Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for å effektivt utlede og kultur pluripotent stilk cellelinjer fra mouse embryoer på blastocysten scenen.
Abstract
Mus embryonale stamcelleforskningen (mESC) avledning er prosessen som pluripotent cellelinjer er etablert fra preimplantation embryo. Disse linjene beholde evnen til selv-fornye eller skille ved bestemte betingelser. På grunn av disse egenskapene, mESC er et nyttig verktøy i regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier. Denne artikkelen beskriver en enkel protokoll for å få mESC linjer med høy avledning effektivitet (60-80%) av dyrking blastocysts fra ettergivende musen stammer på materen celler i definerte medium med leukemi hemmende faktor. Protokollen kan også brukes til å effektivt avledet mESC linjer fra uten tillatelse musen stammer, med enkle tillegg av en cocktail av to små molekyl hemmere til avledning medium (2i medium). Detaljerte prosedyrer på forberedelse og kultur av materen celler, innsamling og kultur av mouse embryoer, og avledning og kultur mESC linjer er gitt. Denne protokollen krever ikke spesialisert utstyr og kan utføres i et laboratorium med grunnleggende pattedyr celle kultur kompetanse.
Introduction
Embryonale stamceller (ESC) er pluripotent celler avledet fra preimplantation embryo, som beholde evnen til selv-fornye eller skille under bestemte forhold1. Basert på disse egenskapene, ESC har blitt et nyttig verktøy for regenerativ medisin, sykdom modellering og vev tekniske studier2.
ESC var avledet for første gang fra preimplantation mouse embryoer, stammer mus ESC (mESC) linjer med lav suksess3,4. I år forble avledning effektiviteten lave på grunn av vanskelighetene ved å opprettholde pluripotency i vitro. Dessuten tilstedeværelsen av materen celler5, som bedre avledning effektivitet, fremme kolonien vedlegg, og forbedre karyotypic stabilitet6, flere modifikasjoner av protokollen føre til en forbedring i pluripotency vedlikehold. Det viktigste var tillegg av leukemi hemmende faktor (LIF) mESC kultur medium7,8, bruk av embryoer fra 129S2 ettergivende bakgrunn9 og kultur mESC med medium med definert serum, gratis potensielle differensiering faktorer10. Flere nylig, overbevisende bevis har vist at tillegg av en cocktail av to små molekyl modulatorer av signalveier til mESC kultur medium (kjent som 2i) er best å opprettholde pluripotency. 2i cocktail består av en kombinasjon av den MEK inhibitor PD0325901, noe som reduserer differensiering signaler ved å hemme mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) veien, og den GSK3β inhibitor CHIR99021, som forbedrer celle overlevelse på lav tetthet ved å aktivere Wnt veien11.
I denne artikkel beskriver vi en enkel protokoll for effektivt utlede mESC linjer fra mus blastocysts. Vi følger standard prosedyrer, dyrking embryoer fra ettergivende stammer på materen celler i avledning medium supplert med LIF og en serum erstatning12. Etter denne protokollen, mESC linjer kan avledes med effektivitet tilsvarende de innhentet i 2i medium. Til tross for dette, kan 2i legges for å unngå mulige problemer med pluripotency vedlikehold eller når du arbeider med uten tillatelse stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av dyrene beskrevet i delene nedenfor er godkjent av den etiske komiteen på dyr og menneske forskning av Universitat Autònoma de Barcelona og Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jeg Alimentació av Generalitat de Catalunya (protocol #8741).
1. mater celle inaktivering og lagring
Merk: Human foreskin fibroblaster (HFF-1) var tidligere frosset i 1 mL av frysing løsning med 90% fosterets Bovine Serum (FBS) og 10% dimethyl sulfoxide ( DMSO) og lagret i flytende nitrogen før bruk.
- Tine kryogene ampuller med HFF-1 (1 mL) ved immersing ampullen i en 37 ° C vannbad.
- Legge til tinte innholdet av kryogene ampullen i forvarmes Dulbecco ' s endret Eagle ' s Medium (DMEM) med 10% FBS å gjøre en 1:10 fortynning.
- Frø utvannet cellene (10 mL) i en MT75 bolle og kultur dem på 37 ° C og 5% CO 2.
- Neste dag, endre medium å eliminere DMSO restene. Fjern mediet og tilsett 10 mL forvarmes DMEM med 10% FBS.
- Kultur i HFFs og endre mediet hver 48t til kultur når confluent scenen. Dette kan ta ca 7-10 dager.
- å forberede inaktivering løsningen, fortynne mitomycin C i DMEM med 10% FBS i en siste konsentrasjon av 10 µg/mL. Inkuber cellene med inaktivering løsningen for 3 h 37 ° C og 5% CO 2.
- Fjerne inaktivering løsningen og skyll cellene tre ganger med 2 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS) å eliminere mitomycin C restene.
- For å koble deaktivert cellene, Legg 1 mL av forvarmes Trypsin-EDTA løsning og ruge i 5 min på 37 ° C og 5% CO 2.
- Observere cellene under en invertert mikroskop for å sikre de frittstående (10 x objektiv med 0,3 numeriske aperture eller NA). Hvis de ikke, ruge dem for et par minutter på 37 ° C og 5% CO 2. Når cellene igjen under invertert mikroskopet.
- Pipetter løsningen med en Pasteur pipette for å distansere celle klumper.
- Nøytralisere enzymatisk løsningen ved å legge 4 mL av DMEM med 10% FBS og resuspend.
- Tar en aliquot av cellen suspensjon og gjøre en 1: 100 fortynning i HBSS. For å bestemme antall celler, laste 10 µL av fortynning i en Neubauer ' s kammer. Telle celler i en av de store torgene i kammeret under en invertert mikroskop (20 x mål med en 0,45 NA).
- Gjenta telling i totalt fire store ruter. Beregne totalt antall celler (N) n = gjennomsnittlig antall celler som telles x totalvolum x fortynning x 10 4.
- Sentrifuge resten av utvalget for 5 min på 200 x g. Forkast nedbryting og resuspend pellets med frysing løsning i en konsentrasjon av 10 6 celler per mL.
- Aliquot suspensjonen i Kryogenisk ampuller med 10 6 celler (1 mL) hver. Plasser kryogene ampullene i en fryser beholder og fryse på-80 ° C.
- Neste dag, lagre kryogene ampullene i flytende nitrogen.
2. Mater cellekultur
- en til fire dager før avledning prosessen, tine kryogene ampuller som inneholder 1 x 10 6 inaktivert HFF-1 celler i et vannbad på 37 ° C.
- Gjør en 1:6 fortynning av tinte HFF-1 i pre varmet DMEM med 10% FBS og holde temperaturen på 37 ° C.
- Fyll hver brønn av en 4-vel plate med 500 µL av forvarmes 0,2% fra svin huden og holde platen på 37 ° C i 10 minutter
- Fjerner den 500 µL av fra brønnene og legge 500 µL av HFFs fortynning. Forsiktig rock platen for å sikre en jevn fordeling av HFFs på bunnen av brønnene. Unngå sirkulære bevegelser, ellers cellene vil konsentrere seg i sentrum av brønnen.
- Ruge platen minst 24 timer på 37 ° C og 5% CO 2 å få en monolayer av deaktivert HFFs i hver brønn.
- Neste dag, observere cellene under en invertert mikroskop (10 X objektiv med 0,3 NA) og sjekke at de er tilknyttet og homogent distribuert. Endre medium for å eliminere DMSO restene. Fjerne mediet og legge til 500 µL av forvarmes DMEM med 10% FBS.
3. Fosteret samling og kultur
- fire dager før embryoet samling, administrere 5 IE gravid mare ' s serum gonadotropin ved intraperitoneal injeksjon til 6-12 uke gamle kvinnelige mus.
Merk: Vi har brukt kvinner fra 129S2 eller B6CFAF1 stammer, selv om kvinner fra andre mus stammer kan brukes. Likevel, når arbeider med kvinner fra ikke-ettergivende stammer (f.eks CBA) medium bør suppleres med 2i som nevnt i trinn 4.2. - Etter 48 h, administrere 5 IE humant choriongonadotropin ved intraperitoneal injeksjon og kompis kvinner med hanndyr, i minst 8 uker gamle, på en 1:1 ratio. Skille kvinner fra menn morgendagen.
- Dagen før embryoet samling, forbereder en 35 mm cellekultur Petriskål med flere 40 µL dråper KSOMaag medium med 4 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA) og fyll tallerkenen med mineralolje å fullt ut dekke dråper. Inkuber retten på 37 ° C og 5% CO 2 å equilibrate mediet.
- å forberede embryoet manipulasjon Pipetter, varme den tynnere delen av en lang-tipped glass Pasteur pipette bruker en Bunsen-brenner. Når myk, trekke det fra flammen og dra de to endene fra hverandre. Bryte det til ønsket lengde. Den indre diameteren på spissen bør være 100-150 µm.
- Euthanize kvinnelige musene av cervical forvridning 45-48 h innlegg-coitum (PC).
- Dissekere mus for å avsløre bukhulen ved å kutte huden med buet glatt skarp saks og peritoneum med rett skarp saks. Ta en livmor med tang kuttet oviduct med rett skarp saks og plasserer den i Hepes-bufret CZB medium (HCZB) 13 på 37 ° C. Gjenta prosessen for å fjerne andre oviduct.
- Flush oviducts med en 1 mL sprøyte lastet med HCZB holdt på plass av urmaker tang samle 2-celle embryoer.
Merk: For å forberede rødme nål ta en 30 G sprøyte nål, kutt slutten og bakken til en butt tupp på en slipende stein. - Bruker munnen pipette apparatet, plukke opp embryoene, vaske dem i HCZB og kultur dem i tidligere utarbeidet embryoet kultur retten på 37 ° C og 5% CO 2 til blastocysten scenen. Opptil 50 embryo kan være dyrket i hver 40 µL dråpe. Overvåke embryo utvikling hver 24 h under en stereomicroscope.
Merk: Alternativt embryo kan samles på blastocysten scenen å forkorte i vitro embryoet kultur. I dette tilfellet euthanize kvinner på dag 3.5-4.5 PC, dissekere livmoren. og skylle den med HCZB.
4. Stamcelle avledning
- utarbeidelse av avledning platene
- ved embryoet seeding, forberede avledning medium ved supplere DMEM medium med 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 x ikke-essensielle aminosyrer , 20% av serum erstatning og 10 3 U/mL LIF.
- Eventuelt også legge 1 µM av MEK hemmer PD0325901 og 3 µM av GSK3 hemmer CHIR99021 å få en 2i medium.
- Ta 4-vel platen med monolayer av deaktivert HFFs (trinn 2.6) fra den inkubator. Fjerner mediet og legge 800 µL av forvarmes avledning medium i hver brønn. Returnere platen til inkubator.
- Zona pellucida fjerning og embryo seeding
- forberede en 35 mm cellekultur Petriskål med tre 30 µL dråper Sure Tyrode ' s løsning 14 og tre 30 µL dråper avledning medium. Dekke dråper med mineralolje og holde parabolen på 37 ° C.
- Ta fosteret kultur parabol settefiskanlegg. Én overføre blastocysts kultur dråper til en syrlig Tyrode ' s løsning slipp ved hjelp en embryoet manipulasjon pipette. Hvis mulig, velger du bare de utvidede blastocysts systemfeilkoden avledning.
- Overvåke zona pellucida fordøyelsen under stereomicroscope. Så snart den zona pellucida forsvinner, overføre blastocysten til en avledning middels slipp for å vaske ut den sure Tyrode ' s løsning.
- Ta 4-vel avledning platen fra inkubatoren og frø en zona-fri blastocysten på materen celler i hver brønn.
- Tilbake 4-vel avledning platen til inkubator og kultur på 37 ° C og 5% CO 2.
- Overvåking stamcelleforskningen vekst og medium endre
- overvåke kulturer hver 24 h under en invertert mikroskop (20 X objektiv med 0,45 NA). Det er viktig å merke seg om det er tegn på stamcelleforskningen differensiering, for eksempel hovne refraktiv celler rundt resultatet eller selv skyve materen celler side.
- Annenhver dag, endre mediet av kulturen. Ta 4-vel platen settefiskanlegg, fjerne mediet fra hver brønn og legge 800 µL av forvarmes avledning medium supplert med LIF og 2i, hvis brukt. Opprettholde kulturen til utvekster er observert (6-8 dager).
5. Stem cellekultur og vedlikehold
- forberede Kolle-lignende håndtak og stamcelleforskningen manipulasjon pipetter. Følg trinn 3.4 å forberede stamcelleforskningen manipulasjon Pipetter med en diameter på spissen av 250-300 µm. Bruk den andre delen av den trakk Pasteur pipette for å forberede Kolle-lignende håndtaket. Varme og forme den til å få en krok.
- Ta 4-vel kultur plate ut av inkubatoren og finne resultatet under en stereomicroscope. Bruke håndtaket til å skyve unna differensierte celler og matere som omgir resultatet.
Merk: For å unngå eventuelle differensiering av resultatet, er det viktig å fjerne alle differensierte celler fra kanten av resultatet. - Sug opp resultatet med en stilk cellen manipulasjon pipette og plasserer den i en ny rett i en 50 µL trypsin-EDTA dråpe.
- Bruker en skalpell for å kutte resultatet i flere deler for å disaggregate det både mekanisk og enzymatisk.
- Straks, overføre utvekst fragmenter til en frisk dråpe avledning medium å nøytralisere trypsin handling.
- Overføre utvekst fragmenter til en ny 4-vel plate med en monolayer av feeders. Overføre opptil 10 fragmenter per brønn og kultur dem med avledning medium på 37 ° C og 5% CO 2.
- Opprettholde stilk cellen som kulturer i minst seks uker før mESC linjen etablert. Endre mediet annenhver dag og subkultur dem en gang i uken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen, over 95% av utvekst formasjon skal oppnås etter den første uken av kultur (figur 1A). Etablering av mESC linjer etter seks passasjer er variabel blant eksperimentelle gjentak, med en gjennomsnittlig suksess på 60-80%. Tillegg av 2i vesentlig forbedrer ikke resultatet når du arbeider med ettergivende musen stammer, som dem med 129S2 bakgrunn, men det er nødvendig når du arbeider med uten tillatelse stammer.
Musen ESC kolonier skal presentere en vanlig morfologi med en flat form og definerte kanter når kultivert uten behandling (figur 1B-C) eller kultivert med 2i (figur 1 d). Kolonier presentere perifere differensiering tegn skal forkastes (figur 1E-F). Hvis avledning effektiviteten oppnås er lavere enn forventede verdier, kontrollere veksten av mESC kolonier og subkultur dem mer ofte for å unngå overvekst, da dette kan føre til celledød og ville fremme differensiering (figur 1G-H).
Figur 1 : Representant bilder mESC kolonier i kultur. (A) utvekst avledet fra en blastocyst etter den første uken av kultur (B, C) flere mESC kolonier ved passering 10 presentere definerte kanter og en flat figur. (D) koloniene fra mESC linjer behandlet med 2i. (E, F) Eksempler på semi differensiert mESC kolonier presentere perifere differensiering tegn (markert med stiplet ellipser). (G, H) Eksempler på gjengrodde mESC kolonier presentere en dårlig morfologi og differensiering tegn. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å kontrollere stemness antatte mESC linjer innhentet etter seks uker med kultur, bør tilstedeværelse av markører for pluripotency og differensiering vurderes. MESC linjene skal være positivt for pluripotency markører som Oct4 og Sox2 (figur 2 A-B). Videre etter innledningen av spontane differensiering ved dyrking cellene i 10 dager uten mater celler i DMEM med 10% FBS, mESC linjer er forventet å være positivt for ektoderm markør β-tubulin klasse III (Tuj1) (figur 2C), mesoderm markør α-glatt utgangen (αSMA) (figur 2D) og endoderm markøren Alpha-Fetoprotein (AFP) (figur 2E). Bare linjene positivt for fem markører vurdert skal anses ekte mESC linjer for og dermed brukes for beregning av avledning effektiviteten. Vanligvis tilsvarer dette nesten alle mESC linjene generert ved hjelp av nåværende protokollen.
Figur 2 : Representative immunofluorescence mot markører for pluripotency og differensiering. mESC kolonier uttrykke (A) Oct4 (grønn) (B) og Sox2 (rød). Differensiert mESC kolonier uttrykke (C) Tuj1 (grønn), (D) αSMA (grønn) og (E) AFP (grønn). Alle bilder er radioaktivt materiale counterstained med Hoeschst (blå). Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om mESC linje avledning er en velkjent prosedyre rutinemessig brukes i mange laboratorier, er effektiviteten ikke alltid så høyt som forventet på grunn av flere faktorer som kan forstyrre pluripotency vedlikehold. I denne artikkel vise vi, trinn for trinn, hvordan å etablere mESC linjer med høy effektivitet bruker en enkel og pålitelig protokoll. Disse effektivitet er lik de som er rapportert i litteraturen.
For å sikre maksimal effektivitet, er det viktig å kontrollere cellene daglig eller hver andre dag, siden punktene angitt er bare veiledende. Det er viktig å unngå overvekst av kolonier, siden dette fremmer celledød og differensiering. Det er også viktig å redusere så mye som mulig eksponering for koloniene trypsin-EDTA under deres subkultur, fordi dette kan også redusere celle levedyktighet.
En annen viktig faktor er kilden til materen celler og deres kultur. Flere studier har vist at HFF, mus embryonale fibroblaster (MEF) og mus STO fibroblaster er like i stand til å støtte ESC avledning og kultur15. Imidlertid er HFF opp to ganger mer slitesterke enn MEF og STO i kultur16, mer tid for mESC å vokse. Dermed unngår bruk av HFF ekstra mESC subkulturer.
Hvis avledning effektiviteten oppnås er lavere enn resultatene rapportert, er det viktig å nøye sjekke alle komponentene i avledning medium, spesielt serum erstatning. Ulike grupper av serum erstatning kan resultere i betydelige forskjeller i avledning effektivitet17,18. Derfor må hver ny bunke testes før bruk.
Det er viktig å påpeke at genetisk bakgrunn av embryo brukes som en kilde til mESC avledning kan også påvirke avledning effektiviteten. Faktisk er musen stammer klassifisert i ettergivende stammer (som 129S2 og C57BL6) og uten tillatelse belastninger (CBA, NOD og FVB) i henhold til deres evne til å gi mESC linjer under standard betingelser9,19. Protokollen rapporterte her kan med hell brukes embryoer fra begge typer stammer som 2i cocktail er inkludert i avledning medium når du arbeider med embryoer fra uten tillatelse stammer. 2i mediet er kjøpedyktig modulerer signalnettverk mønsteret mESC linjer å opprettholde pluripotency, uavhengig av genetisk bakgrunn6. Hovedbegrensningen er at, på grunn av sterk signalnettverk mønsteret ervervet under kultur20, mESC linjer kulturperler på 2i bli resistente mot differensiering. For å overkomme denne begrensningen, bør mESC linjer kultivert uten 2i for minst én gang før induksjon av differensiering å svekke signalene ervervet.
Samlet kan dette arbeidet lette praksisen med mESC avledning av viser trinnene som enkelt som mulig og peker på de viktigste problemene og hvor å overvinne dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jonatan Lucas for hans teknisk assistanse med mater cellekultur, Servei Estabulari de la UAB for dyr omsorg og Domènec Martín for innspilling av video. Dette arbeidet har vært støttet av Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R og Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC er begunstiget av en PIF-UAB fellesskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
