Summary
Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.
Abstract
Fare embriyonik kök hücre (mESC) türetme tarafından hangi pluripotent Preimplantasyon embriyoların hücre hatları kurulur işlemidir. Bu satırları yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar altında ayırt etmek için korur. Bu özellikleri nedeniyle, mESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları yararlı bir araç vardır. Bu makalede mESC hatları yüksek türetme verimliliği (% 60-80) ile elde etmek için basit bir protokol blastokistlerin keyfi fare suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan tanımlanmış orta lösemi inhibitör faktörü ile takıma gelen Kültür tarafından açıklanır. Protokol Ayrıca verimli bir şekilde mESC satırları keyfi fare suşları türetmek için iki küçük molekül inhibitörleri türetme orta (2i orta) bir kokteyl basit eklenmesiyle uygulanabilir. Hazırlık ve besleyici hücreler, toplama ve fare embriyolar ve türetme kültür ve kültür mESC satırlarının kültür üzerinde ayrıntılı yordamlar sağlanmaktadır. Bu iletişim kuralı özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir laboratuvar temel memeli hücre kültür uzmanlığı ile yapılabilir.
Introduction
Embriyonik kök hücreleri (ESC) yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar1altında ayırt etmek için korumak Preimplantasyon embriyo elde pluripotent hücreler vardır. Bu özelliklere dayalı, ESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları2için yararlı bir araç olmuştur.
ESC den türemiş olan ilk kez fare ESC (mESC) hatları düşük başarı3,4ile kaynaklanan Preimplantasyon fare embriyo. Yıllardır, türetme verimliliği pluripotency içinde vitromuhafaza zorluğu nedeniyle düşük kaldı. Ayrıca türetme verimliliği artırmak, besleyici hücreler5' varlığı koloni eki tanıtmak ve karyotip istikrar6, birçok değişikliği bir iyileşme pluripotency bakım iletişim kuralı müşteri adayının geliştirmek. MESC kültür orta7,8, embriyo 129S2 keyfi arka plan9 kullanımı için en önemli yanı sıra, lösemi inhibitör faktörü (LIF) vardı ve mESC ile takıma orta ile Kültür tanımlanan serum, potansiyel farklılaşma ücretsiz10faktörler. Daha yakın zamanlarda, kanıt zorlayıcı bir kokteyl mESC kültür (2i da bilinir) orta sinyal yollar iki küçük molekül modülatörler ilavesi pluripotency korumak en iyi olduğunu göstermiştir. MEK inhibitörü farklılaşma sinyalleri mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) yolu engelleyerek azaltır, PD0325901 ve GSK3β inhibitörü hücre sağkalım, düşük yoğunluklu geliştirir CHIR99021 2i kokteyl oluşur Wnt yolu11etkinleştirerek.
Bugünkü yazıda, verimli bir şekilde mESC satırları fare blastokistlerin türetmek için basit bir protokol açıklar. Standart prosedürler, keyfi suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan türetme orta LIF ve serum yerine12ile gelen embriyo kültürü takip ediyoruz. Bu iletişim kuralı, mESC çizgileri takip verimliliği 2i ortamda elde edilen eşdeğer ile elde edilebilir. Buna rağmen 2i sigara keyfi suşları ile çalışırken pluripotency bakım veya olası sorunlardan kaçınmak için eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hayvanlar kullanımı etik Komite, hayvan ve insan araştırma Universitat Autònoma de Barcelona ve Departament d tarafından onaylanıp ' tarımsal, Ramaderia, Pesco ben Alimentació Generalitat de Catalunya (iletişim kuralı #8741).
1. Besleyici hücre Inactivation ve depolama
Not: insan sünnet derisi fibroblastlar (HFF-1) daha önce dondurulmuş dondurma çözüm oluşan % 90'ı Fetal sığır Serum (FBS) ve % 10 Dimetil sülfoksit (1 mL DMSO) ve sıvı azot kadar kullanmak saklı.
- 37 ° C su banyosu şişede çeker tarafından HFF-1 (1 mL) kriyojenik bir şişe çözülme.
- Kriyojenik şişeyi çözdürülen içeriğini eklemek için Önceden ısıtılmış Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM) % 10 ile desteklenmiş bir 1:10 yapmak FBS seyreltme.
- Bir T75 şişesi seyreltilmiş hücreleri (10 mL) tohum ve 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de kültür.
- Ertesi gün DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için orta değiştirin. Orta kaldırmak ve 10 mL % 10 ile desteklenmiş Önceden ısıtılmış DMEM ekleyin FBS.
- HFFs kültür ve kültür Konfluent sahne ulaşıncaya kadar her 48 h orta değiştirin. Bu yaklaşık 7-10 gün sürebilir.
- İnactivation çözüm hazırlamak, mitomycin C DMEM % 10 ile desteklenmiş sulandırmak için 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon, FBS. 37 ° C ve % 5 CO 2 3 h için inactivation çözüm hücrelerle kuluçkaya.
- İnactivation çözümü kaldırmak ve 2 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (mitomycin C kalıntıları ortadan kaldırmak için HBSS) üç kez hücrelerle durulayın.
- Inaktif hücreleri ayırmak için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO 2 5 min için kuluçkaya.
- Gözlemlemek müstakil olduklarından emin olmak için ters bir mikroskop altında hücreler (0.3 sayısal diyafram veya NA ile 10 x amaç). Eğer değillerse, onları birkaç dakika 37 ° C ve % 5 CO 2 için kuluçkaya. Yine ters mikroskop altında hücreleri denetleyin.
- Hücre kümeleri ayırmak için bir Pasteur pipet ile çözüm pipette.
- %10 FBS ve resuspend ile DMEM 4 mL ekleyerek enzimatik solüsyona nötralize.
- Bir aliquot hücre süspansiyon take ve HBSS içinde 1: 100 seyreltme. Hücre sayısını belirlemek için bir Neubauer seyreltme 10 µL yük ' s odası. Bir büyük kareler Odası (20 x amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında yer alan hücreleri saymak.
- Tekrar dört büyük kareler toplamda sayma. N (N) hücrelerinin sayısı toplam hesaplamak hücreleri ortalama sayısı = toplam hacim seyreltme x 10 4 x x sayılan.
- 200 x g. atma, 5 min için örnek kalan süpernatant santrifüj kapasitesi ve çözüm mL başına 10 6 hücre bir konsantrasyon, dondurma ile Pelet resuspend.
- Aliquot 10 6 hücre (1 mL) ile kriyojenik şişeleri süspansiyon. Kriyojenik şişeleri bir dondurucu kapsayıcısına getirin ve-80 dondurma ° C.
- Ertesi gün, kriyojenik şişeleri sıvı azot depolamak.
2. Besleyici hücre kültür
- 1-4 gün türetme işlemine başlamadan önce tezcan 1 x 10 6 içeren bir kriyojenik şişe su banyosu 37 hücrelerde HFF-1 inaktive olur ° C.
- 1:6 seyreltme çözdürülen HFF-1'in önceden %10 FBS ve tutmak sıcaklığı 37 ile takıma DMEM sıcak yapmak ° C.
- Her şey bir 4-şey plaka 500 µL Önceden ısıtılmış % 0,2 jelatin domuz deri ile doldurmak ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de plaka tutmak
- Jelatin 500 µL kuyulardan kaldırın ve HFFs seyreltme 500 µL ekleyin. Yavaşça HFFs kuyu dibinde bir tekdüze dağılım sağlamak için plaka rock. Dairesel hareketleri önlemek, aksi takdirde hücreleri iyi merkezinde odaklanacaktır.
- En az 24 saat her iyi Inaktif HFFs monolayer elde etmek için 37 ° C ve % 5 CO 2 s plaka kuluçkaya.
- Ertesi gün (10 X amacı ile 0.3 NA) ters bir mikroskop altında hücreler gözlemlemek ve bağlı ve homojen dağıtılmış kontrol edin. Orta DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için değiştirin. Orta kaldırın ve Önceden ısıtılmış DMEM % 10 ile desteklenmiş 500 µL ekleyin FBS.
3. Embriyo toplama ve kültür
- dört gün öncesine embriyo koleksiyonu, yönetmek hamile kısrak 5 IU ' s serum gonadotropin 6-12 hafta yaşlı kadın farelere mayi enjeksiyonla.
Not: diğer fare suşları kadın-ebilmek var olmak kullanılmış olsa biz 129S2 veya B6CFAF1 suşları, kadın kullandık. Yine de, ne zaman sigara keyfi suşları (örneğin CBA), kadın ile orta çalışma takıma 2i ile adım 4.2 belirtildiği gibi. - Sonra 48 h, insan Korionik gonadotropin 5 IU mayi enjeksiyonu ile yönetmek ve kadın erkek, en az 8 haftalık bir 1:1 oranında, dostum. Dişiler erkeklerin ertesi gün ayırın.
- Embriyo koleksiyonu, önceki gün 35-mm hücre kültürü Petri kabına KSOMaag orta sığır Serum Albumin (BSA) 4 mg/mL ile desteklenmiş çeşitli 40 µL damlaları ile hazırlamak ve plaka tamamen damla kapsayacak şekilde mineral yağ ile doldurun. Orta equilibrate için 37 ° C ve % 5 CO 2 çanak kuluçkaya.
- Embriyo manipülasyon Pipetler, hazırlamak için ısı uzun uçlu cam Pasteur pipet Bunsen burner kullanarak ince parçası. Yumuşak bir kez alev geri çekilin ve iki ucu ayır. İstenilen uzunlukta kesin. İç çapı uç-meli var olmak 100-150 µm.
- Servikal çıkığı 45-48 h mesaj coitum tarafından (PC) kadın fareler ötenazi.
- Eğri pürüzsüz keskin makas ile cilt ve karın zarını düz keskin makas ile kesme ile karın boşluğu ortaya çıkarmak için fareler incelemek. Bir rahim Forseps ile kapmak, düz keskin makas kullanarak ovidukt keser ve CZB Hepes tampon orta (HCZB) 13 37 yerleştirir ° C. diğer ovidukt kaldırmak için yineleme işleminin.
- Oviducts 1 mL şırınga ile yüklenen HCZB ile flush 2 hücreli embriyo toplamak için saatçi forseps tarafından yerinde düzenlenen.
Not: 30 G Hipodermik İğne reçeteye göre sarf iğne almak hazırlamak için sonunda kesti ve zemin bir Zımpara taşı künt bir ipucu için. - Embriyo çekme ağzını pipet aparatı kullanıyorsanız, içinde HCZB yıkama onları ve onları önceden hazırlanmış embriyo kültür tabağına 37 ° C ve % 5 CO 2 blastosist aşaması kadar kültür. En fazla 50 embriyolar her 40 µL düşüş kültürlü olabilir. İzlemek embriyo gelişimi her 24 saat bir stereomicroscope altında.
Not: Alternatif olarak, embriyoların blastosist aşamada vitro embriyo kültürü kısaltmak için toplanabilir. Bu durumda, dişiler gün 3.5-4.5 p.c. ötenazi, rahim incelemek. ve HCZB ile flush.
4. Kök hücre elde edilmesini
- hazırlık türetme plakaların
- embriyo tohum, gün hazırlamak türetme orta DMEM orta 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 ile ilave tarafından x sigara-esansiyel Amino asitler , serum değiştirme ve 10 %20 3 U/mL LIF.
- İsterseniz, ayrıca MEK inhibitörü PD0325901 1 µM ve 3 öneki GSK3 inhibitörü CHIR99021 2i orta elde etmek için µM.
- 4-şey plaka Inaktif HFFs (Adım 2.6) monolayer ile al kuluçka makinesi. Orta kaldırın ve her şey için Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL ekleyin. Plaka da kuluçka için iade.
- Zona pelusida kaldırma ve tohum embriyo
- bir 35 mm hücre kültürü Petri kabına asit Tyrode üç 30 µL damla ile hazırlamak ' s çözüm 14 ve türetme orta üç 30 µL damla. Damla mineral yağ ile kapak ve 37, çanak tutmak ° C.
- Embriyo kültürü bulaşık kuluçka makinesi alın. Birer birer, bir asit Tyrode kültür damla blastokistlerin transfer ' s çözüm açılan bir embriyo manipülasyon pipet kullanarak. Mümkünse, yalnızca genişletilmiş blastokistlerin türetme işlemini başlatmak için seçin.
- Monitör zona pelusida sindirim stereomicroscope altında. En kısa zamanda zona pelusida kaybolur, blastosist asit Tyrode yıkamak için bir türetme orta damla transfer ' s çözüm.
- Kuluçka ve tohum bir zona ücretsiz blastosist Besleyici üzerinde 4-şey türetme plaka hücreleri her kuyuya atın.
- Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür 37 ° C ve % 5 CO 2 4-şey türetme plaka dönmek.
- İzleme kök hücre büyüme ve orta değiştirmek
- kültürler her 24 h (20 X amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında izlemek. Kök hücre farklılaşması, akıbet çevreleyen veya bile besleyici hücreler bir kenara iterek şişmiş refraktif hücreleri gibi belirtileri olup olmadığını unutmamak gerekir.
- Her gün, kültür ortamı değiştirin. 4-şey plaka kuluçka, orta her kuyudan çıkarmak alıp LIF ve 2i, Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL kullandıysanız ekleyin. Outgrowths (6-8 gün) gözlenir kadar kültürü korumak.
5. Kök hücre kültür ve bakım
- hazırla Kolle benzeri kolları ve kök hücre manipülasyon Pipetler. Takip adım kök hücre manipülasyon Pipetler ucundaki 250-300 µm. bir iç çapı ile hazırlamak için 3,4 Kolle benzeri tanıtıcı hazırlamak için çekti Pasteur pipet diğer parçası kullanın. Isı ve bir kanca almak kadar şekil.
- 4-şey kültür plaka kuluçka makinesi dışarı almak ve bir stereomicroscope altında çıkıntı bulun. Farklılaşmış hücreler ve akıbet çevreleyen besleyiciler uzaklaştırmak için tutamacını kullanın.
Not: nihai sonucu farklılaşma önlemek için akıbet kenarından farklılaştırılmış hücrelerin tümünü kaldırmak öenmlidir. - Yapılan bir kök hücre manipülasyon pipet ile Aspire edin ve yeni bir tabak içinde 50 µL tripsin-EDTA damla yerleştirebilirsiniz.
- Mekanik ve enzimatik disaggregate için çeşitli yerlerinde yapılan kesmek için bir neşter kullanın.
- Hemen, akıbet parçaları türetme orta tripsin eylem nötralize etmek için taze bir damla transfer.
- Çıkıntı parçaları besleyiciler monolayer ile yeni bir 4-şey plaka aktarın. İyi başına en çok 10 parça aktarmak ve onları türetme orta 37 ° C ve % 5 CO 2 ile kültür.
- Kurulan mESC satırı düşünmeden önce en az altı hafta için kök hücre benzeri kültürleri korumak. Her gün ve alt kültür orta değiştirmek onları haftada bir kez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı üzerinde kültür (şekil 1A) ilk hafta sonra sonucu oluşumu % 95'i elde edilmelidir. Altı pasajlar sonra mESC satırlarının kurulması arasında deneysel çoğaltır, % 60-80 ortalama bir başarı ile değişkendir. 2i eklenmesi önemli ölçüde sonuçları 129S2 arka plan olanlar gibi keyfi fare suşları ile çalışırken yükseltmek değil ama sigara keyfi suşları ile çalışırken gereklidir.
Fare ESC kolonileri normal morfoloji düz bir şekliyle mevcut olmalıdır ve ne zaman (şekil 1B-C) tedavi olmadan kültürlü kenarları tanımlanan veya 2i ile kültürlü (şekil 1 d). Koloniler sunan çevresel farklılaşma işaret olmalıdır (şekil 1E-F) atılır. Elde edilen türetme verimliliği beklenen değerler düşüktür, mESC kolonileri ve alt kültür hücre ölümüne neden olabilir ve farklılaşma (şekil 1G-H) tanıtmak bu kez aşırı büyüme, önlemek için onları kontrol.
Resim 1 : Kültür mESC koloninin temsilcisi görüntüler. (A)yapılan ilk haftası kültür sonra (B, C) birkaç mESC colonies adlı geçit 10 sunan tanımlı kenarları ve düz bir şekil bir blastosist türetilmiş. (D) koloniler mESC hatlardan 2i ile tedavi. (E, F) Periferik farklılaşma işaretleri (Kesikli elips ile işaretli) sunan yarı farklılaşmış mESC kolonileri örnekleri. (G, H) Kötü morfoloji ve farklılaşma işaretleri sunulması büyümüş mESC kolonileri örnekleri. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Kültür altı hafta sonra elde edilen sözde mESC satırları stemness doğrulamak için Nanog ve ayırt etme belirteçleri varlığı tespit edilebilir. MESC satırları pluripotency işaretleri Oct4 ve Sox2 gibi pozitif olmalıdır (Şekil 2 A-B). Ayrıca, sonra indüksiyon hücrelerin % 10 ile desteklenmiş DMEM hücrelerde besleyici olmadan 10 gün boyunca kültür tarafından kendiliğinden farklılaşma FBS, mESC hatları ektoderm marker β-tübülin Sınıf III (Tuj1) için pozitif olması bekleniyor (şekil 2C), mesoderm marker α-düz kas aktin (αSMA) (şekil 2B) ve endoderm işaret Alpha-Fetoprotein (AFP) (şekil 2E). Yalnızca satırları değerlendirildi beş işaretçileri için olumlu gerçek mESC satırları olarak kabul ve böylece türetme verimlilik hesaplanması için kullanılan. Genellikle, bu mevcut iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan hemen hemen tüm mESC satırlarına karşılık gelir.
Resim 2 : Pluripotent ve ayırt etme belirteçleri karşı temsilcisi ayirt. mESC koloniler (B)(a)Oct4 (yeşil) ifade ve Sox2 (kırmızı). (C) Tuj1 (yeşil), (D) αSMA (yeşil) ve (E) AFP (yeşil) ifade mESC kolonileri farklı. Tüm görüntüleri nükleer malzeme Hoeschst (mavi) ile counterstained. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MESC satır türetme rutin olarak birçok laboratuvarlarda kullanılan iyi bilinen bir işlem olmakla birlikte, verimlilik her zaman pluripotency bakım rahatsız edemez Multipl faktörler nedeniyle beklendiği gibi yüksek değil. Mevcut makalede biz, adım adım, basit ve güvenilir bir iletişim kuralı kullanılarak yüksek verimliliği ile mESC satırları oluşturmak nasıl gösterir. Bu verimliliği literatürde bildirilen benzer.
Maksimum verimliliği sağlamak için hücreleri her gün kontrol etmek önemli ya da her geçen gün, zamanından beri belirtilen sadece açıklayıcı noktalarıdır. Bu hücre ölümü ve farklılaşma teşvik beri koloniler, büyüme önlemek için önemlidir. Bu da hücre canlılığı azaltabilir çünkü Ayrıca kendi alt kültür sırasında koloniler maruz tripsin-EDTA mümkün olduğu kadar azaltmak önemlidir.
Diğer önemli faktör besleyici hücreler kaynağıdır ve kültürlerini olmasıdır. Çeşitli çalışmalarda HFF, fare embriyonik fibroblastlar (MEF) ve fare STO fibroblastlar ESC türetme ve kültür15desteklemek aynı derecede mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, HFF vardır kültür16, MEF ve Tanrı'nın askerleri daha iki kat daha fazla dayanıklı kadar büyümeye mESC için daha fazla zaman tanıyacaktır. Böylece, ilave mESC altkültürler HFF kullanımını önler.
Elde edilen türetme verimliliği bildirdi Sonuçlar düşüktür, dikkatle tüm bileşenler türetme orta, özellikle serum yedek kontrol etmek önemlidir. Serum değiştirme farklı toplu işlemleri türetme verimliliği17,18önemli farklılıklar neden olabilir. Bu nedenle, her yeni toplu iş iş onun kullanılmadan önce test edilmelidir.
MESC türetme için bir kaynak türetme verimliliği de önemli ölçüde etkileyebilir gibi kullanılan embriyoların genetik arka işaret etmek önemlidir. Gerçekten de, fare suşları keyfi suşları (örneğin, 129S2 ve C57BL6) ve mESC çizgiler'in altında standart koşullar9,19verim yeteneğini göre (örneğin, CBA, NOD ve FVB) sigara keyfi suşları içine sınıflandırılmış. Kokteyl 2i türetme ortamda sigara keyfi suşları gelen embriyo ile çalışırken dahil olduğu sürece burada rapor iletişim kuralı başarıyla embriyolar için her iki farklı suşları arasında uygulanabilir. 2i orta pluripotency, bağımsız olarak genetik arka plan6sürdürmek için mESC satırlarının sinyal desen modüle yapabiliyor. Ana sınırlama, kültür20sırasında mESC hatları farklılaşma için dayanıklı hale 2i içinde kültürlü elde güçlü sinyal desen kaynaklanmaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için mESC çizgiler olmadan önce alınan sinyal zayıflamaya farklılaşma indüksiyon en az bir geçiş için 2i kültürlü.
Genel olarak, bu iş sadece mümkün ve ana zorluklar ve nasıl bunların üstesinden işaret olarak olarak adımları göstererek mESC türetme pratiği dindirebilirim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Jonatan Lucas besleyici hücre kültürü, Servei Estabulari de la UAB hayvan bakımı için ve Domènec video kayıt için Martín ile onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser "gayri resmi" de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R ve Generalitat de tarafından desteklenen Catalunya 2014 SGR-524. MVC PIF-UAB bursu yararlanıcı olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes - Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes - Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
- Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
- Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
- Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
- Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
- Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
- Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
- Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
- Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).
