Summary
פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.
Abstract
פיתוח מערכת העצבים כרוכה בביצוע סידרת אירועים שפעילותם מתואמת על ידי מספר איתות המסלולים, רשתות בקרה רגולטריות רציפים. רבים מן החלבונים המעורבים המסלולים הללו אבולוציונית נשמרים בין יונקים אחרים פרוקריוטים, כגון זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, רומז כי עקרונות ארגון דומה קיים במהלך הפיתוח של אלה אורגניזמים. חשוב לציין, דרוזופילה שימש בהרחבה כדי לזהות מנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תהליכים הנדרשים אצל יונקים לרבות נוירוג'נסיס, בידול, הדרכה עצב synaptogenesis. זבובים שימשו גם בהצלחה לדגם מגוון רחב של מחלות התפתחותיות אנושי. כאן נתאר פרוטוקול עבור microdissection שלב אחר שלב, קיבוע, לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך המוח דרוזופילה למבוגרים. פרוטוקול זה מתמקד שתי האוכלוסיות עצביים דוגמה, הגוף פטריות נוירונים, photoreceptors ברשתית, וכוללת שלבים אופציונליים כדי לעקוב אחר נוירונים בודדים הגוף פטריות באמצעות ניתוח פסיפס עם טכניקה סמן תא Repressible (MARCM). נתונים לדוגמה המוח פראי-סוג והן מוטציה מוצגים עם תיאור קצר של קריטריון הבקיע עבור הדרכה עצב פגמים. פרוטוקול זה מדגיש שני נוגדנים ומבוססת על חקירת המורפולוגיה של הגוף פטריות ואילו נוירונים קולט אור, אחרים אזורים במוח דרוזופילה , הלוקליזציה של חלבונים בתוך אזורים אחרים במוח יכול להיות גם חקר באמצעות פרוטוקול זה.
Introduction
מערכת העצבים דרוזופילה אמנם קטן יותר מזה של בני אדם, מכרסמים, המורכבות שלה מספק מודל חזק, נגיש כדי להבין טוב יותר את עמיתיהם חוליות. במקרים רבים, הגנום של חולייתנים וזבובים לקודד חלבונים דומים מאוד המכתיבים את מנגנוני התפתחות מערכת העצבים. למעשה, רבים של הגנים הדרושים להתפתחות העצבית גולגולת יש orthologs בזבובים, כולל אלה מעורבים איתות המסלולים את השליטה המתבנת, נוירוג'נסיס ו הדרכה עצב1,2,3 4, ,5. לדוגמה, netrin היא ליגנד הנדרש להדרכה עצב יונקים ו melanogaster ד6,7,8. בעוד netrin הופרדה במקור רקמת המוח צ'יק עובריים6, מחקרים מאוחרים יותר גילו ש-netrin הזה משחק תפקיד שנשמרת במהלך הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית עובריים (CNS) דרוזופילה8. מחקרים אחרים השתמשו מסכי גנטית עובריים דרוזופילה CNS כדי לזהות קולטנים הדרושים עבור pathfinding גם דרוזופילה וגם בעלי חוליות9של ליגנדים שנשמרת.
בעוד הזבוב עובריים CNS שימש בהרחבה בעבר כדי לזהות ליגנדים קולטנים, חלבוני איתות תאיים הדרושים עבור הדרכה עצב8,9, עבודה האחרונות חקרה את הדרכים, אשר של חלבונים אלה גם לשלוט pathfinding החלטות במהלך בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. באופן ספציפי, חקירה של הגוף פטריות (MB) ופיתוח נוירון קולט אור ברשתית (איור 1) סיפקה תובנה המנגנון הזה pathfinding שליטה, היווצרות סינפסה, גיזום האקסון, מספר היבטים אחרים של עצביים פיתוח10,11,12,13,14,15,16,17. קולט אור נוירונים להתחבר הרשתית לעוף לאזורים במוח למבוגרים שנקרא הנדן, לשד הם קריטיים עבור מסירת מידע חזותי למוח (נבדקה על ידי18,19), בעוד הגוף פטריות הנוירונים הם מרכזי ממוקם במוח לעוף, נדרשים עבור20,של למידה וזיכרון -21. נוירונים קולט אור והן את הנוירונים מהותי של הגופים פטריות, המכונים תאים קניון, לנצל מנגנוני שנשמרת אבולוציונית diffusible תלויי-הקשר עצב והדרכה כדי למצוא את המטרות הפוסט-סינפטית. בנוסף להיותו גלוי הזבוב הבוגר, קולט אור, נוירונים MB גם להיות ישירות visualized הזחלים, גלמי עם נוגדנים או כתב גנים22,23,24,25. היכולת בקלות לדמיין אלו שתי קבוצות של נוירונים בנקודות זמן שונות התפתחותית קידם את השימוש בהם כמו דגמים מעולים עבור היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.
בנוסף נעשה שימוש כמודל להבין את המנגנונים של התפתחות מערכת העצבים נורמלי, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי זבובים יכול לשמש גם מודלים מדויק של מגוון רחב של מחלות האדם, לרבות שביר X תסמונת (FXS)26 , נכות אינטלקטואלית (ID)27,28,29,30,31, ואחרים32. לדוגמה, כדי ללמוד את הפונקציה מולקולרית של ZC3H14, גן לאחרונה לקשר אנושי מוגבלות שכלית, יצרנו מודל לעוף של מזהה משתמש של אלל null של הזבוב ZC3H14 ortholog, שנקרא Nab230. זבובים חסר Nab2 יש ליקויי הזיכרון חמורה, מורחב poly(A) זנבות, recapitulating מה נצפית בחולים אנושיים או החולה נגזר תא קווים33,34. חשוב לציין, זבובים חסר Nab2 גם להציג מוחית חמורה מורפולוגיה פגמים שלהם גופות פטריות למבוגרים34, הדומה תצפית בזבובים חסר הגן תסמונת FXS, FMR135. לפיכך, זבובים יכול לשמש אורגניזם מודל חשוב ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם מחלות לשבש את זה.
לבסוף, הנגישות של תפוקה גבוהה שיטות לעקוב אחר התנהגות, בשילוב עם המערך העצום של כלים גנטיים זמין, להפוך דרוזופילה אורגניזם מודל של בחירה עבור זיהוי האזורים במוח השולטים התנהגויות מורכבות, כגון למידה, זיכרון, שינה, חיזור, הצמא ואחרים36,-37,-38,-39. כלי שימושי במיוחד נמצא במרכז של גנטיקאי לעוף "ארגז הכלים" היא מערכת GAL4/UAS (איור 2). זו מערכת40,41 משתמש ביטוי ספציפי רקמות activator תעתיק Gal4 כדי להגדיל את הביטוי של גנים או transgenes במורד הזרם של במעלה הפעלת רצף (UAS). שינויים של מערכת זו מאפשרת לחוקרים, לדוגמה, הבקרה בדיוק את דעתנית של נוירונים ספציפיים42,43, overexpress או דפיקה למטה גנים ספציפיים של עניין44, 45, לנתח את הדינמיקה ויווסידן בזמן אמת46ו אקספרס גנים כתב לסימון שושלות עצביים41. השילוב של מערכת GAL4/UAS עם רקומבינציה mitotic אפשרו גם את היצירה של הניתוח פסיפס עם12,מערכת סמן תא Repressible (MARCM)47. MARCM כבר בשימוש נרחב נוירון בודד העקיבה כדי לזהות את מרכיבי התא איתות הדרושים עבור הדרכה עצב12,47. למרות אלה וטכניקות אחרות סיפק מספר תובנות על המנגנונים הסלולר הנדרשות לתפקוד מערכת העצבים, דורשות המוח דרוזופילה קודם להיות שפרופסור; הסרת זהיר של המוח הוא נדרש לשמור תבניות מורפולוגיה וחיבור מוח הנכון בין אזורי המוח. להלן כללי התנהגות משתמש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות כמודוגמה אוכלוסיות עצביים כמו זה מנחה אותך דרך הקרע, המוח דרוזופילה immunofluorescent מכתים של מבוגר.
Protocol
1. גנטיקה דרוזופילה melanogaster ונהלים הלם אופציונליות חום
- פעם זבובים כבר חצו, F1 רומא נמצאו, להשיג נקבות או זכרים של גנוטיפ המתאים. תלוי באזור המוח נחקר, זבובים צריך להיות שנאספו מדי יום, המופרדים סקס כך תלויי-גיל ו/או מינית dimorphic דפוסי חיבוריות במוח ניתן להבחין בקלות רבה יותר.
הערה: אופציונלי: אם זבובים משמשות לניתוח פסיפס עם 12 , ניתוח סמן תא Repressible (MARCM) 47, העוברים, הזחלים, או הגלמים צריך להיות המום ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות על חום זירוז mitotic רקומבינציה. על מנת למקד אזורים ספציפיים של הגופים פטריות לניתוח MARCM, הלם חום צריך להיות מתוזמן בהתאם ללוח הזמנים שנקבע על-ידי 12, שמתואר באיור 5 ב'. אם משתמש MARCM כדי לחקור אזורים במוח הגופים פטריות, טייס הניסויים צריכה להתבצע כדי לקבוע את השלב אופטימלית להיות בהלם-חום. בעוד הפעולות הבאות נכתבות לענין eclosed טס, הזכרים המבוגרים יכולים גם ניסויים באמצעות השלבים הבאים לאחר המקרה הגולמי הוסר.
2. דיסקציה תחנת ההכנה
- עמדה stereomicroscope ואת אור מקור עם מצורף סיבים אופטיים goosenecks על benchtop גדול. כדי לקדם את תנועות יד יציבה ולהפחית את היד " לנער " תוך כדי לנתח, זה חיוני כי שטח מנוחה נאותה של היד והזרוע זמין סביב המיקרוסקופ. ודא שיש כ 8-10 ס מ מכל צד של המיקרוסקופ ו 4-6 ס מ בין הבסיס של מיקרוסקופ קצה הספסל.
- מילוי 2 או 3 בארות של כוס תבשיל טוב 9 או 3-ובכן עם 1.0 מ"ל של מאגר ניידת (0.1 M מאגר סודיום פוספט pH 7.2, 0.1% חומרים פעילי שטח nonionic, ראה טבלת חומרים עבור רכיבי מאגר שלם) ומניחים ליד תחנת ויבתר על קרח. המוח ביתור החדש להעביר את המאכל הזה ומאוחסנים עד שלב קיבוע.
- הערה: אם דרושה דימות בשידור חי, דיסקציה המאגר צריך להיות 1 x מאגר פוספט Buffered מלוחים (PBS) או HL3 48. אם חלבונים תאיים לוקליזציה נדרשת, PBS יכול גם לשמש מאגר חלופי עבור ניתוח של קיבוע. בעקבות קיבעון, permeabilization של קרום התא ואז לבצע שימוש שוטף ניידת המכילה אבקת nonionic 0.1% או 0.3%-
- אם PBS משמש עבור ניתוח של קיבוע, פיפטה טיפים צריך להיות שטופים לפחות פעם אחת עם מאגר המכיל חומרי ניקוי (כגון ניידת) כדי למנוע את המוח נשאר עם העצות פיפטה פלסטיק במהלך העברת צינורות microcentrifuge.
- באמצעות ריקה 35 מ מ זכוכית או פלסטיק פטרי, לבנות תבשיל שיש דיסקציה של אלסטומר סיליקון. בקצרה, לערבב את הרכיבים elastomer לפי היצרן ' s כיוונים, שופכים לתוך מנות 35 מ מ, ולתת לזה פולימריזציה בן לילה על משטח שטוח. אלסטומר המכיל מנות לנתיחה אמור לשמש כדי להגן על קצות בסדר לנתח מלקחיים, אשר יכול בקלות להיות פגום, אם נוצר קשר בין המלחציים משטח קשה יותר, כגון צלחת זכוכית. אנחנו באופן קבוע גם לרכוש כלים זמינים מסחרית סיליקון מצופה קמעונאים מקוונים. כדי להגדיל את החדות במהלך ניתוח, סיליקון elastomer לנתיחה הכלים המכיל פחם מוחלש (, ובכך בצבע שחור) הם שימושיים במיוחד.
3. הליך ניתוח מוח למבוגרים
- Anesthetize 3-5 ימים הישן למבוגרים melanogaster ד עם CO 2 או באמצעות קרח. אם משתמש קרח, המקום מונעת המבחנה המכילה זבובים הפוך (סיום הכנס למטה) לתוך דלי קרח עבור ~ 5 דק. הצבת את המבחנה לתוך הקרח הפוך טסה להיות תקוע על האוכל. ברגע שיש כבר מורדם זבובים, במקום הזבובים על ישיבה pad או צלחת פטרי מתכת קר קרח או על CO 2 פליטת פד לעוף. אם לנתח את המוח כדי לנתח הקשורים ניוון מוחיים, זבובים בוגרים עשוי לשמש גם.
- מקום כמות קטנה (150-200 µL) ניידת במרכז המנה לנתיחה באמצעות פיפטה העברה או פיפטה p200 ליצור " בועה " של ניידת. המנה לנתיחה תחת stereomicroscope המקום, להתאים את התאורה ולהתמקד כך הבועה של ניידת ממלא את שדה הראיה, הוא מואר בצורה אחידה.
- לתפעל זבובים כך הם " בטן למעלה " (כלומר, הצד הבטני למעלה) בשכיבה על המתכת או CO 2 pad.
- באמצעות זוג מלקחיים #5, תופסים את הבטן של זבוב כדי ניסויים, שמירה על החסימה של הזבוב, לגמרי להתמזג זה ניידת על המנה לנתיחה.
הערה: עבור השארית של הפרוטוקול, כל השלבים צריכה להתבצע בעוד הראש שקוע בתוך ניידת. - באמצעות זוג מלקחיים #5 השני, הבסיס של החדק לטוס ומשוך את שני זוגות מלקחיים בנפרד כדי לנתק את הראש לטוס מן הגוף. למחוק את החזה והבטן. במהלך שלב זה, זה קריטי כי הראש לא שוחרר, מותר לצוף על פני השטח של ניידת. ברגע בראש הוא צף, זה יכול להיות קשה מאוד לתפוס שוב ללא ריסוק המוח.
הערה: באמצעות שיטה זו, הן ניתקה את הקשרים בין המוח ואת חוט עצבי הגחון. אם שלמות הקשרים בין אזורים אלה של מערכת העצבים נדרשות, פרוטוקול לנתיחה חלופיים, כגון 49 , 50, צריכה להיות מלווה. אם החדק מתנתק מהראש לעוף לפני אלה. הראש נערף, יהיה חור איפה היה החדק. במקרה זה, לתפוס את הראש לטוס בקצה הבור ליד עין אחת. ואז להסיר את הראש באמצעות כמות מתונה של כוח תוך משיכת שני זוגות של מלקחיים מלבד אחד לשני. לעיתים, כאשר הראש מוסר מן הגוף, השרידים חוט עצבי במעיים ו/או הגחון המונחות על ראשו ויש להסירם לפני שתמשיך את הקרע. - בעוד זוג מלקחיים אוחז החדק, הזוג השני עליכם לתפוס את הקצה המדיאלי של העין נכון לטוס. . לאט, משוך המלקחיים מלבד אחד לשני. שלב זה יש לבצע עם כמות קטנה של כוח לרוחב קבוע. המלקחיים עובר לאט מלבד אחד לשני, החדק צריך לעזוב הראש, ליצור חור במרכז הקוטיקולה ראש. למחוק את החדק עם זוג מלקחיים הראשונה מבלי לשחרר את החלק המדיאלי של העין הימנית של הזוג השני-
הערה: המבוגר melanogaster ד המוח נמצא סימטרית (קרי, את ישבנה/אחורי) אזור הראש לטוס. לפיכך, אוחז באותו האזור של הראש יש להימנע. באופן אידיאלי, רק rostral (דהיינו, קבלה) החלק של הראש ליד הרשתית המדיאלי צריך להתפס ישירות על ידי המלקחיים. המוח ואת קנה הנשימה המשויך אמורים להיות גלויים כעת דרך הפתח המרכזי הקוטיקולה. בשלב זה, כל החוטים חוטי לבן של קנה הנשימה המגיחה מתוך החור ניתן להסיר, שנזרקו. - עם הזוג השני של מלקחיים, לתפוס את הקצה המדיאלי של הרשתית השמאלית (בקצה של החור המרכזי הקוטיקולה ראש). כדי להסיר את הרשתיות לציפורן משויך, לאט לאט למשוך המלקחיים אחד מהשני בזווית של 180 מעלות. כפי הרשתית dissociates מן האונה הראייה הבסיסית, אתה צריך להרגיש ירידה קלה ברמת המתח. להתקדם באיטיות כדי למנוע קורע האונה אופטיים.
הערה: הפרדת המלקחיים מהר מדי במהלך שלב זה עלול להניב קריעת thהאונה אופטיים e או שיבוש מבנה גופם פטריות. מדי פעם, הקוטיקולה יוסר אך חתיכות של הרשתית יישארו מחוברים האונה אופטיים. אם הדמיה הגופים פטריות, זה לא לגמרי הכרחי להסיר את הרשתית כולו. עם זאת, ניתוח של אזורים במוח אחרים (כגון תא עצב ברשתית העצבוב של האונות במוח אופטיים) עשוי לדרוש הרשתית יוסרו לחלוטין כפי שתואר על ידי 48 , 51.
הערה: כפי הרשתית לאט מופרדת מן האונה הראייה הבסיסית של המוח, האונה אופטיים צריך להיות נצפות כמו מבנה לבן אטום מכוסה לבן, בכיפות קנה הנשימה. ברגע הרשתית הוסר, זה יכול להיות מושלך. בעת ניתוח pathfinding של הנוירונים ברשתית, צריך לקחת טיפול מסוים במהלך שלב זה כדי למנוע נזק האונה אופטיים. בפרוטוקול נוסף התמקד לנתיחה, הדמיה חיה של הנוירונים קולט אור הוא גם זמין 48. - עכשיו, הסר בזהירות כמו הרבה של קנה הנשימה גלוי ככל האפשר. קנה הנשימה שכבר מכילים או מאוחר יותר למלא את האוויר הקפוא, המוח לצוף, באופן פוטנציאלי, ללכת לאיבוד במהלך השלבים immunostaining מאוחר יותר. כדי להסיר את קנה הנשימה, לבחור זה המוח באמצעות זוג מלקחיים #5 חדים מאוד.
- להסיר את הנותרים רשתית שמסביב לציפורן באמצעות שני זוגות של מלקחיים כדי לתפוס את האזור המדיאלי של הרשתית לטוס שמאלה. בזהירות דמעה הרשתית לשניים כדי להסיר חתיכות של הרשתית, לציפורן. במקרים מסוימים, הסרת את הקוטיקולה שנותרו ללא ריסוק המוח מוכיח מאתגר במיוחד. במקרים אלה, מצאנו כי החוטים הנותרים של חוט עצבי הגחון יכולים במקום זאת להתפס על ידי זוג מלקחיים בעוד אחרים זוג מלקחיים משמש להסרת בקפידה האחרון הקוטיקולה.
- באמצעות פיפטה p200, לעבור המוח ביתור אחד טוב של המנה 9 או 3-ובכן המכיל ניידת. המוח של גנוטיפ באותה צריך להיות איחדו יחד באותה טוב ושמר על קרח. רקמת המוח להיות קבועה בתוך שעה אחת של ניתוח. המוח יכול להיות קבוע בקבוצות קטנות, איחדו אם מספר גדול יותר של המוח נדרשת. במרבית המקרים, חוקר מנוסה יכול בדרך כלל לנתח מוח ולהעביר אותו לצלחת אוסף זכוכית כ 3-5 דקות
4. קיבוע וההליך מכתים Immunofluorescent
- באמצעות פיפטה p200, להעביר המוח גזור מן המנה 9-ובכן צינור microcentrifuge 0.5 mL מלא 0.5 מ של 4% paraformaldehyde מעורבבת עם ניידת. ניתן לשלב לפחות 10-15 השכל. גנוטיפ אותו לתוך שפופרת microcentrifuge אחת. כל השלבים הנותרים (עד הרכבה של המוח על גבי שקופיות) הושלמו צינורות microcentrifuge 0.5 ml-
התראה: Paraformaldehyde (PFA) צריך להיות מטופל בשכונה fume. פסולת כדורגלן צריך תישמר ולא נפטרים מהם כהלכה. 20% paraformaldehyde נרכשו זכוכית ampules יכול להיות aliquoted לתוך צינורות microcentrifuge ומאוחסן ב-20 ° C עד הצורך. - בתוך ברדס fume, דגירה המוח ב- 4% paraformaldehyde עבור 20 דקות במהירות איטית נדנדה בטמפרטורת החדר.
- בעקבות קיבעון, לאפשר המוח להתיישב לתחתית הצינור microcentrifuge על ידי הכבידה.
הערה: לעיתים, המוח יכול לדבוק הצד של הצינור microcentrifuge. במקרה כזה, זה בדרך כלל עוזר רוחבית לסובב את הצינור בין האגודל והאצבע או להתחבר בעדינות את הצינורית על הספסל כדי לקדם שוקע של המוח- - מקבע הסרה באמצעות p1000 פיפטה ולבצע שתי " מהירה " שוטף עם 500 µL של ניידת, המאפשר את השכל להתיישב לתחתית הצינור microcentrifuge בין שוטף. במהלך אלה שוטף מהירה, לאחר כל המוחות התיישבו על ידי הכבידה לתחתית הצינור microcentrifuge, ניידת ניתן מיד להחליף את המאגר טריים; אין זמן לשטוף נוספת נדרשת.
הערה: בדרך כלל, עוזב מאגר נוסף בצינור עדיפה על מסכן המוח להסרת. בדיקה של קצה פיפטה נדרש לעיתים קרובות כדי להבטיח כי אין שכל הוסרו בטעות מהצינור. אם המוח היה בטעות pipetted לתוך הקצה, לוותר על אותם בחזרה לתוך הצינור microcentrifuge, לחכות שכל להתיישב, ולאחר מכן המשך הסרת כל ניידת נוספת שנשאר. - לאחר שעבר כביסה מהירה, להשתמש פיפטה p1000 לביצוע שלוש " ארוך " שוטף: להוסיף 500 µL של ניידת ושטוף במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר-נדנדה/nutator. כל העתיד " רב " שוטף צריך להיות במשך 20 דקות.
הערה: בעקבות אלה שוטף, קבוע המוח ניתן לאחסן במשך הלילה ב 4 ° C בניידת. - להסיר בכביסה האחרונה באמצעות פיפטה p1000, דגירה המוח על הנדנדה או nutator בטמפרטורת החדר ב- 0.5 מ"ל של חסימת פתרון [ניידת + סרום עז רגילה 5% (הגדרות)] במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- נוגדנים משניים עז ישמש בשלבים פרוטוקול עוקבות. אם ייעשה שימוש נוגדנים משניים ממין אחר, סרום נורמלי זה מינים (ולא המיתרים) אמור לשמש פתרונות חסימה ו נוגדן.
- באמצעות פיפטה p1000, להסיר חסימה פתרון ולהוסיף נוגדן ראשוני מעורבבת עם ניידת (ניידת + 5% המיתרים + נוגדן ראשוני מדולל). בעת שימוש עם נוגדן ראשוני בפעם הראשונה, דילול אופטימלית של נוגדן זה ייקבע מדעית.
הערה: להמחשת הגוף פטריות נוירונים, נוגדנים ההכרה Fas2 משמשים בדרך כלל. נוגדנים אלה הינם זמינים מן מחקרים התפתחותיים ליפידים הבנק (DSHB) כמו נוגדנים 1D 4, צריך להיות 1:20 מדולל ניידת + 5% המיתרים.
הערה: להמחשת נוירונים קולט אור, נוגדנים ההכרה chaoptin משמשים בדרך כלל. נוגדנים Chaoptin הינם זמינים מן DSHB כמו נוגדנים 24B10, צריך להיות 1:20 מדולל ניידת + 5% המיתרים.
הערה: תהליך קיבוע מבטלת בדרך כלל זריחה של חלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). לכן, בעת שימוש MARCM כדי לנתח הדרכה עצב של נוירונים מגה-בתים בודדים, להשתמש נוגדן להכרת GFP. - דגירה המוח בפתרון נוגדן ראשוני על נדנדה/nutator 2-3 לילות ב- 4 מעלות צלזיוס
- בעקבות הדגירה עם נוגדנים העיקרי, לאפשר את המוח ליישב לתחתית הצינור microcentrifuge ולאחר מכן להסיר את הפתרון העיקרי נוגדן.
- באמצעות פיפטה p1000, לבצע 2 " מהירה " שוטף ו- 3 " רב " 20 דקות שוטפים עם 0.5 מ של ניידת כמתואר לעיל צעדים 4.4, 4.5, בקפידה ומאפשר המוח להתיישב על ידי הכבידה לתחתית הצינור microcentrifuge בין כל ווש
- המוח Incubate עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר עם נוגדנים משניים עם התווית fluorescently המתאים. נוגדנים משניים הם בדרך כלל מדולל ב- 0.5 מ של ניידת + 5% המיתרים-ריכוז של 1:200.
הערה: לאחר נוגדנים משניים פלורסנט נוספו, המוח צריך לשמור בחושך לאורך כל הניסוי.
הערה: בשרידי במקרה שיורית GFP פלורסצנטיות, בעת ביצוע ניתוח MARCM, מומלץ להשתמש של נוגדנים משניים המסומנת fluorophore בעל אורכי גל עירור/פליטה דומה כמו GFP (למשל, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) או Alexa488). - בעקבות הדגירה נוגדנים משניים, לאפשר את המוח ליישב לתחתית הצינור microcentrifuge ולהסיר את הפתרון נוגדנים משניים.
- 2 לבצע " מהירה " שוטף ו- 3 " רב " 20 דקות שוטפים עם 0.5 מ של ניידת כמתואר לעיל צעדים 4.4, 4.5, בקפידה ומאפשר המוח להתיישב לתחתית הצינור microcentrifuge בין כל ווש
- בעקבות השלישי " רב " 20 דקות לשטוף, שימוש פיפטה p200 להסיר כמה שיותר מאגר ככל האפשר.
- 75 להוסיף µL של פלורסנט אנטי-לדעוך הרכבה בינונית בראש. פיפטה המוח, הרכבה בינונית לתוך קצה פיפטה פעם לערבב. היפוך לא הצינור מאז המוח עשוי נתקעות על כובע או צידי הצינור microcentrifuge.
הערה: בעקבות ההשעיה של המוח במדיום הרכבה, צינורות עשוי להיות עטוף בנייר אלומיניום כדי להאט את fluorophore שכבתה, המאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם יש צורך, מוח ניתן לאחסן במשך מספר ימים ב 4 ° C, אך כדאי אידיאלי להיות מותקן על גבי שקופיות במהירות האפשרית.
5. הרכבה למבוגרים melanogaster ד המוח על גבי שקופיות מיקרוסקופ והדמיה
- לבנות " גשר " שקופיות. תנוחה שנייה " בסיס " coverslips בערך 1 ס מ זו מזו על שקופית הטעון חיובית. ודא כי בצד הטעון חיובית של השקופית פונה מעלה. מקפידים על coverslips לשקופית עם הלק כפי שמוצג באיור 3 א. זה בדרך כלל עוזר לאטום את שלושת הקצוות החיצוניים של כל תגית כיסוי בסיס עם הלק כדי להבטיח הרכבה מדיה לפתיל לא תחת שער גולשת בסיס אלה. תן לק. להתייבש לחלוטין (10-15 דקות) לפני שתמשיך.
- למקם את השקופית תחת stereomicroscope, pipette הפתרון מדיה הרכבה המכיל את השכל ביתור לחלל שבין coverslips שני. כדי לספק יותר חדות, זה שימושי לתמרן את האורות מתכווננת כך הם מקבילים עם הגג הספסל.
- להסיר תוספת הרכבה מדיה מתוך השקופית באמצעות פיפטה של, נזהר שלא pipette את המוח מחוץ לשקופית.
- וויק הרכבה נוספת משם מדיה. זה יאפשר את השכל למקם ליתר דיוק במהלך השלב הבא.
- באמצעות זוג מלקחיים, את stereomicroscope, מקם את השכל על השקופית בתבנית רשת עם אונות antennal פונה למעלה
- המקום מכסה (" גשר ") על המוח ( איור 3 א). להשתמש לק. לאטום את הצדדים של תגית כיסוי גשר שבו הם לפנות " בסיס " שער גולשת.
- לאט בעזרת פיפטה p200, למלא את חלל מרכז מתחת לגשר עם הרכבה טריים מדיה ( איור 3 ב). מקום טיפה אחת בכל פעם על קצה coverslip מרכז פתוח ולאפשר התקשורת הולכת וגוברת עד לפתיל תחת coverslip גשר המרכז. המשך עד החלל כולו מתמלא הרכבה מדיה, ואז לאטום העליון והתחתונים עם לק. ברור.
- פעם אחת הלק יבש, תמונה של השקופיות באופן מיידי או לאחסן בקופסה שקופית חזק lightproof ב-20 מעלות צלזיוס
- בתוך שבוע אחד, תמונה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר עם לייזרים עירור ולסנן קוביות המתאימות הנוגדנים משני פלורסנט שבחרת. Z-אוסף תמונות של הגוף פטריות נוירונים מתקבלים בדרך כלל באמצעות 20 X או מטרות X 40. הדמיה של נוירונים קולט אור ברשתית עשויים לדרוש הגדלה גבוהה יותר.
Representative Results
השיטה המתוארת לעיל מאפשר הפריט החזותי לשחזור ואמין של כמעט כל אזור במוח דרוזופילה למבוגרים. כאן אנחנו התמקדו פטריות ושל נוירונים קולט אור, אך מחקרים אחרים השתמשו בשיטות אחרות כדי להמחיש אזורים במוח כגון pars intercerebralis52, שעון נוירונים53,54, ו antennal האונה הקרנה נוירונים55, בקרב רבים אחרים. חשוב, טכניקה זו ניתן להציג באופן חזותי הן מבנים המוח כולו, כמו גם נוירונים בודדים בתוך אותם מבנים תוך שימוש בטכניקות כגון MARCM12,47. איור 4, איור 5ו- 6 איור הצג מספר סוגים שונים של נתונים של נוירונים קולט אור וגופי פטריות המוח למבוגרים יכולה להפיק בעזרת טכניקה זו ניתוח ו- immunostaining.
ראשית, השיטה המתוארת לעיל יכול לשמש ישירות לדמיין גוף פטריות מורפולוגיה באמצעות נוגדנים מזהה 2 Fasciculin (Fas2) או גנים הכתב לידי גוף פטריות נוירונים34. כפי שמוצג באיור 4A ו- איור 4B, Fas2 נוגדנים יכול לשמש כדי להמחיש את α, β, ו (במידה פחותה) וγ אונות של הגופים פטריות למבוגרים דרוזופילה המוח. Fas2 הוא חלבון אדהזיה תא-תא נדרש עבור נוירון fasciculation ו מתבטא ברמה גבוהה ב- α וβ אונות23,56,57, שהופך אותו סמן אמין ומבוסס היטב של אלה פטריות הגוף נוירונים. ראוי לציין, עגול בצורת הגוף אליפסואיד הינו ממוקם באזור המרכז של המוח למבוגרים גם להיות visualized באמצעות נוגדן זה (איור 4א).
פגמים בחלבונים הדרכה עצב לעיתים קרובות לגרום שהיישום penetrant הגוף פטריות מוטציה פנוטיפים15,34,35. לכן, במרבית המקרים, כמה עשרות המוח צריך להיות עם תמונה וניתח. לדוגמה, הגוף פטריות β האונה האקסונים של הזבובים null Nab2 באופן בלתי הולם של הכדור, המוח. פנוטיפ "פיוז'ן" האונה הזה "הצלבה" או β בדרך כלל נצפית ~ 80% של מבוגר Nab2 null זבובים אבל הוא בעיקר נעדרו פקדים פראי-סוג, ניתן לסווג גם קלה, מתונה או להשלים פיוז'ן34. "פיוז'ן" של β אונות לרוחב קו נובעת התחזית contralateral שגוי של אקסונים לתוך האונה במוח הנגדי. כפי שמוצג באיור 4C ומפורט ב34,35, היתוך קלה מתייחס β אונות המחוברות באמצעות "בשרך דק של סיבים Fas2-חיובית," בעוד פיוז'ן מתונה מתייחס אונות β מחוברים באופן משמעותי יותר זה מראה עובי האונה ירד מעט בקו האמצע. פיוז'ן מלאה (או "קיצוניים") מתייחס אונות β מחוברים לחלוטין ולהראות ירידה האונה עובי או Fas2 מכתים בקו האמצע. היקף הגוף פטריות β האונה פיוז'ן ניתן לכמת, מוצגים כפי שמתואר 34,35 או טבלה המציגה את אחוז המוח מציג כל סוג של פגם מורפולוגיה.
בנוסף מכתים עם נוגדנים Fas2,47,48 12,בטכניקה MARCM יכול לשמש גם לדמיין האקסון החלטות הדרכה של נוירונים בודדים GFP+ בתוך האונות הגוף פטריות. MARCM מנצל רקומבינציה mitotic במהלך הפיתוח כדי ליצור נוירונים בודדים או קבוצות הקשורות clonally של הנוירונים, המסומנים GFP (איור 5א). MARCM מספק דרך ליצור מספר קטן של נוירונים לגמרי חסרי חלבון בטווח זבוב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים. ככזה, טכניקה זו כבר שימושי במיוחד בניתוח הפונקציות הדרכה עצב של חלבונים חיוניים גם הכדאיות organismal בסך הכל12,47. Homozygous נוירונים null המסומנים GFP ניתן להשוות ישירות כדי לשלוט נוירונים המסומנים GFP בפראי-סוג רקע גנטי. יתר על כן, תלוי מתי המתפתח זחלים או גלמים בהלם-חום, מחלקות שונות של הגוף פטריות נוירונים יכולים להיות ממוקד (איור 5B).
דוגמה של סוג הנתונים שנוצרו בעזרת טכניקה זו מוצג באיור 5C, שבו נוצרות פראי-סוג (כלומר, שליטה) MARCM שיבוטים כדוגמה. כדי ליצור באמצעות נוירונים בודדים את הגוף פטריות GFP+ שמוצג באיור 5C, פיתוח F1 הזחלים שוכנו בתחילה ב 25 º C. כ 5-6 ימים לאחר הבקיעה זחל (ALH), הגלמים היו חום בהלם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וחזרתי כדי 25 ° C עד וגיחתו. לאחר הבקיעה למבוגרים, המוח היו גזור ב ניידת, קבוע, מודגרות בו זמנית עם נוגדנים זיהוי Fas2 (1D 4, מדולל 1:20 ב ניידת) ו- GFP (מדולל שבערך ב ניידת). המוח היו לאחר מכן מודגרות עם נוגדנים משניים, רכוב על שקופיות כמתואר לעיל. GFP+ תאים זוהו, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר ואת העוצמה המקסימלית תחזיות נוצרו תוך שימוש ImageJ. כפי שהוכח איור 5C, שליטה GFP+ נוירונים המופקים האונות α וβ colocalize עם Fas2 ולסיים לפני פנייה אל האמצע המפריד בין שני חצאי המוח דרוזופילה . פרויקטים האקסון יחיד anteriorly, bifurcates, ואז פרויקטים הן dorsally ו- medially טופס α, β אונות. מספר מחקרים קודמים השתמשו בטכניקה זו כדי לחקור אם חלבונים מסוימים נדרשים ללמוד חלוקת התא באופן עצמאי על היבטים רבים של axonogenesis, כולל סיומת, pathfinding, מ., ו/או גיזום10, 11,12,13,14,15,16,17,34.
בנוסף הגופים פטריות, ההחלטות pathfinding עצב של קולט אור ברשתית נוירונים (תאי-R) גם להיות visualized באמצעות השיטה לנתיחה המתוארת לעיל (כמו גם על ידי דה שיטת ניתוחscribed תוך התייחסות48.) כל ommatidia בתוך העין לטוס מכיל 8 נוירונים קולט אור זה ניתן לסווג לשלוש קבוצות (איור 1): R1-R6 תאים, אשר פרויקט אקסונים אל הנדן שטחית של האונה הראייה במוח; R7 תאים, אשר פרויקט אקסונים לשכבה M6 עמוק יותר של לשד; ותאים R8, אשר פרויקט אקסונים לשכבה M3 ביניים של19,לשד58. הדפוס הקרנה של כל מחלקה של קולט אור נחקר בהרחבה ו יחד הנוירונים הללו בהצלחה שימשו כמודל להבין את איתות המסלולים המעורבים האקסון-הדרכה-19,-59. חשוב לציין, כל האקסונים קולט אור, ניתן בקלות לאבחן במוח דרוזופילה גזור על-ידי immunostaining של הבוגר, הגולמי, או רקמות זחל באמצעות נוגדן זה מזהה chaoptin, תא משטח גליקופרוטאין24, 60 , 61. גנים כתב GFP או β-galactosidase כל סוג R-תא (R1-R6 R7, R8 תאים) גם נבנו והוא יכול לשמש כדי להמחיש כל מחלקה של קולט אור62. מאז כל סוג של R-תא מסתיימת בשכבה אחרת של האונה אופטיים המתפתח, העיתונאים האלה אפשרו להשוואות מפורט של המסלולים איתות נדרש עבור כל סוג התא כראוי למצוא את המטרה. דוגמה דפוסי ביטוי המיוצר על ידי שני הגנים האלה כתב בשילוב עם לוקליזציה chaoptin (אשר יכול לשמש כסמן של נוירונים קולט אור כל) מוצג באיור 6. כדי להמחיש R7 photoreceptors, המוח המכילים את הגן עיתונאי ספציפי ל- R7 Rhodopsin4-LacZ היו גזור, צבעונית עם נוגדנים chaoptin ו β-galactosidase. אופסין # רודופסין 4 (Rh4) מתבטאת במיוחד תת-קבוצה של תאים R763; האמרגן Rh4 ולכן ניתן לנהוג כתב ביטוי גנים בתאים אלה בלבד. כצפוי, תאים R7 לסיים בשכבה M6 עמוק יותר של לשד (מסומן בקו מקווקו צהוב איור 6). באופן דומה, המוח לבטא β-galactosidase מן האמרגן אופסין # רודופסין 6 (Rh6), אשר מתבטאת במיוחד R8 photoreceptors63, היו גזור, immunostained באמצעות נוגדנים ההכרה chaoptin, Β-galactosidase. כפי שמוצג באיור 6, R8 photoreceptors מסתיימות כאשר השכבה R3 שללשד. אמנם לא מוצג כאן, Rh1-LacZ יכול לשמש גם כדי להמחיש הסיום של R1-R6 photoreceptors בתוך הנדן.
איור 1: המבוגר דרוזופילה melanogaster המוח מורכב אזורים ברורים באופן פונקציונלי, אך מחוברים. (א) חלוקה לרמות של הבוגרים melanogaster ד המוח מוצג, הדגשת קולט אור ברשתית ההיקפית נוירונים וגופי פטריות במיקום מרכזי. (B) מוגדל תרשים של הגוף פטריות למבוגרים האקסון חבילות (נקרא גם אונות) מזוהים באמצעות נוגדנים Fas2. הנוירונים מהותי של הגופים פטריות, המכונים תאים קניון, פרויקט אקסונים anteriorly מגופים ממוקם dorsally תא (תא גופות מושמט מן הדיאגרמה הזה) ויוצרים מבנים נפרדים האונה. במוח למבוגרים, הטופס אונות (באיור אדום) וγ מפני צרור המדיאלי יחיד של אקסונים, תוך כדי הגבי α, β המדיאלי אונות (כחול באיור) טופס האקסון יחיד אשר bifurcates במהלך תהליך pathfinding. Α ' / β' נוירונים לפתח עצב אונות חלקית חופפים עם אלה של הנוירונים α/β, אבל אינם מזוהים על ידי נוגדנים Fas2, מושמטים מכל זה הפוך. הנוירונים ברשתית (C) הם קריטיים, בהעברת מידע חזותי של הרשתית על האונה אופטיים. פרויקט אקסונים מגופים תא ממוקם את הרשתית (בז) והקשרים טופס עם התאים היעד הפוסט-סינפטית פרופריה או לשד. R1-R6 קולט אור תאים (מוצג באדום) טופס חיבורים ספציפיים עם תאים בשכבה החיצונית של האונה אופטיים, קרא הנדן. קולט אור R7 תאים (צהוב) סינפסה עם מטרות בשכבה M6 של לשד, בעוד R8 תאים (מוצג בצבע ירוק) פרויקט אקסונים לשכבה M3 מעט יותר שטחית של לשד. חלק C על-ידי רשות מן מקמילן מוציאים לאור בע מ: מדעי הטבע המוח (הפניה64, זכויות יוצרים (2011)). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: GAL4 ה/UAS מערכת יכול לשמש עבור ביטוי גנים יישוב. כדי להשיג זבובים ביטוי גנים עניין ("X גנים") דפוס מסוים רקמות, זבובים חייב להכיל transgene לבטא החלבון activator תעתיק Gal4 תחת השליטה של תוספת רקמות ספציפיות והן של transgene המכיל את ה-DNA Gal4 איגוד רצף (המכונה רצף הפעלה במעלה או UAS) בסמוך אל הגן אקס בדרך כלל, שילוב זה מושגת על ידי הזדווגות הזבובים הורים כי זה מכילים transgene אחת ובחירה עבור F1 רומא המכילים את שניהם. הדור1 F וכתוצאה מכך, Gal4 יתבטא, יהיה לאגד UAS להפעלת שעתוק של גנים X באופן ספציפי רקמות. חשוב, transgenes שונים המכילים UAS יכול לשמש בשילוב עם אותו GAL4 "נהג". לדוגמה, transgene לבטא Gal4 בגופים פטריות (Mb) יכול להיות משולב עם transgene המכילות UAS GFP אקספרס, transgene זה דופק את הביטוי של גנים עניין באמצעות התערבות RNA או UAS-transgene מפיקה עיתונאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הרכבה המוח כהכנה immunofluorescence הדמיה. (א) המוח הם רכובים בשקופיות SuperFrost פלוס עם כיסוי גשר כדי למנוע שיטוח של המוח. שני-"בסיס" שער גולשת הם דבקו Superfrost פלוס מפרוטונים שמטענם שקופית עם לק. ברור, והטרף המוח ממוקמות מכן בשקופית ביניהם. תגית כיסוי ברורה "גשר" הממוקמת מעל המוח, דבקה את פתקי שער הבסיס. (B) פעם אחת הלק יבש, Vectashield הוא לאט לאט pipetted מתחת לגשר כדי לשמר את זריחה של הנוגדן משנית. לק. ברור משמש לאחר מכן לאטום העליון והתחתון של תגית כיסוי "גשר". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: פטריות גוף אקסונים להיות בבירור visualized באמצעות נוגדנים מזהה Fas2. (א) למבוגרים דרוזופילה המוח היו גזור, קבוע, מודגרות עם נוגדנים הכרה Fas2. נוגדנים העיקרי זוהו באמצעות מצמידים Alexa488 נוגדנים משניים עז-נגד-עכבר, המוח רכוב על גבי מפרוטונים שמטענם שקופיות עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. Bisymmetrically ממוקם פטריות גוף התא גופות להרחיב אקסונים anteriorly, bifurcate, בצורת חבילות האקסון (נקרא גם אונות). האקסונים המהווים את ההערכה dorsally α האונות ואת ההערכה medially β אונות express Fas2. אנושות, β אונות של הזבובים פראי-סוג לסיים לפני האמצע של המוח. הגוף אליפסואיד במיקום מרכזי גם להיות visualized באמצעות 1D 4 נוגדן. (B) medially-הקרנת γ האונה אקסונים של הגוף פטריות למבוגרים דרוזופילה גם אקספרס Fas2, ניתן לאבחן באמצעות 1D 4 נוגדן. בדרך כלל, הביטוי של Fas2 בγ האונה אקסונים הוא פחות מזו של האונות α וβ. (ג) הגוף פטריות אקסונים של המוח Nab2-null (גנוטיפ: Nab2-ex3-/Nab2-ex3) כי פרויקט contralaterally, לעתים קרובות חוסר אונות. Nab2-null המוח היו גזור, קבוע, מוכתם 1D 4 נוגדן לדמיין גוף פטריות α, β, γ אונות. העוצמה המקסימלית Z-מחסנית תחזיות מקטעים אופטי גם כפרט ממוקדת על אזור קו האמצע מוצגים. אמנם הגוף פטריה פראי-סוג β האונה אקסונים לעתים נדירות של הכדור, המוח, המוח Nab2-null יש כמויות משתנות של הקרנה שגויה לרוחב קו לתוך הכדור contralateral במוח, וכתוצאה מכך β "מאוחה" אונות. כמשמעותם הפניות34,35, פיוז'ן מתון מתייחס < β אונות עם רק מספר "חוטים" של אקסונים לחצות את קו האמצע, פיוז'ן מתונה מתייחס למצבים איפה Fas2 β חיובי האונה נוירונים לחצות האונה במוח קו האמצע אך β רוחב בקו האמצע הוא ירד, ומתייחס היתוך להשלים למצבים איפה שיש אין הפחתה של β האונה עובי כפי האונות לחצות את קו האמצע של המוח. מאז אליפסואיד הגוף מבטא גם Fas2, סעיפים אופטי מציג את קו האמצע הם לעתים קרובות יותר שימושי להמחיש β האונה פיוז'ן. ראוי לציין, חסר אונות גם לעתים קרובות שנצפו (מסומן כאן עם הכוכבית לבן). הנתונים בחלק C משמש כימות של הגוף פטריות פנוטיפים מן ההפניה34, עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : MARCM יכול לשמש כדי להמחיש את האקסונים של נוירונים בודדים. (א) פסיפס ניתוח עם סמן תא Repressible (MARCM) משתמשת FLP בתיווך recombinase mitotic רקומבינציה באתרים והשפלתם כדי ליצור שני תאי הבת ברורים. בדוגמה זו, כל התאים מכילים חלבון GAL4 גוף ספציפי פטריות על כרומוזום נפרדים. בעקבות רקומבינציה mitotic במהלך חלוקת התא, תא אחד של הבת (למעלה) מבטא GFP (או הקרום מאוגד CD8-GFP) מכיל שני אללים mutant של גנים של עניין, בעוד אחרים הבת התא (למטה) יורש שני אללים (WT) פראי-סוג ו transgene לבטא את החלבון Gal80 באמצעות מקדם טובולין. Gal80 מעכב Gal4, אז כל התאים לייצר Gal80 יהיה ללא-פלורסנט, צריך להיות homozygous או משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים פראי-סוג. תאים הנמצאים GFP+ בלבד יכיל שני עותקים של אלל מוטנט. שימו לב כי רק אחד ממספר שיטות ליצירת תאים GFP+ המכילים גם שני אללים mutant של גנים עניין מוצג; נא עיין12,45,,56 , עבור דוגמאות אחרות. (B) מאז התפתחות פטריות גוף נוירונים מתחילה עם נוירונים γ, ואז α'/ β' נוירונים, ומסתיימת α/β הנוירונים, כל מחלקה של נוירון יכול באופן סלקטיבי להיות ממוקד, דמיינו ידי חום מזעזע בנקודות זמן שונות התפתחותית. כפי שמתואר 12, הלם חום 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס המתרחשת ≤2.5 ימים לאחר הבקיעה זחל (ALH) במיוחד תמקד γ; הנוירונים, תוך הלם חום, המתרחשת 3.5-4.5 ימים ALH (בשלב מאוחר L3 הזחל) תמקד α'/ β' נוירונים, חום לזעזע את o ccurs בין 5-7 ימים ALH (במהלך פיתוח הגולמי) תמקד α/β נוירונים. (ג) אקסונים פראי-סוג בודדים היו visualized באמצעות MARCM. הגלמים פראי-סוג ~ 5-6 בנות יום (גנוטיפ: hsFLP, UAS-CD8-GFP; ג'קוזי FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, > Gal80; OK107-GAL4/+) נדהמו חום ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות לזירוז mitotic רקומבינציה. המוח היו גזור, קבוע, מוכתם נוגדנים להכרת GFP (שבערך), Fas2 (1:20). המוח היו לאחר מכן מודגרות עם נוגדנים משניים fluorescently שכותרתו, דמיינו ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. זו דוגמה נתונים גנוטיפ "שליטה", GFP תאים חיובי שנוצר באמצעות MARCM הם פראי-סוג, במקום המכיל שני אלליםmut ג'ין, מכילים שני אלליםWT ג'ין. הגוף פטריות β אונות (visualized באמצעות נוגדנים ההכרה Fas2) לסיים לפני שהגיע האמצע המוח; Α האונה נוירונים נוכחות גם הן. כדי להציג ביתר פירוט, התמקדה האונה מוח אחד מוצג בשורה התחתונה של תמונות. חלק ג הותאם באישור הפניה34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : קולט אור אקסונים גם להיות visualized. מבוגר המוח β-galactosidase לביטוי photoreceptors R7 (משמאל, באמצעות Rh4-LacZ) או R8 photoreceptors (נכון, שימוש Rh6-LacZ) היו גזור, קבוע, מודגרות עם נוגדנים להכרת β-galactosidase או chaoptin. המוח היו לאחר מכן מודגרות עם נוגדנים משניים fluorescently שכותרתו, דמיינו ידי סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר. סעיפים אופטי יחיד מוצגים כל מהמוח. בצד השמאל, מספר R7 קולט אור אקסונים (חיצים) ניתן לראות המסתיים M6 לרובד העמוק של לשד (מוצג על ידי הקו המקווקו צהוב). בצד הימין, אקסונים קולט אור R8 (חיצים) לסיים בשכבה M3 החיצונית של לשד (מוצג על ידי הקו המקווקו הירוק). מאז R7 photoreceptors אקספרס או Rh3 או photoreceptors Rh4 ו- R8 אקספרס או Rh5 או Rh663, photoreceptors R7 או R8 כל לא יכול להיות visualized באמצעות גן כתב LacZ יחיד. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
דיסקציה והדמיה השיטה המתוארת לעיל ניתן להשתמש במגוון רחב של immunostaining, גרה יישומי הדמיה. אנו המחולקות פרוטוקול immunostaining כללי, הדגישו דרך אחת שבה MARCM יכול לשמש כדי להמחיש עצב מורפולוגיה של נוירונים בודדים הגוף פטריות. בנוסף, נהלים כלליים אלה יכול לשמש גם עבור הדמיה אחרים אזורים במוח בקבועה או מבוגר טרי ביתור המוח48,65. הדמיה חיה עשוי לספק גישה יעילה יותר בעת ניתוח דפוסי ביטוי של מלכודות משפר, כתב גנים או לחקות קווים66, לדוגמה. כדי למנוע לכידת ממצאים מוות של תאים במהלך הדמיה חיה של GFP ברקמת מבולבל, המוח צריך להיות גזור 1 x מדיה פוספט Buffered מלוחים (PBS) או HL348רכוב על גשר שקופיות 1 x PBS (או HL3), עם תמונה של פחות מ 15-20 דקות טיפול צריך גם להתייחס כדי להסיר את קנה הנשימה רב ככל האפשר של המוח גזור לפני הדמיה, מאז זה יכול להפריע ויזואליזציה של זריחה GFP.
ואילו תנאים מכתימים להערכת המורפולוגיה של נוירונים הגוף, קולט אור פטריות61,יחסית ומבוססת24,67, הלוקליזציה של חלבון ספציפי עניין באלה תא סוגי עשויים לדרוש פתרון מקיף ואופטימיזציה. בפרט, צריך להיות מוטבת מספר שלבים קריטיים, כולל דילול נוגדן, מאגר רכיב ריכוז חסימה של יציבות, כדי להפיק את התוצאות ביותר לשחזור ואמין. ראשית, צריך להיקבע ריכוז אופטימלי של נוגדן ראשוני. למרות נוגדנים זמינים מסחרית יש לעתים קרובות לדילול המוצע (אנחנו לעיתים קרובות בתחילה להפעיל באמצעות הריכוז הזה), ערכים אלה רחוקות נקבעים מדעית על רקמות דרוזופילה . לכן, בדיקה של סדרת דילולים נוגדן ראשוני כי טווח מעל ומתחת החל הצעה היצרן לעתים קרובות התוצאות מכתים יותר ספציפי. בעוד נוגדן ראשוני דילול יכולה להיות השפעה משמעותית על צביעת דיוק בדיוק ייקבע, שכל הזמן מודגרת ב נוגדן ראשוני המכיל פתרונות יכול להשתנות במידה ניכרת עם השפעה קטנה על התוצאה הכוללת. לדוגמה, הבחנו תוצאות דומות כאשר המקננת גזור מוחות עם הנוגדן העיקרי של נוגדן Fas2. בשביל שניים, שלושה, או אפילו ארבעה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. אמנם אנו ממליצים לפחות שני לילות, יש גם מודגרות המוח בפתרון נוגדן ראשוני לילה יחיד ואנו שהושג מכתים לשחזור. חשוב, להגביל את כמות הזמן המוח מודגרת ב הנוגדן משני ל-3 שעות בטמפרטורת החדר (או לילה אחד ב 4 ° C) מסייעת מגבלת איגוד שאינם ספציפיים של נוגדנים משניים רקמת המוח.
שנית, ייתכן צורך להשתמש נוספים ריאגנטים "חסימה" לחסל את האות הרקע הבלתי רצויים. האפשרויות כוללות הגדלת ריכוז המיתרים ~ 10%, הוספת 1-10% שור אלבומין (BSA) חסימה, ראשי/משני פתרונות נוגדן או טרום ספיחה של נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C עם עוברי דרוזופילה (ראה התייחסות68, סעיף 2.9, שלב 3).
בזמן שכתבנו בפרוטוקול לעיל באמצעות ניידת כמו המאגר המוצע עבור כל קיבעון, לשטוף, נוגדן הדגירה צעדים, קיבוע הרקמה במאגרי אחרים (כגון פיפ ו- PEM, נמצאת טבלת חומרים) עלול לגרום עמוקה הבדלים עוצמת אות. לדוגמה, מחקרים קודמים הדגימו כי Cyclin E הוא לא ניתן לזיהוי בשנת דיסקים דמותי זחל כאשר רקמות המתוקנים ב- paraformaldehyde 4% מסורתיים מדולל ב- PBS, אבל הוא נראה בבירור כאשר רקמות קבועים במאגר פיפ (Moberg קן, אישי תקשורת, ו הפניה69). בנוסף שינויים במאגר רכיבים, משנים את זמן וטמפרטורה עבור קיבוע הרקמה יכול גם להשפיע באופן משמעותי על immunofluorescent מכתים, יכול להיקבע מדעית במידת הצורך. בדרך כלל, קיבוע זמן צריך להיות ארוך מספיק כדי לאפשר crosslinking מספיקות של רכיבי הסלולר, תחזוקה לטווח הארוך של מורפולוגיה הסלולר בסך הכל בעת היותו מוגבל מספיק כדי למנוע נגמר-crosslinking "לקבור" של חלבון epitopes. לכן, כאשר בתחילה מיטוב מכתימים תנאים נוגדן ראשי החדשים שנרכשו, אנו בדרך כלל להגביל את זמן קיבעון כ 20 דקות, לעתים קרובות יהיה לתקן את הרקמות בטמפרטורה קרירה.
מספר פקדים צריכים להיכלל בכל ניסוי immunofluorescence לחקור יחודיות של נוגדנים ראשיים ומשניים, כמו גם את השפעת הרקע הגנטי/transgenes על פנוטיפ שנצפה. לבירור אם הנוגדן העיקרי בשימוש במיוחד מזהה את החלבון עניין, רקמות מהזבובים חסר זה חלבון ו/או רקמות overexpressing החלבון צריך להיות כלול כפקדים. התוספת של אנטיגן מטוהרים עודף חלבון יכולים להיכלל גם כדי לקבוע אם הנוגדן ראשי מזהה אחרים epitopes במוח לעוף. לבסוף, כל אות ניאון נוכח כאשר נוגדנים העיקרי מושמטים מייצג הרמה של איגוד לא ספציפית על ידי הנוגדנים משני שנבחרו.
יש גם לכלול מספר פקדים חשוב להעריך את התרומה של הרקע הגנטי או הנוכחות של transgenes עוצמת מכתימים או מורפולוגיה עצביים. לדוגמה, הזבובים בשימוש הניסוי MARCM באיור 5 להכיל מספר transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, האמבטיה > GAL80, OK107-GAL4), שכל אחד מהם צריך להיות מנותח בנפרד על ההשפעות על הגוף פטריות מורפולוגיה. ב מורפולוגיה מאוד מינימלי, פטריות גוף של הזבובים המכיל OK107-GAL4 והן UAS-CD8-GFP צריך להיות מנותח. זה יכול להיות גם צורך להעריך את ההשפעה של הלם חום ומפליגה Flp הפקה recombinase על פיתוח גוף פטריות על-ידי ניתוח המכילים הן hsFLP והן FRT82B. למרות MARCM יכול לספק תובנה משמעותית אם חלבון נתון שולט באופן עצמאי הדרכה עצב, מספר פקדים נדרש לבצע במדויק מסקנה זו יכול להיות מגבלה מינור של טכניקה זו. בניסויים פחות מסובך, פקדים דומים חלים גם. לדוגמה, קח ניסוי שבו מערכת GAL4/UAS משמש בשילוב עם transgene RNAi לביטוי תמונות ציפורים של חלבון של עניין כל הנוירונים. בניסוי זה, לפחות שני transgenes להיות נוכחים: נהג GAL4 פאן עצבית, כגון elav-GAL4, את transgene UAS-RNAi . המורפולוגיה של הגוף פטריות נוירונים בזבובים המכילים כל אחד מהם את transgenes האלה לבד צריך להיחקר בנוסף התנאי ניסיוני איפה זבובים הנמל בשני transgenes בתוך הזבוב אותו.
לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון עניין מתבטאת נוירונים הגוף פטריות יש בדרך כלל צורך המוח הכתם שיתוף עם נוגדנים Fas2. לחלופין, פלורסנט חלבונים כמו GFP, RFP, או הקרום מאוגדים CD8-GFP יכול להתבטא גם באמצעות מערכת GAL4/UAS , בשילוב עם נוגדנים זיהוי החלבון עניין. Fas2 מזהה רק fasciculated האקסונים המהווים האונות α וβ הגוף פטריות, השימוש של CD8-GFP, מונחי-GAL4 ממברנה מכורך מאז שימושי במיוחד עבור סימון הגוף פטריות נוירונים.
פגמים הדרכה עצב לעתים קרובות לא 100% penetrant, אפילו המוח גנוטיפ באותה עשויים להראות כמה השתנות. לכן, כאשר ניתוח החדש שנוצר אללים mutant פגמים הגוף פטריות או קולט אור pathfinding, שילוב של אללים שונים וגישות צריך להיות מנוצל. רוב המחקרים בספרות להשתמש מספר גישות שונות כדי לחקור אם חלבון ממלאת תפקיד התא-אוטונומי שליטה הדרכה עצב: אני) ניתוח של pathfinding פגמים homozygous זבובים null (רצוי באמצעות nu שוניםll אללים), ii) ניתוח של pathfinding פגמים זבובים חסר החלבון עניין רק בנוירונים (בדרך כלל באמצעות RNAi), השלישי) ניתוח MARCM של פגמים pathfinding, ו- iv) להציל את הניסויים איפה הגן מחדש מתבטאות הנוירונים של homozygous null זבובים. באופן אידיאלי, כמה עשרות המוח לכל גנוטיפ צריך להיות מנותח על פגמים מורפולוגיה עצביים.
למרות הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת בעיקר על לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך רקמת קבועה, מספר יישומים עתידיים של טכניקה זו מפותחים לרקמות מוח חי תמונה. ברגע שכל הם גזור (בדרך כלל בתקשורת התרבות התא), ואז ניתן בתרבית במשך מספר ימים ב 25 º C. השיטות שמחוץ culturing שפותחו במטרה לחקור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כגון פעילות החלבון לקידום התחדשות האקסון בעקבות פציעה70,71, תאיים דינמיקה איתות72, ההתפתחות העצבית73.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Changhui פאק Alysia Vrailas מורטימר להוראת בתחילה SMK טכניקת ניתוח מוח. אנו מודים גם חברי קבוצת המעבדה של קן Moberg, במיוחד כריס סיבובים, עבור אנושות לקרוא את כתב היד. נוגדנים זיהוי Fas2 (1D 4), chaoptin (24B10) התקבלו מהבנק ליפידים של מחקרים התפתחותיים. נוגדנים 24B10 ועליהן כדי DSHB סימור Benzer ו Nansi Colley24,60,61, נוגדן 1D 4 נמצא כדי DSHB על קורי גודמן 22,23,56. מניות לטוס התקבלו ממרכז מניות בבלומינגטון. . גם אני רוצה להודות את המחקר החקלאי אוהיו ומרכז פיתוח מרכז (OARDC) MCIC הדמיה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי לשיקוף המוחות בכל איור 4A וב' SMK נתמך על ידי מענק של NICHD (1 R15 HD084241-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
| Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
| Fas2 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 | |
| Chaoptin Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Antibody | Aves Lab | GFP-1010 | |
| Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody | ThermoFisher | A-11039 | |
| Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody | ThermoFisher | A-21236 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscope Services | RT15713 | |
| VectaShield | Vector Labs | H-1000 | |
| SuperFrost Plus Slides | ThermoFisher | 99-910-01 | |
| Coverslips | ThermoFisher | 12-553-454 | |
| Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
| Na phosphate Buffer dibasic | Sigma | S3264 | |
| Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
| fingernail polish | Electron Microscope Services (EMS) | 72180 | |
| stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
| 9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
| nutator/rocker | Fisher | 22-363-152 or 88-861-041 | |
| 35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potential Fixation Buffers | |||
| PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed | ||
| PLP buffer | 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O | ||
| PEM buffer | 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks available from Bloomington | |||
| elav (c155)-GAL4 | BL458 | Pan-neuronal GAL4 driver | |
| w*;;;OK107-GAL4 | BL 854 | GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4 | BL 7362 | GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64305 | GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*; 201Y-GAL4 | BL 4440 | GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome) | |
| y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP | BL 64296 | GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO | BL 5145 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP | BL5146 | MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 | BL 44408 | MARCM stock for flipping 3rd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 | BL44406 | MARCM stock for flipping 2nd chromosome | |
| w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 | BL 44407 | MARCM stock for flipping X chromosome | |
| y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO | BL 5137 | GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein) | |
| y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP | BL 5139 | MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome | |
| y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO | BL 28832 | MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome | |
| w*; FRTG13, Tub>GAL80 | BL 5140 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome | |
| y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 | BL 5135 | MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome |
References
- Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
- Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
- Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
- Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
- Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
- Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
- Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
- Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
- Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
- Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
- Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
- Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
- van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
- Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
- Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
- van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
- Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
- Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
- Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
- Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
- Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
- Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
- Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
- Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
- Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
- Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
- Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
- Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
- Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
- Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
- Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
- Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
- Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
- Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
- Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
- Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
- Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
- Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
