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Cancer Research

Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Este protocolo describe un proceso analítico eficaz y práctico de la extracción de muestra y determinación simultánea de múltiples fármacos, doxorrubicina (DOX), mitomycin C (MMC) y un metabolito DOX cardio tóxico, doxorubicinol (DOXol), en lo biológico muestras de un modelo de tumor de mama preclínicos tratadas con nanopartículas formulaciones de combinación de fármacos sinérgicos.

Abstract

Quimioterapia de combinación se utiliza con frecuencia en la clínica para el tratamiento del cáncer; sin embargo, los efectos adversos asociados al tejido normal pueden limitar su beneficio terapéutico. Combinación de fármacos basados en nanopartículas se ha demostrado para mitigar los problemas planteados por la terapia de la combinación libre de drogas. Nuestros estudios previos han demostrado que la combinación de dos fármacos contra el cáncer, doxorrubicina (DOX) y mitomicina C (MMC), produce un efecto sinérgico contra ambos murino y células de cáncer de mama en vitro. DOX y MMC Co cargados de lípidos de polímero híbrido nanopartículas (DMPLN) omite varias bombas transportador de eflujo que confieren multirresistencia y demostraron mayor eficacia en modelos de tumores de mama. En comparación con las formas de solución convencional, tal eficacia superior de DMPLN fue atribuida a la farmacocinética sincronizada de DOX y MMC y biodisponibilidad intracelular creciente de drogas dentro de las células del tumor de nanocarrier PLN.

Para evaluar la farmacocinética y la bio-distribución de co administra DOX y MMC en solución libre y formas de nanopartículas, un método simple y eficiente Análisis de múltiples fármacos con alto rendimiento de fase inversa de la cromatografía líquida (HPLC) fue desarrollado. En contraste con métodos previamente divulgados que analizan individualmente DOX o MMC en el plasma, este nuevo método HPLC es capaz de cuantificar simultáneamente DOX, MMC y un metabolito importante de DOX cardio tóxico, doxorubicinol (DOXol), en diversas matrices biológicas ( por ejemplo, sangre, tumor de mama y el corazón). Una doble punta de prueba fluorescente y ultravioleta absorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) se utilizó como estándar interno (I.S.) para la detección de un solo paso de múltiples análisis de drogas con longitudes de onda de detección diferentes. Este método fue aplicado con éxito para determinar la concentración de DOX y MMC por enfoques de solución y nanopartículas en sangre entera y tejidos varios en un modelo Murino ortotópico mama tumor. El método analítico que se presenta es una herramienta útil para el análisis clínico previo de entrega basados en nanopartículas de combinaciones de fármacos.

Introduction

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La quimioterapia es una modalidad de tratamiento primario para muchos tipos de cáncer, pero a menudo se asocia con efectos adversos graves y eficacia limitada debido a la resistencia a los medicamentos y otros factores1,2,3. Para mejorar el resultado de la quimioterapia, se han aplicado regímenes de combinación de fármacos en la clínica basada en consideraciones tales como la no superposición de toxicidades, diferentes mecanismos de acción de los fármacos y drogas no-cross resistencia4,5 , 6. en los ensayos clínicos, una mejor tasa de respuesta del tumor a menudo se observó utilizando simultáneamente administra combinaciones de fármacos en comparación con un régimen de drogas secuencial entrega7,8. Sin embargo, debido a la bio-distribución óptima de droga libre formas, inyección simultánea de múltiples drogas puede causar toxicidad prominente tejido normal que compensa el efecto terapéutico9,10,11. Administración de fármacos basados en Nanocarrier ha demostrado para alterar la farmacocinética y la bio-distribución de medicamentos encapsulados, mejorar la acumulación orientada a tumor12,13,14. Como los revisados en nuestros últimos artículos, nanopartículas cargadas junto con combinaciones de fármacos sinérgicos han demostrado la capacidad para mitigar los problemas de combinaciones de medicamentos libre, debido a su controlada entrega Co temporal y espacial de múltiples drogas al tejido del tumor, permitiendo efectos sinérgicos de la droga contra el cáncer de células de4,15,16. Como resultado, han demostrado una eficacia terapéutica superior y baja toxicidad en ambos estudios preclínicos y clínicos4,17,18.

