Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Prøven udvinding og samtidige kromatografiske kvantitering af Doxorubicin og Mitomycin C efter narkotika kombination levering i nanopartikler til Tumor-bærende mus

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Denne protokol beskriver et effektivt og praktisk analytisk proces af prøven udvinding og samtidige bestemmelse af flere stoffer, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) og en cardio-giftige DOX metabolit, doxorubicinol (DOXol), i biologiske prøver fra en prækliniske bryst tumor model behandlet med nanopartikel formuleringer af synergistiske drug kombination.

Abstract

Kombination kemoterapi er ofte bruges i klinikken til behandling af cancer; tilknyttede bivirkninger til normale væv kan dog begrænse sit terapeutiske fordel. Nanopartikler-baseret drug kombination har vist sig at mindske problemer med fri narkotika kombinationsbehandling. Vores tidligere undersøgelser har vist, at kombinationen af to anticancermedicin, doxorubicin (DOX) og mitomycin C (MMC), produceret en synergistisk effekt mod begge murine og human brystkræft celler i vitro. DOX og MMC Co indlæst polymer-lipid hybrid nanopartikler (DMPLN) omgås forskellige efflux transporter pumper, der giver multidrug resistance og demonstreret forbedret effektivitet i bryst tumor modeller. Sammenlignet med konventionelle løsning former, blev sådan superior effekten af DMPLN tilskrevet den synkroniserede farmakokinetik DOX og MMC og øget intracellulær stof biotilgængelighed inden for tumorceller aktiveres med nanocarrier PLN.

For at evaluere farmakokinetik og bio-distribution af administreres Co DOX og MMC i både gratis løsning og nanopartikel former, en enkel og effektiv multi drug analysemetoden med omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) var udviklet. I modsætning til tidligere rapporteret metoder, der analyseres DOX eller MMC individuelt i plasma, er denne nye HPLC-metoden i stand til samtidigt kvantificere DOX, MMC og en større cardio-giftige DOX metabolit, doxorubicinol (DOXol), i forskellige biologiske matricer ( fx fuldblod, bryst tumor og hjertet). En dobbelt fluorescerende og ultraviolet absorberende sonde 4-methylumbelliferone (4-MU) blev brugt som en intern standard (I.S.) for et-trins påvisning af flere retskemisk med registrering af forskellige bølgelængder. Denne metode blev anvendt til at bestemme koncentrationen af DOX og MMC leveret af både nanopartikel og løsning tilgange i fuldblod og forskellige væv i en orthotopic bryst tumor murine model. Den analytiske metode præsenteret er et nyttigt værktøj til præ-klinisk analyse af nanopartikler-baserede levering af narkotika kombinationer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kemoterapi er en primær behandling modalitet for mange kræftformer, men det er ofte forbundet med alvorlige bivirkninger og begrænset effektivitet på grund af lægemiddelresistens og andre faktorer1,2,3. For at forbedre resultatet af kemoterapi er narkotika kombination regimer blevet anvendt i klinikken er baseret på overvejelser som ikke-overlappende toksiciteter, forskellige mekanismer af narkotika handling, og ikke-cross drug resistance4,5 , 6. i kliniske forsøg, en bedre tumor responsrate var ofte observeret ved hjælp af samtidig administreret medicin kombinationer i forhold til et regime af sekventielle drug delivery7,8. Dog, på grund af sub-optimale bio-distribution af gratis narkotika former, samtidig indsprøjtning af flere stoffer kan forårsage fremtrædende normale væv toksicitet, der opvejer de terapeutiske effekt9,10,11. Nanocarrier-baseret drug delivery har vist sig at ændre farmakokinetik og bio-distribution af indkapslede narkotika, forbedre tumor-målrettet ophobning12,13,14. Som gennemgået i vores seneste artikler, har nanopartikler Co fyldt med synergistiske drug kombinationer vist evne til at afhjælpe problemer med fri narkotika kombinationer, på grund af deres kontrollerede tidsmæssige og rumlige Co levering af flere stoffer til tumor væv, aktivering synergistiske narkotika effekter mod kræft celler4,15,16. Som et resultat, har overlegen terapeutiske virkning og lav toksicitet påvist i både prækliniske og kliniske undersøgelser4,17,18.

Vores tidligere in vitro- undersøgelser fundet at kombinationen af to anticancermedicin, doxorubicin (DOX) og mitomycin C (MMC), produceret en synergistisk effekt mod flere bryst kræft celler linjer og derudover Co lastning DOX og MMC inden for polymer-lipid hybrid nanopartikler (DMPLN) overvandt forskellige multiresistent tilknyttede efflux pumper (fx P-glykoprotein og bryst kræft resistente protein)19,20,21. In vivo, aktiveret DMPLN rumlige-temporale Co levering af DOX og MMC til tumor websteder og øget biotilgængelighed af narkotika i kræftceller, som angivet af moderation af dannelsen af DOX metabolit doxorubicinol (DOXol)22. Som et resultat forøget af DMPLN tumor celle apoptose, tumor væksthæmning og langvarig vært overlevelse i forhold til fri kombination af DOX og MMC eller en liposomal DOX formulering22,23,24, 25.

Analysere den faktiske mængde narkotika Co leveret af en nanocarrier er kritisk for at designe effektiv nanopartikel formuleringer. Mange metoder har været udviklet til at analysere niveauet plasma af enkelt DOX eller MMC doser ved hjælp af højtryksvæskekromatografi (HPLC) alene eller i kombination med massespektrometri (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. men disse metoder er ofte tidskrævende og upraktisk for kombinationsbehandling som et stort antal biologiske prøver skal udarbejdes særskilt analyse af flere stoffer (undertiden herunder narkotika metabolitter). Den stærke plasmaproteinbinding af DOX og MMC har røde blodlegemer en stor evne til at binde og koncentrere mange anticancermedicin35,36. Således kan plasma analyse for DOX eller MMC obfuscate faktiske blod stof koncentrationer. Den nuværende arbejde (figur 1) beskriver en enkel og robust flere narkotika analysemetode med omvendt fase HPLC samtidig ekstrakt og kvantificere DOX, MMC og DOX metabolit doxorubicinol (DOXol) fra fuldblod og forskellige væv ( fx tumorer). Det har været anvendt med succes til at bestemme farmakokinetik og bio-distribution af DOX og MMC og dannelsen af DOXol efter medicinafgivelse via gratis løsninger eller nanopartikel former (dvs.DMPLN og liposomal DOX) i en orthotopically implanteret murine bryst-tumor musemodel efter intravenøs (IV) injektion22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle dyreforsøg blev godkendt af de dyr Care Udvalget af University Health Network på Ontario Cancer Institute og gennemføres i overensstemmelse med den canadiske Rådet om dyrs pleje retningslinjer.

1. biologiske prøveforberedelse

  1. indsamle fuldblod, vigtige organer, og bryst tumor på forud fastsatte tidspunkter efter intravenøs (IV) indgift af lægemiddel-holdige formuleringer (f.eks., DMPLN, liposomal DOX)
    1. indsprøjtes et bryst tumor-bærende mus i.v. med et tilberedt stof-holdige formulering.
    2. Bedøver musen på bestemte tidspunkter (f.eks., 15 min) ved at give inhalerbar 2% isofluran i et lukket kammer.
    3. Lå bedøvede musen på ryggen og satte sin næse gennem en næsestykket, der konstant leverer 2% isofluran.
      Bemærk: For at sikre, at musen undergår dybe anæstesi, forsigtigt klemme fore lemmer af mus og udseende til enhver trækninger bevægelse.
    4. Grundigt rense de bryst og underliv regioner med 70% ethanol og derefter udføre en terminal procedure af cardiac punktering på de dybe bedøvede mus ved hjælp af en heparinized 1 mL sprøjte og en 23 G kanyle.
    5. Indsamle fuldblod i en mærket natrium heparin sprøjtes plastikrør og swirl forsigtigt røret for at sikre indsamlede blod kommer i kontakt med den coatede heparin i rørvæggen. Indsamle mindst 50 µL fuldblod. Altid opbevare prøverne på ice.
    6. Tape alle fire lemmer af musen til at sikre det og åbne i bughulen og brystkassen af musen ved hjælp af en saks og pincet. Skift tarmene til side og skubbe leveren opad til tilstrækkeligt udsætte Vena. Skære portåren til blod-dræning.
    7. Perfuse hele musen kroppen med 50 mL af iskold 0,9% saltvand gennem hjertet ved hjælp af en 10 mL sprøjte med en 25 G kanyle.
      Bemærk: Bøje nålen ved 90° for at vejlede sprøjten ind i vena.
    8. Punktafgifter organer i følgende rækkefølge: hjerte, lunge, lever, milt, nyrer. Derefter, adskille bryst tumor fra de omkringliggende bindevæv ved hjælp af et par snit saks på den højre brystkirtler fedt pad med musen. Indsamle alle organer enkeltvis i 1,5 mL polypropylen rør og hurtigt fryse dem i flydende nitrogen.
      ​ Bemærk: adskille galdeblæren fra leveren.
    9. Gemme fuldblod på 4 ° C og fjernet væv i-80 ° C fryser indtil senere HPLC-analysen.
  2. Uddrag DOX, MMC og DOXol fra biologiske matricer.
    1. Vejer alle frosne dissekeret væv hurtigt og overføre dem til en 13 mL afrundet bund konisk slange. For at undgå mulige drug metabolisme eller nedbrydning, holde prøverne på ice.
    2. Tilsættes 1-5 mL iskold celle lysisbuffer ind i røret.
      Bemærk: Lydstyrken på buffer til at bruge afhænger væv vægt baseret på væv-buffer forholdet mellem 1 g: 5 mL (w/v); for små organer, såsom hjerte og milt, forholdet er 1 g: 2 mL.
    3. Bruge en op-ned slagtilfælde bevægelse til at homogenisere vævsprøver på isen med en hastighed på 18.000 rpm ved hjælp af en elektrisk hånd homogeniseringsapparat.
      Bemærk: Afsluttede homogenisering kræver ca 3-5 gentagelser af en kort homogenisering proces på mindre end 15 s, efterfulgt af væv afkøling over isen mellem hver kort homogenisering.
    4. Vaske 10 mm sav-tand generator sonde af homogeniseringsapparat med destilleret deioniseret vand (DDI) H 2 O, 70% ethanol, og derefter DDI H 2 O mellem hver vævsprøve til at undgå krydskontaminering.
    5. Overføre 50 µL af væv homogenatet eller fuldblod i en 1,5 mL polypropylen micro-centrifugerør og spike med 5 µL af en intern standard (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) ind i røret.
      Bemærk: 4-MU løsning blev udarbejdet i methanol her.
    6. Tilføje 250 µL af en iskold ekstraktionsmiddel i rør indeholdende blod eller væv homogenatet.
      Bemærk: Ekstraktionsmidlet består af 60% acetonitril (ACN) og 40% ammoniumacetat (5 mM) med pH indstillet til pH = 3,5 bruge 0,05% myresyre. Bruge en 1:5 (v/v) eksempel: ekstraktionsmiddel til volumen ratio.
    7. Kraftigt vortex blanding i 2 min., centrifuger på 3.000 x g force på 4 o C i 10 min og afpipetteres 200 µL supernatanten i en anden pre kølet friske micro-centrifugerør.
    8. Fordampe supernatanten ved 60 ° C under en langsom strøm af nitrogen gas med beskyttelse mod lys.
    9. Rekonstruere den tørrede rest med 100 µL af iskold methanol, energisk vortex for 30 s og centrifugeres ved 3000 x g ved 4 ° C for en anden 5 min.
    10. Overføre supernatanten til en HPLC hætteglas indsætte og placere prøve hætteglas i en autosampler bakke injektionsvæske.

2. HPLC instrumentering og driftsparametre

  1. forberede HPLC mobiltelefon-fase med konsekvent reproducerbarhed
    1. måle 500 mL af HPLC-grade H 2 O ved anvendelse af et måleglas.
    2. Måle 500 mL af HPLC-renhed acetonitril (ACN) ved hjælp af en separat måleglas.
    3. Forsigtigt tilføje 0,5 mL trifluoreddikesyre (TFA) (forsigtighed) i hver 500 ml H 2 O og ACN at opnå den mobile fase af H 2 O og ACN 0,1 vægtprocent TFA, hhv.
      Bemærk: TFA er ætsende og giftige og skal håndteres under et laboratorium stinkskab. Alle opløsningsmiddelblandinger tilberedes ved stuetemperatur.
    4. Filter mobile faser gennem en nylon membranfilter med et 0,45 µm pore størrelse og overføre det til ren HPLC reservoir flasker.
  2. Set-up HPLC instrumentering til samtidige påvisning af DOX, MMC, og DOXol og I.S. 4-MU.
    1. Tænd gradient pumpe, de gasser, auto-sampler, fotodiode array detektor og multi λ fluorescens detektor.
    2. Input de oprindelige betingelser for mobiltelefon-fase sammensætning til 16,5% H 2 O (0,1% TFA) og 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Sat UV-detektor på to kanaler, en ved 310 nm for 4-MU (I.S.) og den anden på 360 nm til MMC.
    4. Sæt fluorescens detektor på to kanaler, en ved λ ex / λ em = 365/445 nm for 4-MU og den anden på λ ex / λ em = 480 nm/560 nm for DOX og DOXol, hhv.
    5. Sæt en isocratic gennemstrømningshastighed på 1,0 mL/min.
    6. Reagensglasset en forudinstalleret omvendt fase C 18 kolonne (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) ved stuetemperatur i 10 min til baseline etablering.
  3. Adskille narkotika (DOX, MMC, DOXol og 4-MU) ved hjælp af gradient mobiltelefon-fase tilstand.
    1. Indsprøjtes 15 µL af uddraget og igen koncentreret prøver ved hjælp af auto-sampler.
    2. Gradvist ændre startbetingelse mobiltelefon-fase (se protokollen trin 2.2.2) til 100% ACN (0,1% TFA) over 18 min ved hjælp af automatiserede gradient pumpen.
      Bemærk: Under adskillelse proces, fire kanaler (to UV-absorberende og to lysstofrør) vises samtidig med hver kanal viser en drug sammensatte (se protokollen trin 2.2.3 og 2.2.4).
    3. Bevare 100% af ACN (0,1% TFA) for 1 min og derefter vende tilbage til den oprindelige mobile fase betingelse i 1 min.
    4. Re betingelse i kolonnen med den første Mobil fase på strømningshastigheden af 1,5 mL/min. til 4 min til den næste prøve injektion.

3. HPLC validering

  1. forberede arbejdsstandarder af DOX, MMC og DOXol, og 4-MU (I.S.).
    1. Vejes separat 1 mg af DOX og MMC stof pulver (forsigtighed) og 4-MU på en frisk lille vejer papir (3 x 3 inches 2).
      Bemærk alle anticancermedicin betragtes en sundhedsfare, der kan forårsage akut toksicitet og kønscelle mutagenicitet på indånding eller indtagelse. De skal håndteres omhyggeligt med handsker og masker.
    2. Overføre den vejes DOX, MMC og 4-MU i en ny individuelle 1,5 mL polypropylen micro-centrifugerør.
    3. Tilsættes 1 mL af methanol og vortex kort til 1 mg/mL koncentration af DOX og MMC.
    4. Tilsættes 1 mL methanol i et hætteglas indeholdende pre afvejes 1 mg DOXol (forsigtighed) og vortex kort til 1 mg/mL koncentration af DOXol.
      Bemærk: DOXol er en cardio-giftige metabolit og skal håndteres forsigtigt.
    5. Pipette 20 µL af rede stamopløsninger af DOX, MMC, DOXol og 4-MU ind i en ny særskilt 1,5 mL polypropylen micro-centrifugerør og tilføje 980 µL af methanol til at få en arbejdstid på 20 µg/mL af hver enkelt drug.
    6. Fortyndes 20 µg/mL af DOX, MMC og DOXol ved hjælp af methanol for at opnå arbejdsstandarder 50 ng - 20 µg /mL for DOX, MMC og DOXol og 2000 ng/mL for I.S. 4-MU.
    7. Seal hætten af røret af arbejdende løsninger med et smalt stykke af paraffin film dækker at forhindre methanol fordampning, wrap hele røret med aluminiumsfolie at undgå udsættelse for direkte lys og opbevares ved -20 ° C.
  2. Bestemme linearitet, præcision og nøjagtighed af DOX, MMC og DOXol i biologisk matricer (dvs. fuldblod og tumor homogenatet).
    1. Samtidig spike 5 µL af arbejdsstandarder af DOX og DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µg/mL), og 4-MU (2 µg/mL) i 50 µL af Tom fuldblod eller væv homogenatet i polypropylen mikro-centrifugeglas til få den standard koncentration kurve spænder fra 5-2000 ng/mL for drug forbindelser og 200 ng/mL for 4-MU (I.S.).
    2. Udføre stof udvinding analysen beskrives i protokollen 1.2.
    3. Bruge lav, median og høje koncentrationer af DOX og DOXol (50, 500, og 2.000 ng/mL) og MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) for samhandelen og Inter-Diesel dagen præcision og nøjagtighed.
      Bemærk: Forberede frisk standard koncentrationer på dagen for analyse.
  3. Analyse af prøver
    1. indsprøjtes 15 µL af prøven med auto-prøvetager.
    2. Gradvist ændre den mobile fase over 0 til 18 min, stigende sammensætning af ACN over intervallet.
    3. Efter 18 min, holde den mobile fase betingelse for 1 min.
    4. Vende tilbage til den oprindelige tilstand over de næste 2 min, så igen Blandingen henstår i 4 min før den næste indsprøjtning.
    5. Efter hver prøve køre, Bemærk at toppene af narkotika forbindelser med deres retentionstid er vist som følger: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) og DOX.
    6. Integrere topareal under kurve (AUC) af stof forbindelser ved hjælp af HPLC software.
    7. Beregn AUC-forholdet mellem enkelt drug sammensatte og I.S. (ligning 1) og bruge de standard kurver udarbejdet i henhold til de samme ekstraktion procedurer til at bestemme drug koncentrationerne af DOX, MMC og DOXol i DMPLN formulering.
      Equation 1
    8. stof opsving procentvise (ligning 2) beregnes ved at sammenligne drug koncentrationer rekonstitueres ved hjælp af methanol af ekstrakter af spidse biologiske prøver til at af standard (" pænt ") narkotika opløsning i methanol.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

To anticancermedicin, DOX og MMC samt DOX metabolit, DOXol, blev samtidig registreret uden biologiske indblanding under den samme anvendt gradient HPLC tilstand ved hjælp af 4-MU som I.S. for både fluorescens og UV detektorer. DOX, MMC, DOXol og 4-MU var godt adskilt fra hinanden med retentionstider af 5,7 min til MMC, 10.4 min til DOXol, 10,9 min for 4-MU og 11,1 min for DOX (figur 2). Hver enkelt drug i fuldblod og forskellige væv viste koncentration linearitet med korrelationskoefficienter (R2) spænder fra 0,98 til 1,00 (figur 3 og tabel 1). Den nedre grænse for kvantitering (LLOQ) af DOX, DOXol og MMC var 10 ng/mL, 10 ng/mL og 100 ng/mL fuldblod og 25 ng/mL, 25 ng/mL og 200 ng/mL i forskellige væv, henholdsvis (tabel 1). HPLC metode udviklet viste mindre end 15% variation med hensyn til intra og Inter-Diesel dagen præcision og nøjagtighed for DOX, MMC og DOXol i fuldblod og forskellige biologiske matricer (fx, hjerte, lunger, lever, milt og nyrer), der angiver fremragende reproducerbarhed (tabel 2 og 3). Mere end 85% af DOX og MMC blev gendannet fra fuldblod efter ekstraktion (tabel 4).

Multidrug analyse procedurer ved hjælp af et-trins nedtrapning proteinization af et syrnet ekstraktionsmiddel fulgt ved at ansætte en multikanal HPLC metode blev anvendt til at bestemme farmakokinetik og bio-distribution af lang-cirkulerende eller Pegyleret nanopartikel-baseret drug levering af både DOX alene eller i kombination med MMC i en orthotopic bryst tumor murine model (tal 4 og 5). Figur 4 viser mindst 6-fold højere drug koncentrationer i blodet over tid leveret af nanopartikler (dvs.liposomal DOX og DMPLN) end de tilsvarende fri narkotika løsninger (dvs.gratis DOX eller gratis DOX-MMC) (figur 4). på grund af langvarig systemisk cirkulation, nanopartikler var i stand til at udnytte de forbedrede permeabilitet og fastholdelse virkningerne af tumor, hvilket resulterer i øget DOX og MMC ophobning i bryst tumor (figur 5A) 37. i mellemtiden kvantitativt beslutsomme dannelsen af DOX metabolit DOXol i brysttumorer over 24 h angiver en forskel i stof biotilgængelighed for forskellige narkotika formuleringer (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 : Illustration af analysen processer til samtidige bestemmelse af DOX og MMC leveret af nanopartikler in vivo. (A) forberedelse af DMPLN ved hjælp af en et-trins ultra-sonikering metode efterfulgt af et samlesæt proces; (B) biologisk prøve samlinger fra en orthotopic bryst tumor murine model; (C) narkotika udvinding fra biologiske matricer og narkotika rekonstitution; (D) Gradient HPLC for adskillelse af DOX, MMC og DOXol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af kromatogrammer af Tom fuldblod og narkotika blandinger i blod. Sammenligning af kromatogrammer af Tom fuldblod og narkotika blandinger i blodet ved hjælp af HPLC kombineret til UV og fluorescens detektorer på (A) UV 360 nm til MMC. (B) UV 310 nm for I.S. 4-MU; (C) Fluorescens ved λex / em = 480/560 nm for DOX og DOXol; (D) Fluorescens ved λex / em = 365/445 nm for I.S. 4-MU. AU er absorbans enhed og EU er fluorescens enhed. De injicerede koncentrationer af MMC, DOX, og DOXol og deres I.S. 4-MU var 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL og 200 ng/mL, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentation af standard kurver for MMC, DOX og DOXol i fuldblod. Koncentrationsintervaller var fra 100 ng/mL til 2000 ng/mL for MMC (A), fra 5 ng/mL til 2000 ng/mL for lav DOX koncentration (B) og fra 5 ng/mL, 50 ng/mL for DOXol (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Anvendelse af flere drug analysesystem, bruger en multikanals og gradient-HPLC-metoden, for at studere farmakokinetik af lang-cirkulerende nanopartikel-baseret drug delivery. (A) tid-blod koncentration profiler af DOX i mono-terapi ved hjælp af gratis narkotika løsninger (gratis DOX) eller en liposomal formulering (Se Tabel af materialer); (B) tid-blod koncentration profiler af DOX og MMC som en gratis narkotika kombination (gratis DOX-MMC) eller DMPLN. Fuldblod blev indsamlet på forskellige tid point op til 24 timer efter en enkelt i.v. injektion til mus forsynet med en orthotopic murine bryst tumor. Alle mus behandlet med 9,2 mg/kg DOX alene eller i kombination med 2,9 mg/kg MMC. Fordi LLOD MMC var 100 kombineret ng/mL ved hjælp af HPLC UV-detektor, MMC koncentration efter 6 timer efter injektion, blev fastsat ved massespektrometri. Tallet er blevet ændret fra Zhang mfl. Nanomedicin med tilladelse22. Alle datapunkter præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) med n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Anvendelse af flere narkotika analyse ved hjælp af gradient HPLC-metoden til at studere tumor bio-distribution af en nanopartikel-baseret drug delivery system. (A) samlede DOX og MMC koncentrationer af gratis DOX-MMC eller DMPLN i brysttumorer; (Rong > B) samlede DOXol metabolit dannelse i brystkræft tumorer behandles med mono- eller kombination DOX kemoterapi. Alle mus behandlet med 9,2 mg/kg DOX alene eller i kombination med 2,9 mg/kg MMC. Fordi gratis DOX-MMC havde en lav tumor ophobning, der var ud af LLOD af MMC ved hjælp af HPLC kombineret UV-detektor, blev MMC koncentration i gratis DOX-MMC fastsat ved massespektrometri. Tallet er blevet ændret fra Zhang mfl. Nanomedicin med tilladelse22. Alle datapunkter præsenteres som betyder ± SD med n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: linearitet og LLOQ af DOX, MMC og DOXol i forskellige biologiske matricer. Data repræsenterer gennemsnit ± SD for n = 3.

Table 2
Tabel 2: Intra og Inter-Diesel dagen præcision og nøjagtighed af DOX, MMC og DOXol i mus fuldblod (n = 3).

Table 3
Tabel 3: Intra og Inter-Diesel dagen præcision og nøjagtighed af DOX, MMC og DOXol i brysttumorer (n = 3).

Table 4
Tabel 4: DOX og MMC opsving procent i de hele blodprøver efter ekstraktion (n = 3). Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD for n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sammenlignet med andre kromatografiske metoder, der muliggør påvisning af en enkelt drug arter ad gangen, er denne HPLC protokol købedygtig samtidig kvantificere tre narkotika forbindelser (DOX, MMC og DOXol) i den samme biologiske matrix uden at skulle ændre den mobile fase. Denne forberedelse og analyse metode har været anvendt med succes til at bestemme farmakokinetik og bio-distribution af to nanopartikel-baseret drug delivery systems (dvs. liposomal DOX og DMPLN)22. Da pegyleret nanopartikler forlænge systemisk cirkulation af belæsset narkotika medfører forhøjet drug koncentrationer over en lang periode (> 24 h), metoden beskrevet kromatografiske er omkostningseffektiv for storstilet analysen af nanopartikel Co belæsset narkotika kombinationer i prækliniske studier22. Farmakokinetik gratis DOX løsning og liposomal DOX vist i figur 4A stemmer overens med rapporteret litteraturen data i gnavere38,39, yderligere støtte gyldigheden af den nuværende metode. Selv om UV-fotodiode-array detektor tillader flere-kanaler samtidig registrere og vise lægemidler ved hjælp af variable bølgelængder (dvs. 310 nm for 4-MU og 360 nm for MMC), UV-detektor iboende detektionsgrænsen er mindre følsomme end de Fluorescens detektor. Således, for hurtigt at fjerne, ikke-fluorescerende stoffer som MMC leveret i gratis løsninger, drug koncentrationer på senere tidspunkter kan falde til under LLOQ af UV-detektor.

Generelt, bruges en kort kromatografi kolonne (f.eks., 5 cm) til HPLC-analysen til at minimere eluering tid og driftstid. Men, for at analysere flere stof forbindelser, især dem med meget lignende molekylære strukturer (fx, DOX og dets metabolit DOXol), det er vanskeligt at opnå fuld adskillelse ved hjælp af kort kolonne på grund af iboende kolonne effektivitet. Således både en længere kolonne (f.eks.25 cm, brugt i den nuværende protokol) og en optimering af HPLC parametre under udviklingen af metoden, der er nødvendige for at opnå en god peak opløsning. Selvom DOX, DOXol og 4-MU blev elueret på tæt retentionstid, blev interferens mellem DOX/DOXol og 4-MU ikke observeret i den forbehandlede prøve koncentration (fx, 50 ng/mL) i gaskromatografer (figur 2). Imidlertid en høj DOX koncentration (f.eks., ~ 10.000 ng/mL) leveret af nanopartikler som følge af lange blod omløb tid kunne forstyrre peak påvisning af sig selv og andre forbindelser (f.eks.DOXol) og kan resultere i selvstændig quenching DOX fluorescens40,41. I dette tilfælde kan en ordentlig prøveopløsning ved hjælp af tomme fuldblod kraeves før analysen til at bestemme drug koncentrationer.

Udvindingsmetoder kan yderligere komplicerer analysen af kemoterapeutiske stof kombinationer. Selvom DOX eller MMC kan være udvundet ved hjælp af forskellige udvindingsmetoder, herunder faste fase ekstraktion (SPE) eller væske-solid udvinding, er disse procedurer tidskrævende og dyrt. Nogle af udvindingsmetoder resultere i dårlig opsving og mulige drug nedbrydning når saltsyre føjes til udvinding opløsningsmiddel42,43,44. For storstilet biologisk prøve præparater, den nuværende ekstraktion metode er enkel, hurtig og kun kræver tilsætning af små mængder af ikke-farligt organisk opløsningsmiddel for effektiv frigørelse proteinization efterfulgt af systematisk prøve rekonstitution ved hjælp af methanol. Høj genfindingsprocent (> 85%) blev opnået for alle narkotika prøver af varierende koncentrationer ved systematisk anvendelse af de samme udvinding protokol. Selv om variation stadig eksisterer, er at forskellene statistisk insignifikante. For yderligere at reducere variation, kan optimering af individuelle prøve ekstraktion ved lav og høj narkotika koncentrationer være påkrævet. Bemærk, at udvinding metoden ikke skelner gratis frigivet stof fra stof tilbage i nanopartikel som nanopartikler blev opløst efter tilsætning af organiske opløsningsmidler. Således er kræver den sande farmakokinetik af nanopartikler alene vs gratis stof alene udvikling af et numerisk deconvolution metode ved hjælp af matematiske modeller til at forudsige deres adfærd i vivo45.

I Resumé, blev en enkel og selektiv HPLC-metoden udviklet for samtidige bestemmelse af DOX, MMC og Doxol i vivo. Den nuværende metode viser robusthed, selektivitet, præcision og nøjagtighed over en bred vifte af narkotika koncentrationer for musen hele blod og væv. Denne metode har været anvendt med succes for at få blod koncentration-tid profil af DOX og MMC og bio-fordelingen af DOX, DOXol og MMC i brystkræft tumorer og andre vigtige organer (f.eks. hjertet). Denne protokol giver et nyttigt redskab for belyse makro- og mikroskopiske i vivo mekanismer af nanopartikler-leveret DOX indeholdende stoffet kombination kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser og interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne parlamentsarbejdet udstyr tilskud fra naturvidenskab og teknisk forskning (NSERC) Council of Canada til HPLC, driftstilskud fra det canadiske Institut for sundhed Research (CIHR) og canadiske bryst kræft forskning (CBCR) Alliance til X.Y. Wu, og University of Toronto legat til R.X. Zhang og T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13, (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5, (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15, (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6, (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15, (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74, (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15, (2), 003372 (2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101, (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22, (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15, (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80, (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5, (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9, (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15, (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5, (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2, (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119, (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22, (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12, (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11, (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334, (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6, (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32, (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764, (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739, (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721, (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43, (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676, (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42, (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6, (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91, (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81, (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7, (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50, (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826, (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19, (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).
Prøven udvinding og samtidige kromatografiske kvantitering af Doxorubicin og Mitomycin C efter narkotika kombination levering i nanopartikler til Tumor-bærende mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter