti dell'annuncio. Così, il presentato AD ratto modelprovides uno strumento prezioso in vivo per esplorare la funzione di un neurone, patologia neuronale e lo screening di stupefacenti dell'annuncio.
Introduction
È noto che l'annuncio è una malattia neurodegenerativa cronica e progressiva, con perdita di memoria graduale come la sindrome clinica principale. In patologia generale, c'è l'atrofia del tessuto nervoso, neurone e perdita di sinapsi, come pure un neurone subcellulare disturbi, struttura e funzione, che sono tutti coinvolti nello sviluppo e nella manifestazione clinica di AD1,2. È stato riferito che quando gli animali erano intracerebroventricolare iniettato con Aβ, si verificano alcuni eventi neurotossici nel cervello che coinvolgono la perdita del neurone, perturbazione di omeostasi del calcio, neurone apoptosis e specie reattive dell'ossigeno sovrapproduzione3. Tuttavia, molteplici fattori sono coinvolti nella patogenesi dell'annuncio e quindi è essenziale per stabilire un modello migliore dell'annuncio.
Un protocollo dettagliato è descritto qui per stabilire un in vivo mimico AD modello attraverso l'iniezione di intracerebroventricular di Aβ25-35 e AlCl3, combinato con l'iniezione del nucleo thalamic di anterodorsal di RHTGF-β1 ai ratti. Questo ratto modelhighly imita la funzione neuronale umana e histopathogenesis dell'annuncio, tra cui disturbi della memoria, perdita del neurone e danni alla struttura, apoptosi, onere Aβ intracellulare e NFT aggregazione4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 impedisce la formazione di Aβ solubile della Aβ depositato, e la RHTGF-β1 può promuovere la produzione di Aβ depositato e facilitare AD occorrenza10. Questo attacco da diversi fattori per il neurone è in conformità con il multi-patogenesi dell'annuncio.
L'intero esperimento ha misurato 86 giorni: la figura 1 Mostra una sequenza temporale di disegno sperimentale, con il punto di tempo di chirurgia animale, modello animale screening, test di memoria spaziale degli animali e preparazione del campione. Il primo giorno di apertura, RHTGF-β1 era microiniettati in nucleo thalamic di anterodorsal. Il secondo giorno di apertura, Aβ25-35 e AlCl3 erano microiniettati nel ventricolo laterale al giorno per 14 giorni consecutivi al mattino e 5 giorni consecutivi nel pomeriggio, rispettivamente. Tutti i ratti sono stati ammessi a recuperare per 45 giorni dopo l'operazione. Labirinto dell'acqua di Morris è stato usato per lo screening per i ratti di modello di successo con danno di memoria e per valutare la memoria spaziale dei ratti. I ratti hanno subito 4 giorni consecutivi del labirinto dell'acqua di formazione con 2 prove al giorno, e il giorno 4 di formazione, i ratti sono stati valutati con la prestazione del labirinto dell'acqua di Morris per danno di memoria. Tutti i ratti hanno continuato a essere nutriti 37 giorni dopo la proiezione del modello animale. La memoria spaziale di ratti è stata testata nel labirinto dell'acqua di Morris oltre 7 giorni consecutivi, dal giorno 79 al giorno 85 dopo l'operazione. Tutti i ratti sono stati sacrificati per decapitazione giorno 86 per la preparazione di campioni di cervello.
Figura 1. Timeline del disegno sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Questa procedura era in conformità con i regolamenti di somministrazione sperimentale animale rilasciato dal comitato dello stato della scienza e della tecnologia della Cina il 31 ottobre 198811. Gli scienziati dovrebbero seguire le linee guida stabiliti ed approvati dalle loro organizzazioni istituzionali e nazionali di regolamentazione animale.
Nota: Animali e reggenti: quattro-mese-vecchio maschio topi Sprague Dawley (300-350 g) sono stati forniti per questo esperimento. Tutti i ratti sono stati alloggiati in gruppi (quattro o cinque per gabbia) ad una temperatura di 23 ± 1 ° C con un ciclo luce-buio di 12 h. Il cibo e l'acqua era disponibile ad libitum. I ratti sono stati acclimatati per le condizioni di alloggio per 7 giorni prima che la procedura è stata effettuata. Aβ25-35 è stato disciolto in soluzione salina di DMSO 1% a 1 mg/mL e sonicato per 5 min in un oscillatore ad ultrasuoni fino a completa dissoluzione. AlCl3 e RHTGF-β1 sono stati dissolti in una soluzione salina all'1% e 0,1 mg/mL, rispettivamente. Rosso Congo, nitrato d'argento e altri prodotti chimici erano di grado analitico e sono stati acquistati da fonti commerciali ordinarie.
1. intervento chirurgico
Nota: 20 ratti Sprague-Dawley maschi erano microiniettati con Aβ mescolati nel ventricolo laterale e nucleo thalamic anterodorsal e designati come il gruppo trattato con Aβ mescolato. Un altro 20 ratti sono stati sottoposti alla stessa operazione ma ricevuto microiniezione Salina di 0,1% DMSO e designato come il gruppo sham-operated.
- Anestetizzare i ratti con 100% isoflurane per inalazione e quindi frenare su un apparato stereotassica del cervello.
- Radere il pelo sul vertice della testa con forbici chirurgiche e disinfettare con iodoforo. Poi, coprire asciugamano monouso chirurgico sulla testa.
- Fare un'incisione sulla pelle testa lungo la calvaria longitudinale mediana con forbici e bisturi chirurgici.
- Separare il tessuto sottocutaneo e la fascia, pulire il calvarium cranio con un cotone sterile asciutto per arrestare il sanguinamento e contrassegnare il bregma con un pennarello.
- Fare riferimento al ratto cervello stereotassiche mappa12; considerando il bregma come punto di origine, segnare i tre punti, nucleo thalamic anterodorsal (annuncio) (posteriore (P): 2,0 mm per il bregma; laterale (L): 1.4 mm alla linea mediana) per iniezione RHTGF-β1 e fissare una vite, il ventricolo laterale (LV) area ( posteriore (P): 0,8 mm per il bregma; laterale (L): 2,0 mm alla linea mediana) per l'iniezione Aβ25-35 e AlCl3 e il seconda posto di fissaggio a vite (anteriore (F): 2,0 mm per il bregma; laterale (L): 1,5 mm alla linea mediana).
- Delicatamente praticare tre fori di diametro di 1 mm con una punta di osso flessibile, designata a questi tre punti del cranio (1.5. passo). Non avvitare più necessario evitare pugnalare il tessuto cerebrale profonda.
- Fermare l'emorragia e pulire la superficie del cranio ripetutamente con cotone sterile asciutto.
- Inserire un ago collegato alla pompa di micro-iniezione, al cervello a 4,6 mm di profondità e delicatamente iniettare 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) nell'area di annuncio. Soggiorno dell'ago 2 min dopo l'iniezione e, lentamente, estrarre l'ago (Supplemental File 1).
- Fissare le due viti nel cranio, indicato nei punti di annuncio e la seconda vite che fissa il luogo del cranio (che sono stati designati a 1.5. passo) con un piccolo cacciavite. Non avvitare più necessario evitare pugnalare il tessuto cerebrale profonda.
- Assemblare il sistema di impianto di cannula (Supplemental File 2), inserire la cannula fittizia nella cannula guida dopo la disinfezione ad alta pressione.
- Inserire la cannula di guida in acciaio inox tubi al cervello a 4,6 mm nell'area di LV attraverso il foro del cranio (Supplemental File 3), con l'aiuto del titolare della cannula dell'apparecchiatura stereotassica dei ratti.
- Mescolare il materiale di base della protesi con protesi base acqua rapporto di 1,5 g / 1 mL, mettere la pasta per coprire il piedistallo in plastica del cannula di guida e due viti per immobilizzare la cannula di guida e fino a coprire l'incisione di tutta la pelle per evitare l'infezione della pelle.
- Il giorno 2 dell'operazione, anestetizzare i ratti con inalazione isoflurane utilizzando la macchina di anestesia animale piccolo. Estrarre la cannula fittizia, inserire la cannula interna nella cannula guida e avvitare la vite di fissaggio per immobilizzare la cannula interna.
- Impostata la cannula interna il tubo in polietilene che collega la pompa di microiniezione e regolare la velocità di iniezione da 1 μL/min. Microinject la Aβ25-35 o AlCl3 a LV.
- Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 al giorno per 14 giorni al mattino e 3 μL AlCl3 (1%) al giorno per 5 giorni nel pomeriggio sotto anestesia isoflurano.
- Attendere 5 minuti dopo aver terminato l'iniezione, delicatamente estrarre la cannula interna e inserire nuovamente la cannula fittizia nella cannula guida.
- Il giorno 15 dopo l'intervento chirurgico (che corrisponde all'ultimo giorno di iniezione di Aβ25-35) smantellare il sistema di impianto di cannula. Delicatamente rimuovere il solido materiale base della protesi dentaria con pinze e forbici chirurgiche, svitare le due viti, estrarre la cannula guida e disinfettare la ferita con betadine. Riempire il buco del cranio con cemento osseo e suturare la pelle con un metodo semplice sutura interrotti.
- Eseguire la stessa operazione con il gruppo di falsità-azionati e microinject soluzione fisiologica 0,1% DMSO.
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Assistenza infermieristica postoperatoria
- Casa 2 ratti per gabbia dopo operazione e fornire cibo per 30 giorni.
Nota: 18 ratti nel gruppo sham-operated sopravvissuto (90% tasso di successo dell'operazione) e 19 ratti nel composito-Aβ gruppo trattato sopravvissuto (tasso di successo del 95% di apertura).
- Casa 2 ratti per gabbia dopo operazione e fornire cibo per 30 giorni.
2. lo screening per la valutazione della memoria spaziale con Morris Water Maze e ratti di modello di successo
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Labirinto dell'acqua di Morris
Nota: Il labirinto ad acqua di Morris è stato usato per valutare ratto memoria spaziale13. Labirinto dell'acqua di Morris è una vasca circolare in acciaio inox con diametro di 120 cm e 50 cm di profondità. Prova del labirinto dell'acqua è stata effettuata, basato sul paradigma del "gold standard" descritto in neuroscienze comportamentali da J. Nunez14.- Annerire la piscina d'acqua con qualche goccia di colorante alimentare.
- Mantenere la profondità di acqua a 31,5 cm e la temperatura a 23 ° c ± 1 ° C.
- Impostare una piattaforma circolare in plexiglass trasparente 1,5 cm sotto la superficie dell'acqua.
- Sostengono che tutti i segnali spaziali intorno al labirinto di acqua sono invariabili durante i test del labirinto di acqua.
- Dividere la piscina in 4 quadranti uguali da linee immaginarie per raccolta dati descrittivi.
- Posizionare la piattaforma nascosta nel primo quadrante (Q1) del labirinto dell'acqua.
- Catturare il topo nuoto comportamenti (misurati dalla latenza, traiettoria o numero di attraversamento) attraverso una videocamera, sopra il labirinto di acqua collegato a un software di analisi grafica basata su computer.
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Screening per ratti di modello di successo per il gruppo trattato con Aβ composito
- Giorno 45 dell'intervento, eseguire il labirinto ad acqua di Morris formazione per 4 giorni consecutivi allo schermo per i ratti di modello di successo con danno di memoria e raccogliere il rapporto di proiezione (SR).
Nota: Il SR è definito come la latenza media di ogni ratto composited Aβ-trattati e falsità-azionati gruppo di ratti per trovare la piattaforma nascosta sotto l'acqua in superficie il giorno 4 di acqua addestramento del labirinto. "A" è la latenza media di ogni ratto Aβ-trattati mescolato a trovare la piattaforma nascosta e "B" è la latenza media della falsità-azionati gruppo di ratti per trovare la piattaforma nascosta, il giorno 4 del labirinto dell'acqua di formazione, nella seguente equazione:
Quando SR era più grande di 0.2 per un composited Aβ-trattati del ratto, ratto era considerato come un ratto di modello di successo con la memoria alterata di composited Aβ-trattati ratto15. Le prestazioni di memoria intraday è stata calcolata il valore medio dei ratti per trovare la piattaforma nascosta ai dati di 2 studi. Il processo di prova del labirinto dell'acqua di Morris è stato progettato in modo tale che i ratti sono stati autorizzati a nuotare in acqua labirinto serbatoio e ricerca per la piattaforma nascosta entro 60 s. Se un ratto non scoprire la piattaforma nascosta all'interno di 60 s, poi il ratto è stato messo sulla piattaforma con la mano di sperimentatore. Quando un ratto raggiunto sulla piattaforma nascosta (in modo indipendente o assistita), il ratto era ha lasciato stare lì per 20 s. Quindi, il ratto è stato rimosso dal serbatoio e ha permesso un recupero fisico per 10 s fra le 2 prove.
- Giorno 45 dell'intervento, eseguire il labirinto ad acqua di Morris formazione per 4 giorni consecutivi allo schermo per i ratti di modello di successo con danno di memoria e raccogliere il rapporto di proiezione (SR).
3. esame neurone
- Il post chirurgia di giorno 86, nell'ambito dell'anestesia isoflurano, eutanasia i ratti per decapitazione (Figura 1).
- Mettere il cervello sul ghiaccio e separare delicatamente i due emisferi presso il Rafe. Prendere l'emisfero sinistro del chiasma ottico e fissarlo in formaldeide 4% per l'osservazione della luce microcopy di ematossilina di neurone ed eosina (HE), rosso Congo o nitrato d'argento macchia (Vedi sezioni 4-6). Difficoltà area dell'ippocampo CA1 di giusto emisfero in glutaraldeide al 2,5% per l'osservazione di elettrone microcopy (sezione 7).
- Elaborare il cervello per la preparazione del campione di microcopy di luce/elettroni, come descritto in precedenza16,17.
4. neurone HE macchiatura
- Deparaffinizzare ogni diapositiva (ogni 20 min.) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.
- Macchia per 3 min con ematossilina (0,5% p/v) e poi sciacquare con acqua corrente per rimuovere il colorante non legato da diapositive.
- Sciacquare con acido cloridrico 0,1% in alcool per 1 s per rimuovere il colore dei nuclei non colorati.
- Immergere in soluzione di ammoniaca 0,5% per 2 minuti fino a quando il luce blu si trasforma.
- Macchia per 1 min con eosina 1%.
- Disidratare per 5 min con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
- Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.
- Osservare e contare i neuroni viventi della macchia HE a 0,125 mm in mezzo CA1 dell'ippocampo e per 0,0352 mm2 nella corteccia cerebrale ad un ingrandimento di 400x con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.
5. rosso Congo macchiatura per analizzante neurone Aβ onere
- Deparaffinizzare ogni diapositiva (20 min) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.
- Macchia per 20 min con colore rosso di Congo soluzione (0,5 g rosso Congo, 80 mL di alcole metilico, glycerinum 20 mL) di lavoro.
- Sciacquare in acqua distillata per 5 min.
- Differenziare rapidamente con la soluzione alcalina (idrossido di potassio di 0,2 g alcool/100 mL) di alcool 80% per 3 s.
- Sciacquare due volte, ciascuna per 5 minuti con acqua distillata.
- Colorante di contrasto in ematossilina di Gill per 3 min.
- Sciacquare in acqua corrente per 2 min.
- Immergere in acqua ammoniacale (aggiungere poche gocce di idrossido di ammonio per acqua di rubinetto e mescolate bene) per 30 s o fino a quando le sezioni diventano blue.
- Sciacquare in acqua corrente per 5 min.
- Disidratare con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
- Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.
- Osservare e contare le celle colorate con rosso Congo ad un ingrandimento di 400x, con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.
6. colorazione per analizzante neurone NFT formazione di nitrato d'argento
- Deparaffinizzare ogni diapositiva (20 min) con gradiente alcool (100%, 95%, 90%, 80% e 70%) distillare l'acqua in una cappa aspirante.
- Immergere in soluzione di nitrato d'argento di 20% e agente di tappatura per 20 min al buio.
- Lavare in acqua distillata due volte, 5 min per ogni volta.
- Immergere nella soluzione d'argento ammoniacale. Goccia di soluzione di ammoniaca in soluzione di nitrato d'argento 20% e aggiungere fino a quando la soluzione va da torbidità per chiarimenti. Contemporaneamente, agitare la soluzione con una bacchetta di vetro per 15 min e poi mettere nell'idrossido di ammonio 1% diluito per 2 min.
- Porre il vetrino nella soluzione lavoro in via di sviluppo per 3-7 minuti fino a quando il blocco nero nell'assone può essere osservato.
- Immergere nella soluzione di ammoniaca 0,1% diluito per 1 minuto e poi risciacquare con acqua per 1 min.
- Smaltire con tiosolfato di sodio 5% per 2 minuti e poi sciacquare con acqua per 5 minuti.
- Disidratare con gradiente (alcool di 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).
- Deselezionare in xilene e montare con mezzo di montaggio resinoso.
- Osservare e registrare la cella per la macchia di nitrato d'argento ad un ingrandimento di 400x con un microscopio ottico da una persona accecata per il disegno sperimentale.
7. hippocampal Neuron ultrastruttura misura
- Tagliare ippocampo del ratto CA1 in vari cubi (1 x 1 x 1 mm3) e inserire in glutaraldeide al 2,5% per 2 ore a 4 ° C.
- Sciacquare i cubi con PBS tre volte (pH 7.2, 10 min per ogni volta).
- Difficoltà i cubi in 1% di acido osmico per 2 ore a 4 ° C.
- Sciacquare i cubi in doppia acqua distillata 3 x (10 min per ogni volta).
- Disidratare con gradiente alcol 50%, 70% e 90% (10 min per ciascuno), 100% due volte (15 min per ogni volta).
- Sostituire l'ossido di propilene due volte (15 min per ogni volta), propilene ossido: resina 1:1 (60 min per ogni volta che a temperatura ambiente) e ossido di propilene: resina 1:4 (60 min per ogni volta che a temperatura ambiente). Mettere a bagno in resina (120 min, a temperatura ambiente).
- Incorporare nell'812 EPON e polimerizzare (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
- Tagliare le sezioni semifini (1 µm), macchia di blu di metilene e localizzare sotto il microscopio.
- Macchia le sezioni ultrasottili (50 nm) con acetato di uranile-o e piombo citrato.
- Esaminare sotto un microscopio elettronico a JEM-1400 e raccogliere immagini.
Representative Results
Tutti i dati sono presentati come media ± SEM. SAS/STAT pacchetto è stato utilizzato per calcolare l'analisi statistica. Le differenze di gruppo in latenza per trovare la piattaforma nascosta nella acquisizione di memoria e test di ri-apprendimento di memoria sono state analizzate da bidirezionale analisi della varianza (ANOVA) con misure ripetute. Le differenze di gruppo nella prova della sonda e numero di neuroni sono state analizzate da One-way ANOVA seguita da test di multiplo-portata di Duncan. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo18.
Screening per i ratti di modello di successo con danno di memoria per il gruppo trattato con Aβ composito:
I risultati in Figura 2AA1 e 2AA2 mostrano che il gruppo di ratti falsità-azionati sempre nuotato liberamente ed i ratti di compositi gruppo Aβ-trattato (Figura 2AB1, AB2) sempre nuotato intorno il perimetro della piscina in nuoto di adattamento nella Labirinto di acqua di Morris. Oltre i 4 giorni di screening per ratti di modello insufficienza di memoria, tutti i ratti avevano progressivamente declinando volte per trovare la piattaforma nascosta (latenza) (Figura 2B). Il giorno 4 di Morris acqua labirinto formazione, se il SR era più di 0,2 (che era basato sulla latenza di ogni ratto composited Aβ-trattati e falsità-azionati gruppo di ratti per trovare la piattaforma nascosta), poi il ratto composited Aβ-trattati è stato considerato un successo ratto di modello con danno di memoria. 18 dei 19 ratti (94,70%) che è sopravvissuto l'operazione passata i ratti screening. 6 modello di successo di ogni gruppo sono stati scelti per i seguenti esperimenti.
Figura 2 . Screening per i ratti di modello di successo con danno di memoria nel gruppo trattato con Aβ composito utilizzando l'acqua di Morris labirinto formazione. (A) il nuoto di adattamento traiettoria dei ratti nel labirinto dell'acqua di Morris. (AA1–AA2) Gruppo di falsità-azionati; (AB1–AB2) Gruppo trattato con Aβ mescolato. Latenza media (B) per trovare la piattaforma nascosta per 4 giorni consecutivi del processo di screening in acqua Morris labirinto formazione per il gruppo di falsità-azionati e il gruppo trattato con Aβ mescolato. Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited causato ratto acquisizione di memoria e memoria ri-apprendimento disabilità:
L'acquisizione di memoria del ratto è stato determinato nella prova di navigazione posizionamento il giorno 1 e 2 della prova del labirinto dell'acqua di Morris, che corrispondeva alla chirurgia dell'alberino giorno 79 e 80. Durante i 2 giorni dell'acquisizione memoria prova, tutti i ratti esposti progressivamente in declino latenza per trovare la piattaforma nascosta. Come mostrato nella Figura 3, le latenze del composito gruppo Aβ-trattato per trovare la piattaforma nascosta erano 360.67% e 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) superiori a quelli del gruppo di falsità-azionati il giorno 1 e 2 dell'acqua Morris labirinto prova, rispettivamente. Questo indica che la Aβ composto può indurre il danno di acquisizione di memoria in ratti.
Il ratto memoria ri-apprendimento è stata analizzata mediante l'inversione prova il giorno 4, 5 e 6 della prova del labirinto dell'acqua Morris, che corrispondeva alla chirurgia dell'alberino giorno 82, 83 e 84. Come mostrato nella Figura 3, le latenze del composito gruppo Aβ-trattato per trovare la piattaforma nascosta erano 306.20%, 650.16% e 936.92% di tempo più lungo rispetto a quelli del gruppo di falsità-azionati (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01). Questo dimostra che la Aβ compositi può elevare la memoria ri-apprendimento danno in ratti (Figura 3).
Figura 3 . Aβ composited causato ratto acquisizione e memoria memoria ri-apprendimento disabilità. La prova di navigazione posizionamento è stata utilizzata per valutare l'acquisizione di memoria di 2 giorni consecutivi nuoto conquista il giorno 1 e 2 nella prova del labirinto dell'acqua di Morris. Questi sono stati effettuati su chirurgia dell'alberino giorno 79 e 80. L'inversione di prova è stato utilizzato per valutare la memoria ri-apprendimento di 3 giorni consecutivi, il Punteggio di nuoto il giorno 4, 5 e 6 nella prova del labirinto dell'acqua Morris, che corrispondeva al giorno 82, 83 e 84 dell'operazione. I grafici di grafico linea mostrano la latenza media per trovare la piattaforma nascosta per ogni gruppo il giorno 1, 2, 4, 5 e 6 nella prova del labirinto dell'acqua di Morris. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie (giorno x gruppo) con misure ripetute. Media ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, rispetto al gruppo di Sham-operated. Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited causato danno ritenzione di ratto di memoria:
La conservazione della memoria del ratto è stata misurata dalla prova della sonda il giorno 3 di prova del labirinto dell'acqua Morris, che ha corrisposto alla chirurgia di giorno 81 post. Nella conservazione della memoria 1 giorno prova, il gruppo trattato con Aβ composited preso meno tempo di nuoto, nuoto e attraversando numero in Q1 entro 60 s, che corrispondeva al 32,14%, 30.11% e 78.95% (p < 0,01), rispettivamente, rispetto a quelli della gruppo di falsità-azionati (Figura 4A, 4B). Questi risultati indicano che il composto Aβ può produrre danno di ritenzione della memoria in ratti.
Figura 4 . Aβ composte prodotte danno ritenzione di ratto memoria. La prova della sonda è stata utilizzata per valutare la conservazione della memoria di 1 giorno conquista il 3 ° giorno di nuoto nella prova del labirinto dell'acqua di Morris, che è stato condotto su chirurgia dell'alberino giorno 81. (A) tempo di nuoto, nuoto e attraversando numero in Q1 entro 60 s nella prova della sonda (nessuna piattaforma). Dati sono stati analizzati con il test di multiplo-gamma one-way ANOVA. Media ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, contro il gruppo Sham-operated. (B) il nuoto traiettoria dei ratti nella prova della sonda. (A) Sham-operated gruppo, mostrando una maggiore tempo di nuoto e distanza del quadrante di destinazione (Q1). (B) gruppo trattato con Aβ Composited risultati meno tempo nuoto e distanza nel quadrante di destinazione (Q1). Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited influenzato velocità di Swimming del ratto:
Il ratto velocità di nuoto è stato calcolato dalla piattaforma visibile prova il giorno 7 di prova del labirinto di Morris acqua, che corrispondeva al giorno 85 post chirurgia. Il ratto di velocità, in base al calcolo della distanza e tempo di fare un passo sulla piattaforma, di ogni gruppo in piscina di nuoto non era significativamente differente. Di conseguenza, potrebbero essere escluse le differenze individuali nel ratto velocità di nuoto, che indica che la motivazione e le capacità motorie erano essenzialmente intatte in tutti i ratti (Figura 5).
Figura 5 . Aβ composited influenzato velocità di swimming del ratto. Il ratto velocità di nuoto è stato calcolato dalla piattaforma visibile prova il giorno 7 di prova del labirinto dell'acqua di Morris, che è stato condotto il giorno 85 dopo l'operazione. Il ratto di velocità di ogni gruppo di nuoto non era significativamente differente. Dati sono stati analizzati con il test di multiplo-gamma one-way ANOVA. Media ± SEM. n = 6. Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited causato cambiamento morfologico un neurone del ratto:
Tutti i ratti sono stati uccisi per decapitazione giorno 86 della chirurgia. L'ispezione visiva trovato che una superficie gialla o una corteccia cerebrale sottile o compressa apparso in ratti trattati con Aβ composti diversi. Rispetto al gruppo di falsità-azionati (Figura 6A,A2), osservazione di microscopia ottica del gruppo Aβ-trattato composto da lui macchiato, trovato cambiamenti patologici Neurone ippocampale, quali degenerazione neurofibrillary, neuronophagia, Picnosi nucleare e marginazione nucleare (Figura 6AB2). Inoltre, la parte della corteccia cerebrale nel gruppo trattato con Aβ composito ha rivelato la necrosi colliquativo tipico, che fu caratterizzata da membrane interrotte delle cellule, i nuclei frammentati e infiltrazione di cellule infiammatorie estesa nella regione necrotico ( Figura 6A B3). Questo indica che la Aβ compositi può provocare lesioni patologiche strutturali neuronali in ratti.
Oltre alle alterazioni patologiche della struttura di un neurone, rispetto al gruppo di falsità-azionati, il conteggio del neurone è stato diminuito anche significativamente nell'ippocampo e corteccia cerebrale (tranne che per l'esempio di necrosi colliquative) dei compositi Gruppo trattato con Aβ. Il numero di neuroni era 63.86% (p < 0,01) inferiore a quello del gruppo sham-operated in hippocampal CA1 sezioni di 0,125 mm e 55.46% (p < 0,01) inferiore a sezioni di corteccia cerebrale di 0,0352 mm2 (Figura 6B), che suggerisce che la Aβ compositi può provocare un conteggio di neurone in diminuzione.
Figura 6 . Aβ composited causato cambiamento morfologico neuronale ratto. (A) immagini rappresentative dei neuroni corticali ippocampali e cerebrali, macchiati con lui. (A1–B1) Ippocampo 40 x; (A2–B2) Ippocampo CA1 400x; (A3–B3) Corteccia cerebrale x 400. (A1–A3) Gruppo di falsità-azionati; (B1–B3) Gruppo trattato con Aβ mescolato; Mostra perdita del neurone contrassegnata, degenerazione neurofibrillary (→), neuronophagia (←), picnosi nucleare (↗), membrane cellulari nucleare marginazione (↙) nell'ippocampo, colliquativo tipico necrosi (★), interrotto, un numero elevato di cellule infiammatorie infiltrate nella corteccia cerebrale in parte del gruppo composito di Aβ-trattati. Barra della scala di A1, B1 = 10 µm; Barra della scala di A2, A3, B2, B3 = 100 µm. (B) numero di neuroni con la macchia di HE nell'ippocampo e corteccia cerebrale, che sono stati contati sotto un microscopio chiaro (400 x). Ogni volume rappresenta la media ± SEM da 9 campi visivi di 3 campioni indipendenti (n = 3). ** p < 0.01, rispetto al gruppo di Sham-operated. Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La microscopia elettronica osservato l'ultrastruttura subcellulare dei neuroni di ippocampo. La sottostruttura di neuroni ippocampali nel gruppo trattato con Aβ composto (figura 7B1 – B4) significativamente sono stati distrutti, mostrando gonfiamento mitocondriale e rottura di cristae, densità aumentata dell'elettrone mitocondriale, dilatata grezzo Reticolo endoplasmatico, depolimerizzate poliribosomi e polymicrotubules, alcuni densità post-sinaptica (PSD), molti i lisosomi secondari e lipofuscin sedimento nel citoplasma, rispetto al gruppo di falsità-azionati (figura 7A1 – A4). La membrana nucleare è stato grezzo e infossati, il euchromatin è stato condensato e denaturato, gli strati del fodero di myelin sono stati sciolti o degenerazione e assoni interni e fibre sono stati attenuati. Questi risultati dimostrano che la Aβ compositi può produrre danni alla sub-struttura neurone in ratti.
Figura 7 . Struttura subcellulare del neurone ippocampale valutata dall'osservazione al microscopio elettronico. A1 -A4: gruppo Sham-operated. Barra della scala di A1 = 4 µm, 12, 000 x; Barra della scala di A2 = 3 µm, 15, 000 x; Barra della scala della A3 = 5 µm, 10, 000 x; Barra della scala della A4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1–B4) Gruppo trattato con Aβ mescolato. (B1) Neurone e pyknosis nucleare (←), dell'eucromatina condensa o degenerazione (#), rigonfiamento di astrociti piedi (*), mitocondri di elettroni ad alta densità (▲), guaina mielinica strati sciolti o attenuazione (→); (B2) Maggiore GFAP, mitocondri di elettroni ad alta densità (▲), guaina mielinica strati sciolti o attenuazione (), i lisosomi secondari maggiore (↑), periciti picnosi, condensa l'eucromatina periciti o degenerazione (☆), rigonfiamento di astrociti piedi (*), densità dell'elettrone ad alta mitocondri (▲), più lipofuscin (↓), guaina mielinica strati sciolti o attenuazione (→). B4: più neurotrasmettitore eccitatorio (#), elettroni ad alta densità o lesioni della membrana i mitocondri (▲), meno synapsis. Barra della scala di B1, B2 = 10 µm, 5, 000 x; Barra della scala di B3 = 5 µm, 8, 000 x; Barra della scala del B4 = 1 µm, 40, 000 x. Nella figura è stata modificata da riferimento 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited causato Aβ onere in neuroni del ratto:
Colorazione rosso Congo è stato utilizzato per rilevare l'onere Aβ sui neuroni. I risultati mostrano che la Aβ mescolati in particolare può indurre l'onere Aβ intracellulare nell'ippocampo del ratto e corteccia cerebrale (Figura 8A). Il numero positivo delle cellule con Aβ rosso macchiato di rosso Congo nell'ippocampo e corteccia cerebrale del gruppo trattato di Aβ composito è 8,05 e 4.09 volte (p < 0,01) superiori a quelli del gruppo di falsità-azionati (Figura 8B). Questo dimostra che Aβ compositi può aumentare onere Aβ neurone in ratti.
Figura 8 . Aβ composited causato onere Aβ nel ratto neuroni. (A) immagini rappresentative del neurone Aβ positivo macchiato di rosso Congo nell'ippocampo e cerebrale corticale. (A1–B1) Ippocampo CA1 400x; (A2–B2) Corteccia cerebrale x 400. (A1–A2) Gruppo di falsità-azionati; (B1–B2) Gruppo composto di Aβ-trattato, Mostra più Aβ positivo cellule macchiate di rosso Congo. Barra della scala = 10 µm, 400 x. (B) i numeri positivi dei neuroni Aβ tinto di colore rosso di Congo nell'ippocampo e corteccia cerebrale, che sono stati contati sotto un microscopio chiaro (400 x). Ogni volume rappresenta la media ± SEM da 9 campi visivi di 3 campioni indipendenti (n = 3). ** p < 0.01, rispetto al gruppo di Sham-operated. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Aβ composited causato NFT deposizione in neuroni del ratto:
Macchiatura di nitrato d'argento è stata usata per la rilevazione della deposizione di NFT in neuroni. I risultati mostrano che composited Aβ notevolmente può causare la deposizione di NFT intracellulare nel ratto ippocampo e corteccia cerebrale (Figura 9A). Il numero positivo delle cellule con NFT marrone macchiato di nitrato d'argento nell'ippocampo e corteccia cerebrale del gruppo trattato di Aβ composito è 9.75 e 4.82 volte (p < 0,01) superiori a quelli del gruppo di falsità-azionati (Figura 9B ). Questo dimostra che la Aβ compositi può aumentare l'aggregazione di NFT neurone in ratti.
Figura 9 . Aβ composited causato aggregazione NFT nel ratto neuroni. (A) immagini rappresentative di neuroni positivi NFT macchiati di nitrato d'argento nell'ippocampo e corteccia cerebrale. (A1–B1) Ippocampo CA1 400x; (A2–B2) Corteccia cerebrale x 400. (A1–A2) Gruppo di falsità-azionati; (B1–B2) Gruppo trattato con Aβ mescolato. il NFT più risultati positivi cella macchiato di nitrato di argento nel gruppo trattato con compositi. Barra della scala = 10 µm, 400 x. (B) positivo NFT neuroni numeri di macchiato di nitrato d'argento nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale, che sono stati contati sotto un microscopio chiaro (400 x). Ogni volume rappresenta la media ± SEM da 9 campi visivi di 3 campioni indipendenti (n = 3). ** p < 0.01, rispetto al gruppo di Sham-operated. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
È noto che la perdita della memoria e dell'apprendimento sono i principali sintomi clinici in pazienti AD2. La procedura qui descritta è un metodo in vivo per studiare AD; Abbiamo adattato un protocollo precedentemente pubblicato che testato un farmaco per alleviare i deficit di memoria e lesioni di un neurone in un modello di ratto4. Il nostro protocollo fornisce dettagli importanti per ottenere dati importanti, come pure un alto tasso di sopravvivenza degli animali che modellano con successo il funzionamento, i deficit di memoria, lesioni del neurone, onere Aβ e deposizione di NFT, per imitare l'annuncio (nell'esperimento attuale, il tasso di sopravvivenza e tasso di modello di successo dell'operazione sono più del 90%). Questi ratti di modello di successo sono stati usati per misurare la loro memoria spaziale con prova del labirinto dell'acqua di Morris. La prova di navigazione posizionamento ha trovato che la Aβ compositi può causare danno di acquisizione di ratto di memoria; la prova della sonda ha trovato che la Aβ compositi può ridurre la conservazione della memoria del ratto; e l'inversione prova abbiamo trovato che la Aβ compositi può provocare nel ratto ri-apprendimento danno. Questi dati di test del labirinto dell'acqua di Morris mostrano che la Aβ composto può indurre memoria spaziale del ratto. Nel complesso, l'iniezione intracerebroventricolare di ratti con Aβ25-35 in combinazione con AlCl3 e TGF-β1 creato un fattibile e credibile in vivo AD-come modello animale per il laboratorio.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che il volume del cervello nei pazienti dell'annuncio è del 10% inferiore a quella dei soggetti sani. Atrofie varie possono essere trovate nell'emisfero cerebrale di osservazione visiva. Il grado di atrofia corticale è positivamente correlato al danno memoria19. L'istologia, il gran numero di perdita del neurone e grave patologia morfologica disturba direttamente la funzione di memoria in pazienti AD20. Nello studio presente, osservazione al microscopio luce/elettronico trovato che i ratti microiniettati con Aβ composited visualizzato drammatici cambiamenti neuropathological, tra cui la perdita del neurone e la rottura della struttura di un neurone e subcellulare. Questo risultato conferma il disordine di memoria spaziale del ratto indotto da Aβ mescolati ed è simile allo stato dei pazienti dell'annuncio.
È noto che l'onere Aβ di cervello e aggregazione NFT sono considerati i più importanti tratti di histopathogenic in annuncio. Possono distruggere la struttura di un neurone, disturbare la segnalazione neurale, disturba la funzione neuronale e provocare demenza avanzata17. Il presente modello animale ha trovato onere Aβ e aggregazione NFT nel cervello, che sono d'accordo con lo stato di paziente AD. Di conseguenza, le lesioni del neurone presenti in ratti indotti da Aβ composited utilizzabile come modello per studiare la patologia neuronale e strategia di trattamento dell'annuncio.
I seguenti sono esempi di screening gli effetti della droga nei modelli del ratto AD: Zhao et al., ha riferito che entrambi i flavonoidi da Scutellaria steli e foglie (SSF) e Scutellaria barbata (SBF) può attenuare il danno di memoria di ratto e apoptosi indotta da composited Aβ8,9. Guo et al., inoltre ha segnalato che SBF può inibire l'aggregazione NFT e sovra-fosforilazione di proteina tau al fianco di Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 e Thr231 e diminuire l'espressione di mRNA e di proteina GSK-3beta, CDK5 e PKA in ratti trattati con Aβ compositi21 . Contemporaneamente, Shang et al., hanno anche riferito che SBF può sopprimere la proliferazione di astrociti e microglia e inferiore Aβ1-40, Aβ1-42, e β-site APP cleaving enzima 1 (BACE1) espressione del mRNA nel cervello di Aβ composited ratti22. Basato su risultati di cui sopra, il nostro modello animale è vantaggioso rispetto altri modello annuncio-come, che coinvolgono più funzione di un neurone e struttura disordine.
Per quanto riguarda altri modello annuncio-come, intracerebroventricular singola iniezione di Aβ ai ratti possa causare i deficit di memoria di ratto, perdita del neurone e la proliferazione di neurogliocyte, ma può o non può avere di deposizione di Aβ e NFT23. Ratti esposti ad alte dosi Al sembrano avere un alto tasso di successo e mimico AD un conveniente modello animale, con danno di memoria, perdita del neurone, proliferazione di neurogliocyte e placca senile (SP) e aggregazione NFT nel cervello. Tuttavia, la dose elevata di Al può causare lesioni del fegato del ratto e anoressia, accompagnata con diminuito peso24. Ratto invecchiato è un altro annuncio-come modello. I ratti invecchiati dimostrano i deficit di memoria, cambiamenti patologici di un neurone struttura/sottostruttura, deposizione di lipofuscin, ma senza onere Aβ e aggregazione di NFT. Ratti di più di 24 mesi di età sono considerati invecchiato per questo modello e pertanto richiede un periodo più lungo di alimentazione e quindi il costo è più elevato17,25. Topi transgenici SAMP8 e APP sono il mimic più vicino a questo annuncio e sono più i modelli ideali per lo studio di annuncio. Ma entrambi i modelli animali sono più costosi e sono limitati a utilizzare nel laboratorio26,27. Rispetto ai modelli animali di cui sopra, il nostro modello di composto modello animale Aβ-trattati ha un più a basso costo e ad alte prestazioni, che lo rende uno strumento ideale per lo studio di annuncio.
In conclusione, iniezione di intracerebroventricular di Aβ25-35 combinata con AlCl3 e TGF-β1 ai ratti offre un prezioso in vivo modello animale per capire meglio il danno di memoria spaziale, lesioni neuronali, onere Aβ e deposizione di NFT Annuncio sottostante. Questo modello fornisce una veloce e relativamente semplice protocollo sperimentale con un animale di alto sopravvivere tasso e tasso di successo di alta modello di funzionamento, nonché un alto tasso di duplicazione, che ha dimostrato di essere più economico. Il presente modello animale è un modello efficace di imitare AD e può convalidare ulteriormente da utilizzato per simulare varie altre malattie.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Scienza naturale provinciale Hebei (No. C2009001007, H2014406048), l'amministrazione provinciale di Hebei della medicina tradizionale cinese (n. 05027) e il progetto di costruzione di tema chiave del Collegio Provinciale di Hebei, Cina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Denture base material | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China | 20170609 |
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