Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Utvinning og samtidige brukt kromatografiske kvantifisering av doksorubicin og Mitomycin C etter narkotika kombinasjon levering i nanopartikler til Tumor rentebærende mus

Published: October 5, 2017 doi: 10.3791/56159
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv og praktisk analytiske prosessen eksempel utvinning og samtidige fastsettelse av flere rusmidler, doksorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) og en cardio-giftig DOX metabolitten, doxorubicinol (DOXol), biologisk prøver fra prekliniske brystet tumor modell behandlet med hydrogenion formuleringer av synergistisk medikament kombinasjon.

Abstract

Kombinasjon kjemoterapi er ofte brukt i klinikken for behandling; tilhørende bivirkninger på normalt vev kan imidlertid begrense dens terapeutiske nytte. Hydrogenion-baserte narkotika kombinasjon har vist seg å redusere problemene gratis narkotika Kombinasjonsbehandling. Våre tidligere studier har vist at kombinasjonen av to anticancer legemidler, doksorubicin (DOX) og mitomycin C (MMC), produsert en synergistisk effekt mot både murint og menneskelige brystkreft celler i vitro. DOX og MMC co lastet polymer-lipid hybrid nanopartikler (DMPLN) forbigått ulike middelklasseinnbyggere transporter pumper som overdrar multidrug motstand og viste forbedret effekt i brystet tumor modeller. Sammenlignet med konvensjonelle Løsningsskjemaer, ble slik overlegen effekten av DMPLN tilskrevet synkronisert farmakokinetikken av DOX og MMC og økt intracellulær narkotika biotilgjengelighet innen kreftceller aktiveres av nanocarrier PLN.

For å evaluere farmakokinetikken og bio-distribusjon av administrert co DOX og MMC både gratis løsning og hydrogenion former, en enkel og effektiv multi-Drug analysemetode bruker omvendt-fase høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) var utviklet. I motsetning til tidligere rapportert metoder som analysert DOX eller MMC individuelt i plasma, er denne nye HPLC metoden kjøpedyktig samtidig quantitate DOX, MMC og en cardio-giftig DOX hovedmetabolitten, doxorubicinol (DOXol), i ulike biologiske matriser ( f.eks fullblod, brystet svulsten og hjertet). En dobbel fluorescerende og ultrafiolett absorberende sonde 4-methylumbelliferone (4-MU) ble brukt som en intern standard (er) for ettrinns påvisning av flere narkotika analyse med annerledes oppdagelsen bølgelengder. Denne metoden ble brukt for å bestemme konsentrasjonen av DOX og MMC levert av både hydrogenion og løsning tilnærminger i fullblod og ulike vev i en orthotopic brystet tumor murine modell. Analysemetode presentert er et nyttig verktøy for pre-klinisk analyse hydrogenion-baserte levering av rusmiddelkombinasjoner.

Introduction

Kjemoterapi er en primær behandling modalitet for mange kreft men det er ofte forbundet med alvorlige bivirkninger og begrenset effekt på grunn av resistens og andre faktorer1,2,3. For å forbedre resultatet av kjemoterapi er narkotika kombinasjon regimer brukt i klinikken basert på hensyn som ikke-overlappende toksisitet, ulike mekanismer av stoffet handling, og ikke-cross narkotika motstand4,5 , 6. i kliniske forsøk, en bedre svulst svarprosent ble ofte observert bruke samtidig administrert rusmiddelkombinasjoner sammenlignet med en diett av sekvensiell stoffet levering7,8. Men på grunn av sub-optimale bio-fordelingen av gratis narkotika, kan samtidig injeksjon av flere stoffer forårsake fremtredende normalt vev toksisitet som oppveier den terapeutiske effekt9,10,11. Nanocarrier-baserte narkotika-leveranser har vist seg å endre farmakokinetikken og bio-fordelingen av innkapslede narkotika, styrke svulst målrettede akkumulering12,13,14. Som omtalt i våre siste artikler, har nanopartikler co lastet med synergistisk rusmiddelkombinasjoner vist evne til å redusere problemene gratis rusmiddelkombinasjoner, på grunn av deres kontrollert timelige og romlig co levering av flere legemidler tumor vev, aktivere synergistisk narkotika effekter mot kreft celler4,15,16. Resultatet har overlegen terapeutiske effekten og lav toksisitet blitt vist både prekliniske og kliniske studier4,17,18.

Våre tidligere i vitro studier funnet at kombinasjonen av to anticancer legemidler, doksorubicin (DOX) og mitomycin C (MMC), produsert en synergistisk effekt mot flere bryst kreft celler linjer, og videre co lasting DOX og MMC i polymer-lipid hybrid nanopartikler (DMPLN) overvant ulike multi-resistente tilknyttede middelklasseinnbyggere pumper (f.eks, P-glykoprotein og bryst kreft motstandsdyktig protein)19,20,21. I vivo, DMPLN aktivert romlig-temporalt co levering av DOX og MMC svulst områder og økt bioavailability av narkotika kreftceller, som indikert av moderasjon av dannelse av DOX metabolitten doxorubicinol (DOXol)22. Resultatet forbedret av DMPLN svulst celle apoptose, tumor vekst hemming og langvarig vert overlevelse sammenlignet med gratis DOX og MMC eller en liposomal DOX formulering22,23,24, 25.

Analysere faktiske mengden av narkotika co levert av en nanocarrier er avgjørende for å utforme effektive hydrogenion formuleringer. Mange metoder har blitt utviklet for å analysere plasma nivået av enkelt DOX eller MMC doser bruker Væskekromatografi (HPLC) alene eller i kombinasjon med massespektrometri (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. disse metodene er imidlertid ofte tidkrevende og upraktisk for Kombinasjonsbehandling som et stort antall biologiske prøver må være forberedt separat for analyse av flere stoffer (noen ganger inkludert narkotika metabolitter). I tillegg til sterk plasma protein binding av DOX og MMC har røde blod celler også en stor evne til å binde og konsentrere mange anticancer narkotika35,36. Plasma analyse for DOX eller MMC kan dermed Beskytt faktiske blod narkotika konsentrasjoner. Den nåværende arbeidet (figur 1) beskriver en enkel og robust flere narkotika analysemetode bruker omvendt fase HPLC samtidig og quantitate DOX, MMC og DOX metabolitten doxorubicinol (DOXol) fra fullblod og ulike vev ( f.eks svulster). Det har vært anvendt for å bestemme farmakokinetikken og bio-distribusjon av DOX og MMC og dannelsen av DOXol etter stoffet levering via gratis løsninger eller hydrogenion skjemaer (dvs.DMPLN og liposomal DOX) i en orthotopically implantert murine bryst-svulst musemodell etter intravenøs (IV) injeksjon22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle dyreforsøk ble godkjent av dyr omsorg komiteen av universitetet helse nettverket på Ontario Cancer Institute og gjennomført i samsvar med kanadiske Rådet for dyr omsorg retningslinjer.

1. biologiske utvalg forberedelse

  1. samle fullblod, store organer og bryst svulst på forhåndsbestemte tidspunkt etter intravenøs (IV) administrasjon av narkotika inneholder formuleringer (f.eks, DMPLN, liposomal DOX)
    1. injisere en brystet tumor rentebærende musen IV med forberedt narkotika inneholder formulering.
    2. Bedøve musen på angitt tidspunkt (f.eks, 15 min) ved å gi inhalable 2% isoflurane i et forseglet kammer.
    3. Lå bedøvet musen på ryggen og sette sin nese gjennom en revolveren som leverer stadig 2% isoflurane.
      Merk: For å sikre musen gjennomgår dype anestesi, forsiktig knip forgrunnen lemmer av musen og se for enhver rykninger bevegelse.
    4. Rengjør regionene brystet og magen med 70% etanol, og deretter utføre en terminal prosedyre av cardiac punktering på dyp bedøvet mus ved hjelp av en heparinized 1 mL sprøyte og en 23 G nål.
    5. Samle hele blodet i en merket natrium heparin sprayet plastrør og virvel forsiktig røret slik samlet fullblod kommer i kontakt med den belagt heparin av rør veggen. Samle minst 50 µL av hele blod. Alltid holde prøvene med ice.
    6. Tape alle fire lemmer på å sikre det og åpne bukhulen og brystkasse av musen med en saks og tang. Skifte tarmen til side og skyv leveren oppover å avsløre tilstrekkelig portalen blodåre. Kutte portalen blodåre for blod drenering.
    7. Perfuse hele musen kroppen med 50 mL iskald 0,9% saltoppløsning gjennom hjertet med en 10 mL sprøyte med en 25 G nål.
      Merk: Bøy nålen i 90° for guiding sprøyten i portalen blodåre.
    8. Avgiftsdirektoratet organer i følgende rekkefølge: hjerte, lunge, leveren, milt, nyrer. Deretter skille brystet svulsten fra omkringliggende bindevev med en snitt saks ved rett mammary fett pad museklikk. Samle alle organer individuelt i 1,5 mL polypropylen rør og raskt fryse dem i flytende nitrogen.
      ​ Merk: skille galleblæren fra leveren.
    9. Lagre hele blod på 4 ° C og forbrukeravgift vev i-80 ° C fryseren til senere HPLC-analyse.
  2. Ekstra DOX, MMC og DOXol fra biologiske matriser.
    1. Veie alle frosne dissekert vev raskt og overføre dem til et 13 mL avrundet bunn konisk rør. For å unngå mulige narkotika metabolisme eller degradering, holde prøvene på ice.
    2. Legge til 1-5 mL iskald celle lyseringsbuffer inn i røret.
      Merk: Volumet på bufferen som skal brukes, avhenger av vev vekten basert på vev-buffer forholdet mellom 1 g: 5 mL (w/v); for små organer, som hjerte og milt, er 1 g: 2 mL.
    3. Bruker en opp-ned slag bevegelse til homogenize vev prøvene på is med en hastighet på 18 000 rpm bruker en elektrisk homogenizer.
      Merk: Fullført homogenisering krever ca 3 til 5 gjentakelser av en kort homogenisering prosessen med mindre enn 15 s, etterfulgt av vev kjøling over isen mellom hvert kort homogenisering.
    4. Vask 10 mm saw-tooth generator sonden av homogenizer med destillert deionisert (DDI) H 2 O, 70% etanol, og deretter DDI H 2 O mellom hver Vevsprøve å unngå kryss-kontaminering.
    5. Overføre 50 µL av vev homogenate eller hele blodet til en 1,5 mL polypropylen mikro-sentrifuge rør og topp med 5 µL av en intern standard (is) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) inn i røret.
      Merk: 4-MU løsning er utarbeidet i metanol her.
    6. Legge til 250 µL en iskald utvinning løsemiddel inn i røret som inneholder fullblod eller vev homogenate.
      Merk: Utvinning løsemiddelet består av 60% acetonitrile (ACN) og 40% ammonium acetate (5 mM) med pH justert til pH = 3.5 bruker 0,05% maursyre. Bruke et 1:5 (v/v) eksempel: utvinning løsningsmiddel til volumkontrollen.
    7. Kraftig vortex blandingen i 2 minutter, sentrifuger i 3000 x g-kraft ved 4 o C for 10 min og Pipetter 200 µL supernatant inn i en annen pre kjølt frisk mikro-sentrifuge rør.
    8. Fordampe nedbryting på 60 ° C under en langsom strøm av nitrogen gass med beskyttelse mot lyset.
    9. Gjeninnføre den tørkede resten med 100 µL av iskalde metanol, kraftig vortex for 30 s og sentrifuger 3000 x g ved 4 ° C i en annen 5 min.
    10. Overføre nedbryting til en såkalt HPLC medisinglass setter og plasser prøven ampuller i en autosampler brett for injeksjon.

2. HPLC instrumentering og drift parametre

  1. forberede HPLC mobile-fase med konsekvent reproduserbarhet
    1. måle 500 mL HPLC-klasse H 2 O bruker en uteksaminert sylinder.
    2. Måle 500 mL HPLC-klasse acetonitrile (ACN) bruker en separat uteksaminert sylinder.
    3. Nøye legge til 0,5 mL av trifluoroacetic syre (TFA) (advarsel) i hver av 500 mL av H 2 O og ACN å få den mobile fasen av H 2 O og ACN som inneholder 0,1% TFA, henholdsvis.
      Merk: TFA er korrosiv og giftige og skal håndteres under avtrekksvifte laboratorium. Alle løsemiddel blandinger tilberedes ved romtemperatur.
    4. Filter mobile phases gjennom en nylon membran med en 0,45 µm pore størrelse og overføre den til ren HPLC reservoaret flasker.
  2. Oppsett HPLC instrumentering samtidige deteksjon av DOX, MMC, og DOXol og er 4-MU.
    1. Slå på gradering pumpe, de gasser, auto-sampler, photodiode matrise detektor og multi λ fluorescens detektor.
    2. Inn den første vilkår av mobil-fase sammensetning 16,5% H 2 O (0,1% TFA) og 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Angi UV-detektor to stred, ett på 310 nm for 4-MU (er) og den andre på 360 nm for MMC.
    4. Angi fluorescens detektoren på to stred, ett på λ ex / λ em = 365/445 nm for 4-MU og den andre på λ ex / λ em = 480 nm/560 nm for DOX og DOXol, henholdsvis.
    5. Angi en isocratic strømningshastighet på 1,0 mL/min.
    6. Equilibrate en forhåndsinstallert omvendt fase C 18 kolonne (4.6 mm x 250 mm, 5 µm) ved romtemperatur for 10 min for planlagte etablissement.
  3. Skille narkotika (DOX, MMC, DOXol og 4-MU) bruk av gradient mobile-fase betingelse.
    1. Injisere 15 µL av utdraget og re konsentrert prøver ved den auto-sampler.
    2. Gradvis endre betingelsen for første mobile-fase (se protokollen trinn 2.2.2) til 100% ACN (0,1% TFA) over 18 min bruk av automatiserte gradient pumpen.
      Merk: Under separasjon prosessen, fire kanaler (to UV-absorberende og to fluorescerende) vises samtidig med hver kanal viser ett stoff sammensatt (se protokollen gå 2.2.3 og 2.2.4).
    3. Beholde 100% av ACN (0,1% TFA) for 1 min og deretter tilbake til mobile startfasen tilstand innen 1 min.
    4. Re tilstand kolonnen med mobile startfasen på strømningshastighet på 1,5 mL/min for 4 min for neste eksempel injeksjon.

3. HPLC godkjenningen

  1. forberede arbeider standarder av DOX, MMC og DOXol og 4-MU (is).
    1. Veie separat 1 mg av DOX og MMC narkotika pulver (advarsel) og 4-MU på en frisk små veier papir (3 x 3 tommer 2).
      Merk alle anticancer narkotika anses helsefarlig som kan forårsake akutt toksisitet og bakterie celle genetisk virkning på innånding eller svelging. De bør håndteres forsiktig med hansker og masker.
    2. Overføre vektet DOX, MMC og 4-MU inn i et nytt personlige 1,5 mL polypropylen mikro-sentrifuge rør.
    3. Legge til 1 mL av methAnol og vortex kort å få 1 mg/mL konsentrasjonen av DOX og MMC.
    4. Legge til 1 mL av metanol i ampuller med pre vektet 1 mg DOXol (advarsel) og vortex kort å få 1 mg/mL konsentrasjonen av DOXol.
      Merk: DOXol er en cardio-giftig metabolitten og bør håndteres forsiktig.
    5. Pipetter 20 µL av forberedt lager løsninger av DOX, MMC, DOXol og 4-MU inn i en ny skille 1,5 mL polypropylen mikro-sentrifuge rør og legge 980 µL av metanol å få en fungerende standard 20 µg/mL av hvert legemiddel.
    6. Fortynne 20 µg/mL av DOX, MMC og DOXol bruk av metanol for å få jobbe standarder for 50 ng - 20 µg /mL for DOX, MMC og DOXol og 2000 ng/mL for er 4-MU.
    7. Forsegle hetten tube arbeider løsninger med en smal parafin filmen dekker å hindre metanol fordamper, vikle hele røret med aluminiumsfolie å unngå eksponering for lys og store på -20 ° C.
  2. Bestemme linearitet, presisjon og nøyaktighet av DOX, MMC og DOXol i biologiske matriser (dvs. fullblod og svulst homogenate).
    1. Samtidig topp 5 µL av arbeider av DOX og DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1000 ng/mL - 16 µg/mL), og 4-MU (2 µg/mL) i 50 µL av Tom fullblod eller vev homogenate i polypropylen mikro-sentrifuge rør til få standard konsentrasjonen kurven fra 5-2000 ng/mL for narkotika forbindelser og 200 ng/mL for 4-MU (is).
    2. Utføre narkotika utvinning analysen beskrevet i protokollen 1.2.
    3. Bruker lav, gjennomsnittlig og høy konsentrasjoner av DOX og DOXol (50, 500 og 2000 ng/mL) og MMC (100, 1000, 2000 ng/mL) for intra - og inter - dag presisjon og nøyaktighet.
      Merk: Forberede frisk standard konsentrasjoner ved analyse.
  3. Analyse av prøver
    1. injisere 15 µL av prøven med den auto-sampler.
    2. Gradvis forandre den mobile fasen over 0 til 18 min, øke sammensetningen av ACN over intervallet.
    3. Etter 18 min, holde mobile fase tilstanden i 1
    4. Tilbake til den opprinnelige tilstanden over neste 2 min, så nytt equilibrate for 4 min før neste injeksjon.
    5. Etter hver prøve kjøre, Merk at toppene av narkotika forbindelser med sine tiden vises som følger: MMC, DOXol, 4-MU (er) og DOX.
    6. Integrere topp under kurven (AUC) av narkotika forbindelser HPLC programmvre.
    7. Beregne AUC forholdet mellom individuelle drug sammensatte og is (formel 1) og bruke standard kurver utarbeidet under samme utvinning prosedyrer til å bestemme narkotika konsentrasjonen av DOX, MMC og DOXol i DMPLN formulering.
      Equation 1
    8. beregning narkotika utvinning (ligning 2) ved å sammenligne de narkotika konsentrasjonene rekonstituert bruker metanol fra ekstrakter av piggete biologiske prøver som av standard (" pen ") narkotika løsning i metanol.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To anticancer legemidler, DOX og MMC, samt DOX metabolitten, DOXol, oppdaget samtidig uten biologiske forstyrrelser under samme anvendt gradient HPLC betingelse bruker 4-MU som er for både fluorescens og UV detektorer. DOX, MMC, DOXol og 4-MU var godt adskilt fra hverandre med tid 5.7 min for MMC, 10.4 min for DOXol, 10,9 min for 4-MU og 11,1 min for DOX (figur 2). Rusmiddel i hele blod og ulike vev viste konsentrasjon linearitet med korrelasjonskoeffisienter (R2) mellom 0,98 1,00 (Figur 3 og tabell 1). Nedre grense for kvantifisering (LLOQ) av DOX, DOXol og MMC var 10 ng/mL, 10 ng/mL og 100 ng/mL fullblod og 25 ng/mL, 25 ng/mL og 200 ng/mL i ulike vev, henholdsvis (tabell 1). Metoden HPLC utviklet vises mindre enn 15% variasjon i intra - og inter - dag presisjon og nøyaktighet for DOX, MMC og DOXol i hele blod og ulike biologiske matriser (f.eks, hjerte, lunger, leveren, milt og nyrer), som indikerer utmerket reproduserbarhet (tabeller 2 og 3). Mer enn 85% av DOX og MMC ble gjenopprettet fra fullblod etter ekstraksjon (Tabell 4).

Multidrug analyse-prosedyrer som bruker ettrinns de proteinization ved en sur utvinning løsemiddel etterfulgt av ansette en såkalt HPLC metoden ble brukt for å bestemme farmakokinetikken og bio-fordelingen av lang-sirkulerende eller Pegylert hydrogenion-baserte narkotika-leveranser av både DOX alene eller i kombinasjon med MMC i en orthotopic brystet tumor murine modell (tall 4 og 5). Figur 4 viser minst 6-fold høyere narkotika konsentrasjoner i blodet over tid levert av nanopartikler (i.e.liposomal DOX og DMPLN) enn tilsvarende gratis narkotika løsninger (dvs., gratis DOX eller gratis DOX-MMC) (figur 4). på grunn av langvarig systemisk sirkulasjon, nanopartikler kunne utnytte forbedret permeabilitet og oppbevaring effekten av svulsten, som resulterer i økt DOX og MMC akkumulering i brystet svulsten (figur 5et) 37. i mellomtiden kvantitativt bestemt dannelsen av DOX metabolitten DOXol i bryst tumorer over 24 h indikerer en forskjell i stoffet bio-tilgjengelighet for ulike stoffet formuleringer (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 : Illustrasjon av analyse prosesser for samtidige fastsettelse av DOX og MMC levert av nanopartikler i vivo. (A) forberedelse av DMPLN med en ettrinns ultra-sonication metode etterfulgt av en selvstendig montering prosess; (B) biologiske prøvekolleksjoner fra en orthotopic brystet tumor murine modell; (C) narkotika utvinning fra biologiske matriser og narkotika rekonstituering; (D) Gradient HPLC for separasjon av DOX, MMC og DOXol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av chromatograms tom fullblod og narkotika blandinger i blod. Sammenligning av chromatograms tom fullblod og narkotika blandinger i blod bruker mye HPLC koblet til UV og fluorescens detektorer på (A) UV 360 nm for MMC. (B) UV 310 nm for er 4-MU; (C) fluorescens på λex / em = 480/560 nm for DOX og DOXol; (D) fluorescens på λex / em = 365/445 nm for er 4-MU. AU er absorbansen enhet og EU er fluorescens enhet. Injisert konsentrasjonen av MMC, DOX, og DOXol og deres er 4-MU var 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL og 200 ng/mL, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representasjon av standard kurver for MMC, DOX og DOXol i fullblod. Konsentrasjon områdene var fra 100 ng/mL til 2000 ng/mL for MMC (A), fra 5 ng/mL til 2000 ng/mL for lav DOX konsentrasjon (B) og 5 ng/mL til 50 ng/mL for DOXol (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Bruk av flere narkotika analyse systemet, bruke en flerkanals og gradient HPLC metode, for å studere farmakokinetikken av lang sirkulerende hydrogenion-baserte narkotika levering. (A) tid-blod konsentrasjonen profiler av DOX i mono-terapi bruker gratis narkotika løsninger (gratis DOX) eller en liposomal formulering (se Tabell for materiale); (B) tid-blod konsentrasjonen profiler av DOX og MMC som gratis narkotika kombinasjon (gratis DOX-MMC) eller DMPLN. Fullblod ble samlet inn på ulike tid poeng opptil 24 timer etter en enkelt IV injeksjon til mus bærer en orthotopic murint brystet svulsten. Alle mus ble behandlet med 9.2 mg/kg DOX alene eller i kombinasjon med 2,9 mg/kg MMC. Fordi LLOD av MMC var 100 kombinert ng/mL bruker HPLC UV-detektor, MMC konsentrasjon etter 6 h etter injeksjon ble bestemt av massespektrometri. Figuren er endret fra Zhang et al. Nanomedicine med tillatelse22. Alle datapunkter presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD) med n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Bruk av flere narkotika analyse ved hjelp av gradient HPLC metoden for å studere svulst bio-distribusjon av en hydrogenion-baserte narkotika leveringssystem. (A) Total DOX og MMC konsentrasjoner av gratis DOX-MMC eller DMPLN i bryst tumorer; (Rong > B) Total DOXol metabolitten formasjon i brystkreft svulster behandlet med mono- eller kombinasjon DOX kjemoterapi. Alle mus ble behandlet med 9.2 mg/kg DOX alene eller i kombinasjon med 2,9 mg/kg MMC. Fordi gratis DOX-MMC hadde en lav svulst akkumulering som var av LLOD av MMC ved hjelp av HPLC kombinert UV-detektor, ble MMC konsentrasjon i gratis DOX-MMC bestemt av massespektrometri. Figuren er endret fra Zhang et al. Nanomedicine med tillatelse22. Alle datapunkter presenteres som betyr ± SD med n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: linearitet og LLOQ av DOX, MMC og DOXol i ulike biologiske matriser. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD n = 3.

Table 2
Tabell 2: Intra - og inter - dag presisjon og nøyaktighet av DOX, MMC og DOXol i musen fullblod (n = 3).

Table 3
Tabell 3: Intra - og inter - dag presisjon og nøyaktighet av DOX, MMC og DOXol i bryst tumorer (n = 3).

Table 4
Tabell 4: DOX og MMC utvinning prosenten i hele blodprøvene etter ekstraksjon (n = 3). Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med andre brukt kromatografiske metoder som aktiverer deteksjon av en enkelt stoff Art samtidig, er dagens HPLC protokollen kjøpedyktig samtidig quantitate tre narkotika forbindelser (DOX, MMC og DOXol) i den samme biologisk matrisen uten behov for å endre mobile fasen. Denne forberedelse og analyse metoden har vært anvendt for å bestemme farmakokinetikken og bio-fordelingen av to hydrogenion-baserte narkotika leveringssystemer (dvs. liposomal DOX og DMPLN)22. Siden pegylert nanopartikler forlenge systemisk sirkulasjon av lastet stoffet som resulterer i høyt blod narkotika konsentrasjoner over en lengre periode (> 24 h), beskrevet brukt kromatografiske metoden er kostnadseffektivt for storskala eksempel analyse av hydrogenion lastet co rusmiddelkombinasjoner i pre kliniske studier22. Farmakokinetikken av DOX gratisløsning og liposomal DOX vist i Figur 4A er konsistent med rapporterte litteratur data i gnagere38,39, ytterligere støtte gyldigheten av det aktuelle metoden. Selv om UV photodiode-array-detektor lar flere-kanaler samtidig oppdage og vise narkotika med variabel bølgelengder (dvs. 310 nm for 4-MU og 360 nm for MMC), innebygd Deteksjonsgrensen på UV-detektor er mindre sensitive enn det fluorescens detektoren. Derfor for rask eliminering, ikke-fluorescerende narkotika som MMC levert gratis løsninger, kan narkotika-konsentrasjoner på senere tidspunkt falle under LLOQ av UV-detektor.

Generelt, vil en kort kromatografi kolonne (f.eks, 5 cm) bli brukt for såkalt HPLC-analyse for å minimere elueringsrør tid og driftstid. Likevel, ved å analysere flere narkotika forbindelser, særlig de med ligner molekylære strukturer (f.eks, DOX og dens metabolitten DOXol), er det vanskelig å oppnå full separasjon med kort kolonnen på grunn av iboende kolonnen effektivitet. Dermed for både en lengre kolonne (f.eks25 cm, brukes i gjeldende protokollen) og en optimalisering av HPLC parametere under utviklingen av metoden å oppnå en god peak oppløsning. Selv om DOX, DOXol og 4-MU var elut på nær oppbevaringsperioden, ble forstyrrelser mellom DOX/DOXol og 4-MU ikke observert i forberedt eksempel konsentrasjon (f.eks, 50 ng/mL) i chromatographs (figur 2). Men en høy DOX konsentrasjon (f.eks, ~ 10.000 ng/mL) levert av nanopartikler som følge av lang blod sirkulasjon tid kan forstyrre peak påvisning av seg selv og andre forbindelser (f.eksDOXol) og kan medføre selv slukke av DOX fluorescens40,41. I dette tilfellet kan en skikkelig prøve fortynning med Tom fullblod være nødvendig før eksempel analyse å finne stoffet konsentrasjoner.

Innhenting kan ytterligere å komplisere analyse av chemotherapeutic rusmiddelkombinasjoner. Selv om DOX eller MMC kan hentes ved hjelp av ulike metoder, utvinning, inkludert solid fase utvinning (SPE) eller væske-solid utvinning, er disse prosedyrene tidkrevende og kostbar. Noen av metodene utvinning resultere i dårlig utvinning og mulige narkotika fornedrelse når saltsyre legges til utvinning løsemiddel42,43,44. For storskala biologiske utvalg preparater, nåværende utvinning metoden er enkel, rask og bare krever tillegg av små mengder ikke farlig organisk løsemiddel for effektiv de proteinization etterfulgt av systematisk eksempel rekonstituering bruker metanol. Høye utvinningsgraden (> 85%) ble oppnådd for alle narkotika prøver av varierende konsentrasjoner systematisk bruke samme utvinning protokoll. Selv om variasjon fortsatt eksisterer, er forskjellene statistisk ubetydelig. For ytterligere å redusere variasjonen, kan optimalisering av enkelte eksempel utvinning i lav og høy narkotika konsentrasjoner være nødvendig. Merk at utvinning metoden ikke skiller gratis utgitt narkotika fra stoffet igjen i hydrogenion som nanopartikler ble fullstendig oppløst etter organiske løsemidler. Dermed krever true farmakokinetikken av nanopartikler alene vs gratis narkotika alene utvikling av en numerisk deconvolution metoden ved hjelp av matematisk modellering for å forutsi deres atferd i vivo45.

Oppsummert, ble en enkel og selektiv HPLC metoden utviklet for samtidig fastsettelse av DOX, MMC og Doxol i vivo. Den nåværende metoden viser robusthet, selektivitet, presisjon og nøyaktighet over et bredt spekter av narkotika konsentrasjoner for musen hele blod og vev. Denne metoden har vært anvendt for å få blodet konsentrasjon-tid profilen DOX og MMC og bio-distribusjon av DOX, DOXol og MMC i bryst tumorer og andre viktige organer (f.eks hjerte). Denne protokollen gir et nyttig verktøy for Klargjørende makro- og mikroskopiske i vivo mekanismer for hydrogenion levert DOX inneholder narkotika kombinasjon kjemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser og interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner takknemlig utstyr tilskuddet fra Natural Science og Engineering Research (NSERC) Council of Canada for HPLC, det operative stipendet fra Canadian Institute of Health Research (CIHR) og kanadiske Breast Cancer Research (CBCR) Alliansen å X.Y. Wu, og University of Toronto stipend R.X. Zhang og T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., , CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15 (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6 (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15 (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74 (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15 (2), 003372 (2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101 (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22 (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15 (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80 (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5 (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9 (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15 (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5 (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2 (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119 (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22 (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. , 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11 (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334 (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6 (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32 (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764 (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739 (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721 (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43 (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676 (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42 (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6 (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91 (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81 (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7 (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50 (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826 (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19 (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).

Tags

Kreftforskning problemet 128 HPLC samtidige analyse biologisk eksempel utvinning kombinasjon kjemoterapi nanopartikler farmakokinetikken bio-distribusjon doksorubicin mitomycin C doxorubicinol blod svulst
Utvinning og samtidige brukt kromatografiske kvantifisering av doksorubicin og Mitomycin C etter narkotika kombinasjon levering i nanopartikler til Tumor rentebærende mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K.,… More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter