Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/56174
Automatic Translation
1,2, 3, 2,3
1Program in Neuroscience, The College of Wooster, 2Department of Biology, The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology, The College of Wooster

Summary

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Abstract

Zenuwstelsel ontwikkeling betekent een opeenvolgende reeks van gebeurtenissen die door verschillende signaalroutes en regulerende netwerken worden gecoördineerd. Veel van de eiwitten die betrokken zijn in deze trajecten zijn evolutionair bewaard tussen zoogdieren en andere eukaryoten, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster, suggereren dat soortgelijke organiserende beginselen bestaan tijdens de ontwikkeling van deze genetisch gemodificeerde organismen. Bovenal is Drosophila gebruikt uitgebreid te identificeren van cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van de processen die nodig zijn bij zoogdieren waaronder neurogenese, differentiatie, axonale begeleiding en synaptogenese. Vliegen zijn ook met succes gebruikt om het model van een scala van menselijke neurologische ziekten. Hier beschrijven we een protocol voor de stapsgewijze microdissection, fixatie en immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten in de hersenen Drosophila volwassen. Dit protocol is gericht op twee voorbeeld neuronale populaties, paddestoel lichaam neuronen en netvlies researchdieren en bevat optionele stappen wilt traceren van individuele paddestoel lichaam neuronen mozaïek analyse met een Repressible cel Marker (MARCM)-techniek. Voorbeeldgegevens uit zowel wild-type en mutant hersenen worden getoond samen met een korte beschrijving van een scorende criteria voor axonale begeleiding gebreken. Terwijl dit protocol twee gevestigde antilichamen benadrukt voor het onderzoeken van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen, andere Drosophila hersengebieden en de lokalisatie van eiwitten binnen andere hersengebieden kan ook worden onderzocht met behulp van dit protocol.

Introduction

Hoewel het zenuwstelsel Drosophila kleiner dan die van de mens en knaagdieren is, biedt de complexiteit ervan een krachtige, aanspreekbaar model om beter te begrijpen zijn gewervelde tegenhangers. In veel gevallen coderen het genoom van de gewervelde dieren en vliegen zeer vergelijkbaar eiwitten die de mechanismen van ontwikkeling van het zenuwstelsel dicteren. In feite, nodig veel van de genen voor neuronale ontwikkeling in gewervelde dieren orthologs in vliegen, met inbegrip van die betrokken zijn bij signaalroutes dat controle patronen, neurogenese en axonale begeleiding1,2,3 ,4,5. Netrin is bijvoorbeeld een ligand die nodig zijn voor de oriëntatie van de axonale in zoogdieren en D. melanogaster6,7,8. Terwijl netrin oorspronkelijk geïsoleerd van embryonale chick hersenen weefsel6 was, latere studies is gebleken dat netrin een geconserveerde rol speelt tijdens de ontwikkeling van de embryonale centrale zenuwstelsel (CNS) in Drosophila8. Andere studies hebben genetische schermen waarmee in de embryonale Drosophila CNS geconserveerde liganden en receptoren vereist voor vastloper in zowel Drosophila en gewervelde dieren9aangeduid.

Terwijl de embryonale vlieg CNS heeft uitgebreid in het verleden is gebruikt als aanduiding van liganden, receptoren en intracellulaire signalering eiwitten nodig voor axonale begeleiding8,9, heeft recent werk waar velen van de manieren onderzocht deze eiwitten ook bepalen vastloper besluiten tijdens de latere stadia van ontwikkeling. In het bijzonder heeft onderzoek van paddestoel lichaam (MB) en de retinale fotoreceptor neuron ontwikkeling (Figuur 1) verstrekt inzicht in de mechanismen die controle vastloper, synaps formatie, axon snoeien en verschillende andere aspecten van neuronale ontwikkeling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuronen het vliegen netvlies verbinden met regio's van de volwassen hersenen genaamd de lamina en medulla en zijn essentieel voor het doorgeven van visuele informatie naar de hersenen (herzien door18,-19), terwijl de paddestoel lichaam neuronen zijn Centraal gelegen in de vlieg hersenen en zijn nodig voor leren en geheugen20,-21. Fotoreceptor neuronen zowel de intrinsieke neuronen van de paddestoel organen, Kenyon cellen, genaamd gebruiken evolutionair geconserveerde diffusible en contact-afhankelijke axonale begeleiding mechanismen om te zoeken naar hun post synaptic doelen. Naast het feit dat zichtbaar in volwassen vliegen, kunnen fotoreceptor en MB neuronen ook worden rechtstreeks gevisualiseerd in larven en poppen met antilichamen of verslaggever genen22,23,24,25. De mogelijkheid om gemakkelijk het visualiseren van deze twee sets van neuronen op verschillende ontwikkelings tijd punten heeft het gebruik ervan als prachtige modellen voor vele aspecten van neuronale ontwikkeling bevorderd.

Naast wordt gebruikt als een model om te begrijpen van de mechanismen van de normale zenuwstelsel ontwikkeling, hebben recente studies aangetoond dat vliegen ook als accurate modellen van een breed scala van ziekten bij de mens dienen kunnen, met inbegrip van fragiele X syndroom (FXS)26 , Intellectuele handicap (ID)27,28,29,30,31, e.a.32. Bijvoorbeeld om te bestuderen van de moleculaire functie van ZC3H14, een gen onlangs gekoppeld aan menselijke verstandelijke beperking, we vliegen heeft een model gemaakt van ID met behulp van een null-allel van de vlieg ZC3H14 ortholog, Nab230genoemd. Vliegen ontbreekt Nab2 hebben ernstige geheugen waardeverminderingen en uitgebreid poly(A) staarten, Recapitulerend wat is waargenomen in menselijke patiënten of patiënt afgeleid cel lijnen33,34. Bovenal weergeven vliegen ontbreekt Nab2 ook ernstige hersenen morfologie gebreken in hun volwassen paddestoel organen34, vergelijkbaar met wat is waargenomen in vliegen de FXS syndroom gen, FMR135ontbreekt. Vliegen kunnen dus dienen als een belangrijk model-organisme om te studeren zowel normale hersenontwikkeling en ziekten die verstoren.

Tot slot, de toegankelijkheid van hoge-doorvoer methoden om te controleren van gedrag, gecombineerd met het enorme aantal beschikbare genetische hulpmiddelen, zorg Drosophila een modelorganisme van keuze voor het identificeren van de hersengebieden waarmee complexe gedrag, zoals leren en geheugen, slaap, verkering, dorst en anderen36,37,38,39. Een bijzonder nuttig instrument dat in het midden van een vlieg geneticus "gereedschapskist" is de GAL4/UAS-systeem (Figuur 2). Dit systeem40,41 gebruikt de specifieke expressie weefsel van de transcriptionele activator van Gal4 om de expressie van genen of transgenen stroomafwaarts van een Upstream activeren sequentie (UAS). Wijzigingen van dit systeem zijn toegestaan onderzoekers, bijvoorbeeld, exact bepalen de prikkelbaarheid van specifieke neuronen42,43, overexpress of knock-down specifieke genen van belang44, 45, real-time calcium dynamiek in vivo46analyseren en express reporter genen ter gelegenheid van de neuronale lineages41. De combinatie van het GAL4/UAS-systeem met Mitotische recombinatie ook toegestaan voor de oprichting van het mozaïek-analyse met een Repressible cel Marker (MARCM) systeem12,47. MARCM is gebruikt uitgebreid in enkel neuron tracering om de cellulaire signalering onderdelen vereist voor axonale begeleiding12,47te identificeren. Hoewel deze en andere technieken een aantal waardevolle inzichten over de cellulaire mechanismen die nodig zijn voor de functie van het zenuwstelsel verschaft hebben, de meeste vereisen dat de hersenen van Drosophila eerst worden ontleed; zorgvuldige verwijdering van de hersenen is verplicht te houden juiste hersenen morfologie en verbinding patronen tussen hersengebieden. Het volgende protocol gebruikt paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen alsvoorbeeld neuronale populaties als het begeleidt u doorheen de dissectie en immunefluorescentie kleuring van volwassene Drosophila hersenen.