Nuestros en vitro estudios anteriores encontraron que la combinación de dos fármacos contra el cáncer, doxorrubicina (DOX) y mitomicina C (MMC), produce un efecto sinérgico contra varias líneas de células de cáncer de mama y, además, co carga DOX y MMC en lípidos de polímero híbrido nanopartículas (DMPLN) superaron varios resistente a múltiples fármacos asociados emanación bombas (por ejemplo, P-glicoproteína y proteína resistente al cáncer de mama)19,20,21. In vivo, DMPLN permitió entrega cooperación espacial y temporal de DOX y MMC a los sitios del tumor y mayor biodisponibilidad de los fármacos dentro de células de cáncer, como lo indica la moderación de la formación de los metabolitos DOX doxorubicinol (DOXol)22. Como resultado, el DMPLN mayor apoptosis de las células tumorales, inhibición del crecimiento tumoral y supervivencia prolongada host para libre combinación de DOX y MMC o liposomal DOX formulación22,23,24, 25.

Analizando la cantidad de drogas realizada conjuntamente por un nanocarrier es fundamental para el diseño de formulaciones de nanopartículas efectivas. Se han desarrollado muchos métodos para analizar el nivel de plasma de dosis únicas de DOX o MMC utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) solo o en combinación con la espectrometría de masas (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. sin embargo, estos métodos son a menudo lentos y poco práctico para la terapia de combinación ya que un gran número de muestras biológicas deben prepararse por separado para el análisis de múltiples fármacos (a veces incluidos los metabilitos de la droga). Además de la Unión a proteínas plasmáticas fuerte de DOX y MMC, células de sangre rojas también tienen una gran capacidad para enlazar y concentrar muchas drogas anticáncer35,36. Así, el análisis del plasma para DOX o MMC puede ofuscar concentraciones de la droga de sangre real. El presente trabajo (figura 1) describe un simple y sólido método de análisis de drogas múltiples mediante HPLC de fase inversa simultáneamente extraer y cuantificar DOX, MMC y el DOX metabolito doxorubicinol (DOXol) de sangre entera y tejidos varios ( por ejemplo, tumores). Se ha aplicado con éxito para determinar la farmacocinética y bio-distribución de DOX y MMC, así como la formación de DOXol después de la administración de fármacos vía libres soluciones o formas de nanopartículas (es decir, DMPLN y DOX liposomal) en un orthotopically implantar modelo de tumor de mama murino ratones después de intravenoso (i.v.) de inyección22.

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Protocol

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todos los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado Comité de Universidad red de Salud Animal del Instituto de cáncer de Ontario y realizados de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal.

1. preparación de muestras biológicas

  1. recoger la sangre, los órganos principales y tumor de mama en momentos predeterminados después de la administración intravenosa (i.v.) de drogas que contienen formulaciones (p. ej., DMPLN, DOX liposómica)
    1. inyectar un i.v. de ratón con tumores de mama con una formulación que contiene el medicamento preparada.
    2. Anestesiar el ratón en momentos señalados (por ejemplo, 15 min) dando inhalables 2% isoflurano en un compartimiento sellado.
    3. Pone el ratón anestesiado en su espalda y puso su nariz a través de una boquilla que suministra constantemente 2% isoflurano.
      Nota: Para asegurarse de que el ratón somete a anestesia profunda, Pellizque suavemente extremidades delanteras del ratón y buscar cualquier movimiento que crispa.
    4. Limpiar las regiones de tórax y abdomen con etanol al 70% y llevar a cabo un procedimiento terminal de punción cardiaca en los ratones anestesiados profundos usando una jeringa heparinizada 1 mL y una aguja de 23 G.
    5. Recoge la sangre en un etiquetado sodio heparina rocía el tubo de plástico y agite suavemente el tubo para asegurarse de recoger sangre entra en contacto con la heparina revestida de la pared del tubo. Recoger un mínimo de 50 μl de sangre entera. Siempre mantenga las muestras en hielo.
    6. Cinta de los cuatro miembros del ratón para fijarlo y abrir la cavidad abdominal y la caja torácica del ratón utilizando un par de tijeras y pinzas. Cambio de los intestinos al lado y empujar el hígado hacia arriba para exponer suficientemente la vena porta. Cortar la vena porta para el drenaje de sangre.
    7. Inundar el cuerpo de todo ratón con 50 mL de solución salina 0.9% helada a través del corazón utilizando una jeringa de 10 mL con una aguja de 25 G.
      Nota: Doblar la aguja a 90° para guiar la jeringa a la vena porta.
    8. Órganos de impuestos especiales en el siguiente orden: corazón, pulmón, hígado, bazo, riñones. Luego, separar el tumor del pecho de los tejidos conectivos circundantes mediante un par de tijeras de incisión en la almohadilla de grasa mamaria derecha del ratón. Recoja todos los órganos individualmente en tubos de polipropileno de 1.5 mL y congélelos rápidamente en nitrógeno líquido.
      ​ Nota: separar la vesícula biliar desde el hígado.
    9. Almacenar la sangre a 4 ° C y suprimido los tejidos en el congelador de-80 ° C hasta su posterior análisis HPLC.
  2. Extracto de DOX, MMC y DOXol de matrices biológicas.
    1. Pesan todos los tejidos disecados congelados rápidamente y transferir a un tubo cónico de fondo redondeado de 13 mL. Para evitar posibles drogas metabolismo o degradación, mantener las muestras en hielo.
    2. Agregar de 1-5 mL de tampón de lisis celular helada en el tubo de.
      Nota: El volumen de buffer a utilizar depende del peso de tejido basado en la razón tejido-buffer de 1 g: 5 mL (w/v); para pequeños órganos, como corazón y bazo, la proporción es de 1 g: 2 mL.
    3. Utilizar un movimiento de movimiento arriba-abajo para homogeneizar las muestras de tejido en el hielo a una velocidad de 18.000 rpm usando un homogeneizador de mano eléctrica.
      Nota: Homogeneización completa requiere aproximadamente 3 a 5 repeticiones de un proceso de homogeneización cortos de menos de 15 s, seguido del enfriamiento con hielo entre cada corto homogeneización del tejido.
    4. Lavar la sonda de generador de dientes de Sierra de 10 mm de la homogeneizadora con agua destilada desionizada (DDI) H 2 O, etanol al 70% y luego DDI H 2 O entre cada muestra de tejido para evitar la contaminación cruzada.
    5. Transferir 50 μl de homogenado de tejidos o sangre entera en un tubo de microcentrífuga polipropileno de 1.5 mL y spike con 5 μl de una interna estándar (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) en el tubo de.
      Nota: solución 4-MU se preparó en metanol aquí.
    6. Añadir 250 μl de un solvente de extracción helada al tubo que contiene sangre o tejido homogeneizado.
      Nota: El disolvente de extracción consiste en 60% acetonitrilo (ACN) y acetato de amonio 40% (5 mM) con pH ajustado a pH = 3,5 con 0.05% de ácido fórmico. Utilizar una muestra de 1:5 (v/v): solvente de extracción relación.
    7. Vortex vigorosamente la mezcla durante 2 min, centrifugar a 3.000 x g de fuerza a 4 o C por 10 min y pipetee 200 μL de sobrenadante en otro tubo de microcentrífuga fresco previamente enfriada.
    8. Evapórese sobrenadante a 60 ° C bajo una corriente lenta de nitrógeno con la protección de la luz.
    9. Reconstituir el residuo seco con 100 μl de metanol helada, vortex vigorosamente por 30 s y centrifugue a 3000 x g a 4 ° C por 5 min otra
    10. Transferir el sobrenadante a un inserto HPLC frasco y colocar frascos de la muestra en una bandeja de automuestreador para la inyección.

2. Instrumentación HPLC y parámetros de operación

  1. fase móvil HPLC preparar con reproducibilidad consistente
    1. medida de grado HPLC H 2 O utilizando una probeta graduada de 500 mL.
    2. Medir 500 mL de acetonitrilo grado HPLC (ACN) usando un cilindro graduado separado.
    3. Con cuidado añada 0,5 mL de ácido trifluoroacético (TFA) (PRECAUCIÓN) en cada una de 500 mL de H 2 O y la CAN para obtener la fase móvil de H 2 O y ACN que contiene 0.1% TFA, respectivamente.
      Nota: TFA es corrosivo y tóxico y debe ser manejado bajo una campana de laboratorio. Todas las mezclas solventes están preparadas a temperatura ambiente.
    4. Fases móviles filtro a través de un filtro de membrana de nylon con un 0.45 μm tamaño de poro y transferir en limpiamos botellas de depósito HPLC.
  2. Instrumentación instalación HPLC para la detección simultánea de DOX, MMC y DOXol y I.S. 4-MU.
    1. Interruptor de la bomba de gradiente de gasser, muestreador automático, detector del arsenal del fotodiodo y multi detector de fluorescencia de λ.
    2. Entrada a las condiciones iniciales de la composición de la fase móvil a 16,5% H 2 O (0.1% TFA) y 83,5% ACN (0.1% TFA) (v/v).
    3. Ajustar el detector de UV en dos canales, uno en 310 nm para 4-MU (I.S.) y el otro en 360 nm para MMC.
    4. Activado el detector de fluorescencia de dos canales, uno en λ ex / em λ = 365/445 nm 4-MU y el otro en λ ex / λ em = 480 nm/560 nm para DOX y DOXol, respectivamente.
    5. Fijar un caudal isocrática de 1,0 mL/min.
    6. Equilibrar una columna de 18 preinstalado de fase inversa C (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) a temperatura ambiente durante 10 min para el establecimiento de la referencia.
  3. Separar drogas (DOX, MMC, DOXol y 4-MU) usando la condición gradiente de fase móvil.
    1. Inyectar 15 μl de muestras extraídas y concentradas a utilizar el muestreador automático.
    2. Poco a poco cambiar la condición inicial de la fase móvil (consulte el protocolo paso 2.2.2) al 100% ACN (0.1% TFA) sobre 18 minutos usando la bomba de gradiente automatizada.
      Nota: Durante el proceso de separación, cuatro canales (dos absorbentes de UV y dos fluorescentes) aparecen simultáneamente con cada canal que muestra un medicamento compuesto (consulte el paso protocolo 2.2.3 y 2.2.4).
    3. Mantener el 100% de ACN (0.1% TFA) por 1 min y luego retorno a la condición de fase móvil inicial en 1 minuto
    4. Volver a acondicionar la columna con la fase móvil inicial en el flujo de 1,5 mL/min durante 4 min para la siguiente inyección muestra.

3. Validación de HPLC

  1. preparación de estándares de trabajo de DOX, MMC y DOXol y 4-MU (I.S.).
    1. Pesar por separado 1 mg de polvo de droga DOX y MMC (PRECAUCIÓN) y 4-MU en un dulce pequeño peso de papel (3 x 3 pulgadas 2).
      Tenga en cuenta que todos los medicamentos contra el cáncer son considerados un peligro para la salud que puede causar mutagenicidad toxicidad y la célula de germen aguda en la inhalación o ingestión. Deben manipularse cuidadosamente con guantes y máscaras de.
    2. Transferir la pesada DOX, MMC y 4-MU en un tubo nuevo de microcentrífuga polipropileno individual 1.5 mL.
    3. Añada 1 mL de metanfetaminaanol y agitar brevemente para obtener 1 mg/mL concentración de DOX y MMC.
    4. Agregar 1 mL de metanol a un vial previamente pesado 1 mg de DOXol (PRECAUCIÓN) y vortex brevemente para obtener concentración de 1 mg/mL de DOXol.
      Nota: DOXol es un metabolito de cardio tóxica y debe manipularse con cuidado.
    5. Pipeta 20 μl de las soluciones madre preparadas de DOX, MMC, DOXol y 4-MU en un nuevo separar el tubo de microcentrífuga polipropileno de 1.5 mL y añadir 980 μl de metanol para obtener un estándar de trabajo de 20 μg/mL de cada droga.
    6. Diluir 20 μg/mL de DOX, MMC y DOXol con metanol para obtener los estándares de trabajo de 50 ng - 20 μg/ml para DOX, MMC y DOXol y 2000 ng/mL para I.S. 4-MU.
    7. Sello de la tapa del tubo de soluciones de trabajo con un estrecho trozo de cubierta de la película de parafina para evitar la evaporación del metanol, envuelva el tubo entero con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz directa y conservar a -20 ° C.
  2. Determinar la linealidad, precisión y exactitud de DOX, MMC y DOXol en matrices biológicas (es decir, sangre y tumor homogeneizado).
    1. Al mismo tiempo punto 5 μl de estándares de trabajo de DOX y DOXol (50 ng/mL - 20 μg/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 μg/mL) y 4-MU (2 μg/mL) en 50 μl de sangre entera en blanco o tejido homogeneizado en tubos de microcentrífuga de polipropileno para obtener la curva de concentración estándar que van desde 5-2000 ng/mL para los compuestos de la droga y 200 ng/mL para 4-MU (I.S.).
    2. Realizar el ensayo de extracción de droga se describe en el protocolo 1.2.
    3. Uso de baja, mediana y alta concentración de DOX y DOXol (50, 500 y 2.000 ng/mL) y MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) para precisión intra y inter día.
      Nota: Preparar concentraciones estándar frescas en el día del análisis.
  3. Análisis de muestras
    1. inyectar 15 μl de la muestra usando el muestreador automático.
    2. Poco a poco cambie la fase móvil sobre 0 a 18 minutos, aumento de la composición de ACN en el intervalo de.
    3. Después de 18 minutos, mantenga la condición de fase móvil durante 1 minuto
    4. Regresar a la condición inicial durante los próximos 2 minutos y volver a equilibrar durante 4 minutos antes de la inyección siguiente.
    5. Después de cada muestra ejecute, tenga en cuenta que los picos de los compuestos de la droga con su tiempo de retención se muestran como sigue: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) y DOX.
    6. Integrar el área de pico en la curva (AUC) de los compuestos de drogas utilizando el software HPLC.
    7. Calcular la relación AUC entre drogas individual compuesto y I.S. (ecuación 1) y las curvas estándar preparadas bajo los mismos procedimientos de extracción para determinar las concentraciones de la droga de DOX, MMC y DOXol en formulación DMPLN.
      Equation 1
    8. calcular el porcentaje de recuperación de drogas (ecuación 2) mediante la comparación de las concentraciones de medicamento reconstituidas con metanol de los extractos de las muestras biológicas con picos para que de la norma (" limpio ") solución en metanol de la droga.
      Equation 2

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Representative Results

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Dos medicamentos contra el cáncer, DOX y MMC, así como el metabolito DOX, DOXol, fueron detectado simultáneamente sin ninguna interferencia biológica bajo las mismas condiciones HPLC de gradiente aplicada utilizando 4-MU como el I.S. para los detectores de UV y fluorescencia. DOX, MMC, DOXol y 4 MU estaban bien separados unos de otros con tiempos de retención de 5,7 min para MMC, 10,4 min DOXol, 10,9 min 4-MU y min 11,1 para DOX (figura 2). Cada medicamento en la sangre y diversos tejidos mostraron linealidad de concentración con coeficientes de correlación (R2) oscilan entre 0,98 y 1,00 (figura 3 y tabla 1). El límite inferior de cuantificación (LLOQ) de DOX, DOXol y MMC fue de 10 ng/mL, 10 ng/mL y 100 ng/mL en sangre entera y 25 ng/mL, 25 ng/mL y 200 ng/mL en varios tejidos, respectivamente (tabla 1). El método HPLC desarrollado muestra menos que 15% de variación en términos de exactitud y precisión intra - y inter - el día para DOX, MMC y DOXol en sangre entera y varias matrices biológicas (p. ej., corazón, pulmones, hígado, bazo y riñones), indicando excelente reproducibilidad (tablas 2 y 3). Más del 85% de DOX y MMC fue recuperado de sangre después de la extracción (tabla 4).

Los procedimientos de análisis de la proteinization de un solo paso mediante un solvente de extracción acidulado seguido empleando un multicanal con éxito se aplicó el método HPLC para determinar la farmacocinética y bio-distribución de larga circulación o Administración de fármacos basados en nanopartículas de pegilado de ambos DOX solos o en combinación con MMC en un trasplante orthotopic del mama modelo murino del tumor (figuras 4 y 5). La figura 4 muestra menos 6-fold altas concentraciones de fármaco en el sangre tiempo de nanopartículas (es decir, la DOX y DMPLN) que las soluciones de medicamento libre equivalente (es decir, DOX gratis o libre DOX-MMC) (figura 4). debido a la circulación sistémica prolongada, las nanopartículas fueron capaces de explotar los efectos de la permeabilidad y la retención mejorados del tumor, dando por resultado DOX y MMC acumulación creciente en el tumor de mama (figura 5A) 37. mientras tanto, la formación cuantitativa determinada de metabolito DOX DOXol en tumores de mama más de 24 h indica una diferencia en la biodisponibilidad de la droga para varias drogas formulaciones (figura 5B).

Figure 1
Figura 1 : Procesos de ilustración del análisis para la determinación simultánea de DOX y MMC por nanopartículas en vivo. (A) preparación de DMPLN utilizando un método de ultra-sonicación un paso seguido por un montaje propio proceso; Colecciones de muestras biológicas (B) de un modelo Murino ortotópico mama tumor; (C) drogas extracción de matrices biológicas y reconstitución de drogas; (D) gradiente HPLC para la separación de DOX, MMC y DOXol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación de cromatogramas de la sangre en blanco y mezclas de la droga en sangre. Comparación de cromatogramas de la sangre en blanco y mezclas de la droga en sangre mediante HPLC acoplada a detectores de Ultravioleta y fluorescencia en (A) Ultravioleta de 360 nm para MMC; (B) UV 310 nm para I.S. 4-MU; (C) fluorescencia en λex / em = 480/560 nm para DOX y DOXol; (D) fluorescencia en λex / em = 365/445 nm para I.S. 4-MU. AU es la unidad de absorción y UE es unidad de fluorescencia. Las concentraciones inyectadas de MMC, DOX y DOXol y su I.S. 4-MU fueron 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL y 200 ng/mL, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representación de curvas estándar para MMC, DOX y DOXol en sangre total. Los rangos de concentración fueron de 100 ng/mL a 2000 ng/mL para MMC (A), de 5 ng/mL a 2000 ng/mL para la concentración de DOX baja (B) y de 5 ng/mL a 50 ng/mL para DOXol (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Aplicación del sistema de análisis de drogas múltiples, usando un método HPLC multicanal y degradado, para estudiar la farmacocinética de los basados en nanopartículas de larga circulación de drogas entrega. (A) perfiles de concentración de la sangre tiempo de DOX en mono-terapia con soluciones de fármaco libre (libre de DOX) o una formulación liposómica (véase Tabla de materiales); (B) perfiles de concentración de la sangre tiempo de DOX y MMC como una combinación de medicamentos gratis (gratis DOX-MMC) DMPLN. Sangre fue recogida en distintos puntos de tiempo de hasta 24 h después de una inyección única i.v. a ratones un tumor de mama Murino ortotópico. Todos los ratones fueron tratados con 9,2 mg/kg DOX solo o en combinación con 2,9 mg/kg MMC. Porque LLOD de MMC fue 100 ng/mL con el HPLC había acoplado detector de UV, concentración de MMC después de después de la inyección 6 h fue determinada por espectrometría de masas. Se ha modificado la figura de Zhang et al. Nanomedicina con permiso22. Todos los puntos de datos se presentan como media ± desviación estándar (SD) con n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Aplicación de múltiples análisis de drogas utilizando el método HPLC gradiente para estudiar el tumor bio-distribución de un sistema de entrega de drogas basados en nanopartículas. Concentraciones DOX Total (A) y MMC de libre DOX-MMC o DMPLN en tumores de mama; (Rong > B) formación de metabolito DOXol Total en tumores de mama tratados con mono - o combinación de quimioterapia DOX. Todos los ratones fueron tratados con 9,2 mg/kg DOX solo o en combinación con 2,9 mg/kg MMC. Porque gratis DOX-MMC tuvo una acumulación de tumor bajo que fue de LLOD de MMC utilizando que la HPLC acoplado a detector de UV, concentración libre DOX-MMC MMC fue determinada por espectrometría de masas. Se ha modificado la figura de Zhang et al. Nanomedicina con permiso22. Todos los puntos de datos se presentan como media ± SD con n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: linealidad y LLOQ de DOX, MMC y DOXol en diversas matrices biológicas. Los datos representan la media ± SD para n = 3.

Table 2
Tabla 2: Día Intra y entre precisión y exactitud de DOX, MMC y DOXol en ratón sangre (n = 3).

Table 3
Tabla 3: Intra y inter día precisión y exactitud de DOX, MMC y DOXol en tumores de mama (n = 3).

Table 4
Tabla 4: porcentaje de recuperación DOX y MMC en las muestras de sangre después de la extracción (n = 3). Los datos representan la media ± SD n = 3.

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Discussion

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En comparación con otros métodos cromatográficos que permitan la detección de especies de un solo medicamento a la vez, el presente Protocolo HPLC es capaz de cuantificar simultáneamente tres compuestos de la droga (DOX, MMC y DOXol) en la misma matriz biológica sin necesidad de cambiar la fase móvil. Este método de preparación y el análisis se ha aplicado con éxito para determinar la farmacocinética y bio-distribución de dos sistemas de entrega de medicamentos basados en nanopartículas (es decir, la DOX y DMPLN)22. Puesto que las nanopartículas de pegilado prolongan la circulación sistémica del fármaco cargado dando por resultado concentraciones de la droga de alta sangre durante un largo período de tiempo (> 24 h), el método cromatográfico descrito es rentable para el análisis de la muestra a gran escala de combinaciones de drogas misma carga de nanopartículas en los estudios preclínicos22. La farmacocinética de la solución gratuita de DOX y DOX liposomal se muestra en la figura 4A es consistente con datos de la literatura divulgó en roedores38,39, más futura apoyando la validez del método actual. Aunque el detector de fotodiodo UV permite múltiples canales al mismo tiempo detectar y mostrar la drogas usando longitudes de onda variable (es decir, 310 nm para MU 4 y 360 nm de MMC), el límite de detección intrínseca de detector UV es menos sensible que la detector de fluorescencia. Así, para la eliminación rápida, no fluorescente drogas como MMC entregado en soluciones libres, las concentraciones de la droga en momentos posteriores pueden caer por debajo del detector de LLOQ de UV.

En general, una columna de cromatografía corto (por ejemplo, 5 cm) se utilizaría para el análisis HPLC para minimizar el tiempo de elución y el tiempo de funcionamiento. Sin embargo, en el caso de analizar múltiples compuestos de medicamentos, especialmente aquellos con estructuras moleculares muy similares (por ejemplo, DOX y su metabolito DOXol), es difícil de lograr la total separación utilizando la columna corta debido a la eficiencia intrínseca de la columna. Por lo tanto, una columna más larga (p. ej., 25 cm, utilizado en el protocolo actual) y una optimización de parámetros HPLC durante el desarrollo del método son necesarios para lograr una solución de buen pico. Aunque DOX, DOXol y 4-MU se eluyen en el tiempo de retención de cierre, la interferencia entre DOX/DOXol y 4 MU no se observó en la concentración de la muestra preparada (por ejemplo, 50 ng/mL) en los cromatógrafos (figura 2). Sin embargo, una alta concentración de DOX (p. ej., ~ 10.000 ng/mL) por nanopartículas como resultado tiempo de circulación de la sangre largo podría interferir con la detección de pico de sí mismo y de otros compuestos (por ejemplo, DOXol) y puede resultar en uno mismo-amortiguamiento de DOX fluorescencia40,41. En este caso, puede requerirse una dilución de la muestra adecuada con sangre entera en blanco antes de análisis de la muestra para determinar concentraciones de la droga.

Métodos de extracción pueden complicar aún más el análisis de combinaciones de fármacos quimioterapéuticos. Aunque DOX o MMC se puede extraer utilizando diversos métodos de extracción, incluyendo la extracción en fase sólida (SPE) o extracción líquido-sólido, estos procedimientos son lentos y caros. Algunos de los métodos de extracción resultan en pobre recuperación y degradación de fármaco posible cuando se agrega ácido clorhídrico para la extracción solvente42,43,44. Para las preparaciones de muestras biológicas de gran escala, el presente método de extracción es simple, rápida y sólo requiere la adición de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos no peligrosos para el eficiente de proteinization seguido muestra sistemática reconstitución utilizando metanol. Las tasas de alta recuperación (> 85%) se lograron para todos muestras de concentraciones variables de drogas aplicando sistemáticamente el mismo protocolo de extracción. Aunque existe variabilidad, las diferencias son estadísticamente insignificantes. Para reducir la variación, la optimización de la extracción de la muestra individual en concentraciones bajas y altas de la droga puede ser necesaria. Tenga en cuenta que el método de extracción utilizado no distingue fármaco liberado libre de medicamento restante en la nanopartícula como nanopartículas fueron completamente disueltos después de la adición de disolventes orgánicos. Por lo tanto, la verdadera farmacocinética de nanopartículas solo vs libre droga solo requiere el desarrollo de un método de deconvolución numérica usando modelos matemáticos para predecir su comportamiento en vivo45.

En Resumen, se desarrolló un método HPLC selectivo y simple para la determinación simultánea de DOX, MMC y Doxol en vivo. El presente método muestra selectividad, precisión, robustez y precisión en una amplia gama de concentraciones de la droga para el ratón sangre y los tejidos. Este método ha sido aplicado con éxito para obtener el perfil de tiempo de concentración de sangre de DOX y MMC y la bio-distribución de MMC, DOXol y DOX en tumores de mama y otros órganos importantes (p. ej., corazón). Este protocolo proporciona una herramienta útil para dilucidar las macro - y microscópica en vivo mecanismos de DOX entregado nanopartículas con quimioterapia de combinación de drogas.

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Disclosures

Los autores no tienen ninguna competencia de intereses financieros y conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores reconocen agradecidos la donación de equipo de Ciencias naturales e Ingeniería de investigación (NSERC) Consejo de Canadá para HPLC, la subvención de funcionamiento del Instituto canadiense de investigación de la salud (CIHR) y canadiense de investigación de cáncer de mama (CBCR) Alianza a X.Y. Wu y la beca de la Universidad de Toronto para R.X. Zhang y Zhang T..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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