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Cancer Research

Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Ce protocole décrit un processus analytique efficace et pratique de l’extraction de l’échantillon et le dosage simultané de plusieurs drogues, doxorubicine (DOX), la mitomycine C (MMC) et un métabolite DOX cardio toxiques, doxorubicinol (DOXol), dans le biologique échantillons d’un modèle de tumeur mammaire précliniques traitement avec des formulations de nanoparticules de combinaison synergique de médicaments.

Abstract

Chimiothérapie d’association est fréquemment utilisée en clinique pour le traitement du cancer ; Cependant, les effets indésirables associés aux tissus normaux peuvent limiter ses bienfaits thérapeutiques. Combinaison de médicaments à base de nanoparticules a été démontré pour atténuer les problèmes rencontrés par le traitement d’association de médicaments gratuits. Nos études antérieures ont montré que la combinaison de deux médicaments anticancéreux, doxorubicine (DOX) et la mitomycine C (MMC), produit un effet de synergie contre les deux murin et cancer du sein humain cellules in vitro. Les nanoparticules de hybride co-chargés polymère-lipidiques DOX et MMC (DMPLN) contourné différentes pompes de transporteur d’efflux qui confèrent une résistance multidrogue et efficacité accrue démontrée dans les modèles de tumeurs du sein. Par rapport aux formes de solution conventionnelle, telle une efficacité supérieure de DMPLN a été attribuée à la pharmacocinétique synchronisée de DOX et MMC et biodisponibilité accrue de drogues intracellulaire dans les cellules tumorales activées par le nanocarrier PLN.

Afin d’évaluer la pharmacocinétique et la bio-distribution de co-administration DOX et MMC en solution gratuite et en forme de nanoparticules, une méthode d’analyse de plusieurs médicaments simples et efficaces à haute performance phase inverse, chromatographie en phase liquide (HPLC) a été mis au point. Contrairement aux méthodes rapportés précédemment analysés individuellement les DOX ou MMC dans le plasma, cette nouvelle méthode HPLC est capable de doser simultanément DOX, MMC et un métabolite majeur de DOX cardio toxiques, doxorubicinol (DOXol), dans diverses matrices biologiques ( par exemple, sang, tumeur du sein et du coeur). Un double fluorescent et ultraviolet absorbant sonde 4-méthylumbelliférone (4-MU) a été utilisé comme étalon interne (RI) pour la détection d’une étape d’analyse des drogues multiples avec des longueurs d’onde de détection différentes. Cette méthode a été appliquée avec succès pour déterminer les concentrations de DOX et MMC livré par les approches de nanoparticules et de solution dans le sang entier et divers tissus dans un modèle murin de tumeur orthotopique du sein. La méthode analytique présentée est un outil utile pour l’analyse préclinique de livraison à base de nanoparticules de combinaisons de médicaments.

Introduction

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Pourtant, il est souvent associé à des effets indésirables graves et une efficacité limitée en raison de la résistance aux médicaments et autres facteurs1,2,3, la chimiothérapie est une modalité de traitement primaire pour nombreux cancers. Pour améliorer les résultats de la chimiothérapie, régimes de combinaison de drogue ont été appliquées à la clinique fondée sur des considérations telles que les toxicités non chevauchantes, différents mécanismes d’action des médicaments et drogues non-Croix résistance4,5 , 6. dans les essais cliniques, un meilleur taux de réponse tumorale a été souvent observé en utilisant simultanément administré des combinaisons de médicaments par rapport à un régime de médicaments séquentielle livraison7,8. Cependant, à cause de moins qu’optimale bio-distribution des formes de médicaments gratuits, injection simultanée de plusieurs médicaments peut causer toxicité des tissus normaux qui l’emporte sur l’effet thérapeutique9,10,11. Livraison de médicaments nanocarrier a démontré que modifier la pharmacocinétique et la bio-distribution de médicaments encapsulés, améliorant l’accumulation ciblée tumeur12,13,14. Comme dans nos articles récents, nanoparticules chargés conjointement avec des associations médicamenteuses synergiques ont démontré la capacité d’atténuer les problèmes rencontrés par des combinaisons de médicaments gratuits, en raison de leur prestation conjointe contrôlée temporelle et spatiale de plusieurs médicaments de tissu tumoral, ce qui permet des effets synergiques de médicaments contre le cancer cellules4,15,16. Ainsi, l’efficacité thérapeutique supérieure et une faible toxicité ont été démontrés dans les deux études pré-cliniques et cliniques4,17,18.

Nos études antérieures au in vitro constaté que la combinaison de deux médicaments anticancéreux, doxorubicine (DOX) et la mitomycine C (MMC), produit un effet synergétique contre plusieurs lignées de cellules de cancer du sein et, en outre, co chargement DOX et MMC dans des nanoparticules hybrides polymère lipidique (DMPLN) a surmonté diverses résistantes à plusieurs médicaments associés efflux pompes (p. ex., P-glycoprotéine et protéine résistante du cancer du sein)19,20,21. In vivo, DMPLN permis co-exécutants spatio-temporelle de DOX et MMC aux sites tumoraux et biodisponibilité accrue de médicaments dans les cellules cancéreuses, comme indiqué par la modération de la formation du métabolite DOX doxorubicinol (DOXol)22. En conséquence, le DMPLN amélioré l’apoptose des cellules tumorales, inhibition de la croissance tumorale et la survie prolongée hôte par rapport à la pour libre combinaison DOX / MMC ou un liposomale DOX formulation22,23,24, 25.

Analysant le montant réel de médicaments fourni conjointement par nanocarrier est critique pour la conception de formulations NANOPARTICULAIRES efficace. Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser le taux plasmatique de doses uniques de DOX ou MMC à l’aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) seule ou en combinaison avec la spectrométrie de masse (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Toutefois, ces méthodes sont souvent fastidieux et peu pratique pour la thérapie de combinaison comme un grand nombre d’échantillons biologiques doivent être préparés séparément pour l’analyse de plusieurs médicaments (parfois, y compris leurs métabolites). En plus de la liaison aux protéines plasmatiques fort de MMC et DOX, les globules rouges ont également une grande capacité à se lier et se concentrent de nombreux médicaments anticancéreux35,36. Ainsi, analyse du plasma pour DOX ou MMC peut masquer des concentrations sanguines réelles de la drogue. Le présent travail (Figure 1) décrit un simple et robuste, méthode d’analyse de drogues multiples à l’aide de CLHP en phase inverse à extraire simultanément et à quantifier DOX, MMC et le doxorubicinol de métabolite DOX (DOXol) de sang et de tissus différents ( par exemple, des tumeurs). Il a été avec succès appliqué pour déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution de MMC et DOX, ainsi que la formation de DOXol après administration de médicaments par l’intermédiaire des solutions libres ou formes de nanoparticules (c.-à-d., DMPLN et DOX liposomale) dans un orthotopically implanté le modèle murin du sein-tumeur de la souris après par voie intraveineuse (i.v.) injection22.

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Protocol

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toutes les expérimentations animales ont été approuvées par Animal Care Comité du réseau universitaire de santé à l’Institut ontarien du Cancer et réalisées selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines.

1. préparation de l’échantillon biologique

  1. recueillir le sang entier, les principaux organes et du sein tumeur à des moments prédéterminés après administration par voie intraveineuse (i.v.) de médicaments contenant des formulations (par exemple, DMPLN, DOX liposomale)
    1. injecter un i.v. de souris avec tumeur du sein avec une formulation préparée contenant un medicament.
    2. Anesthésier la souris aux moments désignés (par exemple, 15 min) en donnant l’isoflurane inhalables de 2 % dans une enceinte étanche.
    3. Posez la souris anesthésiée sur son dos et mettre son nez à travers un embout qui alimente constamment 2 % isoflurane.
      Remarque : Pour garantir la souris subit une anesthésie profonde, légèrement pincer les membres avant de la souris et recherchez de n’importe quel mouvement contractions.
    4. Nettoyer les régions de poitrine et l’abdomen à l’aide d’éthanol à 70 % et puis effectuez un terminal intérieur de ponction cardiaque sur les souris anesthésiés profondes à l’aide d’une seringue héparinée 1 mL et une aiguille de 23 G.
    5. Collecter le sang dans une étiquette sodium héparine pulvérisé le tube en plastique et agiter doucement le tube afin de s’assurer que le sang recueilli entre en contact avec l’héparine de revêtement de la paroi du tube. Recueillir un minimum de 50 µL de sang total. Gardez toujours les échantillons sur glace
    6. Tape tous les quatre membres de la souris à sécuriser et à ouvrir la cavité abdominale et la cage thoracique de la souris à l’aide d’une paire de ciseaux et pinces. Décaler les intestins vers le côté et poussez le foie vers le haut pour exposer suffisamment la veine porte. Couper la veine pour le drainage sanguin.
    7. Perfuse le corps de toute souris avec 50 mL de glacé salin de 0,9 % à travers le cœur à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille 25 G.
      NOTE : Plier l’aiguille à 90° pour guidant la seringue dans la veine porte.
    8. Ordre
    9. organes d’accise dans ce qui suit : cœur, poumons, foie, rate, les reins. Puis, séparer la tumeur du sein les tissus conjonctifs environnants à l’aide d’une paire de ciseaux de l’incision à la coussinets adipeux mammaire droite de la souris. Recueillir tous les organes individuellement dans des tubes en polypropylène de 1,5 mL et congelez-les rapidement dans l’azote liquide.
      ​ Remarque : séparer la vésicule biliaire du foie.
    10. Conserver le sang total à 4 ° C et tissus excisés dans le congélateur à-80 ° C jusqu'à l’analyse CLHP.
  2. Extrait DOX, MMC et DOXol de matrices biologiques.
    1. Peser tous les tissus disséqués congelés rapidement et de les transférer dans un tube conique arrondie du fond de 13 mL. Pour éviter le métabolisme des médicaments possibles ou dégradation, conserver les échantillons sur Ice.
    2. Ajouter 1 à 5 mL de tampon de lyse cellulaire glacée dans le tube.
      Remarque : Le volume de mémoire tampon à utiliser dépend de la masse de tissu selon le ratio de tissu-tampon de 1 g : 5 mL (p/v) ; pour les petits organes, comme le cœur et la rate, le ratio est de 1 g : 2 mL.
    3. Utiliser un mouvement haut-bas coup pour homogénéiser les échantillons de tissus sur la glace à une vitesse de 18 000 tr/min en utilisant un homogénéisateur main myoélectrique.
      Remarque : Homogénéisation terminée nécessite environ 3 à 5 itérations d’un processus d’homogénéisation courte de moins de 15 s, suivi par le tissu de refroidissement sur la glace entre chaque courte homogénéisation.
    4. Laver la sonde de générateur de dent de scie de 10 mm de l’homogénéisateur avec distillée désionisée (DDI) H 2 O, éthanol à 70 %, puis DDI H 2 O entre chaque échantillon de tissu pour éviter la contamination croisée.
    5. Transférer 50 µL d’homogénat tissulaire ou de sang dans un tube en polypropylène de micro-centrifugeuse de 1,5 mL et spike avec 5 µL d’un intérieur standard (I.S.) 4-méthylumbelliférone (4-MU) (2000 ng/mL) dans le tube.
      Remarque : la solution de 4-MU a été préparée dans le méthanol ici.
    6. Ajouter 250 µL d’un solvant d’extraction glacée dans le tube contenant le sang entier ou homogénat tissulaire.
      Remarque : Le solvant d’extraction est constitué de 60 % d’acétonitrile (ACN) et l’acétate d’ammonium 40 % (5 mM) avec pH ajusté à pH = 3,5 à l’aide d’acide formique de 0,05 %. Utiliser un échantillon de 1:5 (v/v) : solvant d’extraction ratio volume.
    7. Vigoureusement vortex le mélange pendant 2 min, centrifuger à 3 000 x g force à 4 o C pendant 10 min et ajouter 200 µL de surnageant dans un autre tube de micro-centrifugeuse frais préalablement réfrigéré.
    8. S’évaporer surnageant à 60 ° C sous un lent courant d’azote gazeux avec protection contre la lumière.
    9. Reconstituer le résidu séché avec 100 µL de méthanol glacé, vigoureusement les Vortexer pendant 30 s et centrifuger à 3000 x g à 4 ° C pendant encore 5 min.
    10. Transvaser le surnageant dans un encart de flacon HPLC et placer les flacons d’échantillon dans un bac d’échantillonneur automatique pour injection.

2. Instrumentation HPLC et paramètres d’opération

  1. préparer HPLC phase mobile avec une reproductibilité compatible
    1. 500 ml de qualité HPLC H 2 O à l’aide d’une éprouvette graduée.
    2. 500 ml de qualité HPLC acétonitrile (ACN) à l’aide d’une éprouvette graduée distincte.
    3. Soigneusement ajouter 0,5 mL d’acide trifluoroacétique (TFA) (CAUTION) dans chacun des 500 mL H 2 O et ACN pour obtenir la phase mobile H 2 O et ACN contenant 0,1 % TFA, respectivement.
      NOTE : TFA est corrosif et toxique et doit être manipulé sous une hotte de laboratoire. Tous les mélanges de solvants sont préparés à la température ambiante.
    4. Phases mobiles filtre à travers un filtre à membrane en nylon avec un 0,45 µm taille de pore et le transférer dans des bouteilles de réservoir propres HPLC.
  2. Instrumentation montage HPLC pour la détection simultanée de 4-MU DOX, MMC et DOXol et I.S..
    1. Mettre en marche la pompe à gradient, dé-gasser, échantillonneur automatique, détecteur à photodiode et multi détecteur de fluorescence λ.
    2. D’entrée les conditions initiales de composition de la phase mobile à 16,5 % H 2 O (0,1 % TFA) et 83,5 % ACN (0,1 % TFA) (v/v).
    3. Régler le détecteur UV sur deux canaux, l’un à 310 nm pour 4-MU (I.S.) et l’autre à 360 nm pour MMC.
    4. Régler le détecteur de fluorescence sur deux canaux, l’un à λ ex / λ em = 365/445 nm pour 4-MU et l’autre à λ ex / λ em = 480 nm/560 nm pour DOX et DOXol, respectivement.
    5. Régler un isocratique débit de 1,0 mL/min.
    6. Équilibrer une colonne de 18 préinstallé phase inverse C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) à température ambiante pendant 10 min pour la création de la ligne de base.
  3. Séparer les médicaments (DOX, MMC, DOXol et 4-MU) à l’aide d’État gradient de phase mobile.
    1. Injecter 15 µL d’échantillons extraits et re-concentrés à l’aide de l’échantillonneur automatique.
    2. Changer progressivement la condition initiale de la phase mobile (reportez-vous à l’étape de protocole 2.2.2) à 100 % ACN (0,1 % TFA) pendant 18 min à l’aide de la pompe à gradient automatisée.
      Remarque : Pendant le processus de séparation, quatre canaux (deux absorbants UV et deux fluorescentes) apparaître simultanément avec chaque canal affichant un médicament composé (reportez-vous à l’étape du protocole 2.2.3 et 2.2.4).
    3. Conserver 100 % de ACN (0,1 % TFA) pendant 1 min et puis retour à la condition initiale phase mobile dans 1 min.
    4. Re-conditionner la colonne avec la phase mobile initiale à débit de 1,5 mL/min, 4 min pour l’injection de l’échantillon suivante.

3. Validation de l’HPLC

  1. élaborer des normes de travail de DOX, MMC et DOXol et 4-MU (I.S.).
    1. Peser séparément de 1 mg de poudre de drogue DOX et MMC (prudence) et 4-MU sur une nouvelle petite pesée papier (2 de 3 x 3 pouces).
      Notez que tous les médicaments anticancéreux sont considérés comme un danger pour la santé qui peut causer mutagénicité de cellules germinales et de toxicité aiguë par inhalation ou ingestion. Ils doivent être manipulés avec soin avec des gants et des masques.
    2. Transférer la pesée DOX, MMC et 4-MU dans un nouveau tube de la micro-centrifugeuse polypropylène individuels 1,5 mL.
    3. Ajouter 1 mL de methJerome et vortexer brièvement pour obtenir la concentration de 1 mg/mL de MMC et DOX.
    4. Ajouter 1 mL de méthanol dans un flacon contenant préalablement pesé à 1 mg de DOXol (prudence) et vortex brièvement pour obtenir la concentration de 1 mg/mL de DOXol.
      Remarque : DOXol est un métabolite toxique cardio et doit être manipulé avec soin.
    5. Pipette 20 µL des solutions mères préparées de DOX, MMC, DOXol et 4-MU dans un nouveau séparer le tube micro-centrifuge en polypropylène de 1,5 mL et ajouter 980 µL du méthanol pour obtenir une norme de travail de 20 µg/mL de chaque drogue.
    6. Diluer 20 µg/mL de DOX, MMC et DOXol à l’aide de méthanol pour obtenir les normes de travail de 50 ng - 20 µg/ml pour DOX, MMC et DOXol et 2000 ng/mL pour I.S. 4-MU.
    7. Joint le capuchon du tube de solutions de travail avec un morceau étroit de pelliculeuse de paraffine pour éviter l’évaporation du méthanol, enrouler le tube entier avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière directe et les conserver à -20 ° C.
  2. Déterminer la linéarité, la précision et l’exactitude de DOX, MMC et DOXol dans des matrices biologiques (c.-à-d., de sang et tumeur homogénat).
    1. Simultanément spike 5 µL de normes de travail de DOX et DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1 000 ng/mL - 16 µg/mL) et 4-MU (2 µg/mL) dans 50 µL de sang vide ou homogénat tissulaire dans les tubes en polypropylène de micro-centrifugeuse à obtenir la courbe de concentration standard allant de 5-2000 ng/mL pour les composés médicamenteux et 200 ng/mL pour 4-MU (I.S.).
    2. Effectuer le test d’extraction drogue décrit dans le protocole 1.2.
    3. Utiliser des concentrations faibles, médianes et hautes de DOX et DOXol (50, 500 et 2 000 ng/mL) et MMC (100, 1000, 2 000 ng/mL) pour la précision intra - et inter - jour.
      NOTE : Préparer des concentrations standards frais le jour de l’analyse.
  3. Analyse des échantillons
    1. injecter 15 µL de l’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique.
    2. Changer progressivement de la phase mobile plus de 0 à 18 min, augmentant la composition d’ACN au cours de l’intervalle.
    3. Après 18 min, maintenir l’état de phase mobile pendant 1 min.
    4. Reviennent à l’état initial au cours de la prochaine 2 min, puis ré-équilibrer pendant 4 min avant l’injection suivante.
    5. Après chaque échantillon exécuter, on remarquera que les pics de composés médicamenteux avec leurs temps de rétention sont indiqués comme suit : MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) et DOX.
    6. Intégrer la surface sous la courbe (AUC) de composés médicamenteux à l’aide de logiciels HPLC du pic.
    7. Calculer le rapport AUC entre chaque médicament composé et I.S. (équation 1) et les courbes standards établis selon les mêmes procédures d’extraction permet de déterminer les concentrations de médicament de DOX, MMC et DOXol dans la formulation de DMPLN.
      Equation 1
    8. calculer le pourcentage de récupération de médicaments (équation 2) en comparant les concentrations de médicament reconstituées à l’aide de méthanol des extraits d’échantillons biologiques enrichis à celle de la norme (" pur ") solution dans le méthanol des drogues.
      Equation 2

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Representative Results

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Deux médicaments anticancéreux, DOX et MMC, ainsi que le métabolite DOX, DOXol, ont été détecté en même temps sans aucune interférence biologique sous la condition d’HPLC dégradée appliquée même en utilisant 4-MU comme l’I.S. pour la fluorescence et détecteurs UV. DOX, MMC, DOXol et 4-MU étaient bien séparés les uns des autres avec des temps de rétention de 5,7 min pour MMC, 10,4 min pour DOXol, 10,9 min pour 4-MU et 11,1 min pour DOX (Figure 2). Chaque médicament dans le sang entier et divers tissus a montré la linéarité concentration avec des coefficients de corrélation (R2) allant de 0,98 à 1,00 (Figure 3 et tableau 1). La limite inférieure (PPQM) de DOX, DOXol et MMC a été de 10 ng/mL, 10 ng/mL et 100 ng/mL dans le sang et 25 ng/mL, 25 ng/mL et 200 ng/mL dans divers tissus, respectivement (tableau 1). La méthode HPLC développé affiché moins que 15 % de variation en termes de précision intra - et inter - jour et l’exactitude de DOX, MMC et DOXol dans le sang et les diverses matrices biologiques (p. ex., cœur, poumons, foie, rate et des reins), ce qui indique excellente reproductibilité (tableaux 2 et 3). Plus de 85 % de MMC et DOX a été récupéré à partir de sang total après extraction (tableau 4).

Les procédures d’analyse multiple utilisant les dé-proteinization en une seule étape de solvant d’extraction acidifiée suivi en employant un multicanal méthode CLHP a été appliquée avec succès pour déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution de brassage long ou Administration de médicaments à base de nanoparticules de pégylé des deux DOX seul ou en combinaison avec MMC en un orthotopique seins modèle murin de tumeur (Figures 4 et 5). La figure 4 montre au moins 6 fois des concentrations plus élevées de médicaments dans le temps trop de sang livré par nanoparticules (c.-à-d.liposomale DOX et DMPLN) que les solutions équivalentes médicament libre (c.-à-d., DOX gratuit ou libre DOX-MMC) (Figure 4). en raison de la circulation systémique prolongée, nanoparticules ont été en mesure d’exploiter les effets améliorés de perméabilité et de la rétention de la tumeur, ce qui entraîne une accumulation DOX et MMC dans la tumeur du sein (Figure 5A) 37. dans le même temps, la formation quantitativement déterminée du métabolite DOX DOXol dans les tumeurs du sein sur une période de 24 h indique une différence dans la bio-disponibilité des médicaments pour diverses drogues formulations (Figure 5B).

Figure 1
Figure 1 : Illustration de l’analyse des processus de détermination simultanée de MMC livré par nanoparticules in vivoet DOX. (A) préparation de la DMPLN en utilisant une méthode d’ultra-sonication en une seule étape suivie d’un processus d’auto-assemblage ; Collections d’échantillon biologique (B) d’un modèle murin de tumeur orthotopique du sein ; (C) Drug extraction à partir de matrices biologiques et de reconstitution de médicaments ; (D) Gradient HPLC pour la séparation de DOX, MMC et DOXol. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison des chromatogrammes de vide de sang et de mélanges de drogues dans le sang. Comparaison des chromatogrammes de vide de sang et de mélanges de drogues dans le sang à l’aide de HPLC couplée à des détecteurs UV et de la fluorescence en (A) UV 360 nm pour MMC ; (B) UV 310 nm pour I.S. 4-MU ; (C) Fluorescence à λex / em = 480/560 nm pour DOX et DOXol ; (D) Fluorescence à λex / em = 365/445 nm pour I.S. 4-MU. UA est unité d’absorption et UE est unité de fluorescence. Les concentrations injectées de MMC, DOX et DOXol et leur I.S. 4-MU étaient de 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL et 200 ng/mL, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentation des courbes standard pour MMC, DOX et DOXol dans le sang entier. Les plages de concentration étaient de 100 ng/mL à 2000 ng/mL pour MMC (A), de 5 ng/mL à 2000 ng/mL pour la faible concentration de DOX (B) et de 5 ng/mL à 50 ng/mL pour DOXol (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Application du système d’analyse drogues multiples, en utilisant une méthode HPLC multicanal et dégradée, pour étudier la pharmacocinétique des long-circulation-à base de nanoparticules drug delivery. (A) profils de concentration des temps-sang de DOX en monothérapie à l’aide de solutions de médicament libre (free DOX) ou une formulation liposomale (voir Table des matières) ; (B) profils de concentration des temps-sang de DOX et MMC comme une combinaison de médicament libre (libre DOX-MMC) ou DMPLN. Sang total ont été recueilli à divers temps points jusqu'à 24 h après une injection unique i.v. à des souris porteuses d’une tumeur du sein murine orthotopique. Toutes les souris ont été traitées avec 9,2 mg/kg DOX seul ou en combinaison avec 2,9 mg/kg MMC. Parce que le khalid de MMC a été de 100 ng/mL à l’aide de l’HPLC couplé détecteur UV, concentration, MMC après que injection après 6 h a été déterminée par spectrométrie de masse. La figure a été modifiée par Zhang et al. Nanomédecine avec autorisation22. Tous les points de données sont présentés comme moyenne ± écart-type (SD) avec n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Application d’analyse des drogues multiples à l’aide de la méthode du gradient de CLHP pour étudier la tumeur bio-distribution d’un système de livraison de médicaments à base de nanoparticules. Concentrations de DOX Total (A) et MMC de libre DOX-MMC ou DMPLN dans les tumeurs du sein ; (Rong > B) Total DOXol formation de métabolites dans les tumeurs du sein traité par chimiothérapie DOX mono - ou une combinaison. Toutes les souris ont été traitées avec 9,2 mg/kg DOX seul ou en combinaison avec 2,9 mg/kg MMC. Une accumulation faible tumeur qui était hors de khalid de MMC à l’aide de que l’HPLC couplé détecteur UV a dû gratuit DOX-MMC, MMC concentration gratuit DOX-MMC a été déterminée par spectrométrie de masse. La figure a été modifiée par Zhang et al. Nanomédecine avec autorisation22. Tous les points de données sont présentés comme moyenne ± écart-type avec n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1 : linéarité et dénombrement de DOX, MMC et DOXol dans diverses matrices biologiques. Les données représentent la moyenne ± écart type pour n = 3.

Table 2
Tableau 2 : Intra - et inter - jour précision et l’exactitude de DOX, MMC et DOXol dans le sang entier de souris (n = 3).

Table 3
Tableau 3 : Intra - et inter - jour précision et exactitude de DOX, MMC et DOXol dans les tumeurs du sein (n = 3).

Table 4
Tableau 4 : pourcentage de recouvrement DOX et MMC dans les échantillons de sang entier après extraction (n = 3). Les données représentent la moyenne ± écart type pour n = 3.

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Discussion

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Par rapport aux autres méthodes chromatographiques qui permettent la détection d’une espèce seul médicament à la fois, le présent protocole HPLC est capable de doser simultanément trois composés médicamenteux (DOX, MMC et DOXol) dans la même matrice biologique sans avoir à changer la phase mobile. Cette méthode de préparation et d’analyse a été appliquée avec succès pour déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution de deux systèmes de délivrance de médicaments à base de nanoparticules (c.-à-d. liposomale DOX et DMPLN)22. Étant donné que les nanoparticules pégylé prolongent la circulation systémique de drogue chargé, ce qui entraîne des concentrations de médicament sanguin élevé sur une longue période de temps (> 24h), la méthode par chromatographie en phase décrite est rentable pour l’analyse des échantillons à grande échelle de NANOPARTICULES chargés conjointement des combinaisons de médicaments dans des études précliniques,22. La pharmacocinétique de la solution gratuite de DOX et DOX liposomale illustré à la Figure 4A est conforme aux données de la littérature signalés dans rongeurs38,39, étayant la validité de la méthode actuelle. Bien que le détecteur à barrettes de photodiode UV permet de multiples canaux simultanément, détecter et afficher des médicaments utilisant des longueurs d’onde variables (c.-à-d., 310 nm pour 4-MU et 360 nm pour la MMC), la limite de détection intrinsèque du détecteur UV est moins sensible que le détecteur de fluorescence. Ainsi, pour l’élimination rapide, médicaments non fluorescent comme MMC livré en solutions libres, les concentrations de médicament aux périodes ultérieures doivent tomber au-dessous le détecteur QMD des UV.

En général, une colonne de chromatographie courte (p. ex., 5 cm) servirait pour analyse par CLHP de minimiser le temps d’élution et la durée d’utilisation. Pourtant, dans le cas d’analyser plusieurs composés médicamenteux, en particulier ceux ayant des structures moléculaires très similaires (par exemple, DOX et son métabolite DOXol), c’est difficile à réaliser la séparation complète à l’aide de la colonne courte en raison de l’efficacité d’intrinsèque colonne. Ainsi, aussi bien une colonne plus longue (par exemple, 25 cm, utilisée dans le protocole actuel) et une optimisation des paramètres HPLC lors de l’élaboration de la méthode sont nécessaires pour obtenir une bon pic résolution. DOX, DOXol et 4-MU sont éluées au temps de rétention proche, l’interférence entre DOX/DOXol et 4-MU ne était pas observée de la concentration de l’échantillon préparé (p. ex., 50 ng/mL) dans les chromatographes (Figure 2). Toutefois, une forte concentration de DOX (p. ex., ~ 10 000 ng/mL) livrée par nanoparticules en raison du temps de circulation de sang long susceptibles de gêner la détection de pics d’elle-même et d’autres composés (par exemple, DOXol) et peut entraîner extinction automatique de DOX fluorescence40,41. Dans ce cas, une dilution de l’échantillon approprié à l’aide de sang vide il faudra préalablement à l’analyse de l’échantillon pour déterminer les concentrations de médicament.

Méthodes d’extraction peuvent compliquer l’analyse des combinaisons de médicaments chimiothérapeutiques. Bien que DOX ou MMC peut être extraites à l’aide de différentes méthodes d’extraction, y compris l’extraction en phase solide (SPE) ou extraction liquide-solide, ces procédures sont longues et coûteuses. Certaines des méthodes d’extraction provoquer rétablissement médiocre et dégradation de drogue possible lorsque l’acide chlorhydrique est ajouté à l’extraction solvant42,43,44. Pour les préparations d’échantillon biologique à grande échelle, la présente méthode d’extraction est simple, rapide et seulement nécessite l’ajout de petites quantités de solvant organique non dangereux pour efficace dé-proteinization suivie à l’aide de reconstitution échantillon systématique méthanol. Taux de récupération élevé (> 85 %) ont été réalisées pour toutes les drogues des échantillons de concentrations variables en appliquant systématiquement le même protocole d’extraction. Bien que la variabilité existe toujours, les différences sont statistiquement non significative. Pour réduire la variation, l’optimisation de l’extraction de chaque échantillon à des concentrations faibles et élevées peut-être être nécessaire. Notez que la méthode d’extraction utilisée ne distingue pas de médicament sorti libre de drogue restant dans les nanoparticules comme les nanoparticules ont été complètement dissous après addition de solvants organiques. Ainsi, la vraie pharmacocinétique de nanoparticules seul vs médicament libre seul exige l’élaboration d’une méthode de déconvolution numériques à l’aide de la modélisation mathématique pour prédire leur comportement en vivo45.

En résumé, il a développé une méthode de CLHP simple et sélective pour la détermination simultanée de DOX, MMC Doxol et in vivo. La présente méthode montre la sélectivité, la robustesse, la précision et la précision sur une large gamme de concentrations du médicament pour les souris de sang et les tissus. Cette méthode a été appliquée avec succès pour obtenir le profil de concentration-temps de sang de DOX et MMC et la bio-distribution de DOX, DOXol et MMC dans les tumeurs du sein et d’autres organes importants (p. ex., cœur). Ce protocole fournit un outil utile pour élucider les macro - et microscopiques en vivo mécanismes de nanoparticules-livré DOX contenant la chimiothérapie d’association médicamenteuse.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas des intérêts financiers divergents et les conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs remercient la subvention d’équipement de sciences naturelles et du Conseil de recherche en génie (CRSNG) du Canada pour HPLC, la subvention de fonctionnement de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC) et le Canadian Breast Cancer Research (RSARF) Alliance à X.Y. Wu et la bourse de l’Université de Toronto à R.X. Zhang et T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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