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Immunology and Infection

非侵入性 体内生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植

doi: 10.3791/56169 Published: April 9, 2018

Summary

提出了一种利用生物发光标记细菌对肠出血性大肠杆菌 (大肠杆菌) 进行殖民化的小鼠模型的详细协议。在活体动物中, 通过非侵入性的体内成像系统来检测这些生物发光细菌, 可以提高我们目前对大肠杆菌定植的认识。

Abstract

肠出血性大肠杆菌 (肠出血性大肠杆菌) O157:H7, 是 causesdiarrhea、出血性结肠炎 (HS) 和溶血尿毒症综合征 (溶血尿毒症) 的食源病原体, 可殖民到人类肠道。为了研究肠内大肠杆菌定植的详细机制在体内,必须有动物模型来监测和量化大肠杆菌的定植。通过将生物发光表达质粒转化为肠出血性大肠杆菌来监测和定量活寄主中大肠杆菌的定植, 我们在这里展示了一种小鼠大肠杆菌的定植模型。用生物发光标记的大肠杆菌接种的动物, 通过非侵入性的体内成像系统检测, 显示了小鼠强烈的生物发光信号。感染后1和2天后, 生物发光信号仍可在受感染的动物身上检测到, 这表明在寄主中至少有2天发生了大肠杆菌的殖民。我们还表明, 这些发光的肠外大肠杆菌定位到小鼠肠道, 特别是在盲肠和结肠, 从体图像。这种鼠肠大肠杆菌定植模型可以作为一种工具, 以提高目前的知识, 肠出血性大肠杆菌的殖民机制。

Introduction

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大肠杆菌 O157:H7 是一种病原体, 引起腹泻1, HS2, 溶血症3, 甚至急性肾功能衰竭4通过污染的水或食物。肠出血性大肠杆菌是一个致病性 enterobacterium 和殖民的胃肠道的人1。当出血性大肠杆菌第一次坚持宿主肠道上皮, 他们通过 III. 型分泌系统 (T3SS) 将定植因子注入宿主细胞, 该类型作为分子注射器诱导附加和谦逊 (a/E) 病变随后执行附着力 (殖民化)5。enterocyte 避嫌 (李) 致病性岛5的轨迹编码了这些涉及 A/E 病变形成的基因。

生物发光是一种光产生化学反应, 荧光素酶催化其基底荧光素生成可见光 6.这种酶法通常要求存在氧或三磷酸腺苷 (ATP)6。生物发光成像 (BLI) 允许研究人员的可视化和量化的寄主病原体相互作用的活动物7。BLI 可以通过以下生物发光细菌来表征活体动物的细菌感染周期, 它们迁移到并侵入不同的组织7;这揭示了感染的动态发展。此外, 动物的细菌负荷与生物发光信号8有关;因此, 简单直接地估计实验动物的病理状况是一种方便的指标。

这里使用的质粒包含荧光素酶操纵, luxCDABE, 这是从细菌Photorhabdus luminescens编码其自己的荧光素酶基板7,9。通过将这种荧光素酶表达质粒转化为细菌, 可以通过观察活动物中的这些生物发光细菌来监测其定植和感染过程。总体而言, BLI 和生物发光标记的细菌允许研究人员监测细菌数量和位置, 细菌的生存能力与抗生素/治疗治疗, 和细菌基因表达感染/殖民化6,7. 报告了许多致病细菌, 表达了luxCDABE操纵检查其感染周期和/或感染中的基因表达。这些细菌, 包括致肾盂肾炎大肠杆菌 10, 出血性大肠杆菌8, 11, 12, 13,致病大肠杆菌 (EPEC)8 , 柠檬酸杆菌rodentium14,15, 沙门氏菌伤寒16, 李斯特氏李斯特氏增生17, 耶尔森氏菌小肠结肠炎 18, 19,霍乱弧菌20已被记录在案。

已开发了几个实验模型, 以促进研究肠大肠杆菌的殖民化在体外体内21,22,23。然而, 缺乏适当的动物模型来研究肠内大肠杆菌的定植在体内, 从而导致缺乏细节。为促进对肠内大肠杆菌定植机制的研究,在体内, 建立动物模型来观察和量化活体动物的肠外培养是一种无创的方法是很有价值的。

这篇手稿描述了一个老鼠大肠杆菌的殖民模型, 使用一个生物发光表达系统来监测大肠杆菌在活寄主时间的殖民化。小鼠灌接种生物发光标记的大肠杆菌, 并在小鼠身上检测到无侵入性的体内成像系统13中的发光信号。感染了生物发光标记的大肠杆菌病的小鼠在2天后的肠道感染后显示出明显的生物发光信号, 这表明这些细菌在感染后2天后在宿主肠道内被殖民。体图像数据表明, 这种殖民化在小鼠的盲肠和结肠中特别存在。利用该模型, 通过体内成像系统, 在活体宿主中检测出生物发光大肠杆菌的定植, 研究肠道细菌定植的详细机制, 从而促进对大肠杆菌诱发的生理和病理改变。

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Protocol

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注意: 根据疾病控制和预防中心 (CDC) 生物安全指导 (https://www.cdc.gov/), 大肠杆菌 O157:H7 是生物安全等级 2 (BSL-2) 病原体。因此, 所有涉及肠出血性大肠杆菌的实验程序都必须在 BSL-2 设施中进行。在进行实验时, 要穿上实验室的大衣和手套。在认证的生物安全柜 (BSC) 工作。对实验台进行70% 乙醇消毒实验。所有接触 (或潜在接触) 肠出血性大肠杆菌的仪器或设备应使用70% 乙醇或漂白剂进行消毒。污染 (或可能污染的) 废物应小心密封和蒸压。如有必要, 戴上口罩、护眼、双手套或连身裤。6周大的 C57BL/6 雌性小鼠在国立成武大学实验动物中心 (NCKU) 购买和维护。动物实验由 NCKU 的机构动物护理和使用委员会批准 (批准号 104-039)。

1. Bioluciferase 标记的大肠杆菌生成

  1. 混合50的脱氧核糖核酸 (脱氧核糖核酸), 1 ul 每10微米向前和反向底漆, 2 ul 2.5 毫米 deoxynucleotides (dNTPs), 2 ul 10x 缓冲器, 0.2 ul DNA 聚合酶, 和无菌的双蒸馏水 (ddH2O) 到最后一卷 20 ul, 以放大抗卡那霉素卡带, nptII基因24。DNA 模板来自 pBSL18024, 它是从国家 BioResource 项目 (NBRP) 购买的。PCR 条件列在表 1中, 并且底漆序列在表 2中可用。
  2. 将 PCR 产品结扎在套件协议之后的商业克隆载体上 (请参见材料表)。
  3. nptII基因片段从克隆向量中的NsiISmaI和克隆复制到 pBBR1MCS4 中, 由NsiIScaI从 pAKlux29中消化, 以创建卡那霉素抗性质粒,pWF27813
  4. luxCDABE操纵从表达质粒9、pAKlux2、 SpeIhfScaI的荧光素酶和克隆到SpeI-hfSmaI中消化 pWF278 生成卡那霉素抗性和荧光素酶表达质粒, pWF27913
    注: 对于质粒提取物和切除片段纯化, 分别采用商业质粒萃取和凝胶萃取试剂盒。为酵素消化, 混合 100 ng 脱氧核糖核酸, 1 ul 10x 缓冲器, 1 ul 每选择的制约酵素和无菌 ddH2O 到总容量 10 ul, 并且孵化在37°c 为 2.5-3 h。
  5. 将 pWF279 质粒转化为大肠杆菌 O157:H7 EDL933 主管细胞, 用2500伏穿孔4毫秒。
  6. 将转化后的细菌细胞在1毫升 Luria Bertani (LB) 培养基中孵育1小时, 37 摄氏度。
  7. 板上的细菌在 LB 琼脂板块补充50µg/毫升卡那霉素在37摄氏度, 16-18 小时。
  8. 第二天, 通过体内成像机检查板的发光信号。选择一个单一的殖民地从板块和文化它在3毫升 LB 补充50µg/毫升卡那霉素在37°c 16-18 h。
  9. 在无菌 ddH2O 中稀释100% 甘油, 制备细菌培养基, 使30% 甘油溶液。
  10. 冷冻卡那霉素耐药性的大肠杆菌O157:H7 EDL933 细菌, 窝藏荧光素酶质粒作为一个细菌库存的螺帽 cryovial 作为1:1 的细菌培养率和30% 甘油溶液-80 摄氏度。甘油的最后浓度是15%。

2. 生物发光大肠杆菌制备口服疫苗

注: 在图 1中介绍了大肠杆菌制备和小鼠口服饲实验程序的时间流程图, 以帮助实验性的准备工作。

  1. 条纹大肠杆菌O157:H7 EDL933 细菌将荧光素酶质粒放到 LB 琼脂板上, 其50µg/毫升卡那霉素从-80 摄氏度的库存。在37摄氏度培养 16-18 小时的细菌。
  2. 选择一个单一的殖民地从隔夜板块和文化在3毫升 LB 培养基与50µg/毫升卡那霉素 16-18 小时在37摄氏度孵化器在 220 rpm。
  3. 亚文化细菌 (1:100 稀释) 到卡那霉素 (50 µg/毫升) 含有 LB 汤 2.5-3 小时在37摄氏度孵化器 200 rpm。(例如, 添加2毫升的夜间培养细菌到200毫升 LB 培养基与卡那霉素 (50 µg/毫升) 补充)。
  4. 孵育 2.5-3 小时的细菌, 并测量 600 nm (OD600) 的光学密度值, 直到该值介于0.9 到1之间。细菌细胞数的密度约为 108菌落形成单位 (CFU)/毫升。
  5. 离心机重新培养的细菌在 8000 x g 30 分钟, 4 摄氏度。
  6. 在不搅动细菌颗粒的情况下去除上清液, 用100毫升0.9% 无菌生理盐水用温和搅拌法清洗颗粒。
  7. 重复步骤2.5 和2.6。
  8. 清洗后, 离心机的细菌培养在 8000 x g 30 分钟, 4 摄氏度, 并轻轻地丢弃上清。
  9. 将颗粒凝结成100倍, 0.9% 无菌生理盐水。例如, 如果200毫升细菌是离心, 添加2毫升正常生理盐水悬浮颗粒。
  10. 确认细菌 CFU (它应该是大约 109 CFU/100 ul 在正常盐水冷凝后) 通过10倍的系列稀释25电镀浓缩细菌。

3. 小鼠口服饲肠出血性大肠杆菌

  1. 用链霉素水 (5 克/升) 治疗6周大的雌性 C57BL/6 小鼠24小时。
  2. 24小时后, 在饲前, 改用普通饮水24小时。用常规水治疗24小时后, 小鼠可以口服饲肠内大肠杆菌。
  3. 通过拉回柱塞, 在注射器中填充 100 ul 肠出血性大肠杆菌。确保注射器内没有气泡。用手指对着注射器取出气泡。
  4. 轻轻举起动物, 小心地放在笼子的顶端。
  5. 小心地抓住老鼠的尾巴, 动物会抓住笼子的顶部, 试图离开。
  6. 用拇指和食指抓住动物颈部和背部松弛的皮肤, 以防止老鼠头部移动, 轻轻地抑制老鼠。
  7. 按住鼠标垂直位置插入饲针, 确保鼠标头固定和垂直。
  8. 将饲针插入嘴后的小鼠嘴里, 向下移动到食道和胃部。
  9. 当插入的针是在鼠标的一半或2/3 长度, 注射 100 ul 大肠杆菌, 其中包含约 109 CFU 细胞。

4. 可视化

  1. 口服饲后, 检测1和2天的发光信号。
  2. 在研究动物的生物发光信号之前, 麻醉将它们放入2.5% 异氟醚的腔内, 1.5 升/分钟氧。
  3. 等待 2-5 分钟, 直到所有老鼠失去知觉, 停止移动。动物已经准备好体内检测生物发光。
  4. 通过体内成像系统检测和成像动物的生物发光信号。请参阅5节 "数据采集" 软件操作。在成像过程中, 所有动物都在持续供应2.5% 异氟醚, 1.5 升/分氧。
    1. 单击 "文件" > "实时", 然后手动将焦点放在鼠标上。
    2. 选择曝光时间和激光强度。
    3. 单击 "获取 > 捕获"。
  5. 对于体外成像, 弄死小鼠颈椎脱位, 并清除感染小鼠的整个肠道. 体内成像系统将肠道置于9厘米培养皿和图像中。该设置与 "体内" 映像相同, 但视图字段设置为-b。有关详细信息, 请参阅5节 "数据获取"。
    注意: 颈椎脱位的方法: 用一只手抓住尾巴, 把笼子顶部的老鼠控制住, 这样动物就能抓住笼子。将标记笔或拇指和第一手指放在头骨底部的颈部后部。用手或物体快速向前推进, 同时抑制头部, 用手握住尾巴向后拉。
    仔细检查以确认呼吸骤停, 没有心跳。

5. 数据采集

注意: 用于数据采集的软件列在材料表中。

  1. 要获取图像, 请打开软件的购置控制面板 (图 2)。
  2. 选择 "发光"、"照片" 和 "叠加"。
  3. 将曝光时间设置为 "自动"。将 Binning 设置为 "介质"。
  4. 设置ƒ/停止为1的发光和8的照片。ƒ/停止控制 CCD 探测器接收的光量。
  5. 根据感兴趣的图像字段设置视图字段。选项 "D" 可以容纳五6周大的老鼠, 并在同一时间图像。"C" 可以在一个领域中想象三6周大的老鼠。
  6. 一旦鼠标/样品准备好成像, 点击 "获取" 图像获取。
  7. 打开已获取的图像数据。
  8. 打开 "工具面板" 面板 (图 3)。
  9. 选择 ROI 工具。我们建议圆圈 (最左边的一个) 来范围在图像上的发光区域 (图 4)。
  10. 单击 "测量 ROIs" (铅笔图标) 以测量表面发光强度 (图 3)。"ROI 度量" 面板和量化值显示 (图 5)。
  11. 使用 "ROI 度量" 面板左上角的 "配置测量" 来选择所需的值/信息 (图 6), 否则单击 "导出" 以导出此数据表并另存为. csv 文件 (图 5)。
  12. 使用列 "总通量 (p/秒)" 的值作为. csv 文件中的发光强度量化。

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Representative Results

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我们通过口服饲对6周大的雌性 C57BL/6 小鼠进行生物发光标记的肠内毒素 (~ 109细菌细胞) 的管理。在1小时内对小鼠进行口服大肠杆菌疫苗接种后, 通过体内成像系统检查动物的荧光信号, 如图 7所示。结果表明, 饲小鼠具有生物发光标记的大肠杆菌的强烈发光信号。我们检查了2天后感染的信号。如图 8A所示, 接种了生物发光标记的野生型大肠杆菌 EDL933 的小鼠在感染后2天内显示出强烈的生物发光信号, 这表明在寄主中的大肠杆菌在2天内被殖民。我们还灌感染的生物发光标记 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD)到鼠标 (图 8A)。这个突变体在脂多糖 (LPS) 中叛逃, 已被证明可以减少在我们以前的研究中宿主的殖民化。如图 8A所示, 在ΔrfaD感染的小鼠中没有检测到发光信号, 这表明在小鼠体内没有或更少的细菌细胞被殖民。荧光信号的量化显示在图 8B中。接下来, 确定了这些生物发光标记细菌的位置。被感染的老鼠被人道地牺牲, 整个肠道都被除去。小鼠肠道2天后感染被放置在9厘米培养皿和映像体 (图 9A)。荧光标记的 EDL933 感染小鼠的肠道组织显示, 盲肠和结肠的生物发光信号显著增加, 这表明这些荧光性大肠杆菌在感染小鼠的盲肠和结肠中被殖民2天, 在最小。相比之下, 感染了生物发光标记的ΔrfaD (图 9A),发现其肠道组织中的发光信号减少, 这与体内图像一致 (图8A).荧光信号的量化显示在图 9B中。

Figure 1
图 1: 时间轴实验准备流程图的.
概述了制备荧光大肠杆菌和预处理小鼠链霉素所需的时间。(A) 出血性大肠杆菌的准备工作。(B) 小鼠制剂。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:体内成像系统采集控制面板.
在成像样品之前, 打开 IVIS 采集控制面板。选择 "发光"、"照片" 和 "叠加"。将曝光时间设置为 "自动"。将 Binning 设置为 "介质"。设置ƒ/停止为1的发光和8的照片。ƒ/停止控制 CCD 探测器接收的光量。一旦样品准备好进行成像, 点击 "获取" 获取图像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:工具面板面板.
在图像获取后, 使用 "工具面板" 面板来量化发光强度。打开 "工具面板" 面板并图像数据。选择一个 ROI 工具来范围的图像上的发光信号。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 用于量化的样本的发光信号.
在 ROI 工具包围的图像上的发光信号区域。这里显示的所有发光信号都在红色圆圈中。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: ROI 度量.
在环绕发光信号并单击 "工具面板" 面板上的 "测量 ROIs" 后, 将显示值。柱总通量值 (p/秒) 用于生物发光强度量化。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 添加不同的量化信息.
通过单击 "ROI 度量" 面板左上角的 "配置测量", 可以选择其他所需的量化值/信息。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 在接种荧光性肠出血后小鼠的代表性图像.
口服饲在1小时内接种荧光性大肠杆菌的小鼠的代表性图像。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 2 天后用生物发光标记的小鼠的图像.
(A) 表示在感染后2天后口服饲的小鼠接种的荧光野型肠内 EDL933 和 EDL933 的图像:ΔrfaD 。(B) 对感染肠出血性大肠杆菌的小鼠的生物发光强度进行量化。误差线指示标准偏差。显示有代表性的图像。所有实验都独立进行了三次, 每次有 2-3 只动物, 误差条表示标准偏差。P 值表示通过 t 检验进行统计分析的结果。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 具有生物发光标记的大肠杆菌的感染小鼠肠道组织的图像.
(A) 接种后2天, 用生物发光标记的大肠杆菌, 小鼠被安乐死, 整个肠道组织被切除并成像体。显示有代表性的图像。(B) 定量测定感染肠出血性大肠杆菌的小鼠肠道组织的生物发光强度。所有实验都独立进行了三次, 每次有 2-3 只动物, 误差条表示标准偏差。P 值表示通过 t 检验进行统计分析的结果。颜色刻度表示亮度 (p/秒/厘米2/sr)。缩放条代表1厘米.请单击此处查看此图的较大版本.

步骤 温度 时间 周期数
初始变性 95°c 10分钟 1
变性 95°c 30秒 35
退火 58.4 °c 30秒
扩展 72°c 1.5 分钟
最终扩展名 72°c 10分钟 1
举行 4°c 1

表 1: 聚合酶链反应 (PCR) 条件

底漆名称 序列
nptII F 5 ' CCTATGCATAATAATTCCGCTAGCTTCACG3 '
nptII 河 5 ' GCTCCACCGATAATATTCCTGAGTCATACT3 '

表 2: 用于放大的底漆序列 nptII

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Discussion

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据报道, 用荧光素酶质粒转化出的肠出血性大肠杆菌已被用于检查其在宿主或基因表达式中的定位在体内8,11,12。在这里展示的小鼠模型也被报道来检测在小鼠宿主8中的肠大肠杆菌的殖民时间和定位。然而, 我们提供了如何管理肠内大肠杆菌疫苗接种小鼠灌的详细协议, 以及如何精心准备口腔饲的生物发光细菌。值得注意的是, 对于小鼠口服饲肠出血性大肠杆菌 (步骤 3.7), 当插入饲针时, 鼠标头的位置至关重要。如果位置不是垂直的, 那将是困难的通过针, 并且它可能伤害老鼠。在步骤3.8 中, 当饲针在老鼠的嘴里时, 舌头会稍微躺在嘴外。如果在将饲针传递到食道时遇到阻力, 请停止向前移动针头并立即将其取出。改变针的位置, 以确保针进入食道。当阻力发生时, 针可能进入气管, 这会导致肺部的细菌注射而不是胃。

绿色荧光蛋白 (GFP) 作为生物传感器在生物学实验中的应用十分普遍。然而, 由于血红蛋白、蛋白质和水的吸收率高出200-650 毫微米 26, 因此不建议使用 GFP 作为记者观察活体动物中的病原体感染/殖民化, 这是因为血红素、蛋白和水分的吸光度率高达约与GFP (励磁480毫微米, 发射510毫微米)27。因此, 使用 GFP 信号作为体内成像的记者, 可被动物的血红蛋白、蛋白质和水所阻断26。近红外线 (近红外) 荧光非常适合体内成像, 因为它的吸光度窗口约为 650-900 nm28, 该区域的血红蛋白最低吸收系数 (< 650 nm) 和水 (> 900 nm)26 ,28 。此外, 当组织吸收光时, 有机会诱发自发荧光。当 GFP 窗口中的激发和发射范围的波长, 它诱导更多的自体荧光比近红外29。通过消除自体荧光背景29, 使用近红外光谱可以改善与 GFP 相比的信噪比。生物发光不需要能量激发来产生可见光。它取决于反应催化基荧光素由它的酵素荧光素酶和产生光。由于生物发光不需要直接在样品上的光, 背景信号从样品是非常低的。因此, 使用生物发光作为一个记者是更普遍和更容易为在体内成像。相比之下, 荧光需要光激发来诱发信号光。当组织吸收光时, 就有可能发出荧光光, 并诱发自体荧光, 使它们的信噪比与生物发光的信号更高。

考虑肠出血性大肠杆菌在小鼠中自然地较少被殖民化的口服感染2,22, 一个自然黏膜病原体, 称为柠檬酸杆菌rodentium, 已被用来研究的殖民机制, 小鼠宿主作为一个代理细菌22,30。肠内大肠杆菌和rodentium都在肠道粘膜上殖民, 并诱发宿主2230中的 A/E 病变的形成。他们也包含李致病性海岛, 编码一个 T3SS 和几个效应蛋白导致的 a/E 损伤22,30。因此, 利用荧光素酶表达质粒作为记者在rodentium中检测定植病理学, 通过体内成像系统研究殖民机制, 也报告了14,15. 然而, 虽然c. rodentium感染小鼠是一个有用的模型来研究 T3SS 的功能和机制的 a/E 病变, C. rodentium不包含志贺毒素 (Stx)30, 这是一个主要的导致肠出血性肾功能衰竭的致病因素, 特别是血清型 O157:H73。尽管最近已构造了一个 Stx 表达式rodentium菌株, 但它对大肠杆菌感染更切合实际, 但不包括其他可能对殖民化和/或感染至关重要的大肠杆菌致病因素.此外, rodentium将其67% 的基因与大肠杆菌病32共享, 这表明在殖民和/或感染期间, 肠出血性大肠杆菌可能使用与C. rodentium不同的毒力。

这里使用的荧光素酶表达质粒, pWF27913, 是从 pAKlux29中修改的, 其主干 pBBR1MCS433。虽然 pBBR1MCS4 已在各种细菌33中进行了测试和复制, 但在使用这种以质粒为基础的荧光素酶系统进行实验之前, 确保该质粒的复制源 (ORI) 适合于细菌宿主是至关重要的,从而证实该荧光素酶表达质粒可以在细菌宿主中复制。我们使用抗生素胁迫来维持细菌质粒的稳定性。当细菌在没有抗生素的情况下进入动物时, 野生型肠出血的生物发光信号至少检测了2天。然而, 我们没有跟踪感染超过2天, 因为我们已经看到了显著的差异, 在发光强度之间的肠出血性大肠杆菌和肠出血rfaD (编码一个基因所需的大肠杆菌合成完整的 LPS) 突变在2天。为了使质粒在细菌缺乏抗生素的情况下稳定地维持, 一种质粒 pCM1710,34可用于此目的。pCM17 对两种质粒分区系统和 segregational 后杀死机制进行编码, 以确保在没有抗生素的情况下在细菌中维持质粒 (10,34)。含有 OmpC 启动子驱动的luxCDABE操纵的质粒 pCM17 可以通过发光信号检测到至少7天的8。在缺乏抗生素的情况下获得连续的生物发光表达细菌的另一种方法是将luxABCDE基因插入细菌染色体35。弗朗西斯et使用座子插入luxABCDE操纵和抗生素盒随机插入到肺炎链球菌的染色体中, 获得生物发光稳定应变35

在我们以前的研究13中, 我们利用这个模型系统来检查宿主中的大肠杆菌的定植, 并比较了大肠杆菌野生型和突变体13的定植能力差异。当小鼠被管理的荧光性大肠杆菌病的rfaD突变体, 生物发光信号显著下降, 与2天后感染后的大肠杆菌。这证明了该小鼠模型可以分析宿主中肠大肠杆菌定植的突变效应。此外, 减少肠病的定植的治疗治疗是一个考虑, 潜在的解决肠出血性大肠杆菌病感染, 因为使用抗生素是禁忌5,36。因此, 有必要检验该模型系统是否可用于研究抗殖民化药物/治疗对宿主肠杆菌定植的有效性。我们相信, 通过使用这个模型系统, 不仅可以检查出血性大肠杆菌的时间和地点, 而且还有其他肠杆菌殖民化体内。利用这种动物模型, 可以对小鼠大肠杆菌的定植过程进行监测, 并对宿主的定植负担进行量化, 以确定活动物肠内大肠杆菌的时空定植。利用该模型对肠杆菌的可视化和量化, 使其成为调查分析 enterobacterial 定植精细机制的重要工具, 从而弥补了殖民研究的不足和提高现有知识。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们从医学研究部、美梅医疗中心 (台湾台南) 等地认识到, 帮助小鼠感染, 以及国立诚武大学实验动物中心的支持。这项工作得到了科技部长 (多数) 赠款 (多数 104-2321-006-019、105-2321-b-006-011、and106-2321-B-006-005) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R bacteria incubation 
Orbital shaking incubator FIRSTEK S300 bacteria incubation 
pBSL180 source of nptII gene
pAKlux2 source of luxCDABE operon
T&A Cloning Kit Yeastern Biotech FYC001-20P use for TA cloning 
Nsi I NEB R0127S use for plasmid cloning 
Sca I NEB R0122S use for plasmid cloning 
Spe I-HF NEB R0133S use for plasmid cloning 
Sma NEB R0141S use for plasmid cloning 
T4 ligase NEB M0202S use for plasmid cloning 
Ex Taq TaKaRa RR001A use for PCR amplification
10X Ex Taq Buffer TaKaRa RR001A use for PCR amplification
dNTP Mixture  TaKaRa RR001A use for PCR amplification
PCR machine applied Biosystem  2720 thermal cycler   for PCR amplification
Glycerol SIGMA G5516-1L use for bacteria stocking solution
NaCl Sigma 31434-5KG-R chemical for making LB medium, 10 g/L
Tryptone CONDA pronadisa Cat 1612.00 chemical for making LB medium, 10 g/L
Yeast Extract powder Affymetrix 23547-1 KG chemical for making LB medium, 5 g/L
Agar CONDA pronadisa Cat 1802.00 chemical for making LB agar
kanamycin  Sigma K4000-5G antibiotics, use for seleciton
streptomycin  Sigma S6501-100G antibiotics, eliminate the microbiota in mice
EDL933 competent cell Homemade method is on supplemental document 
Electroporator MicroPulser for electroporation
Electroporation Cuvettes Gene Pulser/MicroPulser 1652086 for electroporation
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti, J-26S XP use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JA25.5 use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JLA10.5 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Beckman Coulter REF357003 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Thermo Fisher scientific 3141-0500 use for centrifuging bacteria 
eppendorf biophotometer plus  eppendorf AG 22331 hamburg for measuring the OD600 value of bacteria
C57BL/6 mice  Laboratory Animal Center of NCKU
lab coat, gloves for personnel protection 
isoflurane  Panion & BF Biotech Inc. G-8669 for mice anesthesia, pharmaceutical grade
1ml syringe  use for oral gavage of mice
Reusable 22 G ball-tipped feeding needle φ0.9 mm X L 50 mm use for oral gavage of mice
surgical  scissors  use for mice experiment
Xenogen IVIS 200 imaging system Perkin Elmer IVIS spectrum use for bioluminescent image capture 
Living Image Software Perkin Elmer version 4.1 use for quantifying the image data

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References

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非侵入性<em></em> <em>体内</em>生物发光系统检测小鼠宿主肠出血性大肠杆菌的定植
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Kuo, C. J., Wang, S. T., Chen, C. S. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).More

Kuo, C. J., Wang, S. T., Chen, C. S. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).

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