Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Monster extractie en gelijktijdige chromatografische kwantificatie van Doxorubicine en mitomycine C na Drug Delivery van de combinatie in nanopartikels met Tumor-dragende muizen

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte en handige analytische proces van extractie van het monster en gelijktijdige bepaling van meerdere drugs, Doxorubicine (DOX), mitomycine C (MMC) en een cardio-toxisch DOX metaboliet, doxorubicinol (DOXol), in de biologische monsters uit een preklinische borst tumor model behandeld met nanoparticle formuleringen van synergetische drug combinatie.

Abstract

Combinatie chemotherapie wordt vaak gebruikt in de kliniek voor de behandeling van kanker; echter kunnen bijbehorende nadelige effecten op de normale weefsel beperken het therapeutisch nut hebben. Nanoparticle gebaseerde drug combinatie is aangetoond dat het verminderen van de problemen van gratis drug combinatietherapie. Onze vorige studies hebben aangetoond dat de combinatie van twee geneesmiddelen, Doxorubicine (DOX) en mitomycine C (MMC), een synergie-effect tegen beide RattenUitrustingen geproduceerd en menselijke borstkanker cellen in vitro. DOX en MMC mede geladen polymeer-lipide hybride nanodeeltjes (DMPLN) overgeslagen verschillende efflux vervoerder pompen die multidrug resistentie en aangetoonde verbeterde werkzaamheid in borst tumor modellen verlenen. Vergeleken met conventionele oplossing vormen, werd deze superieure werkzaamheid van DMPLN toegeschreven aan de gesynchroniseerde farmacokinetiek van DOX en MMC en verhoogde intracellulaire drug biologische beschikbaarheid binnen de tumorcellen ingeschakeld door de nanocarrier PLN.

Om te evalueren van de farmacokinetiek en bio-distributie van samen toegediend DOX en MMC in zowel gratis oplossing en nanoparticle vormen, een eenvoudige en efficiënte multi geneesmiddelenanalyse-methode met behulp van reverse-fase hoge prestatie vloeibare chromatografie (HPLC) was ontwikkeld. In tegenstelling tot de eerder gemelde methoden die DOX of MMC afzonderlijk geanalyseerd in het plasma, is deze nieuwe HPLC-methode kunnen gelijktijdig kwantificeren DOX, MMC en een grote cardio-toxisch DOX metaboliet, doxorubicinol (DOXol), in verschillende biologische matrices ( bijvoorbeeld volbloed, borst tumor en hart). Een dubbele TL- en UV absorberend sonde 4-methylumbelliferone (4-MU) werd gebruikt als een interne standaard (I.S.) voor one-step detectie van meerdere geneesmiddelenanalyse met verschillende detectie golflengtes. Deze methode werd succesvol toegepast om te bepalen van de concentraties van DOX en MMC geleverd door zowel de nanoparticle als de oplossing benaderingen in volbloed en verschillende weefsels in een orthotopic borst tumor lymfkliertest model. De analytische methode gepresenteerd is een nuttig hulpmiddel voor pre-klinische analyse van de nanoparticle gebaseerde levering van drug combinaties.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chemotherapie is een primaire behandeling modaliteit voor vele vormen van kanker, maar het is vaak geassocieerd met ernstige bijwerkingen en beperkte doeltreffendheid als gevolg van resistentie tegen geneesmiddelen en andere factoren1,2,3. Ter verbetering van het resultaat van de chemotherapie zijn drug combinatie regimes toegepast in de kliniek op basis van overwegingen, zoals niet-overlappende toxicities, verschillende mechanismen voor drug actie, en niet-cross drug weerstand4,5 , 6. in klinische proeven, een betere respons van de tumor werd vaak waargenomen met behulp van gelijktijdig toegediend drug combinaties in vergelijking met een regime van sequentiële drug levering7,8. Nochtans, als gevolg van sub-optimale bio-distributie van gratis drug formulieren, gelijktijdige injectie van meerdere drugs kan veroorzaken prominente normale weefsel toxiciteit die opweegt tegen het therapeutisch effect9,10,11. Nanocarrier gebaseerde drug delivery is gebleken om de farmacokinetiek en bio-distributie van ingekapselde drugs, verbetering van de tumor-gerichte accumulatie12,13,14te wijzigen. Zoals besproken in onze recente artikelen, nanodeeltjes samen geladen met synergetische drug combinaties is gebleken dat de mogelijkheid om te verzachten de problemen door gratis drug combinaties, door hun gecontroleerde temporele en ruimtelijke co levering van meerdere geneesmiddelen om tumor weefsel, waardoor de drug van de synergetische effecten tegen kanker cellen4,15,16. Dientengevolge, zijn superieure therapeutische werking en lage toxiciteit aangetoond in beide pre-klinische en klinische studies4,17,18.

Onze vorige in vitro studies gevonden dat de combinatie van twee geneesmiddelen, Doxorubicine (DOX) en mitomycine C (MMC), een synergie-effect tegen verschillende borst kanker cellen lijnen geproduceerd en, bovendien, CO laden DOX en MMC binnen polymeer-lipide hybride nanodeeltjes (DMPLN) heeft verschillende kruisresistente bijbehorende efflux pompen (bijvoorbeeld P-glycoproteïne en borst kanker resistente eiwit)19,20,21overwonnen. In vivo, DMPLN ingeschakeld ruimtelijke-temporele co levering van DOX en MMC naar sites van de tumor en verhoogde biologische beschikbaarheid van drugs in kankercellen, zoals aangegeven door matiging van de vorming van de DOX metaboliet doxorubicinol (DOXol)22. Dientengevolge, verbeterd de DMPLN tumor cel apoptosis, tumor groeiremming en langdurige gastheer overleven in vergelijking met gratis DOX en MMC combinatie of een liposomaal DOX formulering22,23,24, 25.

Analyseren van de werkelijke hoeveelheid drugs mede geleverd door een nanocarrier is van cruciaal belang voor het ontwerpen van effectieve nanoparticle formuleringen. Veel methoden zijn ontwikkeld om te analyseren van het plasma niveau van één DOX of MMC doses met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) alleen of in combinatie met de Spectrometrie van de massa (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. deze methoden zijn echter vaak tijdrovend en onpraktisch voor combinatietherapie zoals een groot aantal biologische monsters apart worden voorbereid voor de analyse van meerdere drugs moet (soms met inbegrip van drug metabolieten). Naast de binding aan eiwitten sterk plasma van DOX en MMC hebben rode bloedcellen ook een grote capaciteit om te binden en het concentreren van vele geneesmiddelen35,36. Dus, plasma analyse voor DOX of MMC kan het verduisteren van werkelijke bloed drug concentraties. Het huidige werk (Figuur 1) beschrijft een eenvoudige en robuuste meerdere drug methode voor de analyse met behulp van omgekeerde fase HPLC gelijktijdig uitpakken en kwantificeren van DOX, MMC en de DOX metaboliet doxorubicinol (DOXol) van volbloed en verschillende weefsels ( bijvoorbeeld tumoren). Het is met succes toegepast om te bepalen van de farmacokinetiek en de bio-distributie van DOX en MMC en de vorming van DOXol na drug levering via gratis oplossingen of nanoparticle vormen (dat wil zeggen, DMPLN en Liposomale DOX) in een orthotopically lymfkliertest borst-tumor muismodel geïmplanteerd na intraveneuze (IV) injectie22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle dierproeven werden goedgekeurd door het dier Care Comité van University Health Network op de Ontario Cancer Institute en uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care Guidelines.

1. biologische bereiding van de monsters

  1. verzamelen van de volbloed, belangrijke organen, en borst tumor op vooraf bepaalde tijdstippen na intraveneuze (i.v.) toediening van drug-bevattende formuleringen (b.v. DMPLN, Liposomale DOX)
    1. een borst tumor-dragende muis i.v. injecteren met een bereid drug-bevattende formulering.
    2. Anesthetize van de muis op de aangewezen tijd-punten (bijvoorbeeld, 15 min) door het geven van inhaleerbare 2% Isofluraan in een afgesloten kamer.
    3. De narcose muis op zijn rug leggen en zijn neus doorverbonden met een neusstuk die voortdurend 2% Isofluraan levert.
      Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de muis diepe verdoving ondergaat, zachtjes knijpen fore ledematen van de muis en de look voor elke twitching beweging.
    4. Grondig reinigen van de borst en buik regio's met behulp van 70% ethanol en voer vervolgens een terminal procedure van cardiale punctie op de diepe narcose muizen met behulp van een injectiespuit 1 mL EDTA en een 23 G naald.
    5. Collect de volbloed in een gelabelde Natrium heparine gespoten kunststof buis en zachtjes swirl de buis om ervoor te zorgen het verzamelde bloed komt in aanraking met de gecoate heparine van de buiswand. Verzamel minimaal 50 µL van volbloed. Houd altijd de monsters op ice.
    6. Tape alle vier ledematen van de muis te beveiligen en open de buikholte en de ribbenkast voor de muis met behulp van een paar van schaar en pincet. De darmen naar de zijkant verschuiven en druk op de lever omhoog om voldoende bloot de ader van de portal. Snijd de ader van de portal voor de afvoer van bloed.
    7. Perfuse het lichaam van de hele muis met 50 mL ijskoud 0,9% zoutoplossing door het hart met een 10 mL injectiespuit met een naald van 25 G.
      Opmerking: Het buigen van de naald bij 90° voor de begeleiding van de injectiespuit in het portal ader.
    8. Accijnzen organen in de volgende volgorde: hart, Long, lever, milt, nieren. Weer, de tumor van de borst worden gescheiden van het omliggende bindweefsel met behulp van een paar incisie schaar op de juiste borstklier vet pad van de muis. Verzamelen van alle organen afzonderlijk in 1,5 mL polypropyleen buizen en snel bevriezen ze in vloeibare stikstof.
      ​ Opmerking: de galblaas scheiden van de lever.
    9. De volbloed bij 4 ° C en verwijderde weefsels bewaren in de vriezer-80 ° C tot latere HPLC analyse.
  2. Uittreksel DOX, MMC en DOXol van biologische matrices.
    1. Weeg alle bevroren ontleed weefsels snel en ze vervolgens overbrengen naar een 13 mL afgerond-onderkant conische buis. Om te voorkomen dat mogelijke drug metabolisme of afbraak, houd de monsters op ice.
    2. 1-5 mL lysisbuffermengsel ijskoude cel toevoegen in de buis.
      Opmerking: De omvang van de buffer te gebruiken hangt af van het gewicht van de weefsel op basis van de verhouding van de weefsel-buffer van 1 g: 5 mL (w/v); voor kleine organen, zoals hart en milt, de verhouding is 1 g: 2 mL.
    3. Een beweging omhoog / omlaag lijn kunt meng de weefselsteekproeven op ijs met een snelheid van 18.000 rpm met behulp van een elektrische hand-homogenizer.
      Opmerking: Voltooide homogenisering vereist ongeveer 3 tot 5 herhalingen van een korte homogenisering proces van minder dan 15 s, gevolgd door weefsel koeling over ijs tussen elke korte homogenisering.
    4. Wassen van de 10 mm saw-tooth generator sonde van de homogenizer met gedestilleerd gedeïoniseerd (DDI) H 2 O, 70% ethanol en vervolgens DDI H 2 O tussen elk weefsel monster te voorkomen van kruisbesmetting.
    5. Breng 50 µL van weefsel homogenaat of volbloed in een 1,5 mL polypropyleen micro-centrifuge buis en spike met 5 µL van een interne standaard (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) in de buis.
      Opmerking: 4-MU oplossing in methanol hier opgesteld.
    6. Voeg toe 250 µL van een ijskoude extractievloeistof in het buisje met volbloed of weefsel homogenaat.
      Opmerking: De extractievloeistof bestaat uit 60% acetonitril (ACN) en 40% ammoniumacetaat (5 mM) met pH aangepast aan de pH = 3,5 met behulp van 0,05% mierenzuur. Gebruik van een 1:5 (v/v) voorbeeld: extractievloeistof aan volumeverhouding.
    7. Krachtig het mengsel gedurende 2 minuten, centrifuge op 3.000 x g kracht bij 4 o C voor 10 min en Pipetteer 200 µL supernatant in een andere vooraf gekoelde verse micro-centrifuge buis vortex.
    8. Evaporate supernatant bij 60 ° C onder een trage stroom van stikstofgas met bescherming tegen licht.
    9. Reconstrueren van het droge residu met 100 µL van ijskoude methanol, krachtig vortex voor 30 s en centrifuge bij 3000 x g bij 4 ° C voor een andere 5 min.
    10. Breng de bovendrijvende substantie in een HPLC flacon invoegen en plaatsen van monster flesjes in de lade van een autosampler voor injectie.

2. HPLC-instrumentatie en bewerkingsparameters

  1. bereiden HPLC mobiele fase met consistente reproduceerbaarheid
    1. 500 mL HPLC-grade H 2 O met behulp van een gegradueerde cilinder meten.
    2. Meten van HPLC-grade acetonitril (ACN) met behulp van een aparte afgestudeerd cilinder 500 mL.
    3. Voeg voorzichtig 0,5 mL trifluorazijnzuur (TFA) (Let op) in elk 500 ml H 2 O en ACN te verkrijgen van de mobiele fase van H 2 O en ACN met 0,1% TFA, respectievelijk.
      Opmerking: TFA is bijtende en giftige en onder een zuurkast laboratorium moet worden behandeld. Alle mengsels van oplosmiddelen zijn bereid bij kamertemperatuur.
    4. Filter mobiele fasen door een membraanfilter van nylon met een 0,45 µm porie grootte en breng dit in een schone HPLC reservoir flessen.
  2. Set-up HPLC instrumentatie voor simultane detectie van DOX, MMC, en DOXol en I.S. 4-MU.
    1. Zet de kleurovergang pomp, ambtshalve gasser, auto-sampler, fotodiode array detector en multi λ fluorescentiedetector.
    2. Input van de oorspronkelijke voorwaarden van de mobiele-fase samenstelling naar 16,5% H 2 O (0,1% TFA) en 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Set van de UV-detector op twee kanalen, één voor één 310 nm voor 4-MU (I.S.) en anderzijds op 360 nm voor MMC.
    4. De fluorescentiedetector ingesteld op twee kanalen, één voor één λ ex / λ em = 365/445 nm voor 4-MU en de andere op λ ex / λ em = 480 nm/560 nm voor DOX en DOXol, respectievelijk.
    5. Instellen van een isocratic debiet van 1,0 mL/min.
    6. Een voorgeïnstalleerde omgekeerde fase C 18 kolom (4.6 mm x 250 mm, 5 µm) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten basislijn verantwoordelijkzijnvoor equilibreer.
  3. Scheiden van drugs (DOX, MMC, DOXol en 4-MU) met kleurovergang mobiele-fase voorwaarde.
    1. Injecteren 15 µL van uitgepakte en opnieuw geconcentreerd monsters met behulp van de auto-sampler.
    2. Geleidelijk veranderen de eerste voorwaarde van de mobiele fase (zie protocol stap 2.2.2) tot 100% ACN (0,1% TFA) meer dan 18 min met behulp van de geautomatiseerde kleurovergang pomp.
      Opmerking: Tijdens het scheidingsproces, vier kanalen (twee UV-absorberend en twee TL) verschijnen gelijktijdig met elk kanaal een drug samengestelde weergeven (Zie Protocol stap 2.2.3 en 2.2.4).
    3. 100% van ACN handhaven (0,1% TFA) voor 1 min en vervolgens terugkeren naar de voorwaarde van de eerste mobiele fase binnen 1 min.
    4. Opnieuw de conditie van de kolom met de eerste mobiele fase stroom snelheid van 1,5 mL/min voor 4 min voor de volgende monster injectie.

3. Validatie van de HPLC

  1. bereiden arbeidsnormen van DOX, MMC en DOXol en 4-MU (I.S.).
    1. Weigh afzonderlijk 1 mg van DOX en MMC drug poeder (voorzichtig) en 4-MU op een klein gewicht van papier (3 x 3 inch 2) frisse.
      Opmerking dat alle antikanker geneesmiddelen worden beschouwd als een gevaar voor de gezondheid die acute toxiciteit en geslachtscellen mutageniteit op inademing of inslikken veroorzaken kan. Zij moeten voorzichtig worden omgegaan met handschoenen en maskers.
    2. De gewogen DOX, MMC en 4-MU overzetten naar een nieuwe afzonderlijke 1,5 mL polypropyleen micro-centrifuge buis.
    3. , Voeg 1 mL van methanol en vortex kort te verkrijgen van 1 mg/mL concentratie van DOX en MMC.
    4. Voeg 1 mL methanol in een flesje dat vooraf gewogen 1 mg DOXol (Let op) en vortex kort te verkrijgen van 1 mg/mL concentratie van DOXol.
      Opmerking: DOXol is een metaboliet van cardio-giftig en moet voorzichtig worden omgegaan,.
    5. Pipetteer 20 µL van bereide voorraad oplossingen van DOX, MMC, DOXol en 4-MU in een nieuwe aparte 1,5 mL polypropyleen micro-centrifuge buis en voeg 980 µL van methanol te verkrijgen van een standaard werken van 20 µg/mL van elk medicijn.
    6. Verdun 20 µg/mL DOX, MMC en DOXol gebruik van methanol om te verkrijgen van de arbeidsnormen van 50 ng - 20 µg /mL voor DOX, MMC en DOXol en 2000 ng/mL voor I.S. 4-MU.
    7. Zegel van de dop van de tube van werkende oplossingen met een smal stuk van paraffine film dekking te voorkomen van methanol verdamping, wikkel de hele buis met aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling aan direct licht en opslag bij -20 ° C.
  2. Bepalen de lineariteit, precisie en nauwkeurigheid van DOX, MMC en DOXol in biologische matrices (dat wil zeggen, volbloed en tumor homogenaat).
    1. Gelijktijdig spike 5 µL van arbeidsnormen van DOX en DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1000 ng/mL - 16 µg/mL), en 4-MU (2 µg/mL) in 50 µL van lege volbloed of weefsel homogenaat in polypropyleen micro-centrifuge buizen naar verkrijgen van de curve van de standaard concentratie variërend van 5-2000 ng/mL voor drug compounds en 200 ng/mL voor 4-MU (I.S.).
    2. Uitvoeren van de drug extractie assay beschreven in Protocol 1.2.
    3. Gebruik lage, gemiddelde en hoge concentraties van DOX en DOXol (50, 500 en 2000 ng/mL) en MMC (100, 1000, 2000 ng/mL) voor intra - en intersite - dag precisie en nauwkeurigheid.
      Opmerking: Bereiden verse standaard concentraties op de dag van analyse.
  3. Analyse van monsters
    1. injecteren 15 µL van het monster met behulp van de auto-sampler.
    2. Geleidelijk veranderen de mobiele fase meer dan 0 tot en met 18 min, verhoging van de samenstelling van ACN over de interval.
    3. Na 18 min, houd de toestand van de mobiele fase 1 min.
    4. Terug te keren naar de oorspronkelijke toestand over de volgende 2 min, dan opnieuw equilibreer gedurende 4 minuten vóór de volgende injectie.
    5. Na elk monster lopen, er rekening mee dat de pieken van de drug compounds met hun retentietijd als volgt worden weergegeven: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) en DOX.
    6. De piekoppervlakte onder de curve (AUC) van drug verbindingen met behulp van HPLC-software integreren.
    7. Berekenen van de AUC verhouding tussen individuele drug samengestelde en I.S. (vergelijking 1) en de standaard curven bereid volgens dezelfde extractie procedures gebruiken om te bepalen van de concentraties van de drug van DOX, MMC en DOXol in DMPLN formulering.
      Equation 1
    8. de drug herstel percentage (vergelijking 2) berekenen door het vergelijken van de concentraties van de drug gereconstitueerd gebruik van methanol uit de extracten van puntige biologische monsters die van de standaard (" nette ") oplossing in methanol van de drug.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Twee antikanker geneesmiddelen, DOX en MMC, evenals de DOX metaboliet, DOXol, werden gelijktijdig ontdekt een biologische ongehinderd onder dezelfde toegepaste gradiënt HPLC staat gebruik van 4-MU als de I.S. voor zowel de fluorescentie en UV detectoren. DOX, MMC, DOXol en 4-MU waren goed van elkaar gescheiden met retentietijden van 5.7 min voor MMC, 10.4 min voor DOXol, 10.9 min. voor 4-MU en 11.1 min voor DOX (Figuur 2). Elk medicijn in volbloed en verschillende weefsels toonde concentratie lineariteit met correlatiecoëfficiënten (R2) variërend van 0.98 tot 1,00 (afbeelding 3 en tabel 1). De ondergrens van kwantificatie (Ondergrens) van DOX, DOXol en MMC was 10 ng/mL, 10 ng/mL en 100 ng/mL in volbloed en 25 ng/mL, 25 ng/mL en 200 ng/mL in verschillende weefsels, respectievelijk (tabel 1). De HPLC-methode ontwikkelde weergegeven minder dan 15% variatie in termen van intra - en intersite - dag precisie en nauwkeurigheid voor DOX, MMC en DOXol in het bloed en verschillende biologische matrices (b.v., hart, longen, lever, milt en nieren), die aangeeft uitstekende reproduceerbaarheid (tabellen 2 en 3). Meer dan 85% van DOX en MMC was hersteld van volbloed na extractie (tabel 4).

De procedures van de multidrug analyse one-step ambtshalve proteinization via een aangezuurde extractievloeistof gevolgd door gebruik te maken van een multichannel HPLC-methode werd succesvol toegepast om te bepalen van de farmacokinetiek en bio-distributie van lange-circulerende of Gepegyleerde drug nanoparticle gebaseerde levering van beide DOX alleen of in combinatie met MMC in een orthotopic borst tumor lymfkliertest model (figuren 4 en 5). Figuur 4 toont ten minste 6-fold hogere concentraties van de drug in het bloed teveel tijd geleverd door nanodeeltjes (d.w.z., Liposomale DOX en DMPLN) dan de gelijkwaardige vrije drug oplossingen (d.w.z., gratis DOX of gratis DOX-MMC) (figuur 4). wegens langdurige systemische circulatie, nanodeeltjes waren kunnen profiteren van de verbeterde permeabiliteit en bewaring van effecten van de tumor, wat resulteert in verhoogde DOX en MMC accumulatie in de borst tumor (Figuur 5A) 37. ondertussen de kwantitatief bepaald vorming van DOX metaboliet DOXol tumoren van de borst meer dan 24 h geeft een verschil in de bio-beschikbaarheid van de drug voor verschillende formuleringen (Figuur 5B geneesmiddelen).

Figure 1
Figuur 1 : Illustratie van de analyse verwerkt voor de gelijktijdige bepaling van DOX en MMC geleverd door nanodeeltjes in vivo. (A) voorbereiding van DMPLN met een one-step ultra-ultrasoonapparaat methode gevolgd door een zelf-assemblage proces; (B) biologische monstercollecties van een orthotopic borst tumor lymfkliertest model; (C) Drug extractie van biologische matrices en reconstitutie van het geneesmiddel; (D) gradiënt HPLC voor scheiding van DOX, MMC en DOXol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Vergelijking van chromatogrammen van lege volbloed en drug mengsels in bloed. Vergelijking van chromatogrammen van lege volbloed en drug mengsels in bloed met behulp van HPLC gekoppeld aan UV- en fluorescentie detectoren op (A) UV 360 nm voor MMC; (B) UV 310 nm voor I.S. 4-MU; (C) fluorescentie bij λex / em = 480/560 nm voor DOX en DOXol; (D) fluorescentie bij λex / em = 365/445 nm voor I.S. 4-MU. AU is extinctie eenheid en EU is fluorescentie eenheid. De geïnjecteerde concentraties van MMC, DOX, en DOXol en hun I.S. 4-MU waren 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL en 200 ng/mL, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Vertegenwoordiging van standaard curven voor MMC, DOX en DOXol in volbloed. De concentratie bereiken moesten van 100 ng/mL 2000 ng/mL voor MMC (A), van 5 ng/mL tot 2000 ng/mL voor lage DOX concentratie (B) en van 5 ng/mL tot 50 ng/mL voor DOXol (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Toepassing van de meerdere systeem voor de analyse van de drug, met behulp van een multichannel en gradiënt HPLC-methode, om te studeren de farmacokinetiek van lange-circulerende nanoparticle gebaseerde drug delivery. (A) tijd-bloed profielen van de concentratie van DOX in mono-therapie met behulp van gratis drug oplossingen (gratis DOX) of een liposomaal formulering (Zie Tabel van materialen); (B) tijd-bloed profielen van de concentratie van DOX en MMC als gratis drug combinatie (gratis DOX-MMC) of DMPLN. Volbloed werd verzameld op verschillende tijd punten tot 24u na een enkele i.v. injectie aan muizen die een orthotopic lymfkliertest borst tumor. Alle muizen werden behandeld met 9.2 mg/kg DOX alleen of in combinatie met 2.9 mg/kg MMC. Omdat de LLOD van MMC 100 was ng/mL met behulp van de HPLC gekoppeld UV-detector, MMC concentratie na 6 uur na injectie werd bepaald door de Spectrometrie van de massa. De figuur is gewijzigd van Zhang et al.. Nanogeneeskunde met toestemming22. Alle de gegevenspunten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) met n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Toepassing van meerdere drugs analyse met behulp van de gradiënt HPLC-methode om te studeren van de tumor bio-verdeling van een nanoparticle gebaseerde drug delivery systeem. (A) totale DOX en MMC concentraties van gratis DOX-MMC of DMPLN in borst tumoren; (Rong > B) totale DOXol metaboliet vorming in borst tumoren met mono- of combinatie DOX chemotherapie behandeld. Alle muizen werden behandeld met 9.2 mg/kg DOX alleen of in combinatie met 2.9 mg/kg MMC. Want gratis DOX-MMC had een accumulatie van lage tumor dat was uit met behulp van de LLOD van de MMC dat de HPLC gekoppeld UV-detector, werd MMC concentratie in gratis DOX-MMC bepaald door de Spectrometrie van de massa. De figuur is gewijzigd van Zhang et al.. Nanogeneeskunde met toestemming22. Alle gegevenspunten worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD met n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Table 1
Tabel 1: lineariteit en Ondergrens van DOX, MMC en DOXol in verschillende biologische matrices. De gegevens zijn gemiddelde ± SD voor n = 3.

Table 2
Tabel 2: Intra - en intersite - dag precisie en nauwkeurigheid van DOX, MMC en DOXol in muis volbloed (n = 3).

Table 3
Tabel 3: Intra - en intersite - dag precisie en nauwkeurigheid van DOX, MMC en DOXol tumoren van de borst (n = 3).

Table 4
Tabel 4: DOX en MMC herstel percentage in de monsters van volbloed na extractie (n = 3). De gegevens vormen gemiddelde ± SD voor n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vergeleken met andere chromatografische methoden waarmee de detectie van een enkele drug soort tegelijk, vermag het huidige protocol van HPLC kwantificeren gelijktijdig drie drug compounds (DOX, MMC en DOXol) in de matrix dezelfde biologische zonder naar de nood voor wijzigen de mobiele fase. Deze voorbereiding en analyse methode is succesvol toegepast om te bepalen van de farmacokinetiek en bio-verdeling van twee nanoparticle gebaseerde drug afgiftesystemen (dat wil zeggen, Liposomale DOX en DMPLN)22. Aangezien de gepegyleerde nanodeeltjes verlengen systemische circulatie van geladen drug resulterend in hoge bloed drug concentraties gedurende een lange periode van tijd (> 24u), de beschreven chromatografische methode is rendabel voor analyse van het monster van de grote schaal van nanoparticle co geladen drug combinaties in pre-klinische studies22. De farmacokinetiek van gratis DOX oplossing en Liposomale DOX weergegeven in Figuur 4A is in overeenstemming met de literatuur van de gerapporteerde gegevens in knaagdieren38,39, verdere ondersteuning van de geldigheid van de huidige methode. Hoewel de UV fotodiode-array detector meerdere-kanalen gelijktijdig detecteren en weergeven met behulp van de variabele golflengten (dat wil zeggen, 310 nm voor 4-MU en 360 nm voor MMC) drugs kunt, de intrinsieke detectiegrens van UV-detector is minder gevoelig dan de fluorescentiedetector. Dus, voor het snel elimineren, niet-belichting fluorescerende drugs zoals MMC geleverd in gratis oplossingen, de concentraties van de drug op latere tijdstippen kunnen lager zijn dan de Ondergrens van UV-detector.

In het algemeen, zou een korte chromatografie kolom (bijvoorbeeld, 5 cm) worden gebruikt voor HPLC analyse om te minimaliseren van de elutie tijd en de werkingsduur. Echter bij het analyseren van meerdere verbindingen van de drug, vooral die met zeer vergelijkbaar moleculaire structuren (bv, DOX en de metabolieten daarvan DOXol), kan het moeilijk zijn om een volledige scheiding met behulp van de korte kolom als gevolg van intrinsieke kolom efficiëntie. Dus zijn zowel een langere kolom (bijvoorbeeld25 cm, gebruikt in het huidige protocol) en een optimalisatie van HPLC parameters tijdens de ontwikkeling van de methode nodig om een goede piek-oplossing te bereiken. Hoewel DOX, DOXol en 4-MU, werden bij nauwe retentietijd geëlueerd, werd de interferentie tussen DOX/DOXol en 4-MU niet waargenomen in de concentratie van het bereide monster (b.v., 50 ng/mL) in de chromatografen (Figuur 2). Echter een hoge DOX concentratie (b.v., ~ 10.000 ng/mL) geleverd door nanodeeltjes als gevolg van lange bloed omloop tijd zou kunnen interfereren met de opsporing van de piek van zichzelf en andere verbindingen (bijvoorbeeldDOXol) en kan resulteren in zelf blussen van DOX fluorescentie40,41. In dit geval een goede monsterverdunning met lege volbloed mogelijk moet vóór de analyse van de steekproef bepalen concentraties van de drug.

Extractiemethoden kunnen verder bemoeilijken de analyse van chemotherapeutische drug combinaties. Hoewel DOX of MMC kan worden geëxtraheerd met behulp van verschillende extractiemethoden, met inbegrip van vaste fase extractie (SPE) of vloeistof-deeltjes extractie, zijn deze procedures tijdrovend en duur. Sommige van de extractiemethoden resulteren in slecht herstel en mogelijke drug afbraak wanneer zoutzuur wordt toegevoegd aan de extractie oplosmiddel42,43,44. Voor grote schaal biologische staalvoorbereiding, de huidige extractiemethode is eenvoudig, snel en alleen vereist de toevoeging van kleine hoeveelheden van ongevaarlijke organisch oplosmiddel voor efficiënte ambtshalve proteinization gevolgd met behulp van de reconstructie van de systematische steekproef methanol. Hoge herstel tarieven (> 85%) werden bereikt voor alle monsters van uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar drug door systematisch de hetzelfde protocol voor extractie toe te passen. Hoewel variabiliteit nog steeds bestaat, zijn de verschillen statistisch niet significant. Verklein verder de variatie en kan de optimalisering van de individuele monster extractie bij lage en hoge drug concentraties worden verlangd. Merk op dat de gebruikte extractiemethode geen onderscheid gratis vrijgegeven drug van de drug nog in de nanoparticle gemaakt wordt zoals nanodeeltjes werden volledig is opgelost na toevoeging van organische oplosmiddelen. Zo, de ware farmacokinetiek van nanodeeltjes alleen vs. gratis drug alleen vereist de ontwikkeling van een methode van de numerieke deconvolutie met behulp van wiskundige modellering te voorspellen hun gedrag in vivo45.

Kortom, werd een eenvoudige en selectieve HPLC-methode ontwikkeld voor gelijktijdige bepaling van DOX, MMC en Doxol in vivo. De huidige methode toont robuustheid, selectiviteit, precisie en nauwkeurigheid over een breed scala aan drugs concentraties voor de muis volledig bloed en weefsels. Deze methode is succesvol toegepast om het bloed concentratie-tijd-Profiel van DOX en MMC en de bio-verdeling van DOX, DOXol en MMC in borst tumoren en andere belangrijke organen (bijvoorbeeld het hart) te verkrijgen. Dit protocol biedt een nuttig instrument voor het ophelderen van macro- en microscopische in vivo mechanismen van DOX nanoparticle-geleverd met drug combinatie chemotherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen en belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de subsidie van de apparatuur van de natuurwetenschappen en de Engineering Research (NSERC) Raad van Canada voor HPLC, de exploitatiesubsidie van de Canadian Institute of Health onderzoek (CIHR) en de Canadian Breast Cancer Research (CBCR) Bondgenootschap aan X.Y. Wu, en de beurs van de Universiteit van Toronto R.X. Zhang en T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13, (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5, (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15, (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6, (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15, (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74, (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15, (2), 003372 (2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101, (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22, (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15, (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80, (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5, (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9, (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15, (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5, (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2, (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119, (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22, (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12, (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11, (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334, (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6, (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32, (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764, (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739, (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721, (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43, (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676, (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42, (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6, (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91, (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81, (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7, (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50, (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826, (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19, (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).
Monster extractie en gelijktijdige chromatografische kwantificatie van Doxorubicine en mitomycine C na Drug Delivery van de combinatie in nanopartikels met Tumor-dragende muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter