Summary
이 프로토콜에 설명 합니다 샘플 추출의 효율적이 고 편리한 분석 프로세스와 여러 약물, 독 소 루비 (DOX), 미토마이신 C (MMC) 및 심장 독성 DOX 대사 산물, doxorubicinol (DOXol), 생물학에서의 동시 결정 전 임상 유 방 종양 모델에서 샘플 시너지 약물 조합의 나노 제형으로 치료.
Abstract
조합 화학요법은 자주 사용 병원에서 암 치료; 그러나, 정상 조직에 관련 된 불리 한 효과 치료 혜택을 제한할 수 있습니다. 나노 기반 약물 조합 무료 약 조합 치료에 의해 발생 하는 문제를 완화 하기 위해 표시 되었습니다. 우리의 이전 연구는 그 두 항 암 약물, 독 소 루비 (DOX) 및 미토마이신 C (MMC)의 조합, 두 murine에 대 한 시너지 효과 생산 하 고 인간의 유방암 세포 생체 외에서. DOX 및 MMC 공동 로드 폴리머-지질 하이브리드 나노 입자 (DMPLN) 다양 한 경과 전송 펌프 multidrug 저항 및 유 방 종양 모델에 설명 된 향상 된 효능을 부여 하는 무시 됩니다. 기존의 솔루션 형태에 비해, DMPLN의 이러한 우수한 효능 DOX 및 MMC nanocarrier pln.로 활성화 하는 종양 세포 내 생체 이용률 증가 세포내 약물의 동기화 된 약물 동력 학에 기인 했다
약 동학 및 바이오-분포의 평가를 공동 관리 DOX 및 MMC 무료 솔루션에 나노 형태, 역 상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는을 사용 하 여 간단 하 고 효율적인 다중 약물 분석 방법 개발. 달리는 플라즈마에 DOX 또는 MMC를 개별적으로 분석 하는 방법에 대 한 이전에 보고 된,이 새로운 HPLC 방법은 동시에 quantitate DOX, MMC 및 주요 심장 독성 DOX 대사 산물, 다양 한 생물 학적 행렬 ( 에서에서 doxorubicinol (DOXol), 수 예를 들어, 전체 혈액, 유 방 종양, 및 심 혼). 이중 형광 및 자외선 흡수 성 조사 4-methylumbelliferone (4-무) 다른 검출 파장 다중 약물 분석의 단계 검출을 위한 내부 표준 (윙하)으로 사용 되었다. 이 방법은 성공적으로 DOX 및 MMC 전체 혈액에 나노와 솔루션 접근 및 orthotopic 유 방 종양 murine 모델에서 다양 한 조직에 의해 전달의 농도 결정 하기 위해 적용 되었습니다. 제시 하는 분석 방법 약물 조합 중 나노 기반 배달의 전 임상 분석을 위한 유용한 도구입니다.
Introduction
아직 그것은 종종 심각한 부작용 및 약물 저항으로 인해 제한 된 효능 및 다른 요인1,2,3관련 된 화학 요법 많은 암에 대 한 기본 치료 양식 적임 이다. 화학 요법의 결과 개선 하기 위해, 약물 조합 regimens 겹치지 독성, 약물 행동, 그리고 크로스 비 약물 저항4,5 의 다른 메커니즘 같은 고려 사항에 따라 병원에 적용 된 , 6. 임상 시험에서 더 나은 종양 응답 속도 종종 관찰 되었다 약물 조합을 순차적 마약 배달7,8의 처방에 비해 관리 동시에 사용 하 여. 그러나, 무료 약물 형태 중 최적의 바이오-분포, 인해 여러 약물의 동시 주입 치료 효과9,,1011를 능가 하는 저명한 정상 조직의 독성을 발생할 수 있습니다. Nanocarrier 기반 약물 전달 약 동학 및 바이오-캡슐화 된 약물, 종양을 대상으로 축적12,,1314강화의 배포 변경 표시 되었습니다. 우리의 최근 기사에서 검토 한 결과, 나노 공동 시너지 약물 조합 로드은 설명 했다 때문에 그들의 통제 시간적 및 공간적 공동 배달의 무료 약물 조합에 의해 발생 하는 문제를 완화 하는 기능 종양 조직에 여러 약물,4,,1516세포 암에 대 한 시너지 약물 효과 활성화. 그 결과, 우수한 치료 효능 및 낮은 독성 두 전 임상 및 임상 연구4,,1718에서 입증 되었습니다.
우리의 이전 체 외에 연구 발견 두 항 암 약물, 독 소 루비 (DOX) 및 미토마이신 C (MMC), 조합의 여러 유 방 암 세포 라인에 대 한 시너지 효과 생산 하 고, 또한, 공동 DOX 및 MMC 내에서 로드 폴리머-지질 하이브리드 나노 입자 (DMPLN) 다양 한 다중 약물 내성 관련된 경과 펌프 (예: P-당단백질과 유 방 암 저항 단백질)19,,2021극복. Vivo에서, DMPLN에 활성화 DOX 및 종양 사이트 MMC의 공간 일시적인 공동 배달 암 세포 내에서 약물의 증가 생체 이용률 DOX 대사 산물 doxorubicinol (DOXol)22의 형성의 검토에 의해 표시 된 대로. 결과적으로 DMPLN 종양 세포 apoptosis, 종양 성장 억제, 그리고 장기간된 호스트 생존 DOX 및 MMC 조합 또는 자주 DOX 배합22,,2324, 무료에 비해 향상 된 25.
공동는 nanocarrier에 의해 전달 하는 약물의 실제 금액을 분석 하는 것이 효과적인 나노 제형 설계에 대 한 중요 합니다. 많은 방법이 플라스마 수준 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)만 사용 하 여 단일 DOX 또는 MMC 복용량의 또는 질량 분석 (MS)26,,2728 와 함께에서 분석 하도록 개발 되었습니다. , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 그러나 34., 이러한 방법 들은 시간과 조합 치료에 대 한 허무로 많은 수의 생물 학적 샘플 (때로는 약물 대사 산물 등) 여러 약물의 분석을 위해 별도로 준비를 해야. DOX 및 MMC의 강한 플라스마 단백질 바인딩 뿐만 아니라 붉은 혈액 세포는 또한 바인딩 많은 항 암 약35,36집중 하 큰 용량을가지고. 따라서, 플라즈마 분석 DOX 또는 MMC에 대 한 실제 혈액 약물 농도 난독 처리할 수 있습니다. (그림 1) 현재 작업에 설명 합니다 간단 하 고 강력한 동시에 추출 하 고 quantitate DOX, MMC 및 전체 혈액 및 다양 한 조직 ( DOX 대사 산물 doxorubicinol (DOXol) 역 상 HPLC를 사용 하 여 여러 약물 분석 방법을 예를 들어, 종양). 그것은 성공적으로 적용 되었다는 orthotopically에는 약 동학 및 바이오-DOX 및 MMC의 분포 뿐만 아니라 무료 솔루션 또는 나노 형태 (즉, DMPLN 및 자주 DOX)를 통해 약물 전달 후 DOXol의 형성을 결정 하 정 맥 (i.v.) 후 murine 유 방 종양 마우스 모델을 이식 주입22.
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Protocol
모든 동물 실험 동물 관리 위원회의 대학 건강 네트워크 온타리오 암 연구소에 의해 찬성 하 고 캐나다 위원회 동물 관리 지침에 따라 실시 했다.
1. 생물학 견본 준비
- 전체 혈액, 주요 기관, 수집 하 고 포함 하는 약물의 정 맥 (i.v.) 관리 후 정해진된 시간 포인트에서 종양을 유 정립 (예를 들어, DMPLN, 자주 DOX)
- 준비 포함 하는 약물 배합 유 방 종양 베어링 마우스 i.v. 주입.
- 흡입 가능 2 %isoflurane 밀폐 챔버에 제공 하 여 지정 된 시간-포인트 (예를 들어, 15 분)에서 마우스를 anesthetize.
- 마 취 마우스의 뒷면을 통해 지속적으로 공급 하는 2% isoflurane nosepiece는 코를 넣어.
참고: 마우스 겪 습 깊은 마 취 되도록 부드럽게 대 타 마우스와 어떤 꿈 틀 운동에 대 한 보고의 앞 팔. - 가슴 및 복 부 지역 70% 에탄올을 사용 하 여 철저 하 게 청소 한 다음 heparinized 1 mL 주사기 23 G 바늘을 사용 하 여 깊은 마 취 쥐에 심장 펑크의 터미널 절차 수행.
- 레이블이 나트륨으로 전체 혈액 수집 덤플링을 플라스틱 튜브를 살포 하 고 부드럽게 코팅된 덤플링을 튜브 벽의 접촉으로 온다 수집된 전 혈 되도록 튜브 소용돌이. 전체 혈액의 50 µ L의 최소를 수집 합니다. 얼음에 샘플을 항상 유지
- 그것을 확보 하 고 복 부 구멍이 위와 집게의 쌍을 사용 하 여 마우스의 흉 곽을 열고 마우스의 모든 4 개의 사지를 테이프. 창 자 쪽으로 이동 하 고 위쪽으로 문맥을 충분히 노출 간 밀어. 혈액의 배수 장치를 위한 포털 정 맥을 잘라.
- Perfuse 25g 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여 마음을 통해 차가운 0.9% 염 분의 50 mL와 함께 전체 마우스 몸.
참고: 포털 혈관에 주사기를 지도 대 한 90 °에 바늘을 벤드. - 소비 기관에는 다음과 같은 순서: 심장, 폐, 간, 비장, 신장. 그런 다음, 마우스의 오른쪽 유 방 지방 패드에 절 개가 위를 사용 하 여 주변 결합 조직에서 유 방 종양을 구분 합니다. 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 모든 장기를 개별적으로 수집 하 고 신속 하 게 액체 질소에 그들을 동결.
참고: 쓸 개는 간에 서 분리. - 나중 HPLC 분석까지-80 ° C 냉동 고에서 4 ° C 및 삭제 조직 전체 혈액 저장.
- 추출 DOX, MMC 및 생물 학적 행렬에서 DOXol.
- 그리고 모든 냉동된 해 부 조직을 신속 하 게 무게 13 mL 둥근 바닥 원뿔 관으로 그들을 전송. 얼음에 샘플을 유지 가능한 약물 대사 또는 저하를 방지 하려면
- 튜브에 1-5 mL의 얼음 세포 세포의 용 해 버퍼를 추가.
참고: 사용 하는 버퍼의 볼륨 1 g: 5 mL (w/v);의 조직-버퍼 비율에 따라 조직 무게에 따라 달라 집니다. 작은 기관, 심장, 비장, 등에 대 한 비율은 1 g: 2 mL. - 업 다운 스트로크 모션 균질 전기 손 균질 화기를 사용 하 여 18000 rpm의 속도로 얼음에 조직 샘플을 사용 하 여.
참고: 완료 된 균질 필요 미만 15의 짧은 균질 화 과정의 약 3-5 반복 각 짧은 균질 사이 얼음 냉각 하는 조직 이어서 s. - 증류수 이온된 (DDI) H 2 O, 70% 에탄올, 그리고 DDI H 2 O 사이 상호 오염을 피하기 위해 각 조직 샘플을 균질 화기의 10 m m 톱니 생성기 프로브 세척.
- 조직 homogenate 또는 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브 1.5 mL와 5 스파이크에 전체 혈액의 전송 50 µ L µ L를 내부 표준 (윙하) 4-methylumbelliferone (4 무) (2000 ng/mL) 튜브에의.
참고: 4-무 솔루션 메탄올 여기에 준비 했다. - 전체 혈액 이나 조직 homogenate 포함 된 튜브에 얼음 추출 용 매 추가 250 µ L.
참고: 추출 용 매로 구성 되어 60% 이기 (ACN)와 40% 염화 아세테이트 (5mm)의 pH를 조정 하는 ph 3.5 = 0.05% 개미 산을 사용 하 여. 1:5 (v/v) 샘플을 사용 하 여: 볼륨 비율을 용 매 추출. - 적극적으로 소용돌이 혼합물 2 분, 10 분 및 다른 미리 냉장된 신선한 마이크로 원심 관으로 표면에 뜨는 피펫으로 200 µ L 4 o C에서 g 포스 x 3000에서 원심 분리기.
- Evaporate 상쾌한 빛 으로부터 보호와 질소 가스의 느린 스트림 아래 60 ° C에서.
- 얼음 처럼 차가운 메탄올, 30 s 및 다른 5 분의 4 ° C에서 3000 x g에서 원심 분리기에 대 한 적극적으로 소용돌이의 100 µ L 말린된 잔류물을 다시 구성
- HPLC 유리병 삽입에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플 튜브 사출 autosampler 트레이.
2. 작업 매개 변수 및 HPLC 계측
- 일관 재현성 준비 HPLC 이동 상
- HPLC 급 H 2 O 졸업된 실린더를 사용 하 여 500 mL를 측정.
- HPLC 급 이기 (ACN)는 별도 졸업된 실린더를 사용 하 여의 500 mL를 측정.
- 신중 하 게 H 2 O의 500 mL의 각 trifluoroacetic 산 (TFA) (주의)의 0.5 mL를 추가 및 H 2 O의 모바일 단계를 ACN ACN 0.1%를 포함 하 고 TFA, 각각.
참고: TFA 부식성 이며 독성이 고 실험실 연기 후드 처리 합니다. 모든 용 매 혼합물 상 온에서 준비가. - 0.45 μ m와 나일론 멤브레인 필터를 통해 필터 모바일 단계 기 공 크기와 깨끗 한 HPLC 저수지 병으로 그것을 전송.
- DOX, MMC, 및 DOXol 및 윙하 4-무의 동시 검출 설정 HPLC 계측.
- 그라데이션 펌프, 드 gasser, 자동 샘플러, 포토 다이오드 배열 검출기와 다중 λ 형광 검출기에 스위치.
- 16.5% H 2 O 모바일 단계 구성의 초기 조건 입력 (0.1 %TFA) 83.5 %ACN (0.1 %TFA) (v/v).
- 310에 하나씩 두 개의 채널에 UV 검출기를 설정 4-뮤 (윙하)에 대 한 nm와 다른 360에서 mmc nm.
- Λ ex에 하나씩 두 개의 채널에 형광 검출기를 설정 / λ em 365/445 = 4-뮤와 λ ex에서 다른에 대 한 nm / λ em = 480 nm/560 nm DOX와 DOXol, 각각.
- 한 isocratic 1.0 mL/분의 유량을 설정
- 기준선 설립에 대 일 분 동안 실내 온도에 사전 설치 된 역 상 C 18 열 (4.6 mm x 250 m m, 5 µ m) equilibrate.
- 약물 (DOX, MMC, DOXol 및 4-무)를 별도 그라데이션 모바일 단계 상태를 사용 하 여.
- 자동 샘플러를 사용 하 여 추출 하 고 다시 집중 견본의 주입 15 µ L.
- 점차 초기 모바일 위상 조건 변경 (프로토콜 단계 2.2.2 참조) 100 %ACN (0.1 %TFA) 18 분 이상 자동된 그라데이션 펌프를 사용 하 여.
참고: 분리 과정에서 4 개 채널 (2 개의 UV 흡수 및 2 개의 형광) 표시 동시에 한 약 복합 표시 각 채널 (2.2.3 및 2.2.4 프로토콜 단계 참조). - ACN의 100%를 유지 (0.1 %TFA) 1 분을 1 분 이내 초기 모바일 위상 조건으로 다음 돌아가기
- 다시 초기 모바일 단계와 1.5 mL/min의 유량에서 4 분에 대 한 다음 샘플 주입에 대 한 열을 조건.
3. HPLC 유효성 검사
- DOX, MMC 및 DOXol, 및 4-뮤 (윙하) 작업 기준 준비.
- DOX 및 MMC 마약 가루 (주의)와 신선한 작은 종이 (3 x 3 인치 2) 무게에 4-무의 무게 별도로 1 mg.
Note 모든 항 암 제 약물 흡입 또는 섭취에 급성 독성 및 생식 세포 변이 일으킬 수 있는 건강 위험으로 간주 됩니다. 그들은 장갑 및 마스크와 함께 신중 하 게 처리 되어야 합니다. - 개별 1.5 mL 새로운 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브로 전송 무게 DOX, MMC 및 4-무.
- 추가 meth의 1 mLanol와 DOX 및 MMC의 1 mg/mL 농도를 간단히 소용돌이.
- DOXol (주의) 하 고 소용돌이 간단히 DOXol의 1 mg/mL 농도의 사전 무게 1 mg를 포함 하는 유리병에 메탄올의 1 mL을 추가.
참고: DOXol 심장 독성 대사 산물 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. - DOX, MMC, DOXol 및 4-뮤로는 새로운의 준비 재고 솔루션의 피 펫 20 µ L 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브를 분리 하 고 각 약물의 20 µ g/mL의 작업 표준을 메탄올의 980 µ L을 추가.
- 희석 20 µ g/mL DOX, MMC 및 50의 작업 표준을 얻기 위해 메탄올을 사용 하 여 DOXol의 ng-DOX, MMC, 및 DOXol에 대 한 20 µ g /mL 및 2000 ng/mL 윙하 4-무.
- 메탄올 증발 방지, 직접 빛을-20에 게 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 전체 튜브 포장 파라핀 영화 취재의 좁은 조각 작업 솔루션의 튜브의 뚜껑을 봉인 ° c.
- DOX 및 MMC 마약 가루 (주의)와 신선한 작은 종이 (3 x 3 인치 2) 무게에 4-무의 무게 별도로 1 mg.
- 선형성, 정밀, DOX, MMC 및 생물 학적 행렬 (즉, 전체 혈액 및 종양 homogenate)에 DOXol의 정확도 결정.
DOX 및 DOXol의 작업 표준의
- 동시에 스파이크 5 µ L (50 ng/mL-20 µ g/mL), MMC (1000 ng/mL-16 µ g/mL), 및 빈 전 혈 또는 폴 리 프로필 렌 마이크로 원심 튜브에서 조직 homogenate의 50 µ L로 4-뮤 (2 µ g/mL) 마약 화합물에 대 한 5-2000 ng/mL 및 4-뮤 (윙하)에 대 한 200 ng/mL에서 배열 하는 표준 농도 곡선을 구하는.
- 프로토콜 1.2에서 설명한 약물 추출 분석 결과 수행.
- DOX와 DOXol의 낮은, 중간 및 높은 농도 사용 (50, 500, 및 2000 ng/mL) 및 MMC (100, 1000, 2000 ng/mL) 내부와 통해 하루 정밀도 정확도 대 한.
참고: 신선한 표준 농도 분석 당일 준비.
- 샘플의 분석
- 자동 샘플러를 사용 하 여 샘플의 주사 15 µ L.
- 점차 모바일 단계 0 ~ 18 분 이상, 증가 간격 동안 ACN의 구성 변경.
- 후 18 분, 1 분에 대 한 모바일 위상 상태를 개최
- 다음 2 분 동안 초기 상태로 반환 다음 다시 다음 주입 하기 전에 4 분 equilibrate.
- 각 샘플을 실행 후 다음과 같이 그들의 보존 기간으로 약 화합물의 봉우리 표시 됩니다 참고: MMC, DOXol, 4-뮤 (윙하)와 DOX.
- HPLC 소프트웨어를 사용 하 여 약 화합물의 곡선 (AUC)에서 피크 지역 통합.
- 개별 약물 화합물 및 윙하 (공식 1) 사이의 AUC 비율을 계산 하 고 동일한 추출 절차에 따라 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 DMPLN 배합에 DOX, MMC 및 DOXol의 약물 농도 결정.
- 그 아군된 생물 샘플의 추출 물에서 메탄올을 사용 하 여 재구성 하는 약물 농도 비교 하 여 약 복구 비율 (식 2)를 계산 표준 (" 깔끔한 ") 솔루션 메탄올에서 마약.
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Representative Results
두 항 암 약물, DOX MMC, 뿐만 아니라 DOX 대사 산물, DOXol, 동시에 형광 및 자외선 감지기는 윙하도 4-무를 사용 하 여 동일한 적용 된 그라데이션 HPLC 조건 하에서 어떤 생물 학적 간섭 없이 감지 했다. DOX, MMC, DOXol 및 4-무 잘 보존 시간 mmc 5.7 분, DOXol 위한 10.4 분, 4-뮤, 10.9 분 및 DOX (그림 2)에 대 일 분 서로에서 분리 했다. 전체 혈액에 각 약물 및 다양 한 조직 상관 관계 계수 (R2) 0.98에서 1.00 (그림 3 및 표 1)에 이르기까지 함께 농도 선형성을 보였다. DOX, DOXol 및 MMC의 정량 (LLOQ)의 하한값은 10 ng/mL, 10 ng/mL 및 100 ng/mL 전 혈 및 25 ng/mL, 25 ng/mL 및 다양 한 조직, 200 ng/mL에서 각각 (표 1). HPLC 방법 개발 전체 혈액과 다양 한 생물 학적 행렬 (예를 들어, 심장, 폐, 간, 비장, 그리고 신장), DOX, MMC 및 DOXol에 대 한 내부와 통해 하루 정밀도 및 정확도 15% 변동 보다 덜 표시 나타내는 우수한 재현성 (표 2 와 3) DOX 및 MMC의 85% 이상 추출 (표 4) 후 전체 혈액에서 복구 했습니다.
산성화 추출 용 매에 의해 한 단계 드 proteinization를 사용 하 여 multidrug 분석 절차는 멀티 채널을 사용 하 여 다음 HPLC 방법 약 동학 및 바이오-긴 순환의 분포 결정을 성공적으로 적용 했다 또는 두 DOX의 PEGylated 나노 기반 약물 전달 하거나 mmc는 orthotopic에 유 방 종양 murine 모델 (그림 4 와 5). 그림 4 에서는 해당 무료 마약 솔루션 (즉, 무료 DOX 또는 무료 DOX-MMC) 보다 (즉, 자주 DOX 및 DMPLN)를 나노 입자에 의해 전달 혈액 이상-시간 적어도 6-fold 높은 약물 농도 (그림 4). 장기간된 전신 순환으로 인해 나노 입자 증가 DOX 및 MMC 축적 유 방 종양(그림 5)에서 결과 종양의 향상 된 침투성 및 보존 효과 이용할 수 있었다 37. 한편, DOX 대사 산물 DOXol 유 방 종양 24 h 이상에서 양적 결정된 형성 다양 한 제형 (그림 5B) 약에 대 한 약물 바이오 가용성에 차이 나타냅니다.
그림 1 : DOX MMC 나노 입자 비보에 의해 전달의 동시 결심에 대 한 분석의 그림 처리. (A) 준비의 DMPLN 자기 조립 프로세스; 다음 단계 울트라 쥡니다 메서드를 사용 하 (B) 생물학적 샘플 컬렉션 orthotopic 유 방 종양 murine 모델; (C) 생물 매트릭스와 마약 재구성;에서 추출 약 (D) DOX, MMC 및 DOXol의 분리를 위한 그라데이션 HPLC. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 빈 전 혈 및 혈액에 약 혼합물의 chromatograms의 비교. (A) mmc; UV 360 nm에 자외선과 형광 검출기를 결합 하는 빈 전 혈 및 혈액 HPLC를 사용 하 여 마약 혼합물의 chromatograms의 비교 (B) UV 310 nm 윙하 4-무;에 대 한 Λ에서 (C) 형광ex / em = 480/560 nm DOX 및 DOXol; Λ에서 (D) 형광ex / em = 365/445 윙하 4-무에 대 한 nm. AU 흡 광도 단위 이며 EU는 형광 단위. MMC, DOX, 및 DOXol 및 그들의 윙하 4-무의 주입된 농도가 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL와 200 ng/mL, 각각 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: MMC, DOX 및 전체 혈액에서 DOXol에 대 한 표준 곡선의 표현. 5 ng/mL 2000 ng/mL 낮은 DOX 농도 (B), 그리고 DOXol (C)에 대 한 50 ng/mL에 5 ng/mL 농도 범위 2000 ng/mL mmc (A), 100 ng/mL에서 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 긴 순환 나노 기반의 약 동학을 공부 하는 멀티 채널 및 그라데이션 HPLC 방법을 사용 하 여 여러 약물 분석 시스템의 응용 프로그램 마약 배달. (A) 시간 혈액 농도 프로 파일 DOX의 모노-치료 무료 마약 솔루션 (DOX 무료) 또는 자주 제제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조). (B) 무료 약물 조합 (무료 DOX-MMC) 또는 DMPLN DOX 및 MMC의 시간 혈액 농도 단면도. 전 혈은 다양 한에서 수집 된 시간 orthotopic murine 유 방 종양 방위 쥐 단일 i.v. 주입 후 최대 24 시간 점. 모든 마우스 9.2 mg/kg DOX 혼자 또는 함께 MMC 2.9 mg/kg로 치료 했다. 때문에 MMC LLOD 100 ng/mL는 HPLC를 사용 하 여 UV 검출기, MMC 농도 6 h-주사 질량 분석에 의해 결정 되었다 후 결합. 그림은 장 외에서 수정 되었습니다. 권한22Nanomedicine입니다. 모든 데이터 요소는 n 평균 ± 표준 편차 (SD)로 제시 = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 그라데이션 HPLC 방법을 사용 하 여 종양 바이오-나노 기반 약물 전달 시스템의 분포를 연구 하는 여러 약물 분석의 응용 프로그램. 유 방 종양; 무료 DOX MMC 또는 DMPLN의 (A) 총 DOX 및 MMC 농도 (
표 1: 선형 및 DOX LLOQ, MMC 및 다양 한 생물 학적 행렬에 DOXol. 데이터를 나타내는 n 평균 ± SD = 3.
표 2: 내부 및 남북 하루 정밀도 마우스 전체 혈액에 DOX, MMC 및 DOXol의 정확도 (n = 3).
표 3: 내부 및 남북 하루 정밀도 유 방 종양에 DOX, MMC 및 DOXol의 정확도 (n = 3).
표 4: 전체 혈액 샘플을 추출 후에 DOX 및 MMC 복구 비율 (n = 3). 데이터를 나타내는 n 평균 ± SD = 3.
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Discussion
한 번에 단일 약물의 탐지를 가능 하 게 다른 컬럼에 방법에 비해, 현재 HPLC 프로토콜은 동시에 변경 하는 필요 없이 동일한 생물학 매트릭스에 세 약 화합물 (DOX, MMC, 및 DOXol)을 quantitate 수 모바일 단계입니다. 약 동학 및 바이오-2 나노 기반 약물 전달 시스템의 배포를 확인 하려면이 준비 및 분석 방법은 성공적으로 적용 (즉, 자주 DOX와 DMPLN)22. 이후 PEGylated 나노 연장 시간의 오랜 기간 동안 높은 혈액 약물 농도 결과로 로드 된 약물의 전신 순환 (> 24 h), 설명된 컬럼에 메서드는 큰 규모의 샘플 분석을 위한 비용 효율적인 전 임상 연구22나노 공동 로드 약물 조합. 무료 DOX 솔루션 및 자주 DOX 그림 4A 의 약 동학은 설치류38,39, 추가 현재 방법의 타당성을 지 원하는 보고 문학 데이터와 일치 합니다. 자외선 포토 다이오드 배열 검출기 다중 채널 동시에 감지 하 고 마약 가변 파장 (MMC에 대 한 4-뮤와 360 nm에 대 한즉, 310 nm)를 사용 하 여 표시할 수, UV 검출기의 본질적인 검출 한계는 보다 덜 민감한는 형광 탐지기입니다. 따라서, 빠른 제거, 비 형광 마약 같은 MMC, 무료 솔루션에서 전달 나중 시간 지점에서 약물 농도 LLOQ UV 감지기 아래가 있습니다.
일반적으로, 짧은 크로마토그래피 열 (예를 들어, 5 cm) 차입 시간과 작동 시간을 최소화 하기 위해 HPLC 분석을 위해 사용 됩니다. 그러나, 여러 약물 화합물, 특히 그들 (예를 들어, DOX와 그것의 대사 산물 DOXol) 매우 유사한 분자 구조를 분석 하는 경우 그것은 본질적인 열 효율성으로 인해 짧은 열을 사용 하 여 전체 분리를 달성 어렵다. 따라서, 더 이상 열 (예를 들어, 현재 프로토콜에 사용 되는 25 cm)와 HPLC 매개 변수의 최적화 방법의 개발 하는 동안 좋은 피크 해상도 달성 하기 위해 필요 합니다. DOX, DOXol 및 4-무 했다 eluted 가까이 보존 시간에, 비록 DOX/DOXol 및 4-무 사이의 간섭 했다 chromatographs (그림 2)에서 준비 된 샘플 농도 (예를 들어, 50 ng/mL)에서 관찰 하지. 그러나, 높은 DOX 농도 (예를 들어, ~ 10000 ng/mL) 긴 혈액 순환 시간으로 인해 나노 입자에 의해 전달와 다른 화합물을 (예를 들어, DOXol)의 피크 검출을 방해할 수 고 발생할 수 있습니다. DOX 형광40,41의 냉각 자체. 이 경우에, 빈 전 혈을 사용 하 여 적절 한 샘플 희석을 약물 농도 결정 하는 샘플 분석 하기 전에 필요할 수 있습니다.
추출 방법을 화학요법 약물 조합 분석에 더 복잡 하 게 수 있습니다. DOX 또는 MMC 또는 액체-고체 추출, 고체 상 추출 (SPE)를 포함 하 여 다양 한 추출 방법을 사용 하 여 추출 될 수 있지만 이러한 절차는 시간이 많이 걸리는 고 비싸다. 일부는 추출 방법의 가난한 복구 및 가능한 약물 저하 때 발생할 염 산 추출 용 매42,,4344에 추가 됩니다. 대규모 생물학 견본 준비를 위한 현재 추출 방법 간단, 신속 하 고만 체계적인 샘플 재구성 사용 하 여 효율적인 드 proteinization에 대 한 적은 양의 비 유해 유기 용 매를 추가 해야 메탄올입니다. 높은 회수율 (> 85%) 모두 체계적으로 동일한 추출 프로토콜을 적용 하 여 다양 한 농도의 샘플을 마약에 대 한 달성 했다. 다양성은 여전히 존재 하지만 차이가 통계적으로 중요 한 되지 않습니다. 더 변화를 줄이기 위해, 낮은 약물 농도에서 개별 샘플 추출의 최적화가 필요할 수 있습니다. Note 사용 되는 추출 방법 약물 나노 유기 솔벤트의 추가 후에 완전히 녹 았다는 나노에 남은 무료 출시 마약을 구분 하지 않습니다. 따라서, 나노 혼자 대 무료 마약 혼자의 진정한 약 동학 수학적 모델링 사용 하 여 그들의 행동 vivo에서45예측 숫자 deconvolution 방법의 개발을 필요 합니다.
요약 하자면, 간단 하 고 선택적 HPLC 방법 동시 측정 DOX, MMC 및 Doxol에서 vivo에서개발 되었다. 현재 메서드는 마우스 전체 혈액과 조직에 대 한 약물 농도의 광범위 한 범위에 걸쳐 견고성, 선택도, 정밀도 정확도 보여 줍니다. 이 방법은 DOX 및 MMC의 혈액 농도-시간 프로 파일 및 바이오-분포 DOX, DOXol 및 MMC의 유 방 종양 및 기타 주요 장기 (예를 들어, 심장)에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 프로토콜은 약물 조합 화학요법을 포함 하 elucidating 매크로 및 미세한 비보에 DOX 나노 전달의 메커니즘에 대 한 유용한 툴을 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 없고 경쟁 금융 관심사 이해 충돌 있다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 HPLC, 캐나다 건강 연구 (CIHR) 캐나다 유 방 암 연구 (CBCR) 연구소에서 운영 보조금에 대 한 자연 과학 및 공학 연구 (NSERC) 위원회 캐나다에서 장비 부여를 인정 X.Y. 우, 얼라이언스 그리고 R.X. 장 하 토니 장 토론토 대학 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxorubicin | Polymed Theraeutics | 111023 | Anticancer drug |
| Mitomycin C | Polymed Theraeutics | 060814 | Anticancer drug |
| Doxorubicinol (DOXol) | Toronto Research Chemicals | D558020 | Metabolite of DOX |
| 4-Methylumbelliferone sodium salt | Sigma-Aldrich | M1508 | Internal standard |
| Myristic Acid | Sigma-Aldrich | 544-63-8 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (100) Stearate | Spectrum | M1402 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (40) Stearate | Sigma-Aldrich | P3440 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Pluronic F68 (PF68) | BASF Corp. | 9003-11-6 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Ultrasonication (UP100H) | Hielscher, Ultrasound Technology | NA | Nanoparticle preparation |
| Water Bath (ISOTEMP 3016HS) | Fisher Scientific | NA | Nanoparticle preparation |
| Liposomal Doxorubicin (Caelyx) | Janssen | Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital | Clinically-approved nanoparticle formulation |
| HPLC-graded Methanol | Caledon Chemicals | 6701-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded H2O | Caledon Chemicals | 8801-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded Acetonitrile | Caledon Chemicals | 1401-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| Trifluoroacetic Acid | Sigma-Aldrich | 302031 | HPLC mobile phase composition |
| 0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper | Whatman | WHA7404004 | HPLC mobile phase preparation |
| 1cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2606-309659 | Treatment injection |
| 5cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2608-309646 | Tissue collections |
| 30G 1/2 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Treatment injection |
| 25G 5/8 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Tissue collections |
| Sterile 0.9% Saline | Univeristy of Toronto House Brand | 1011 | Tissue perfusion |
| 13 ml Rounded-bottom conical tube | SARSTEDT | 62.515.006 | Prolyprolene, tissue homogenization |
| Alpha Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 12571063 | Cell medium |
| 1 x Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010023 | Tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100 ML | Tissue homogenization |
| Formic acid | Caledon Chemicals | 1/5/3840 | Adjust pH for extraction solvent |
| Sodium heparin sprayed plastic tubes | Becton, Dickinson and Company | 367878 | Blood collection |
| Analytical Weigh Balance | Sartorius | CPA225D | NA |
| pH meters | Fisher Scientific | 13-637-671 | accumet BASIC |
| Vortex Mixter | Fisher Scientific | 02-215-365 | Vortexing samples at desired speed |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Fisherbrand | 2043-05408129 | Prolyprolene |
| Model 1000 homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-672 | Tissue homogenization |
| Centrifuge 5702R | Eppendorf | 5702R | Extraction preparation |
| Heated Evaporator System | Glas-Col | NA | Sample reconstitution |
| HPLC Screw Thread Vials | DIKMA | 5320 | HPLC sample injection |
| HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa | DIKMA | 5325 | HPLC sample injection |
| HPLC Polypropylene Insert | Agilent Technologies | 5182-0549 | Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection |
| Xbridge C18 Column | Waters Corporation | 186003117 | Drug analysis |
| Gradient pump | Waters Corporation | W600 | Drug analysis |
| Auto-sampler | Waters Corporation | W2707 | Drug analysis |
| Photodiode array detector | Waters Corporation | W2998 | Drug analysis |
| Multi λ fluoresence detector | Waters Corporation | W2475 | Drug analysis |
| EMPOWER 2 | Waters Corporation | NA | Data analysis software |
| Scientist | Micromath | NA | Pharmacokinetic analysis |
| Female Balb/c Mice | Jackson Laboratory | 001026 | In vivo |
| EMT6/WT Breast Cancer Cells | Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute | NA | In vivo |
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