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Immunology and Infection

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

doi: 10.3791/56169 Published: April 9, 2018

Summary

腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC の植民地化の私達の現在の理解を進めることができます。

Abstract

腸管出血性大腸菌(EHEC) o157: h7、これが食中毒病原体、causesdiarrhea、出血性大腸炎 (HS) と溶血性尿毒症症候群 (HUS) は、人間の腸管に植民地化します。EHEC の植民地化、体内の詳細な機構の研究を監視して定量化 EHEC 植民地動物モデルを持つことが不可欠です。ここを監視して生きている宿主の EHEC の植民地化を定量化 EHEC に発光発現プラスミドを変換することによってマウス EHEC 植民地化モデルを紹介します。発光ラベル EHEC を接種した動物と非侵襲的体内イメージング システム検出によるマウスでの強烈な発光信号を示します。1 と 2 日間は、感染症を投稿後発光信号まだ検出感染した動物、EHEC が、少なくとも 2 日間のホストで植民地化を示唆しています。また、これらの発光 EHEC がex vivo画像から具体的に、盲腸および結腸、小腸に検索を示します。このマウス EHEC 植民地化モデルは、EHEC 植民地化メカニズムの現在のナレッジを進めるためのツールとして役立つかもしれない。

Introduction

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EHEC o157: h7 は、汚染された水や食品を介しても急性腎障害4フス3HS2下痢1を引き起こす病原体です。出血性大腸菌病原性 enterobacterium で、人間1の消化管に定着します。EHEC は最初ホストの腸の粘膜上皮に付着するとき、彼らは、アタッチを誘導してその後を強制する (A ・ E) 病変を卑下分子注射器として機能するタイプ III 分泌システム (T3SS) を介して宿主細胞に植民地化の要因を注入します。接着 (植民地化) の5。A/E 病変形成に関与する遺伝子、上皮細胞卑下 (イ) 病原性島5の軌跡によってエンコードされます。

生物発光は光生成の化学反応、どちらのルシフェラーゼの可視光6を生成するその基質ルシフェリンを触媒します。この酵素プロセスよく酸素またはアデノシン三リン酸 (ATP)6の存在が必要です。生物発光イメージング (結合)、生きている動物7で、研究者の可視化およびホスト病原体の相互作用の量子化ことができます。バリは、発光細菌を次に移行し、さまざまな組織7に侵入すると、生きている動物の細菌感染症のサイクルを特徴付けることができます。これは、感染症の動的な進行を明らかにします。さらに、動物の細菌の負荷は、発光信号8; に関連します。したがって、それは単純で直接的な方法で実験動物の病理学の条件を推定するための便利なインジケーターです。

ここで使用されるプラスミドには、ルシフェラーゼ オペロン、 luxCDABE、菌Photorhabdus luminescens独自のルシフェラーゼ基板7,9をエンコードするからであるが含まれています。細菌にこのルシフェラーゼ発現プラスミドを変換することによって植民地化および伝染のプロセスは生きている動物のこれらの発光細菌を観察することによって監視できます。全体的にみて、バリとバクテリアの生物発光ラベルは、細菌数と場所、細菌性抗生物質/療法の治療と感染症/植民地6,における細菌の遺伝子発現を監視する研究者を許可します。7. 感染症の感染サイクルや遺伝子発現を調べるluxCDABEオペロンを発現する多くの病原性細菌が報告されています。尿路大腸菌10EHEC8,11,12,13, 急性胃腸炎起因を含むこれらの細菌エシェリヒア属大腸菌(EPEC)8,シトロバクター属囓14,15, サルモネラ16リステリア菌17Yersinia enterocolitica18,19コレラ20、文書化されています。

いくつかの実験的モデルは、EHEC の植民地化の in vitroin vivo21,22,23の研究を容易にするために開発されています。しかし、EHEC の植民地化は、生体内で、研究に適した動物モデルの欠乏そしてこうして詳細の結果不足があります。EHEC 植民地化メカニズムは、生体内での研究を容易にする、動物を観察し、非侵襲的な方法で生きている動物の EHEC の植民地化を定量化するモデルを構築する貴重なです。

本稿では、生物発光表現するシステムを使用して生きている宿主に時間をかけて EHEC の植民地化を監視するマウス EHEC 植民地化モデルについて説明します。マウスは接種量発光ラベル EHEC とマウスで、非侵襲的生体内でイメージ投射システム13と発光信号が検出されました。2 日後に感染症、それらの細菌は、2 日後に感染後ホストの腸の植民地を提案した後彼らの腸に発光信号を示した発光ラベル EHEC 感染マウス。前のヴィヴォの画像データを示した盲腸と結腸マウスの具体的にこの植民地化であります。このマウス EHEC のモデルを使用して、発光 EHEC の植民地化がは、生体内イメージング システムのさらなる理解を促進する可能性が腸内細菌の植民地化の詳細なメカニズムの研究生活ホストで検出できます。EHEC による生理学的および病理学的変化。

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Protocol

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注意: EHEC o157: h7 はバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) センター疾病管理・予防 (CDC) のバイオ セーフティの命令 (https://www.cdc.gov/) によると病原体。したがって、EHEC を含むすべての実験手順は、BSL 2 施設で実行する必要があります。実験の実行中の白衣、手袋を着用してください。公認バイオ キャビネット (BSC) で動作します。70% のエタノールの実験の手順の前後には、実験ベンチを消毒します。すべての楽器や機器の接触 (または可能性のある連絡先) EHEC が 70% エタノールや漂白剤で消毒すること。汚染された (または汚染された可能性のある) 廃棄物は密封され、オートクレーブを慎重にする必要があります。必要に応じてマスク、目の保護、手袋や、スーツを着用します。6 週齢の c57bl/6 女性マウスが購入し、研究所動物センターの国立チェン イェーテボリ大学) で維持します。動物実験は動物介護機関と使用 NCKU 委員会 (承認番号 104-039) によって承認されました。

1. Bioluciferase ラベル EHEC 菌生成

  1. ミックス 50 ng デオキシリボ核酸 (DNA)、1 μ L 各 10 μ M の前方ゾーンおよび逆引きプライマー、2 μ L 2.5 mM 弱まり (dNTPs)、2 μ L バッファー、0.2 μ L の DNA ポリメラーゼ、および増幅する 20 μ L の最終巻に滅菌ダブル蒸留水 (ddH2O) × 10、反カナマイシン カセット、 nptII遺伝子24。DNA のテンプレートは、pBSL18024, 国立ナショナルバイオ リソース プロジェクト (NBRP) から購入されるからです。PCR の状態は、表 1に示すが、プライマー シーケンステーブル 2で利用可能です。
  2. キットに続く商業クローニング ベクトルに PCR の製品を縛るプロトコル (材料の表を参照してください)。
  3. NsiIおよびSmaIでクローニング ベクトルからnptII遺伝子のフラグメントを消費税し、pBBR1MCS4 は、カナマイシン耐性プラスミドを作成する pAKlux29 NsiIScaIで消化されてのクローンを作成pWF27813
  4. プラスミド9SpeI-HFScaIとクローンでの pAKlux2 を表現するルシフェラーゼluxCDABEオペロンを消費税SpeI HFおよびSmaIにカナマイシンを生成する pWF278 を消化耐性とルシフェラーゼ発現プラスミド pWF27913
    注: プラスミド抽出と摘出フラグメント精製、使用商業プラスミド抽出とゲル抽出キットそれぞれ。酵素の消化力の 100 ng の DNA、1 μ L の 10 x バッファー、各選択した制限酵素および滅菌 ddH2O 10 μ L の総ボリュームの 1 μ L を混合し、2.5-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  5. 4 ms の 2,500 V の電気穿孔法による pWF279 プラスミドを大腸菌o157: h7 EDL933 有能なセルに変換します。
  6. 1 h の 37 ° C で 1 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 培地で変換された細菌の細胞を孵化させなさい。
  7. 16-18 時間 37 ° c カナマイシンの 50 μ g/mL を添加した LB 寒天培地プレート上の細菌をプレートします。
  8. は、生体内イメージング マシン次の日プレートの発光信号を確認してください。プレートから単一コロニーをピックアップし、3 mL 16 18 h の 37 ° C で 50 μ g/mL カナマイシンを添加した LB の文化します。
  9. 希釈することによって細菌のストック メディアの準備滅菌 ddH2O 30% グリセロールの解決をするために 100% グリセリン。
  10. 凍結カナマイシン耐性-80 ° C で細菌文化と 30% グリセロールの解決の 1:1 の比率としてスクリュー キャップ クリオバイアルで細菌の在庫としてルシフェラーゼ プラスミドをかくまっているエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌グリセロールの最終濃度は 15% です。

2. 発光 EHEC 菌経口接種に備えて

注: EHEC の作製とマウス経口実験プロシージャのタイムラインのフローチャートは図 1実験準備を支援するために提示されます。

  1. ストリークエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌-80 ° C 株式からの 50 μ g/mL カナマイシンと LB 寒天培地プレート上にルシフェラーゼ プラスミドをかくまっています。37 ° C で 16-18 h のバクテリアします。
  2. 一晩プレートと 220 rpm で 37 ° C のインキュベーターで 16-18 h の 50 μ g/mL カナマイシンを 3 mL の LB 培地での培養から単一コロニーを拾います。
  3. サブカルチャー流体培養基 LB の 200 rpm で 37 ° C の定温器で 2.5-3 時間を含んでいる (1: 100 希釈) カナマイシン (50 μ g/mL) に細菌。(追加 2 mL 一晩培養カナマイシン (50 μ g/mL) に 200 mL の LB 培菌など)。
  4. 2.5-3 h の細菌をインキュベートし、600 光学密度値を測定値まで nm (外径600) は、0.9 に 1 間。細菌の細胞数は約 108コロニー形成単位 (CFU) の密度で/mL。
  5. 遠心分離機の 4 ° C、30 分間 8,000 x g で再培養細菌
  6. 細菌のペレットを撹拌せず上澄みを廃棄し、穏やかな攪拌で 100 mL 0.9% 滅菌生理食塩水入りの餌を洗浄します。
  7. 2.5 および 2.6 の手順をもう一度繰り返します。
  8. その後、4 ° C、30 分間 8,000 の x g で細菌培養を遠心し、そっと上澄みを廃棄します。
  9. コンデンセート ペレットに 100 0.9% 滅菌生理食塩水入りに。例えば、200 mL の細菌は、遠心分離された場合、は、食塩水 2 mL 通常ペレットを中断するを追加します。
  10. 10 倍連続希釈25まで集中して細菌をメッキすることによって (にすべき約 109 CFU/100 μ 凝縮後食塩) する CFU の菌を確認します。

3. マウス経口 EHEC の

  1. 24 h のためのストレプトマイシン水 (5 g/L) と 6 週齢女性 c57bl/6 マウスを扱います。
  2. 24 h 後強制経口投与の前にさらに 24 時間の定期的な飲料水に切り替えます。24 時間定期的に水で治療、マウス経口 EHEC のため準備が整います。
  3. 100 μ L EHEC 菌で注射器を入力するには、プランジャーを手前に引きます。シリンジ内に気泡がないことを確認します。注射器の指をスナップすることによって泡を削除します。
  4. 動物を慎重に持ち上げ、ケアとケージの上に置きます。
  5. 慎重に、尾をマウスをつかみ、動物がケージの上部のグリップし離れて移動ましょう。
  6. そっと親指と人差し指の移動からマウスの頭を防ぐために動物の前後首のたるんだ皮膚をつかんでマウスを抑制します。
  7. 強制経口投与の針を挿入し、マウスの頭は固定化と垂直に垂直にマウスを保持します。
  8. 口の屋根に続くマウスの口に強制経口投与の針を挿入し、食道、胃へ移動します。
  9. 挿入した針が半分またはマウスの 3 分の 2 の長さの約 10 の9 CFU セルを含む 100 μ L EHEC 菌を注入します。

4. 可視化

  1. 経口投与後 1 ~ 2 日で発光信号を検出します。
  2. 動物の発光信号を調べる前に 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの商工会議所にそれらを置くことによってそれらを麻酔します。
  3. すべてのマウスになる無意識との移動を停止するまで、2-5 分を待ちます。動物は、体内の発光検出のため準備ができています。
  4. 検出し、は、生体内イメージング システム動物の発光信号をイメージします。ソフトウェアの操作のセクション 5「データ取得」を参照してください。イメージング プロセス中にすべての動物が 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの継続的な供給の下で。
    1. ファイルをクリックして > ライブ、および手動でマウスに焦点を当てます。
    2. 露出時間とレーザーの強度を選択します。
    3. 集録をクリック > をキャプチャします。
  5. Ex vivoイメージング、頚部転位によってマウスを安楽死させるし、感染マウスの小腸全体を削除します。生体内イメージング システム 9 cm シャーレとイメージで腸を配置します。設定は、生体内イメージング以外 A/B としてビューのフィールドを設定と同じ詳細については、セクション 5「データ取得」を参照してください。
    注: 頚部転位方法: 動物がケージをグリップできるように片方の手で尻尾をつかんでケージの上にマウスを抑制します。頭蓋底にマーカー ペンまたは親指と首の背部に対してもう一方の手の最初の指を置きます。すぐに頭を抑制しながら手や物体を進めて、尾を持っている手と後方を引き出します。
    呼吸の阻止とハートビートがない確認を念入りにチェックします。

5. データ集録

注: データ集録に使用するソフトウェアは、材料表に表示されます。

  1. 画像を取得する (図 2) ソフトウェアの取得コントロール パネルを開きます。
  2. 選択「発光」「写真」と「オーバーレイ」。
  3. 「自動」と露出時間をを設定します。「中」としてビニング設定します。
  4. 発光と 8 の 1 として ƒ/ストップの設定は写真のため。CCD 検出器によって光量受けた ƒ/停止を制御します。
  5. 画像取得に関心のあるフィールドに基づいてビューのフィールドを設定します。オプション"D"は、5 6 週齢マウスに合うし、すべて一度にそれらをイメージできます。"C"は、1 つのフィールドに 3 つの 6 週齢のマウスを映すことができます。
  6. マウス/サンプルは画像の準備ができましたら、画像の獲得のため「取得」をクリックします。
  7. 取得したイメージ データを開きます。
  8. ツール パレット パネル (図 3) を開きます。
  9. ROI ツールを選択します。画像 (図 4) の発光領域の範囲に円 (最も左のもの) をお勧めします。
  10. (図 3) 表面の発光強度を測定する「測定ロア」(鉛筆のアイコン) をクリックします。ROI 測定パネルと定量値 (図 5) が表示されます。
  11. ROI 測定パネルの左上隅の値/必要な情報 (図 6) を選択し、それ以外の場合このデータ テーブルをエクスポートして .csv ファイル (図 5) として保存する「エクスポート」をクリックして計測器の構成を使用します。
  12. .Csv ファイルの発光強度の定量化として「全光束 (p/s)"列の値を使用します。

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Representative Results

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生物発光ラベル EHEC を投与 (~ 109細菌細胞) 経口投与による 6 週間の古い女性 c57bl/6 マウスに。1 時間以内のマウスに EHEC の経口接種後動物は図 7に示すように、生体内イメージング システムによる発光信号について検討した.結果は、発光ラベル EHEC と強制経口投与マウスにおける強力な発光信号を示した。2 日間ポスト感染上の信号を調べた。図 8 aに示すとおり、マウス接種 2 日後に感染症は、EHEC を 2 日間でホストで植民地化を示唆した後も強烈な発光信号を示した発光ラベル野生型 EHEC EDL933。我々 は量も発光標識マウス (図 8 a) にΔrfaD (ΔrfaD) EDL933 を感染しています。この変異はリポ多糖 (LPS) に亡命した先行研究においてホストの植民地化を減らすために示されています。ΔrfaDで検出された発光信号がない図 8Aのように- 以下の細菌があることを示唆している感染マウス細胞をマウスの植民地化します。蛍光信号の定量化を図 8 bに示します。次に、これらの生物発光標識細菌の場所を求めた。感染したマウスが人道的犠牲になった、彼らの全体の腸が削除されます。マウス 2 日ポスト感染症の腸は、9 cm シャーレに配置され、前のヴィヴォ(図 9 a) イメージします。発光ラベル EDL933 感染マウスの腸組織に盲腸および結腸、これら発光 EHEC が 2 日間の盲腸および感染マウスの結腸で植民地化を示唆する発光信号の大幅な増加が明らかにしました。少なくとも。対照的に、生物発光ラベルΔrfaD , (図 9 a) 明らかに感染マウス減少体内イメージ (図 8 a と一貫性のある彼らの腸のティッシュの生物発光信号).蛍光信号の定量化は、図 9 bに表示されます。

Figure 1
図 1: タイムラインの実験準備フローチャート
タイミングの概要は、EHEC の発光細菌を準備し、ストレプトマイシンとマウスを前処理に必要な。EHEC (A) 準備。(B) マウスの準備。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:生体内でイメージング システムの取得制御パネル
イメージングのサンプル、前に IVIS 取得コントロール パネルを開きます。選択「発光」「写真」と「オーバーレイ」。「自動」と露出時間をを設定します。「中」としてビニング設定します。発光と 8 の 1 として ƒ/ストップの設定は写真のため。CCD 検出器によって光量受けた ƒ/停止を制御します。サンプルは、画像の準備ができて、画像を取得する「取得」をクリックします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:ツール パレット パネル
イメージを取得後に、、発光強度の定量化ツール パレット パネルを使用します。ツール パレット パネルを開き、データをイメージします。画像の発光信号を範囲に ROI ツールのいずれかを選択します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 定量化のためのサンプルから発光信号します
ROI ツールに囲まれたイメージの発光信号領域。ここに示すすべての発光信号が赤い丸で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ROI 測定
発光信号を旋回ツール パレット パネルの「メジャー ・ ロワ」をクリックする値は示すように掲載されています。全光束 (p/s) の列の値は、生物発光強度の定量化のために使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 異なる数量情報を追加します
ROI 測定パネルの左上隅に計測器の構成をクリックして、その他の必要な定量値/情報を選択できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: マウス発光 EHEC 接種後の代表的なイメージです
1 時間以内の経口投与による発光 EHEC 接種マウスの代表的なイメージ。カラー スケールは、ラディエンス (/sr p/s/cm2) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 2 日後発光ラベル EHEC を接種したマウスのイメージ
(A) マウスの表すイメージ接種生物発光の野生型 EHEC EDL933 と EDL933: 後 2 日後に感染症の経口投与によるΔrfaD 。(B) EHEC 感染マウスの発光強度の定量化。エラーバーは標準偏差を示します。代表的な画像が表示されます。すべて実験を行ったない独立して 3 回 2-3 動物とたびに、エラーバーは標準偏差を示します。P 値は、統計分析の結果を示すには、t 検定。カラー スケールは、ラディエンス (/sr p/s/cm2) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: 発光ラベル EHEC 感染マウスの腸組織の画像
(A) 2 日後に接種生物発光標識 EHEC、マウスを安楽死させ、腸の組織が削除され、 ex vivoをイメージします。代表的な画像が表示されます。(B) EHEC 感染マウスから腸のティッシュの生物発光強度の定量化。すべて実験を行ったない独立して 3 回 2-3 動物とたびに、エラーバーは標準偏差を示します。P 値は、統計分析の結果を示すには、t 検定。カラー スケールは、ラディエンス (/sr p/s/cm2) を表します。スケール バーを表す 1 cm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

手順 温度 時間 サイクル数
初期変性 95 ° C 10 分 1
変性 95 ° C 30 秒 35
アニール 58.4 ° C 30 秒
拡張機能 72 ° C 1.5 分
最終的な拡張 72 ° C 10 分 1
ホールド 4 ° C 1

表 1: ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の条件

プライマー名 シーケンス
nptII F 5' CCTATGCATAATAATTCCGCTAGCTTCACG3'
nptII R 5' GCTCCACCGATAATATTCCTGAGTCATACT3'

表 2: プライマー シーケンスを増幅するために使用 nptII

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Discussion

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それは、ホストまたは8,11,12生体内で遺伝子発現の局在を調べる EHEC ルシフェラーゼ プラスミドで形質転換が利用されていることが報告されています。ここに示すマウスモデルは、EHEC の植民地化のタイミングとローカリゼーションのマウス ホスト8検出に報告されています。それにもかかわらず、EHEC 接種マウスの量管理方法と経口用発光細菌を慎重に準備する方法の詳細プロトコルを提供します。特に、EHEC (ステップ 3.7) のマウス経口は強制経口投与針が挿入されるとき、マウスの頭の位置が重要に。位置が垂直、針を通過することは困難であろうし、マウスを傷つけることができる可能性が高い。3.8 の手順で強制経口投与の針はマウスの口の中、舌が横たわった口の外少し食道に強制経口投与針を渡す際に抵抗が発生した場合針を前進を停止し、すぐにそれを撤回します。針が食道に入っていることを確認してくださいに針位置を変更します。抵抗が発生すると、胃ではなく肺に細菌を注入につながる気管に針を入ることができます。

緑色蛍光タンパク質 (GFP) のバイオ センサーとしての応用生物学実験で一般的です。しかし、記者として GFP を使用して水、蛋白質ヘモグロビンの吸光度が高い 200-650 nm26, と重複する間、生体内イメージングによる生きている動物の病原体感染/植民地は推奨されませんを観察するにはGFP (励起 480 nm、発光 510 nm)27。したがって、GFP を用いた生体内イメージングのためのレポーターとして信号中断すること動物26の水、タンパク質、ヘモグロビン。近赤外線 (NIR) 蛍光は生体内イメージングその吸光度ウィンドウ周りだに最適です 650 900 nm28ヘモグロビンの最低の吸収係数の地域である (< 650 nm) と水 (> 900 nm)26 ,28 。また、組織は、光を吸収する、蛍光を誘発する可能性があります。励起と発光の波長範囲 GFP の] ウィンドウでは、NIR29よりもはるかに多くの蛍光が誘導します。近赤外光の使用は、GFP の蛍光背景29を排除することによってバック グラウンド比の信号を向上できます。生物発光は、可視光を生成する励起を必要はありません。それは、酵素ルシフェラーゼによる基質ルシフェリンを触媒し、光を生成する反応に依存します。生物発光では、サンプルに直接光を必要がないので、サンプルからバック グラウンド信号は非常に低いです。したがって、生物発光の記者はより一般的で生体内イメージングのために簡単を使用します。対照的に、蛍光は光励起信号光を誘導する必要があります。組織は、光を吸収し、蛍光灯の光が出力され、その信号にノイズは生物発光のそれに比べて高いので、自発を引き起こすことのチャンスがあります。

マウスのホストとして植民地化機構の研究シトロバクター属囓と呼ばれるマウスの自然な粘膜病原体に利用されている EHEC が自然以下はマウスに経口感染症2,22によって植民地化の検討、菌22,30を代理します。EHEC とC. 囓は腸の粘膜を植民地化し、ホスト22,30A/E 病変の形成を誘導します。イ病原性アイランド、T3SS と A/E 病変22,30を誘導されるいくつかのエフェクター蛋白質を符号化するも含まれます。したがって、プラスミドを表現するC. 囓植民地化病変を検出し、生体内イメージング システムを介して植民地化機構の研究にレポーターもされて、ルシフェラーゼの使用報告14,15. それにもかかわらず、 C. 囓感染マウスの T3SS の関数と A/E 病変のメカニズムを調査するための有用なモデルですが、 C. 囓には含まれていない志賀毒素 (Stx)30、支配的立場であります。EHEC、特に血清型 o157: h73で腎不全を引き起こす病原性因子。Stx を表現するC. 囓ひずみが構築されていますが最近31、EHEC 感染により現実的である、それは含みません植民地化および/または感染に不可欠な他の潜在的な EHEC の病原因子。さらに、 c. 囓EHEC32EHEC が植民地化および/または感染中に病原性c. の齧歯類とは異なるを使用するを示唆しているその遺伝子の 67% と共有します。

PWF27913, ここで使用されるプラスミドを表現するルシフェラーゼは、そのバックボーンは pBBR1MCS433pAKlux29から変更されました。PBBR1MCS4 はテストされ様々 な細菌33でレプリケートされた、それは実験のためこのプラスミドを用いたルシフェラーゼ システムを使用する前にこのプラスミドの複製 (ORI) の起源が細菌のホストに適したことを確認することが重要と従って確認するプラスミドを表現するこのルシフェラーゼが細菌のホストにレプリケートできます。細菌のプラスミドの安定性を維持するために抗生物質のストレスを使用します。細菌は、抗生物質の不在に動物を入力、するとき、少なくとも 2 日間野生型 EHEC の発光信号が検出されました。ただし、我々 は我々 はすでに EHEC WT と EHEC rfaD (つまり EHEC そのまま組合の合成に必要な遺伝子をエンコードされます) の発光強度に大きな違いを見ていたために 2 日間以上感染しなかった 2 日で突然変異体。プラスミッド細菌抗生物質の不在下で安定を維持するためにプラスミッド pCM1710,34は、この目的のため使用できます。pCM17 は、2 プラスミド間仕切りシステムと抗生物質10,34の不在で細菌のプラスミドの維持 post-segregational の殺害のメカニズムをエンコードします。OmpC プロモーターによって駆動luxCDABEオペロンを少なくとも 7 日間8発光信号で検出できるプラスミドの pCM17 含みます。抗生物質の不在で連続発光式細菌を取得する別の方法は、細菌の染色体35luxABCDE遺伝子を挿入することです。フランシス使用トランスポゾンは、ランダムに発光安定した株で35を取得する肺炎球菌の染色体に挿入されるluxABCDEオペロンと抗生物質カセットを挿入されます。

私たち以前研究13ホストの EHEC の植民地化を確認し、EHEC 野生型 (WT) と突然変異体13植民地化能力の差を比較するこのモデル システムを利用しました。マウスが投与された発光 EHEC rfaD変異劇的に減少生物発光信号比較に掲載 2 日後 WT EHEC の感染症。このマウスモデルがホストの EHEC の植民地化の突然変異の影響を分析することの証拠を提供します。さらに、EHEC の植民地化を減らすための治療は、抗生物質の使用は禁忌5,36EHEC 感染に考慮された、潜在的なソリューションです。したがって、それは価値があるテスト ホストの腸内細菌の植民地化に対する反植民地化薬/治療の有効性の検討、このモデル システムを使用できるか。このモデル システムを使用して、それは、タイミングおよび出血性大腸菌だけでなく、他の腸内細菌の植民地化の生体内の位置を確認することが可能と考えています。この動物モデルを用いたマウスにおける EHEC の植民地化のプロセスを監視する、生きている動物の EHEC の空間的で、一時的な植民地化を決定するホストの植民地化の負担を定量化することができます。可視化・定量化モデルを用いて腸内細菌の植民地化の調査および腸内細菌の植民地化の上質のメカニズムを分析し、こうして植民地化研究の欠乏を補うために素晴らしいツールになり、現在の知識を向上させます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 は、マウスに助けを感染と国立成功大学の研究所動物センターからの支援へのチー ・ チャン陳 Chi Mei 医療センター (台湾・台南) 医学研究科を認めます。この作品は科学の大臣によってサポートされ技術 (ほとんど) が CC に (最も 104-2321-B-006-019、105-2321-B-006-011、and106-2321-B-006-005) を付与します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R bacteria incubation 
Orbital shaking incubator FIRSTEK S300 bacteria incubation 
pBSL180 source of nptII gene
pAKlux2 source of luxCDABE operon
T&A Cloning Kit Yeastern Biotech FYC001-20P use for TA cloning 
Nsi I NEB R0127S use for plasmid cloning 
Sca I NEB R0122S use for plasmid cloning 
Spe I-HF NEB R0133S use for plasmid cloning 
Sma NEB R0141S use for plasmid cloning 
T4 ligase NEB M0202S use for plasmid cloning 
Ex Taq TaKaRa RR001A use for PCR amplification
10X Ex Taq Buffer TaKaRa RR001A use for PCR amplification
dNTP Mixture  TaKaRa RR001A use for PCR amplification
PCR machine applied Biosystem  2720 thermal cycler   for PCR amplification
Glycerol SIGMA G5516-1L use for bacteria stocking solution
NaCl Sigma 31434-5KG-R chemical for making LB medium, 10 g/L
Tryptone CONDA pronadisa Cat 1612.00 chemical for making LB medium, 10 g/L
Yeast Extract powder Affymetrix 23547-1 KG chemical for making LB medium, 5 g/L
Agar CONDA pronadisa Cat 1802.00 chemical for making LB agar
kanamycin  Sigma K4000-5G antibiotics, use for seleciton
streptomycin  Sigma S6501-100G antibiotics, eliminate the microbiota in mice
EDL933 competent cell Homemade method is on supplemental document 
Electroporator MicroPulser for electroporation
Electroporation Cuvettes Gene Pulser/MicroPulser 1652086 for electroporation
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti, J-26S XP use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JA25.5 use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JLA10.5 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Beckman Coulter REF357003 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Thermo Fisher scientific 3141-0500 use for centrifuging bacteria 
eppendorf biophotometer plus  eppendorf AG 22331 hamburg for measuring the OD600 value of bacteria
C57BL/6 mice  Laboratory Animal Center of NCKU
lab coat, gloves for personnel protection 
isoflurane  Panion & BF Biotech Inc. G-8669 for mice anesthesia, pharmaceutical grade
1ml syringe  use for oral gavage of mice
Reusable 22 G ball-tipped feeding needle φ0.9 mm X L 50 mm use for oral gavage of mice
surgical  scissors  use for mice experiment
Xenogen IVIS 200 imaging system Perkin Elmer IVIS spectrum use for bioluminescent image capture 
Living Image Software Perkin Elmer version 4.1 use for quantifying the image data

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References

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非侵襲<em>体内</em>生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性<em>大腸菌</em>の植民地化の検出
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Kuo, C. J., Wang, S. T., Chen, C. S. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).More

Kuo, C. J., Wang, S. T., Chen, C. S. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).

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