Protocol

1. drosophila melanogaster genetica en optionele Heat Shock Procedures

  1. Opnieuw vliegen hebben overschreden en F1 nakomelingen hebben uitgebroed, krijgen vrouwtjes en/of mannen van het passende genotype. Afhankelijk van de regio van de hersenen onderzocht, vliegen dagelijks moeten worden verzameld en gescheiden door geslacht, zodat afhankelijk van de leeftijd en/of seksueel dimorphic patronen van hersenen connectiviteit meer gemakkelijk kunnen worden onderscheiden.
    Opmerking: Optionele: als vliegen voor Mozaïek analyse worden gebruikt met een Repressible cel Marker (MARCM) analyse 12 , 47, embryo's, larven of poppen moeten warmte geschokt bij 37 ° C gedurende 30-45 min aan Mitotische recombinatie induceren. Om zich te richten op specifieke regio's van de paddestoel organen voor MARCM analyse, moet warmte schok worden getimed volgens het schema bepaald door 12 en uiteengezet in Figuur 5 B. Als u MARCM voor hersengebieden dan de paddestoel organen onderzoeken, moeten proefprojecten worden uitgevoerd om te bepalen van de optimale fase als warmte-geschokt. Terwijl de volgende stappen zijn geschreven in betrekking tot eclosed vliegt, pharate volwassenen kunnen ook worden ontleed met behulp van deze stappen zodra het pop geval heeft verwijderd.

2. Dissectie Station voorbereiding

  1. positie de stereomicroscoop en licht bron met aangesloten fiber optic goosenecks op een grote benchtop. Bevorderen van de gestage handbewegingen te verminderen hand " schudden " terwijl het ontleden, is het van essentieel belang dat voldoende hand en arm rust ruimte beschikbaar rond de Microscoop. Ervoor zorgen dat er ongeveer 8-10 inch aan weerszijden van de Microscoop en 4-6 duim tussen de basis van de Microscoop en de rand van de Bank.
  2. Vulling 2 of 3 putjes van een glas 9-well of 3-well schotel met 1,0 mL PTN buffer (0,1 M natrium fosfaatbuffer pH 7,2, 0,1% nonionic oppervlakteactieve stof, zie materialen tabel voor volledige buffer componenten) en plaats naast het ontleden station op ijs. Nieuw ontleed hersenen zal worden overgedragen aan dit gerecht en kan worden opgeslagen tot de fixatie stap.
    1. Opmerking: als levende imaging vereist is, dissectie buffer moet 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of HL3 buffer 48. Als intracellulaire eiwitten lokalisatie vereist is, kan PBS ook worden gebruikt als een alternatieve buffer voor dissectie en fixatie. Na fixatie, permeabilization van celmembranen moet vervolgens worden uitgevoerd met behulp van PTN wast met 0,1 procent of 0,3% nonionic wasmiddel.
    2. Als PBS wordt gebruikt voor ontledingen en fixatie, Pipetteer tips gespoeld minstens één keer met een wasmiddel-bevattende buffer (zoals PTN) moeten worden om te voorkomen dat hersenen kleven op de plastic pipet tips tijdens de overdracht naar microcentrifuge buizen.
  3. Met behulp van een lege 35 mm glas of kunststof petrischaal, bouwen een dissectie schotel met een silicone-elastomeer. Kortom, het mengen van de componenten van de elastomeer volgens de fabrikant ' s de richtingen, giet in 35 mm gerechten, en laat het polymeriseren 's nachts op een vlakke ondergrond. Elastomeer met dissectie gerechten moet worden gebruikt ter bescherming van de fijne tips van ontrafeling van pincet, die gemakkelijk kunnen worden beschadigd als contact wordt gemaakt tussen de Tang en een harder oppervlak zoals een glazen schotel. Wij kopen ook regelmatig verkrijgbare siliconen gecoat gerechten bij online winkels. Om het contrast te verhogen tijdens dissecties, silicone-elastomeer dissectie gerechten met geïnactiveerd houtskool (en dus gekleurde zwart) zijn vooral handig.

3. Volwassen hersendissectie Procedure

  1. verdoving 3-5 dagen oude volwassen D. melanogaster met CO 2 of met behulp van ijs. Als met behulp van ijs, plaats het flesje ondersteboven vliegen met (stekker uiteinde naar beneden) in een ijsemmer voor ~ 5 min. voor het plaatsen van de flacon in ijs is het ondersteboven voorkomt vliegt van het steeds ingediend in het voedsel. Zodra vliegen hebben al verdoofd, plaats de vliegen op een koud metalen pad of petrischaal vergadering in ijs of op een CO-2 uitstoot van vlieg pad. Oudere vliegen kunnen ook worden gebruikt als ontrafeling van hersenen om te analyseren neurodegeneratie,.
  2. Plaats een kleine hoeveelheid (150-200 µL) van PTN in het midden van de dissectie-schotel met behulp van een pipet overdracht of een pipet p200 maken een " bubble " van PTN. Zet de schotel dissectie onder de stereomicroscoop en aanpassen van de verlichting en richten zodat de luchtbel van PTN het gezichtsveld vult en gelijkmatig brandt.
  3. Vliegen te manipuleren zodat zij " buik omhoog " (d.w.z., ventrale zijde naar boven) liggend op het metaal of CO 2 pad.
  4. Gebruiken een paar #5 pincet, begrijpen de buik van een vlieg te worden ontleed, houden van de greep van de vlieg, volledig onderdompelen het in de PTN op de schotel dissectie.
    Opmerking: Voor de rest van het protocol, alle stappen moeten worden uitgevoerd terwijl het hoofd wordt ondergedompeld in PTN.
  5. Met behulp van een tweede paar #5 pincet, begrijpen van de basis van de proboscis van de vlieg en trek de twee paren van verlostang uit elkaar loskoppelen van het vliegen hoofd uit het lichaam. De buik en borstkas te negeren. Tijdens deze stap is het essentieel dat het hoofd niet is vrijgegeven en kunnen drijven op het oppervlak van de PTN. Zodra het hoofd zweeft, kan het zeer moeilijk te begrijpen opnieuw zonder het breken van de hersenen.
    Opmerking: Het gebruik van deze methode, zijn verbindingen tussen de hersenen en de ventrale zenuw snoer verbroken. Als intact verbindingen tussen deze regio's van het centraal zenuwstelsel vereist zijn, moet een alternatieve dissectie-protocol, zoals 49 , 50, worden gevolgd. Als de snuit is losgekoppeld van het vliegen hoofd voordat het hoofd wordt verwijderd, zal er een gat waar de snuit was. In dit geval, begrijpen de vliegen kop aan de rand van het gat in de buurt van één oog. Verwijder vervolgens het hoofd met behulp van een matige hoeveelheid kracht tijdens het trekken van de twee paren van verlostang naast elkaar. Af en toe, als het hoofd is verwijderd uit het lichaam, de gut en/of buikvinnen zenuw snoer blijft gekoppeld aan het hoofd en moet worden verwijderd voordat u doorgaat de dissectie.
  6. Terwijl een paar Tang de proboscis grijpt, het tweede paar moeten grijpen de mediale rand van het oog recht vliegen. Langzaam, trek de verlostang naast elkaar. Deze stap moet worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid van de constante lateraal kracht. Zoals de verlostang langzaam naast elkaar, moet de proboscis trekken uit de buurt van het hoofd en maak een gat in het midden in de hoofd cuticle. Negeren van de proboscis met de eerste paar pincet zonder het vrijgeven van het mediale gedeelte van het rechteroog van het tweede paar.
    Opmerking: De volwassene D. melanogaster hersenen zijn in de caudal (d.w.z., posterior/achterzijde) regio van het vliegen hoofd. Dus moet grijpen die regio van het hoofd worden vermeden. In het ideale geval alleen de rostraal (d.w.z., voorzijde) gedeelte van het hoofd in de buurt van het mediale netvlies direct moet worden begrepen door de verlostang. De hersenen en de bijbehorende luchtpijp moeten nu worden weergegeven via het centrale gat in de cuticula. Op dit moment witte stringy draden van de luchtpijp uitsteekt uit het gat kunnen worden verwijderd en weggegooid.
  7. Met het tweede paar pincet, begrijpen de mediale rand van het linker netvlies (aan de rand van het centrale gat in de hoofd schubbenlaag). Als u wilt verwijderen van het netvlies en de bijbehorende cuticula, Trek langzaam de verlostang afstand van elkaar in een hoek van 180 °. Als het netvlies van de onderliggende optic kwab distantieert, moet u een lichte afname van de spanning voelen. Langzaam gaan om te voorkomen dat de optiek kwab scheuren.
    Opmerking: Scheiden van de verlostang te snel tijdens deze stap kan leiden tot het scheuren van the optic lobe of verstoring van de paddestoel lichaam structuren. Af en toe, de schubbenlaag wordt verwijderd maar stukken van het netvlies blijft gekoppeld aan de optiek kwab. Als de paddestoel organen imaging, is het niet volstrekt noodzakelijk is om het gehele netvlies. Analyse van andere hersengebieden (zoals netvlies neuron innervatie van de optische hersenen lobben arm) kan echter het netvlies volledig verwijderd zoals beschreven door 48 , 51.
    Opmerking: Als het netvlies langzaam van de onderliggende optic kwab van de hersenen gescheiden wordt, de optic kwab moet waarneembare als een ondoorzichtig wit structuur bedekt met wit, stringy luchtpijp. Zodra een netvlies is verwijderd, kan het worden weggegooid. Bij het analyseren van vastloper van retinale neuronen, moet bijzondere aandacht tijdens deze stap worden genomen ter voorkoming van schade aan de optiek kwab. Een aanvullend protocol gericht op dissectie en live beeldvorming van de fotoreceptor neuronen is ook beschikbaar 48.
  8. Nu zorgvuldig Verwijder zo veel van de zichtbare luchtpijp mogelijk. De luchtpijp kan al bevatten of later vullen met lucht, waardoor de hersenen te zweven en, potentieel, verloren tijdens latere immunokleuring stappen. Schakel de luchtpijp, kies het uit de hersenen met behulp van een zeer scherp van #5 verlostang.
  9. Verwijder de resterende netvlies en omliggende cuticula met behulp van beide paren van de verlostang om te begrijpen van de mediale regio van het linker vliegen netvlies. Zorgvuldig het scheuren van het netvlies doormidden om stukken van het netvlies en de schubbenlaag. In sommige gevallen het verwijderen van de resterende cuticle zonder het breken van de hersenen blijkt vooral een uitdaging. In deze gevallen hebben we gevonden dat de resterende onderdelen van het ventrale zenuw snoer in plaats daarvan kunnen worden begrepen door een paar pincet terwijl het andere paar pincet wordt gebruikt voor het zorgvuldig verwijderen van de laatste van de cuticle bestaat.
  10. Ontleed hersenen met behulp van een precisiepipet p200, verplaatsen naar een waterput van de 9 - of 3-well schotel met PTN. Hersenen dezelfde genotype moeten worden samen gebundeld in hetzelfde goed en bewaard op ijs. Hersenweefsel moet worden vastgesteld binnen een uur van dissectie. Hersenen kunnen worden vastgesteld in kleine batches en gebundeld als een groter aantal hersenen vereist is. In de meeste gevallen een ervaren onderzoeker kan meestal ontleden een brein en het overbrengen van de schotel collectie glas in ongeveer 3-5 min.

4. Fixatie en immunefluorescentie kleuring Procedure

  1. ontleed hersenen van de 9-well-schotel met behulp van een pipet p200, overbrengen naar een 0,5 mL microcentrifuge buis gevuld met 0,5 mL 4% paraformaldehyde verdund in PTN. Minstens 10-15 hersenen dezelfde genotype kunnen worden gecombineerd tot één microcentrifuge buis. Alle resterende stappen (tot en met montage van hersenen in dia's) zijn voltooid in 0,5 ml microcentrifuge buizen.
    Let op: Paraformaldehyde (PFA) moet worden behandeld in een zuurkast. PFA afval moet worden opgeslagen en de juiste manier ingeleverd worden. 20% paraformaldehyde gekocht in glas stimulatiedosis kunnen aliquoted in microcentrifuge buizen en opgeslagen bij-20 ° C totdat nodig.
  2. In een zuurkast, incubeer hersenen in 4% paraformaldehyde voor 20 min met trage schommelen bij kamertemperatuur.
  3. Na fixatie, toestaan hersenen om af te wikkelen naar de onderkant van de buis van de microcentrifuge door de zwaartekracht.
    Opmerking: Soms kunnen de hersenen vasthouden aan de kant van de microcentrifuge buis. Als dit gebeurt, is het meestal handig om te lateraal draaien de buis tussen de wijsvinger en de duim of heel zachtjes tikt de buis op de Bank te bevorderen tot zinken brengen van de hersenen.
  4. -Fixeerspray verwijderen met behulp van een p1000 Pipetteer en het uitvoeren van twee " snel " wast met 500 µL van PTN, waardoor de hersenen te vestigen aan de onderkant van de buis van de microcentrifuge tussen de wasbeurten. Tijdens deze snelle wast, zodra alle de hersenen hebben geregeld door de zwaartekracht naar de onderkant van de buis van de microcentrifuge, de PTN kan worden onmiddellijk worden ingewisseld voor verse buffer; geen extra wassen tijd is vereist.
    Opmerking: Extra buffer verlaten in de buis is doorgaans beter te riskeren hersenen verwijdering. Zorgvuldig onderzoek van het uiteinde van de Pipet is vaak nodig om ervoor te zorgen dat geen hersenen per ongeluk zijn verwijderd uit de buis. Als hersenen per ongeluk afgepipetteerde in de tip geweest, afzien ze terug in de microcentrifuge-buis, wachten op de hersenen te regelen en gaat u verder met het verwijderen van eventuele extra PTN die blijft.
  5. Na de laatste snelle wash, een p1000 pipet te gebruiken voor het uitvoeren van drie " lange " wast: Voeg 500 µL van PTN en wassen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een rocker/nutator. Alle toekomstige " lange " wast moet voor 20 mins.
    Opmerking: Na deze wast, vaste hersenen kan worden opgeslagen 's nachts bij 4 ° C in PTN.
  6. Verwijderen van de laatste wassen met behulp van een precisiepipet p1000 en hersenen op een rocker of nutator bij kamertemperatuur in 0,5 mL van het blokkeren van de oplossing [PTN + 5% normale geit serum (NGS)] gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    1. Geit secundaire antilichamen worden gebruikt in latere protocol stappen. Als secundaire antilichamen van een andere soort zal worden gebruikt, de normale serum van die soorten (i.p.v. NGS) moet worden gebruikt in de blokkeren en antilichaam oplossingen.
  7. Met behulp van een pipet p1000, blokkerende oplossing verwijderen en toevoegen van het primaire antilichaam verdund in PTN (PTN + 5% NGS + verdunde primair antilichaam). Wanneer u een primair antilichaam voor de eerste keer, de optimale verdunning van dat antilichaam empirisch dient te worden bepaald.
    Opmerking: Voor het visualiseren van paddestoel lichaam neuronen, worden antistoffen herkennen Fas2 worden doorgaans gebruikt. Deze antilichamen zijn beschikbaar vanaf de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) als antilichaam 1 d 4 en moeten verdund 1:20 PTN + 5% NGS.
    Opmerking: Voor het visualiseren van fotoreceptor neuronen, worden antistoffen herkennen chaoptin worden doorgaans gebruikt. Chaoptin antilichamen zijn verkrijgbaar bij de DSHB als antilichaam 24B10 en moeten verdund 1:20 PTN + 5% NGS.
    Opmerking: De fixatie proces meestal elimineert fluorescentie uit fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescente proteïne (GFP). Daarom, wanneer u MARCM voor het analyseren van axonale begeleiding van individuele MB neuronen, gebruiken een antilichaam herkennen GFP.
  8. Hersenen in primair antilichaam oplossing op een rocker/nutator Incubeer gedurende 2-3 nachten bij 4 ° C.
  9. Na incubatie met primaire antilichamen, toestaan hersenen te regelen naar de onderkant van de buis van de microcentrifuge en verwijder vervolgens de oplossing primair antilichaam.
  10. 2 met behulp van een precisiepipet p1000 uitvoeren " snel " wast en 3 " lange " 20 min wast met 0,5 mL PTN, zoals hierboven beschreven in stap 4.4 en 4.5, zorgvuldig zodat hersenen om te regelen door de zwaartekracht naar de onderkant van de buis van de microcentrifuge tussen elke wash.
  11. Incubate hersenen gedurende 3 uur bij kamertemperatuur met passende fluorescently-geëtiketteerden secundaire antilichamen. Secundaire antilichamen zijn gewoonlijk verdund in 0,5 mL PTN + 5% NGS bij een concentratie van 1:200.
    Opmerking: Zodra fluorescerende secundaire antilichamen zijn toegevoegd, moeten de hersenen worden gehouden in het donker voor de rest van het experiment.
    Opmerking: In geval resterende GFP fluorescentie blijft, bij het uitvoeren van de analyse van de MARCM is het raadzaam om het gebruik van een secundair antilichaam aangeduid met een soortgelijke excitatie/emissie golflengten aangezien GFP fluorophore (bijvoorbeeld, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) of Alexa488).
  12. Na secundair antilichaam-incubatie, toestaan hersenen te regelen naar de onderkant van de buis van de microcentrifuge en verwijder de secundair antilichaam oplossing.
  13. Voeren 2 " snel " wast en 3 " lange " 20 min wast met 0,5 mL PTN, zoals hierboven beschreven in stap 4.4 en 4.5, zorgvuldig zodat hersenen om te betalen aan de onderkant van de buis van de microcentrifuge tussen elke wash.
  14. Na de derde " lange " 20 min wassen, gebruik een pipet p200 om zoveel buffer mogelijk.
  15. Toevoegen 75 µL van fluorescerende anti-fade montage medium naar de hersenen. Pipetteer hersenen en montage medium in de pipet tip eens te mengen. Doen de buis niet omkeren aangezien hersenen kunnen worden geplakt op de dop of zijden van de buis microcentrifuge.
    Opmerking: Na schorsing van hersenen in montage medium, buizen kunnen worden verpakt in aluminiumfolie voor zacht fluorophore blussen en opgeslagen bij 4 ° C's nachts. Als nodig, hersenen kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen bij 4 ° C, maar idealiter moet worden gemonteerd op de dia's zo spoedig mogelijk.

5. Montage van volwassen D. melanogaster hersenen op Microscoop dia's en Imaging

  1. bouwen een " brug " dia. Plaats twee " basis " coverslips ongeveer 1 cm uit elkaar op een positief geladen dia. Zorg ervoor dat de positief geladen kant van de dia is naar boven. Houden de coverslips aan de dia met de vingernagel Pools zoals aangegeven in Figuur 3 A. Is het meestal handig voor het afdichten van de drie buitenranden van elk base cover slip met nagel lak om montage van media niet doet pit onder deze base cover slips. Laat vingernagel Pools volledig drogen (10-15 min) voordat u verdergaat.
  2. Plaats van de dia onder de stereomicroscoop en Pipetteer de montage media oplossing met de ontleed hersenen in de ruimte tussen de twee coverslips. Om meer contrast, is het nuttig om te manoeuvreren de zwanenhals verlichting zodat zij parallel met de bovenkant van de bench.
  3. Verwijderen extra montage media van de dia met behulp van een precisiepipet, dat evenwel niet tot de hersenen van de dia wegslepen Pipetteer.
  4. Wick weg extra montage media. Hierdoor kunnen de hersenen kunnen worden gepositioneerd nauwkeuriger tijdens de volgende stap.
  5. Met behulp van een verlostang of de stereomicroscoop, plaatst u de hersenen op de dia in een rasterpatroon met antennal lobben geconfronteerd met omhoog
  6. Plaats een cover slip (de " brug ") over de hersenen ( Figuur 3 A). Vingernagel Pools te gebruiken voor het afdichten van de zijkanten van de brug cover slip waar zij contact opnemen met de " basis " cover slips.
  7. Met behulp van een precisiepipet p200 langzaam vullen de center-holte onder de brug met verse montage media ( Figuur 3 B). Plaats van één druppel tegelijk op de open rand van het dekglaasje center aan en laat de montage media pit onder de center brug dekglaasje aan. Totdat de gehele holte is gevuld met de montage van de media, dan zegel van de bovenkant en onderkant met duidelijke vingernagel Pools.
  8. Zodra de vingernagel Pools droog is, het beeld van de dia's onmiddellijk of op te slaan in een Svetonepronitsaemyi strak dia doos bij -20 ° C.
  9. Binnen een week, image hersenen met behulp van een laser-scanner confocal microscoop met excitatie lasers & filteren kubussen passend aan de gekozen fluorescerende secundaire antilichamen. Z-stack beelden van paddestoel lichaam neuronen zijn doorgaans verkregen met behulp van 20 X of 40 X doelstellingen. Beeldvorming van retinale fotoreceptor neuronen mogelijk hogere vergroting.

Representative Results

De hierboven beschreven methode voorziet in de betrouwbare en reproduceerbare visualisatie van vrijwel elke regio van de hersenen Drosophila volwassen. We hebben hier gericht op de paddestoel organen en fotoreceptor neuronen, maar andere studies hebben soortgelijke methoden gebruikt om te visualiseren hersengebieden zoals de pars intercerebralis52, klok neuronen53,54, en antennal kwab projectie neuronen55, onder vele anderen. Nog belangrijker is, kan deze techniek worden gebruikt om te visualiseren zowel hele breinstructuur evenals individuele neuronen binnen deze structuren met behulp van technieken zoals MARCM12,47. Figuur 4 Figuur 5en Figuur 6 worden verschillende soorten gegevens van paddestoel organen en fotoreceptor neuronen in volwassen hersenen die kunnen worden gegenereerd met behulp van deze techniek dissectie en immunokleuring weergeven.

Eerst, kan de hierboven beschreven methode direct visualiseren paddestoel lichaam morfologie met antilichamen die Fasciculin 2 (Fas2 herkennen) of via reporter genen uitgedrukt in champignon lichaam neuronen34worden gebruikt. Zoals weergegeven in Figuur 4A en figuur 4B, Fas2 antilichamen kunnen worden gebruikt voor het visualiseren van de α, β, en (in mindere mate) γ lobben van de paddestoel organen in volwassene Drosophila hersenen. Fas2 is een cel-cel adhesie-eiwitten nodig voor neuron Fasciculatie en wordt uitgedrukt op een hoog niveau in de α en β lobben23,56,,57, waardoor het een betrouwbare en gerenommeerde markering van deze paddenstoel lichaam neuronen. Met name kan het circulaire-vormige ellipsoïde lichaam ligt in de centrale regio van de volwassen hersenen ook worden gevisualiseerd met behulp van dit antilichaam (Figuur 4A).

Defecten in axonale begeleiding eiwitten veroorzaken vaak onvolledig penetrant paddestoel lichaam mutant fenotypen15,34,35. Daarom, in de meeste gevallen verscheidene dozijn hersenen moeten beeld en geanalyseerd. Bijvoorbeeld, kruis de paddestoel lichaam β kwab axonen van Nab2 null vliegen ten onrechte de middellijn van de hersenen. Deze "overschrijding" of β kwab "fusion" fenotype wordt meestal waargenomen in ~ 80% van de volwassen Nab2 null vliegt maar is voornamelijk afwezig van wild-type besturingselementen en kunnen worden ingedeeld als lichte, matige of voltooien van fusion34. De "fusion" van β kwabben over de middellijn vloeit voort uit de onjuiste contralaterale projectie van axonen in de tegenovergestelde hersenhelft. Zoals afgebeeld in Figuur 4C en gedetailleerde in34,35, verwijst lichte fusion naar β lobben verbonden door een "dunne strand van Fas2-positieve vezels," terwijl matige fusion naar meer wezenlijk verbonden β lobben verwijst die een licht verminderde kwab dikte toont op de middellijn. Volledige (of "extreme") fusion verwijst naar β lobben die volledig zijn aangesloten en tonen geen afname van de kwab dikte of Fas2 kleuring op de middellijn. De omvang van de paddestoel lichaam β kwab fusie kan worden gekwantificeerd en weergegeven zoals aangetoond in 34,35 , of als een tabel met het percentage van de hersenen tonen van elk type morfologie defect.

Naast de kleuring met Fas2 antilichamen, de MARCM techniek12,47,48 ook bruikbaar om te visualiseren axon beslissingen van de begeleiding van individuele GFP+ neuronen binnen de paddestoel lichaam lobben. MARCM maakt gebruik van Mitotische recombinatie tijdens ontwikkeling maken individuele neuronen of klonaal verwante groepen van neuronen, gemarkeerd met GFP (Figuur 5A). MARCM biedt een manier voor het genereren van een klein aantal neuronen die volledig ontbreken van een proteïne in een anders heterozygoot vlieg. Als zodanig is deze techniek vooral nuttig bij het analyseren van de axonale begeleiding functies van proteïnen toe die ook essentieel voor algemene organisch levensvatbaarheid12,47 zijngeweest. Homozygoot null neuronen gemarkeerd met GFP kunnen rechtstreeks worden vergeleken om te bepalen van neuronen gemarkeerd met GFP in een genetische achtergrond van wild-type. Bovendien, afhankelijk van wanneer ontwikkelende larven of poppen warmte-geschokt zijn, verschillende soorten paddestoel lichaam neuronen kunnen worden gericht (Figuur 5B).

Een voorbeeld van het soort gegevens die zijn gegenereerd met behulp van deze techniek is afgebeeld in Figuur 5C, waar wild-type (dat wil zeggen, controle) MARCM klonen zijn gegenereerd als voorbeeld. Voor het genereren van de individuele GFP+ paddestoel lichaam neuronen afgebeeld in Figuur 5C, ontwikkeling van de F1 waren larven aanvankelijk gehuisvest bij 25 ° C. Ongeveer 5-6 dagen na het larvale uitkomen (ALH), poppen werden warmte geschokt gedurende 30 minuten bij 37 ° C en keerde daarna terug naar 25 ° C tot eclosion. Na volwassen broedeieren, hersenen werden ontleed in PTN, vaste en gelijktijdig geïncubeerd met antilichamen Fas2 herkennen (1 d 4, verdund 1:20 in PTN) en GFP (verdunde 1:500 in PTN). Hersenen waren vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen en gemonteerd op dia's zoals hierboven beschreven. GFP+ cellen werden geïdentificeerd en beeld met behulp van een laser-scanner confocal microscoop en maximumlichtsterkte projecties werden gemaakt met behulp van ImageJ. Zoals aangetoond in Figuur 5C, controle GFP+ neuronen gegenereerd in de α en β lobben colocalize met Fas2 en beëindigen voordat u contact opneemt met de middellijn die de twee hemisferen van Drosophila hersenen scheidt. Een enkele axon projecten anteriorly, bifurcates, en vervolgens projecten zowel dorsally en mediaal vorm de α en β lobben. Verscheidene vorige studies hebben deze techniek gebruikt om te onderzoeken of bepaalde eiwitten nodig zijn om te studeren celdeling autonoom voor vele aspecten van axonogenesis, met inbegrip van uitbreiding, vastloper, vertakking, en/of snoeien10, 11,12,13,14,15,16,17,34.

Naast de paddestoel organen kunnen de axonale vastloper besluiten van retinale fotoreceptor neuronen (R-cellen) ook worden gevisualiseerd met behulp van de methode van de dissectie beschreven hierboven (en door de methode dissectiegeschreven in verwijzing48). Elke ommatidia binnen het vliegen oog bevat 8 fotoreceptor neuronen die kunnen worden ingedeeld in drie groepen (Figuur 1): R1-R6 cellen, die axonen aan de oppervlakkige lamina van de hersenen optic kwab uitsteken; R7 cellen, die axonen naar de diepere laag van de M6 van de medulla uitsteken; en R8 cellen, die axonen aan de tussenliggende M3 laag van de medulla19,-58 uitsteken. Het patroon van de projectie van elke categorie van fotoreceptor is uitgebreid onderzocht en samen deze neuronen zijn met succes gebruikt als een model om te begrijpen van de betrokken bij axon begeleiding19,59signaalroutes. Nog belangrijker is, alle fotoreceptor axonen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in ontleed Drosophila hersenen door immunokleuring van de volwassene, pop, of larvale weefsels met behulp van een antilichaam dat herkent chaoptin, een cel oppervlakte glycoproteïne24, 60 , 61. reporter genen uiting van GFP of β-galactosidase in elke R-celtype (R1-R6, R7 en R8 cellen) zijn ook aangelegd en kan worden gebruikt voor het visualiseren van elke klasse van fotoreceptor62. Omdat elk type R-cel in een andere laag van de ontwikkelingslanden optic kwab eindigt, hebt deze verslaggevers voor gedetailleerde vergelijkingen van de signaalroutes vereist voor elk celtype correct vinden haar doelstelling toegestaan. Een voorbeeld van de expressiepatronen geproduceerd door twee van deze genen verslaggever in combinatie met chaoptin localisatie (die kan worden gebruikt als een marker van alle fotoreceptor neuronen) wordt weergegeven in Figuur 6. Om te visualiseren R7 researchdieren, waren de hersenen met de R7-specifieke Rhodopsin4-LacZ -reporter gene ontleed en gekleurd met antilichamen tegen chaoptin en β-galactosidase. Rodopsine 4 (Rh4) wordt uitgedrukt in een subset van de R7 cellen63; de promotor van de Rh4 kan daarom worden gebruikt om te rijden verslaggever genexpressie in alleen deze cellen. Zoals verwacht, beëindigen R7 cellen in de diepere laag van de M6 van de medulla (aangeduid met een gele stippellijn Figuur 6). Evenzo hersenen uiting van β-galactosidase van de promotor van rodopsine 6 (Rh6), die zich specifiek in de R8 researchdieren63, werden ontleed en immunostained met behulp van de antistoffen herkennen van chaoptin en Β-galactosidase. Zoals aangegeven in Figuur 6, R8 researchdieren beëindigd op de R3-laag van demedulla. Hoewel hier niet getoond, kan Rh1-LacZ ook worden gebruikt om te visualiseren van de beëindiging van de R1-R6 researchdieren in de lamina.

Figure 1
Figuur 1: De volwassene Drosophila melanogaster hersenen bestaat uit functioneel verschillende, maar onderling verbonden gebieden. (A) een schets van de volwassen D. melanogaster hersenen wordt getoond, aandacht voor de centraal gelegen paddestoel organen en perifere Retina fotoreceptor neuronen. (B) uitgebreide diagram van de volwassen paddestoel lichaam axon bundels (ook wel lobben) die worden herkend door Fas2 antilichamen. De intrinsieke neuronen van de paddestoel organen, Kenyon cellen, genaamd project axonen anteriorly van dorsally gelegen cel organen (cel organen weggelaten uit dit diagram) en vormen van verschillende kwab structuren. In de volwassen hersenen, de γ lobben (aangegeven in rood) vorm van een enkele mediale bundel van axonen, terwijl de dorsale α en mediale β lobben (aangegeven in blauw) vorm van een enkele axon bifurcates die tijdens de vastloper. Α ' / β' neuronen ontwikkelen axonale lobben die gedeeltelijk overlappen met die van α/β neuronen, maar worden niet herkend door Fas2 antilichamen en worden weggelaten uit dit diagram. (C) retinale neuronen zijn kritisch in het doorgeven van visuele informatie van het netvlies aan de optiek kwab. Axonen project van cel instanties in het netvlies (beige) en de vorm van verbindingen met post synaptic doelcellen in de lamina of medulla. R1-R6 fotoreceptor cellen (rood weergegeven) vorm van specifieke verbindingen met cellen in de buitenste laag van de optiek kwab, genaamd de lamina. R7 fotoreceptor cellen (geel) Synaps met doelen in de laag van de M6 van de medulla, terwijl R8 cellen (afgebeeld in groen) axonen aan de iets meer oppervlakkige M3 laag van de medulla project. Deel C aangepast met toestemming van Macmillan Publishers Ltd: Nature Neuroscience (verwijst naar64, copyright (2011)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: De GAL4/UAS systeem kan worden gebruikt voor gerichte genexpressie. Met het oog op een uiting van een gen van belang ("Gene X") in een bepaald patroon van weefsel vliegen, moeten vliegen bevatten een uiting van het eiwit transcriptionele activator Gal4 onder de controle van een specifieke versterker van weefsel transgenic zowel een transgenic met het DNA van de Gal4 bindende sequentie (genoemd de Upstream activeren sequentie of UAS) grenzend aan Gene X. meestal, deze combinatie wordt bereikt door paring ouderlijke vliegen bevatten elk een transgenic en selecteren voor F1 nakomelingen die beide bevatten. In de resulterende F1 generatie, Gal4 zal worden uitgedrukt en wordt gebonden aan de UAS transcriptie van Gene X activeren op een specifieke wijze van weefsel. Nog belangrijker is, kan verschillende UAS-bevattende transgenen worden gebruikt in combinatie met de zelfde GAL4 "driver". Bijvoorbeeld, kan een transgenic uiting van Gal4 in de paddestoel organen (MBs) worden gecombineerd met een UAS-bevattende transgenic uitdrukkelijke GFP, een transgenic die klopt beneden uitdrukking van een gen van belang met behulp van RNA-interferentie of een UAS-transgenic die een verslaggever produceert. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Montage van de hersenen ter voorbereiding van immunofluorescentie imaging. (A) hersenen zijn gemonteerd op SuperFrost Plus dia's met een cover van de brug om te voorkomen dat de afvlakking van de hersenen. Twee "base" cover-slips zijn vastgehouden aan een Superfrost Plus positief-geladen dia met duidelijke nagel lak en ontleed hersenen worden vervolgens op de dia ertussen geplaatst. Een duidelijke "brug" cover slip wordt geplaatst boven de hersenen en de base cover slips in acht genomen. (B) eenmaal de vingernagel Pools is opgedroogd, is langzaam afgepipetteerde Vectashield onder de brug voor het behoud van de fluorescentie van het secundaire antilichaam. Duidelijke vingernagel Pools wordt vervolgens gebruikt voor het afdichten van de boven- en onderkant van de "brug" cover slip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Paddestoel lichaam axonen kunnen duidelijk worden gevisualiseerd met behulp van antilichamen die Fas2 herkennen. (A) volwassen Drosophila hersenen werden ontleed, vaste en geïncubeerd met antistoffen herkennen van Fas2. Primaire antilichamen werden herkend met behulp van Alexa488-coupled geit-anti-muis secundaire antilichamen en hersenen waren gemonteerd op positief-geladen dia's en beeld met behulp van een laser confocal microscoop scannen. Bisymmetrically gelegen paddestoel lichaam cel organen axonen anteriorly uitbreiden, splitsen en vormen van axon bundels (ook wel lobben). Axonen die de dorsally projecteren α lobben en mediaal projecteren β lobben vormen express Fas2. Kritisch, beëindigen β lobben van wild-type vliegen voordat de middellijn van de hersenen. Het centraal gelegen ellipsoïde lichaam kan ook worden gevisualiseerd met behulp van de 1 d-4 antilichaam. (B) de mediaal-projecteren γ kwab axonen van de volwassen Drosophila paddestoel lichaam ook express Fas2 en kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de 1 d-4 antilichaam. Typisch, de uitdrukking van Fas2 in γ kwab axonen is minder dan die van de α en β lobben. (C) de paddestoel lichaam axonen van Nab2-null hersenen (genotype: Nab2ex3/Nab2ex3) mis contralaterally project en ontbreekt het vaak aan lobben. Nab2-null hersenen werden ontleed, vaste en gekleurd met de 1 d-4 antilichaam te visualiseren paddestoel lichaam α, β en γ lobben. Maximale intensiteit Z-stack projecties ook als individuele optische secties op de regio schouderstreek gericht worden weergegeven. Terwijl wild-type paddestoel lichaam β kwab axonen zelden de middellijn van de hersenen overschrijden, hebben Nab2-null hersenen wisselende hoeveelheden mis projectie over de middellijn in de contralaterale hersenhelft, wat resulteert in "gesmolten" β lobben. Zoals gedefinieerd in verwijzingen34,35, milde fusion verwijst naar < β lobben alleen verschillende "onderdelen" van axonen overschrijding van de middellijn, matige fusion verwijst naar situaties waar Fas2 positieve β kwab neuronen kruisen de hersenen middellijn maar β kwab breedte aan de middellijn is gedaald, en volledige fusie verwijst naar situaties waar er geen vermindering van β kwab dikte is als de lobben Kruis de middellijn van de hersenen. Aangezien de ellipsoïde lichaam ook Fas2 spreekt, optische gedeelten met de middellijn zijn vaak meer nuttig bij het visualiseren van β kwab fusion. Met name zijn ontbrekende lobben ook vaak waargenomen (hier aangeduid met het witte sterretje). Gegevens in deel C wordt gebruikt in de kwantificering van de paddestoel lichaam fenotypes van referentie34, met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : MARCM kan worden gebruikt voor het visualiseren van de axonen van één neuronen. (A) mozaïek analyse met een Repressible cel Marker (MARCM) gebruik FLP recombinase-gemedieerde Mitotische recombinatie bij FRT sites maken twee verschillende dochtercellen. In dit voorbeeld bevatten alle cellen een paddestoel lichaam-specifieke GAL4 eiwit op een aparte chromosoom. Mitotische recombinatie tijdens de celdeling, naar aanleiding van een dochtercel (boven) spreekt GFP (of het membraan gebonden CD8-GFP) en bevat twee mutant allelen van een gen van belang, terwijl de andere dochtercel (onder) twee allelen van wild-type (WT erft) en een Transgenic uiting van het eiwit van de Gal80 met behulp van een promotor tubuline. Gal80 remt de Gal4, zodat alle cellen produceren Gal80 niet-belichting fluorescerende zullen en heterozygoot of homozygoot wild-type moeten. Alleen de cellen die GFP+ zijn zal bevatten twee kopieën van de mutant allel. Dat is slechts één van de verschillende methoden voor het opwekken van GFP+ cellen ook met twee gemuteerde allelen van een gen van belang weergegeven; Raadpleeg12,45,56 voor andere voorbeelden. (B) omdat de ontwikkeling van neuronen van de paddestoel lichaam begint met γ neuronen, dan α'/ β' neuronen, en eindigt met α/β neuronen, elke klasse van neuron selectief kunnen worden gericht en gevisualiseerd door hitte schokkend op verschillende ontwikkelings tijd punten. Zoals beschreven in 12, een schok warmte 40 minuten bij 37 ° C dat optreedt ≤2.5 dagen na larvale broedeieren (ALH) specifiek γ gericht zal, neuronen, terwijl de warmte schok dat 3,5-4,5 dagen ALH (in de late L3 larvale stadium) optreedt zal richten op α'/ β' neuronen, en een warmte schok die o ccurs tussen 5-7 dagen ALH (tijdens pop ontwikkeling) is gericht op α/β neuronen. (C) individuele wild-type axonen waren gevisualiseerd met behulp van MARCM. Wild-type ~ 5-6 daagse oude poppen (genotype: hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, Bad > Gal80; OK107-GAL4/+) waren warmte geschokt bij 37 ° C gedurende 40 minuten voor het opwekken van de Mitotische recombinatie. Hersenen zijn ontleed, vaste en gekleurd met antistoffen herkennen GFP (1:500) en Fas2 (1:20). Hersenen werden vervolgens geïncubeerd met fluorescently geëtiketteerde secundaire antilichamen en gevisualiseerd door confocale microscopie. In dit voorbeeldgegevens uit een "control"-genotype, GFP positieve cellen gegenereerd met behulp van MARCM zijn wild-type en in plaats van tweemut allelen van het gen bevatten, bevatten tweeWT allelen van het gen. Paddestoel lichaam β lobben (gevisualiseerd met behulp van de antistoffen herkennen Fas2) beëindigen alvorens de middellijn van de hersenen; Α kwab neuronen zijn ook aanwezig. Om te tonen meer detail, wordt een ingezoomd met het oog op een één hersenhelft weergegeven in de onderste rij van beelden. Deel C werd aangepast met toestemming van referentie34. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Fotoreceptor axonen kunnen ook worden gevisualiseerd. Volwassene hersenen waarin β-galactosidase in R7 researchdieren (links, met behulp van Rh4-LacZ) of R8 researchdieren (rechts, met behulp van Rh6-LacZ) werden ontleed, vaste en geïncubeerd met antistoffen herkennen van β-galactosidase of chaoptin. Hersenen werden vervolgens geïncubeerd met fluorescently geëtiketteerde secundaire antilichamen en gevisualiseerd door laser scanning confocal microscopie. Interne optische secties worden weergegeven van elke hersenen. Aan de linkerkant, kunnen verschillende R7 fotoreceptor axonen (pijlen) worden gezien in de diepere laag van de M6 van de medulla (zie afbeelding door de gele stippellijn) beëindigen. Aan de rechterkant uitkomen R8 fotoreceptor axonen (pijlen) in de buitenste laag van de M3 van de medulla (zie afbeelding door de groene stippellijn). Aangezien R7 researchdieren express ofwel Rh3 of Rh4 en R8 researchdieren express Rh5 of Rh663, kunnen niet alle R7 of R8 researchdieren worden gevisualiseerd met behulp van een enkel LacZ verslaggever gen. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De dissectie en visualisatie hierboven beschreven methode kan worden gebruikt in een breed scala van immunokleuring en beeldbewerkingstoepassingen leven. Wij een algemene immunokleuring protocol heb geschetst en hebben gewezen op een manier waarin MARCM kan worden gebruikt voor het visualiseren van axonale morfologie van individuele paddestoel lichaam neuronen. Bovendien, deze algemene procedures kunnen ook worden gebruikt voor andere hersengebieden in vaste imaging of vers ontleed volwassene hersenen48,65. Levende imaging voorschrijven een efficiëntere aanpak bij het analyseren van expressiepatronen enhancer vallen, of reporter genen, MiMIC lijnen66, bijvoorbeeld. Om te voorkomen dat artefacten van celdood tijdens live beeldvorming van GFP in nietgefixeerde weefsel vastleggen, hersenen moeten worden ontleed in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of HL3 media48, gemonteerd op brug dia's in 1 x PBS (of HL3) en beeld in minder dan 15-20 min. Zorg moet ook worden genomen om het verwijderen van zoveel luchtpijp mogelijk van de ontleed hersenen vóór imaging, aangezien het met de visualisatie van GFP fluorescentie interfereren kan.

Terwijl kleuring voorwaarden voor de beoordeling van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen relatief gevestigde24,61,67, de lokalisatie van een specifieke proteïne van belang in deze cel zijn typen kunnen vereisen uitgebreide probleemoplossing en optimalisatie. Verschillende kritische stappen, met inbegrip van antilichaam verdunning, blokkerende buffer component concentratie en fixatie, moeten met name worden geoptimaliseerd voor het genereren van de meest reproduceerbaar en betrouwbare resultaten. Ten eerste, de optimale concentratie van primair antilichaam moet worden bepaald. Hoewel verkrijgbare antilichamen vaak een voorgestelde verdunning hebben (en we vaak in eerste instantie beginnen met behulp van die concentratie), wordt deze waarden worden zelden empirisch bepaald op Drosophila weefsels. Dus, het testen van een reeks verdunningen van primair antilichaam dat bereik boven en onder de fabrikant startende suggestie vaak in meer specifieke kleuring resulteert. Terwijl verdunning van het primaire antilichaam kan een significant effect hebben op kleuring van nauwkeurigheid en nauwkeurig moet worden bepaald, de hersenen van de tijd worden geïncubeerd in primair antilichaam bevattende kunnen oplossingen aanzienlijk variëren met weinig effect op het eindresultaat. Bijvoorbeeld, hebben we vergelijkbare resultaten waargenomen wanneer het broeden ontleed hersenen met de Fas2 antilichaam primair antilichaam voor twee, drie of zelfs vier dagen bij 4 ° C. Hoewel we ten minste twee nachten aanraden, hebben wij ook hersenen in primair antilichaam oplossing voor een enkele nacht geïncubeerd en verkregen reproduceerbare kleuring. Nog belangrijker is, helpt beperking van de hoeveelheid tijd hersenen worden geïncubeerd in het secundaire antilichaam tot 3 uur op kamertemperatuur (of één nacht bij 4 ° C) limiet niet-specifieke binding van secundaire antilichamen aan hersenweefsel.

Ten tweede, kan het nodig met extra "blokkeren" reagentia te elimineren van ongewenste achtergrond signaal zijn. Opties omvatten verhoging van de concentratie van NGS ~ 10%, 1-10% boviene serumalbumine (BSA) toe te voegen aan de blokkerende en primaire/secundaire antilichaam oplossingen, of pre adsorptie van primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C met Drosophila embryo's (Zie verwijst naar68, punt 2.9, stap 3).

Terwijl we het bovenstaande protocol gebruikt PTN als de voorgestelde buffer voor alle fixatie hebben geschreven, wassen, en antilichaam-incubatie stappen, weefsel fixatie in andere buffers (zoals PLP en PEM, vermeld in de Materialen tabel) kan leiden tot diepgaande verschillen in de sterkte van het signaal. Bijvoorbeeld, hebben vorige studies aangetoond dat cycline E niet detecteerbaar in larvale imaginaire schijven is wanneer weefsels worden opgelost in traditionele 4% paraformaldehyde verdund in PBS, maar duidelijk zichtbaar is wanneer weefsels worden opgelost in PLP buffer (Ken Moberg, persoonlijke communicatie en verwijzing69). Naast wijzigingen in buffer componenten, wijziging van de tijd en temperatuur voor weefsel fixatie ook aanzienlijk immunefluorescentie beïnvloeden kan kleuring en empirisch kan worden bepaald indien nodig. In het algemeen, fixatie tijd moet lang genoeg om te voorzien in voldoende crosslinking van cellulaire componenten en onderhoud op lange termijn van algemene cellulaire morfologie terwijl ze beperkt genoeg om te voorkomen dat over-crosslinking en "begraven" van eiwit epitopes. Daarom, wanneer aanvankelijk optimaliseren kleuring voorwaarden voor een nieuw verworven primair antilichaam, we meestal beperken fixatie tijd aan ongeveer 20 min en koudere temperaturen vaak weefsels zal vaststellen.

Meerdere besturingselementen moeten worden opgenomen in eventuele immunofluorescentie experiment te onderzoeken van de specificiteit van de primaire en secundaire antilichamen en het effect van transgenen/genetische achtergrond op het waargenomen fenotype. Om na te gaan of het primaire antilichaam specifiek wordt gebruikt de proteïne van belang herkent, moet weefsel van vliegen ontbreekt deze eiwitten en/of weefsel overexpressing het eiwit worden opgenomen als besturingselementen. De toevoeging van overtollige gezuiverd antigeen eiwit kan ook worden opgenomen om te bepalen of het primaire antilichaam andere epitopes in de vlieg hersenen herkent. Tot slot, elke fluorescent signaal aanwezig bij de primaire antilichamen worden weggelaten vertegenwoordigt het niveau van niet-specifieke binding door de geselecteerde secundaire antilichamen.

Verschillende belangrijke besturingselementen moeten ook worden opgenomen voor de beoordeling van de bijdrage van genetische achtergrond of de aanwezigheid van transgenen kleuring intensiteit of neuronale morfologie. Bijvoorbeeld, het vliegen gebruikt in het experiment van de MARCM in Figuur 5 bevatten meerdere transgenen (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Bad > GAL80 en OK107-GAL4), die elk afzonderlijk moet worden geanalyseerd voor effecten op de morfologie van de paddestoel lichaam. Op een zeer minimale, paddestoel lichaam morfologie van vliegen moet met zowel OK107-GAL4 en UAS-CD8-GFP worden geanalyseerd. Het kan ook zijn nodig om te beoordelen van het effect van warmte schok en Flp recombinase productie door het analyseren van ontwikkelingssamenwerking paddestoel lichaam vliegt die zowel hsFLP als FRT82B bevatten. Hoewel MARCM significante inzicht of een bepaald eiwit autonoom axonale begeleiding bieden kan bepaalt, kunnen het aantal controles nodig zijn om nauwkeurig deze conclusie een kleine beperking van deze techniek. Soortgelijke besturingselementen zijn in minder ingewikkeld experimenten, ook van toepassing. Bijvoorbeeld, neem een experiment waarin het GAL4/UAS -systeem wordt gebruikt in combinatie met een RNAi transgenic tot vechtpartij uitdrukking van een proteïne van belang in alle neuronen. In dit experiment, zullen ten minste twee transgenen aanwezig zijn: een pan-neuronale GAL4 stuurprogramma, zoals elav-GAL4, en de UAS-RNAi transgenic. De morfologie van de paddestoel lichaam neuronen in vliegen met elk van deze transgenen alleen moet naast de experimentele conditie waar vliegen beide transgenen in de dezelfde Vlieg haven worden onderzocht.

Tot slot, om te bepalen of de proteïne van belang wordt uitgedrukt in champignon lichaam neuronen er meestal moet mede vlek hersenen met antilichamen tegen Fas2. Als alternatief, fluorescente proteïnen zoals GFP, RFP of het membraan gebonden CD8-GFP kunnen ook worden uitgedrukt met behulp van de GAL4/UAS -systeem en gebruikt in combinatie met antistoffen herkennen van de proteïne van belang. Fas2 herkent alleen de fasciculated axonen die de paddestoel lichaam α en β lobben vormen, is het gebruik van GAL4-gedreven, membraan-gebonden CD8-GFP sinds vooral handig voor het markeren van de paddestoel lichaam neuronen.

Defecten in axonale begeleiding zijn vaak niet 100% penetrant en zelfs hersenen dezelfde genotype mei uiterlijk vertoon sommige variabiliteit. Daarom, wanneer analyseren nieuw gegenereerd mutant allelen voor gebreken in champignon lichaam of fotoreceptor vastloper, een combinatie van verschillende allelen en benaderingen moet worden benut. De meeste studies in de literatuur gebruiken verscheidene verschillende benaderingen om te onderzoeken of een eiwit een cel-autonome rol speelt in de controle van axonale begeleiding: ik) analyse van vastloper gebreken in homozygoot null vliegen (bij voorkeur met behulp van verschillende null allelen), ii) analyse van vastloper gebreken in vliegen ontbreekt de proteïne van belang alleen in neuronen (meestal via RNAi), iii) MARCM analyse van vastloper gebreken, en iv) redden experimenten waar het gen opnieuw uitgedrukt in de neuronen van homozygoot null is vliegen. Verscheidene dozijn hersenen per genotype moeten idealiter worden geanalyseerd voor gebreken in neuronale morfologie.

Hoewel het protocol hier voornamelijk richt zich op immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten binnen vaste weefsel beschreven, worden verschillende toekomstige toepassingen van deze techniek ontwikkeld naar afbeelding live hersenweefsel. Zodra de hersenen worden ontleed (meestal in cel voedingsbodems), kunnen zij vervolgens worden gekweekt voor meerdere dagen bij 25 ° C. Deze ex vivo kweken methoden worden ontwikkeld om te onderzoeken van een breed scala aan biologische processen, zoals de activiteit van het eiwit die axon regeneratie na letsel70,71, intracellulaire bevordert signalering dynamics72en73van de neuronale ontwikkeling.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Changhui Pak en Alysia Vrailas Mortimer voor aanvankelijk onderwijs SMK de hersendissectie techniek. Wij danken ook leden van de Ken Moberg lab groep, met name Chris rondes, voor het kritisch lezen van het manuscript. Herkennen van Fas2 antilichamen (1 d 4) en chaoptin (24B10) werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank. Antilichaam 24B10 werd gestort op de DSHB door Seymour Benzer en Nansi Colley24,60,,61, antilichaam 1 d 4 werd gestort op de DSHB door Corey Goodman 22,23,56. Vliegen voorraden werden verkregen vanuit het midden van de voorraad Bloomington. Wij willen ook danken de Ohio landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling Center (OARDC) MCIC Imaging Center voor gebruik van de confocal microscoop om het imago van de hersenen in figuur 4A en B. SMK wordt ondersteund door een subsidie van NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Fas2 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4
Chaoptin Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Antibody Aves Lab GFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody ThermoFisher A-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-21236
20% paraformaldehyde Electron Microscope Services RT15713
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Na phosphate Buffer dibasic Sigma S3264
Triton X 100 Sigma X100-100ml
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
nutator/rocker Fisher 22-363-152 or 88-861-041
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
Name Company Catalog Number Comments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4 BL458 Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4 BL 854 GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4 BL 7362 GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64305 GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4 BL 4440 GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64296 GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO BL 5145 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP BL5146 MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 BL 44408 MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 BL44406 MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 BL 44407 MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO BL 5137 GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP BL 5139 MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO BL 28832 MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80 BL 5140 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 BL 5135 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  4. Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
  5. Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
  6. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  7. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  8. Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
  9. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  10. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
  11. Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
  12. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  13. Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
  14. Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
  15. Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
  16. Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
  17. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  18. Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
  19. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
  20. Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
  21. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  22. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  23. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  24. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
  25. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
  26. Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
  27. Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
  28. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
  29. van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
  30. Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
  31. Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
  32. van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
  33. Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
  34. Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
  35. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  36. Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  37. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
  38. Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
  39. Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
  40. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  41. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  42. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  43. Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
  44. Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
  45. Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  46. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
  47. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  48. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  49. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
  50. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
  51. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  52. Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
  53. Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
  54. Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
  55. Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
  56. Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
  57. Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
  58. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  59. Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
  60. Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
  61. Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
  62. Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
  63. Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
  64. Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
  65. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  66. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  67. Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
  68. Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
  69. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  70. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  71. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
  72. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  73. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 129 celbiologie neurowetenschap Drosophila melanogaster dissectie immunofluorescentie hersenen axon begeleiding vastloper confocal microscopie
Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M.… More

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. J. Vis. Exp. (129), e56174, doi:10.3791/56174 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter