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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/56174
Automatic Translation
1,2, 3, 2,3
1Program in Neuroscience, The College of Wooster, 2Department of Biology, The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology, The College of Wooster

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क Drosophila melanogaster मस्तिष्क के ऊतकों के विच्छेदन और immunostaining का वर्णन करता है । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल के उपयोग पर प्रकाश डाला गया है Drosophila मशरूम शरीर और photoreceptor न्यूरॉन्स उदाहरण के रूप में न्यूरॉन्स कि सही ढंग से सामान्य सिद्धांतों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ंयूरॉन विकास के कई पहलुओं.

Abstract

तंत्रिका तंत्र के विकास की घटनाओं है कि कई संकेत रास्ते और विनियामक नेटवर्क द्वारा समंवित कर रहे है की एक अनुक्रमिक श्रृंखला शामिल है । इन रास्ते में शामिल प्रोटीन के कई evolutionarily स्तनधारियों और अंय eukaryotes, जैसे फल मक्खी Drosophila melanogasterके बीच संरक्षित कर रहे हैं, सुझाव है कि इसी तरह के आयोजन के सिद्धांतों के विकास के दौरान मौजूद इन जीवों. महत्वपूर्ण बात, Drosophila बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं है कि neurogenesis, भेदभाव, axonal मार्गदर्शन, और synaptogenesis सहित स्तनधारियों में आवश्यक है विनियमित तंत्र की पहचान । मक्खियों को भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है मानव neurodevelopmental रोगों की एक किस्म मॉडल । यहाँ हम वयस्क Drosophila मस्तिष्क के भीतर प्रोटीन के चरण-दर-चरण microdissection, निर्धारण, और immunofluorescent स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल दो उदाहरण ंयूरॉंस आबादी, मशरूम शरीर ंयूरॉंस और रेटिना photoreceptors पर केंद्रित है, और वैकल्पिक करने के लिए व्यक्तिगत मशरूम शरीर न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) तकनीक के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग कर कदम भी शामिल है । दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती दिमाग से उदाहरण डेटा axonal मार्गदर्शन दोषों के लिए एक स्कोरिंग मानदंडों का एक संक्षिप्त विवरण के साथ दिखाया जाता है । हालांकि इस प्रोटोकॉल मशरूम शरीर और photoreceptor ंयूरॉंस की आकृति विज्ञान की जांच के लिए दो अच्छी तरह से स्थापित एंटीबॉडी पर प्रकाश डाला गया, अंय Drosophila मस्तिष्क क्षेत्रों और अंय मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर प्रोटीन के स्थानीयकरण भी हो सकता है इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर जांच की ।

Introduction

हालांकि Drosophila तंत्रिका तंत्र मनुष्यों और कुतर की तुलना में छोटा है, अपनी जटिलता को बेहतर अपने हड्डीवाला समकक्षों को समझने के लिए एक शक्तिशाली, पंहुचा मॉडल प्रदान करता है । कई मामलों में, रीढ़ और मक्खियों के जीनोम बहुत ही प्रोटीन है कि तंत्रिका तंत्र के विकास के तंत्र हुक्म चलाना सांकेतिक शब्दों में बदलना । वास्तव में, रीढ़ में ंयूरॉन विकास के लिए आवश्यक जीन के कई संकेत रास्ते में शामिल है कि नियंत्रण पैटर्न, neurogenesis, और axonal मार्गदर्शन1,2,3 सहित मक्खियों में orthologs है, ,4,5. उदाहरण के लिए, नेट्ि् स्तनधारियों में axonal मार्गदर्शन और melanogaster6,7,8के लिए आवश्यक एक ligand है । जबकि नेट्ि् मूल भ्रूण चिकी मस्तिष्क ऊतक से अलग किया गया था6, बाद के अध्ययनों से पता चला है कि नेट्ि् भ्रूण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास के दौरान Drosophilaएक भूमिका निभाई8में । अंय अध्ययनों भ्रूण Drosophila सीएनएस में आनुवंशिक स्क्रीन का इस्तेमाल किया है संरक्षित लाइगैंडों और दोनों Drosophila और रीढ़9में pathfinding के लिए आवश्यक रिसेप्टर्स की पहचान ।

जबकि भ्रूण मक्खी सीएनएस अतीत में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है लाइगैंडों, रिसेप्टर्स, और intracellular संकेत प्रोटीन axonal मार्गदर्शन के लिए आवश्यक की पहचान करने के लिए8,9, हाल ही में काम के तरीके की जांच की है जिसमें कई ये प्रोटीन विकास के बाद के चरणों के दौरान pathfinding फैसलों पर भी नियंत्रण करते हैं । विशेष रूप से, मशरूम शरीर की जांच (एमबी) और रेटिना photoreceptor ंयूरॉन विकास (चित्रा 1) तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की है कि नियंत्रण pathfinding, synapse गठन, axon छंटाई, और कई अंय पहलुओं के ंयूरॉन विकास10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor न्यूरॉन्स वयस्क मस्तिष्क के क्षेत्रों के लिए मक्खी रेटिना कनेक्ट लेमिना और मज्जा कहा जाता है और मस्तिष्क के लिए दृश्य जानकारी रिले के लिए महत्वपूर्ण हैं (18,19) द्वारा की समीक्षा की, जबकि मशरूम शरीर ंयूरॉंस केंद्रीय मक्खी मस्तिष्क में स्थित है और सीखने और स्मृति20,21के लिए आवश्यक हैं । दोनों photoreceptor न्यूरॉन्स और मशरूम निकायों के आंतरिक न्यूरॉन्स, Kenyon कोशिकाओं कहा जाता है, evolutionarily संरक्षित diffusible और संपर्क-निर्भर axonal मार्गदर्शन तंत्र का उपयोग करने के लिए अपने पद synaptic लक्ष्यों को खोजने के लिए. वयस्क मक्खियों में दिखाई जा रही है के अलावा, photoreceptor और एमबी न्यूरॉन्स भी सीधे लार्वा और कोषस्थों में एंटीबॉडी या रिपोर्टर जीन22,23,24,25के साथ visualized किया जा सकता है । आसानी से विभिंन विकासात्मक समय अंक पर ंयूरॉंस के इन दो सेट कल्पना की क्षमता ंयूरॉन विकास के कई पहलुओं के लिए शानदार मॉडल के रूप में उनके उपयोग को बढ़ावा दिया है ।

सामांय तंत्रिका तंत्र के विकास के तंत्र को समझने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है के अलावा, हाल के अध्ययनों से यह दिखा दिया है कि मक्खियों भी नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) 26 सहित मानव रोगों की एक विस्तृत विविधता के सटीक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं , बौद्धिक विकलांगता (आईडी)27,28,29,30,31, और अंय३२। उदाहरण के लिए, ZC3H14, एक जीन हाल ही में मानव बौद्धिक विकलांगता से जुड़ा के आणविक समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम एक मक्खी ZC3H14 ortholog के नल एलील का उपयोग कर आईडी के एक मक्खी मॉडल बनाया, Nab230बुलाया । मक्खियों कमी Nab2 गंभीर स्मृति विकलांगता और विस्तारित पाली (क) पूंछ, recapitulating क्या मानव रोगियों या रोगी व्युत्पंन सेल लाइनों३३,३४में मनाया जाता है । महत्वपूर्ण बात, मक्खियों कमी Nab2 भी उनके वयस्क मशरूम निकायों में गंभीर मस्तिष्क आकृति विज्ञान दोष प्रदर्शित३४, क्या मक्खियों में मनाया जाता है के समान FXS सिंड्रोम जीन, FMR1३५कमी । इस प्रकार, मक्खियों एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव दोनों सामांय मस्तिष्क के विकास और रोगों है कि यह बाधित अध्ययन के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

अंत में, उच्च प्रवाह तरीकों की पहुंच के लिए व्यवहार की निगरानी, उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की विशाल सरणी के साथ संयुक्त, बनाने के मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान के लिए पसंद की एक मॉडल जीव है कि नियंत्रण जटिल व्यवहार, जैसे सीखने और स्मृति, नींद, प्रणय, प्यास, और दूसरों को३६,३७,३८,३९। एक विशेष रूप से उपयोगी उपकरण है कि एक मक्खी के केंद्र में है आनुवंशिकी "toolbox" GAL4/यूएएस प्रणाली (चित्रा 2) है । इस प्रणाली४०,४१ Gal4 transcriptional उत्प्रेरक के ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति का उपयोग करता है जीन की अभिव्यक्ति या एक ऊपर सक्रिय अनुक्रम (यूएएस) के transgenes बहाव को बढ़ाने के लिए । इस प्रणाली के संशोधनों के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति दी है, उदाहरण के लिए, ठीक विशिष्ट ंयूरॉंस की उत्तेजितता को नियंत्रित४२,४३, एक्सप्रेस या दस्तक नीचे ब्याज४४के विशिष्ट जीन, ४५, vivo४६में रीयल-टाइम कैल्शियम गतिशीलता का विश्लेषण, और न्यूरॉन वंश४१को चिह्नित करने के लिए एक्सप्रेस रिपोर्टर जीन. mitotic पुनर्संयोजन के साथ GAL4/यूएएस प्रणाली के संयोजन भी एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) प्रणाली12,४७के साथ मोज़ेक विश्लेषण के निर्माण के लिए अनुमति दी । MARCM एकल ंयूरॉन अनुरेखण में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है सेलुलर संकेत axonal मार्गदर्शन12,४७के लिए आवश्यक घटकों की पहचान । हालांकि इन और अंय तकनीकों सेलुलर तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए आवश्यक तंत्र पर बहुमूल्य अंतर्दृष्टि के एक नंबर प्रदान की है, सबसे अधिक आवश्यकता है कि Drosophila मस्तिष्क पहले विदारक हो; मस्तिष्क के सावधान हटाने मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच सही मस्तिष्क आकृति विज्ञान और कनेक्शन पैटर्न बनाए रखने के लिए आवश्यक है. निंनलिखित प्रोटोकॉल मशरूम शरीर और photoreceptor ंयूरॉंस का उपयोग करता है के रूप मेंउदाहरण के रूप में यह आप विच्छेदन और वयस्क Drosophila दिमाग के धुंधला immunofluorescent के माध्यम से गाइड ंयूरॉंस की आबादी ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Drosophila melanogaster जेनेटिक्स और वैकल्पिक हीट शॉक कार्यविधियाँ

  1. एक बार मक्खियों को पार कर दिया गया है और F1 संतति रचा है, महिलाओं और/ मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है की जांच की जा रही है, मक्खियों दैनिक एकत्र किया जाना चाहिए और सेक्स से अलग इतना है कि उंर पर निर्भर है और/या मस्तिष्क कनेक्टिविटी के यौन dimorphic पैटर्न और अधिक आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
    नोट: वैकल्पिक: यदि मक्खियों एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) विश्लेषण के साथ मोज़ेक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है < सुप वर्ग = "xref" > १२ , < सुप वर्ग = "xref" > 47 , भ्रूण, लार्वा, या कोषस्थों गर्मी पर चौंका देना चाहिए ३७ & #176; C के लिए 30-45 मिनट के लिए प्रेरित mitotic पुनर्संयोजन । MARCM विश्लेषण के लिए मशरूम निकायों के विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए, हीट शॉक < सुप वर्ग द्वारा निर्धारित अनुसूची के अनुसार समय पर होना चाहिए = "xref" > 12 और < सुदृढ वर्ग में उल्लिखित = "xfig" > चित्रा 5 बी . यदि MARCM का उपयोग करने से मस्तिष्क क्षेत्रों की जांच करने के लिए मशरूम निकायों के अलावा, पायलट प्रयोगों के लिए इष्टतम स्तर निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए गर्मी चौंका । जबकि नीचे दिए गए कदम eclosed मक्खियों के संबंध में लिखे गए हैं, pharate वयस्कों को भी ुपाल मामले को हटा दिया गया है एक बार इन चरणों का उपयोग कर विच्छेदित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 2. विच्छेदन स्टेशन की तैयारी

  1. स्थिति एक बड़े benchtop पर संलग्न फाइबर ऑप्टिक goosenecks के साथ stereomicroscope और प्रकाश स्रोत । स्थिर हाथ आंदोलनों को बढ़ावा देने और हाथ कम करने के लिए & #34; घे & #34; विच्छेदन करते समय, यह आवश्यक है कि पर्याप्त हाथ और हाथ बाकी जगह माइक्रोस्कोप के आसपास उपलब्ध है । सुनिश्चित करें कि वहां लगभग 8-10 इंच माइक्रोस्कोप के दोनों ओर और माइक्रोस्कोप के आधार और बेंच के किनारे के बीच 4-6 इंच है ।
  2. PTN बफर की १.० मिलीलीटर (०.१ एम सोडियम फास्फेट बफर पीएच ७.२, ०.१% गैर ईओण surfactant के साथ एक गिलास 9 अच्छी तरह से या 3 अच्छी तरह से पकवान के 2 या 3 कुओं को भरने, पूरा बफर घटकों के लिए सामग्री तालिका देखें) और बर्फ पर विदारक स्टेशन के बगल में जगह है । नए विच्छेदित दिमाग इस पकवान को हस्तांतरित कर दिया जाएगा और निर्धारण कदम तक संग्रहीत है ।
    1. नोट: यदि लाइव इमेजिंग की आवश्यकता है, तो विच्छेदन बफर 1x फास्फेट होना चाहिए खारा (पंजाब) या HL3 बफर < सुप वर्ग = "xref" > ४८ . यदि intracellular प्रोटीन स्थानीयकरण की आवश्यकता है, तो पंजाबियों को विच्छेदन और निर्धारण के लिए वैकल्पिक बफर के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है । निंनलिखित निर्धारण, सेल झिल्ली के permeabilization तो PTN बहाकर ०.१% या ०.३% ईओण डिटर्जेंट युक्त का उपयोग किया जाना चाहिए ।
    2. अगर पंजाब विच्छेदन और निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, पिपेट युक्तियों के लिए कम से एक डिटर्जेंट युक्त बफर के साथ एक बार (जैसे PTN) microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण के दौरान प्लास्टिक पिपेट सुझावों के लिए चिपके से दिमाग को रोकने के लिए कुल्ला किया जाना चाहिए ।
  3. एक खाली ३५ मिमी कांच या प्लास्टिक पेट्री पकवान का उपयोग कर, एक विच्छेदन पकवान एक सिलिकॉन elastomer युक्त का निर्माण । संक्षेप में, निर्माता के अनुसार elastomer घटकों को मिलाएं & #39; s दिशाओं, ३५ mm व्यंजन में डालना, और इसे एक सपाट सतह पर रातोंरात polymerize । Elastomer युक्त विच्छेदन व्यंजन को विदारक संदंश के ठीक सुझावों की रक्षा के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए, जो यदि संपर्क संदंश और एक कठिन सतह के बीच किया जाता है, जैसे कांच की डिश के रूप में आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । हम भी नियमित रूप से ऑनलाइन खुदरा विक्रेताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन लेपित व्यंजन खरीद । विच्छेदन के दौरान इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, सिलिकॉन elastomer विच्छेदन बर्तन निष्क्रिय चारकोल युक्त (और इस प्रकार काले रंग) विशेष रूप से उपयोगी होते हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन प्रक्रिया

  1. Anesthetize 3-5 दिन पुराने वयस्क डी melanogaster के साथ सह 2 या बर्फ का उपयोग करके । अगर बर्फ का उपयोग कर, जगह ऊपर नीचे मक्खियों (प्लग अंत) के लिए एक बर्फ की बाल्टी में नीचे मक्खी ~ 5 मिनट । शीशी को उल्टा बर्फ में रखकर मक्खियों को भोजन में दर्ज होने से रोकता है. एक बार मक्खियों anesthetized गया है, एक ठंडी धातु पैड या पेट्री बर्फ में बैठे पकवान पर या एक सह 2 उत्सर्जन मक्खी पैड पर मक्खियों जगह है । अगर neurodegeneration का विश्लेषण करने के लिए दिमाग विदारक है तो पुरानी मक्खियों का भी इस्तेमाल हो सकता है ।
  2. जगह एक छोटी राशि (१५०-२०० & #181; L) ptn के केंद्र में एक अंतरण पिपेट या एक p200 पिपेट बनाने के लिए का उपयोग कर एक & #34; बबल & #34; stereomicroscope के तहत विच्छेदन पकवान रखें और प्रकाश और ध्यान को समायोजित ताकि PTN का बुलबुला देखने के क्षेत्र भरता है और समान रूप से प्रबुद्ध है ।
  3. हेर मक्खियों को इतना कि वे & #34; बेली up & #34; ( यानी , ventral ओर ऊपर) जबकि धातु या कं पर लेटी 2 पैड.
  4. #5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर, एक मक्खी के पेट लोभी और, मक्खी की पकड़ रखते हुए, पूरी तरह से विच्छेदन डिश पर PTN में डूब ।
    ध्यान दें: प्रोटोकॉल के शेष के लिए, सभी कदम सिर PTN में जलमग्न है, जबकि किया जाना चाहिए ।
  5. #5 संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग कर, मक्खी सूंड के आधार समझ और संदंश के दो जोड़े खींच अलग करने के लिए शरीर से मक्खी सिर अलग । पेट और छाती को त्यागें । इस कदम के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि सिर जारी नहीं है और PTN की सतह पर नाव की अनुमति दी है । एक बार सिर तैर रहा है, यह बहुत मुश्किल हो सकता है दिमाग को कुचल बिना फिर से समझ ।
    नोट: इस विधि का प्रयोग, मस्तिष्क और ventral तंत्रिका कॉर्ड के बीच कनेक्शन गंभीर हैं । यदि सीएनएस के इन क्षेत्रों के बीच बरकरार कनेक्शनों की आवश्यकता है, तो एक वैकल्पिक विच्छेदन प्रोटोकॉल, जैसे < सुप वर्ग = "xref" > 49 , < सुप वर्ग = "xref" > 50 , का पालन किया जाना चाहिए । अगर सूंड सिर से पहले उड़ सिर से अलग हो, वहां एक छेद होगा जहां सूंड था । इस मामले में, एक आंख के पास छेद के किनारे पर मक्खी सिर समझ । तो सिर को हटाने के बल का एक उदारवादी राशि का उपयोग करते हुए संदंश के दो जोड़े खींच एक दूसरे से अलग है । कभी-कभार, जब सिर शरीर से हटा दिया जाता है, आंत और/या ventral तंत्रिका कॉर्ड सिर से जुड़ा रहता है और विच्छेदन जारी रखने से पहले हटा दिया जाना चाहिए ।
  6. जबकि संदंश की एक जोड़ी सूंड लोभी, दूसरी जोड़ी सही मक्खी आंख के औसत दर्जे का किनारा समझ चाहिए । धीरे से, एक दूसरे से अलग संदंश खींचो । यह कदम स्थिर पार्श्व बल की एक छोटी राशि के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । के रूप में संदंश धीरे एक दूसरे से अलग कदम, सूंड सिर से दूर खींच और सिर छल्ली में एक केंद्रीय छेद बनाने चाहिए । दूसरी जोड़ी से दाईं आंख के औसत दर्जे का हिस्सा जारी किए बिना संदंश की पहली जोड़ी के साथ सूंड त्यागें ।
    नोट: वयस्क melanogaster मस्तिष्क मक्खी सिर के caudal ( यानी , पीछे/पीछे) क्षेत्र में है । इस प्रकार, लोभी कि सिर के क्षेत्र से बचा जाना चाहिए । आदर्श रूप में, केवल rostral ( यानी , सामने) औसत दर्जे का रेटिना के पास सिर के हिस्से को सीधे संदंश द्वारा समझा जाना चाहिए । मस्तिष्क और एसोसिएटेड श्वासनली अब छल्ली में सेंट्रल होल के माध्यम से दिखाई जानी चाहिए । इस समय, छेद से फैला श्वासनली के किसी भी सफेद रेशेदार धागे को हटाया जा सकता है और छोड़ दिया ।
    7. संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ
  7. , बाईं रेटिना के औसत दर्जे का किनारा समझ (सिर छल्ली में केंद्रीय छेद के किनारे पर) । रेटिना और उससे जुड़े छल्ली को दूर करने के लिए धीरे से संदंश को एक दूसरे से १८० & #176; कोण पर दूर खींचो । अंतर्निहित ऑप्टिक पालि से रेटिना dissociates के रूप में, आप तनाव में एक मामूली कमी महसूस करना चाहिए । धीरे से आगे बढ़ें ऑप्टिक पालि फाड़ को रोकने के लिए ।
    नोट: इस कदम के दौरान भी जल्दी से संदंश को अलग करने से गु के फाड़ में परिणाम हो सकता हैe ऑप्टिक पालि या मशरूम शरीर संरचनाओं के विघटन । कभी-कभार, छल्ली को हटा दिया जाएगा लेकिन रेटिना के टुकड़े ऑप्टिक पालि से जुड़े रहेंगे । यदि इमेजिंग मशरूम निकायों, यह पूरी तरह से पूरा रेटिना को दूर करने के लिए आवश्यक नहीं है । हालांकि, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे कि रेटिना ंयूरॉन इन्नेर्वतिओन ऑप्टिक मस्तिष्क पालियों) का विश्लेषण करने के लिए रेटिना पूरी तरह से वर्णित के रूप में की आवश्यकता हो सकती है < सुप वर्ग = "xref" > ४८ , < सुप वर्ग = "xref" > ५१ .
    नोट: के रूप में रेटिना धीरे मस्तिष्क के अंतर्निहित ऑप्टिक पालि से अलग है, ऑप्टिक पालि एक अपारदर्शी सफेद सफेद, रेशेदार श्वासनली के साथ कवर संरचना के रूप में चौकस होना चाहिए । एक बार एक रेटिना को हटा दिया जाए तो उसे छोड़ दिया जा सकता है । रेटिना न्यूरॉन्स के pathfinding का विश्लेषण करते समय, विशेष देखभाल ऑप्टिक पालि को क्षति को रोकने के लिए इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए । photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और लाइव इमेजिंग पर केंद्रित एक अतिरिक्त प्रोटोकॉल भी उपलब्ध है < सुप वर्ग = "xref" > ४८ .
    8. अब
  8. , ध्यान से जितना संभव हो उतना दिखाई श्वासनली निकाल दें. श्वासनली पहले से ही हो सकता है या बाद में हवा के साथ भरने, दिमाग के कारण नाव और, संभावित, बाद में immunostaining चरणों के दौरान खो दिया है । श्वासनली हटाने के लिए, यह #5 संदंश के एक बहुत तेज जोड़ी का उपयोग कर मस्तिष्क से उठाओ ।
  9. शेष रेटिना और आसपास के छल्ली को हटाने के संदंश के दोनों जोड़ों का उपयोग करके बाईं मक्खी रेटिना के औसत दर्जे का क्षेत्र समझ । ध्यान से रेटिना और छल्ली के टुकड़ों को हटाने के लिए आधे में रेटिना को फाड़ दें । कुछ मामलों में, मस्तिष्क कुचल बिना शेष छल्ली को हटाने विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित होता है । इन मामलों में, हमने पाया है कि ventral तंत्रिका गर्भनाल के बाकी किस्में बजाय संदंश की एक जोड़ी द्वारा समझा जा सकता है, जबकि संदंश के अंय जोड़ी ध्यान से छल्ली के पिछले हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  10. एक p200 पिपेट का उपयोग कर, 9 या 3 अच्छी तरह से PTN युक्त पकवान के एक अच्छी तरह से विच्छेदित दिमाग चाल । एक ही जीनोटाइप के दिमाग में एक साथ एक ही अच्छी तरह से परित और बर्फ पर रखा जाना चाहिए । मस्तिष्क ऊतक विच्छेदन के एक घंटे के भीतर तय किया जाना चाहिए । दिमाग छोटे बैचों में तय किया जा सकता है और अगर दिमाग की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है परित । ज्यादातर परिस्थितियों में, एक अनुभवी शोधकर्ता आमतौर पर एक मस्तिष्क टुकड़े कर सकते है और यह लगभग 3-5 मिनट में ग्लास संग्रह पकवान को हस्तांतरण ।
< p class = "jove_title" > 4. निर्धारण और Immunofluorescent धुंधला प्रक्रिया

  1. एक p200 पिपेट का उपयोग, 9 अच्छी तरह से एक ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge 4% के ०.५ मिलीलीटर के साथ भरा ट्यूब से विच्छेदित दिमाग स्थानांतरण PTN में पतला paraformaldehyde । एक ही जीनोटाइप के 10-15 दिमाग में एक microcentrifuge ट्यूब में संयुक्त किया जा सकता है । सभी शेष कदम (जब तक स्लाइड पर दिमाग के बढ़ते) ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में पूरा कर रहे हैं ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde (पीएफए) एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए । पीएफए अपशिष्ट को बचाना चाहिए और ठीक से निपटाना चाहिए । ग् ampules में खरीदे गए 20% paraformaldehyde को microcentrifuge ट्यूबों में aliquoted किया जा सकता है और इसमें-20 & #176; C तक आवश् यक है ।
    2. एक धुएं के हुड के अंदर
  2. , कमरे के तापमान पर धीमी गति से घोड़ा के साथ 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में दिमाग की मशीन ।
  3. निंनलिखित निर्धारण, दिमाग गुरुत्वाकर्षण द्वारा microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने की अनुमति दें ।
    नोट: कभी-कभार, दिमाग microcentrifuge ट्यूब के पक्ष में चिपक सकता है । यदि ऐसा होता है, यह आमतौर पर बाद में तर्जनी उंगली और अंगूठे के बीच ट्यूब या बहुत धीरे बेंच पर ट्यूब के लिए दिमाग के डूबने को बढ़ावा देने के नल को घुमाने के लिए उपयोगी है ।
  4. हटाने के लिए एक p1000 पिपेट का प्रयोग और प्रदर्शन दो & #34; त् & #34; बहाकर ५०० & #181 के साथ; PTN के एल, दिमाग बहाकर के बीच microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने की अनुमति । इन जल्दी धोने के दौरान, एक बार सभी दिमाग microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा बस गया है, PTN तुरंत ताजा बफर के लिए विमर्श किया जा सकता है; कोई अतिरिक्त धुलाई समय की आवश्यकता है ।
    नोट: आमतौर पर, ट्यूब में अतिरिक्त बफर छोड़ने मस्तिष्क हटाने के जोखिम को बेहतर है । पिपेट टिप के सावधान परीक्षा अक्सर यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई दिमाग गलती से ट्यूब से हटा दिया गया है की आवश्यकता है । अगर दिमाग गलती से टिप में pipetted गया है, उंहें microcentrifuge ट्यूब में वापस बांटना, दिमाग के लिए इंतजार करना, और फिर किसी भी अतिरिक्त PTN कि रहता है हटाने जारी है ।
  5. अंतिम त् वरित धोने के बाद, एक p1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए तीन & #34; long & #34; बहाकर: add ५०० & #181; PTN के एल और एक झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए धो/nutator । सभी भविष् & #34; लंबे & #34; बहाकर 20 मिनट के लिए होनी चाहिए ।
    नोट: इन धोने के बाद, फिक्स्ड दिमाग में रात भर संग्रहित किया जा सकता है 4 & #176; C PTN में ।
  6. एक p1000 पिपेट का उपयोग कर पिछले धोने को हटाने और एक झूली कुरसी या nutator पर कमरे के तापमान में ०.५ मिलीलीटर समाधान अवरुद्ध की [PTN + 5% सामांय बकरी सीरम (NGS)] कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए ।
    1. बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी अनुवर्ती प्रोटोकॉल चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा । यदि अंय प्रजातियों में से माध्यमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जाएगा, कि प्रजातियों से सामांय सीरम (बजाय NGS) अवरुद्ध और एंटीबॉडी समाधान में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  7. एक p1000 पिपेट का उपयोग कर, समाधान अवरुद्ध हटाने और ptn में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने (ptn + 5% NGS + पतला प्राथमिक एंटीबॉडी) । पहली बार के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, उस एंटीबॉडी के इष्टतम कमजोर पड़ने empirically.
    निर्धारित किया जाना चाहिए नोट: मशरूम शरीर ंयूरॉंस visualizing के लिए, एंटीबॉडी पहचानने Fas2 आम तौर पर इस्तेमाल किया जाता है । ये एंटीबॉडी एंटीबॉडी 1D4 के रूप में विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक (DSHB) से उपलब्ध हैं और PTN + 5% NGS में 1:20 पतला किया जाना चाहिए ।
    नोट: photoreceptor न्यूरॉन्स visualizing के लिए, एंटीबॉडी पहचानने chaoptin आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं. Chaoptin एंटीबॉडी एंटीबॉडी 24B10 के रूप में DSHB से उपलब्ध हैं और PTN में 1:20 पतला किया जाना चाहिए + 5% NGS.
    नोट: निर्धारण प्रक्रिया आमतौर पर ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन से प्रतिदीप्ति समाप्त । इसलिए, axonal मार्गदर्शन का विश्लेषण करने के लिए MARCM का उपयोग करते समय व्यक्तिगत MB न्यूरॉन्स, एक एंटीबॉडी पहचानने GFP का उपयोग करें.
    8. एक झूली कुरसी पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में
  8. मशीन/nutator के लिए 2-3 रातों में 4 & #176; C.
    9. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ
  9. निंनलिखित मशीन, दिमाग microcentrifuge ट्यूब के नीचे बसने के लिए और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालने की अनुमति ।
    10. एक p1000 पिपेट का उपयोग
  10. , प्रदर्शन 2 & #34; त् & #34; बहाकर र 3 & #34; long & #34; 20 मिनट ०.५ मिलीलीटर PTN के साथ के रूप में कदम ४.४ और ४.५ में ऊपर वर्णित है, ध्यान से मस्तिष्क प्रत्येक धोने के बीच microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है ।
  11. उचित फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए मशीन दिमाग । माध्यमिक एंटीबॉडी आम तौर पर 1:200 की एकाग्रता पर PTN + 5% NGS के ०.५ मिलीलीटर में पतला कर रहे हैं ।
    नोट: एक बार फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ा गया है, दिमाग प्रयोग के शेष के लिए अंधेरे में रखा जाना चाहिए ।
    ध्यान दें: मामले में अवशिष्ट GFP प्रतिदीप्ति रहता है, जब MARCM विश्लेषण प्रदर्शन यह एक माध्यमिक एंटीबॉडी fluorophore के रूप में समान उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ लेबल का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है (GFP जैसे , Fluoroscein (isothyocyanate) या Alexa488).
  12. माध्यमिक एंटीबॉडी गर्मी के बाद, microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालने के लिए दिमाग की अनुमति दें ।
  13. परफॉर्म 2 & #34; त् & #34; बहाकर र 3 & #34; लम्बा & #34; 20 मिनट ४.४ और ४.५ चरणों में ऊपर वर्णित के रूप में PTN के ०.५ मिलीलीटर के साथ बहाकर, ध्यान से मस्तिष्क प्रत्येक धोने के बीच microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए बसने के लिए अनुमति देता है ।
  14. म् & #34; लम्बा & #34; 20 min वाश, use एक p200 पिपेट जितना संभव हो उतना बफर निकालने के लिए.
  15. Add ७५ & #181; फ्लोरोसेंट विरोधी के एल दिमाग को बढ़ते माध्यम से फीका । पिपेट दिमाग और पिपेट टिप में बढ़ते मध्यम एक बार मिश्रण करने के लिए । ट्यूब पलटना नहीं है के बाद से दिमाग टोपी या microcentrifuge ट्यूब के पक्ष पर अटक हो सकता है ।
    नोट: बढ़ते माध्यम में दिमाग के निलंबन के बाद, ट्यूबों एल्यूमीनियम पंनी में लपेटा जा सकता है धीमी गति से fluorophore शमन और 4 में संग्रहित & #176; सी रातोंरात । यदि आवश्यक हो, दिमाग में कई दिनों के लिए संग्रहित किया जा सकता 4 & #176; C, लेकिन आदर्श रूप में जितनी जल्दी हो सके स्लाइड पर घुड़सवार होना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 5. बढ़ते वयस्क melanogaster दिमाग पर माइक्रोस्कोप स्लाइड और इमेजिंग

  1. Build a & #34; पुल & #34; स्लाइड. वरून दोन & #34; आधार & #34; coverslips एक सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड के अलावा लगभग 1 सेमी । सुनिश्चित करें कि स्लाइड के सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पक्ष का सामना करना पड़ रहा है । coverslips को नख पॉलिश के साथ स्लाइड पर पालन करें जैसा < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ A . यह आम तौर पर एक आधार के तीन बाहरी किनारों को सील करने के लिए नाखून पॉलिश के साथ कवर पर्ची के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए बढ़ते मीडिया इन आधार कवर के तहत बाती नहीं है मददगार फिसल जाता है । चलो नख पॉलिश पूरी तरह से सूखी (10-15 मिनट) आगे बढ़ने से पहले ।
  2. stereomicroscope के तहत स्लाइड प्लेस और पिपेट दो coverslips के बीच अंतरिक्ष में विच्छेदित दिमाग युक्त मीडिया समाधान बढ़ते । और अधिक विपरीत प्रदान करने के लिए, यह gooseneck रोशनी इतना पैंतरेबाज़ी कि वे बेंच शीर्ष के साथ समानांतर रहे है उपयोगी है ।
  3. स्लाइड से अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को हटाने के एक पिपेट का उपयोग कर, सावधान करने के लिए स्लाइड से दिमाग पिपेट नहीं जा रहा है ।
  4. दूर अतिरिक्त बढ़ते मीडिया बाती । इससे दिमाग को अगले स्टेप के दौरान ज्यादा ठीक से तैनात किया जा सकेगा ।
    5. संदंश और stereomicroscope की एक जोड़ी का उपयोग
  5. , antennal ऊपर का सामना करना पड़ पालियों के साथ एक ग्रिड पैटर्न में स्लाइड पर दिमाग की स्थिति ।
  6. जगह एक कवर स्लिप (द & #34; सेतु & #34;) ओवर द दिमाग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 a ). नाखून पॉलिश का प्रयोग करें पुल के किनारे कवर स्लिप को सील करने के लिए जहां वे संपर्क & #34; आधार & #34; कवर स्लिप्स.
  7. एक p200 पिपेट का उपयोग करते हुए, धीरे से केंद्र गुहा को भरने के साथ पुल के तहत ताजा बढ़ते मीडिया (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 बी ). केंद्र coverslip के खुले किनारे पर एक समय में एक बूंद प्लेस और केंद्र पुल coverslip के तहत बाती के बढ़ते मीडिया की अनुमति । जारी रखें जब तक पूरी गुहा बढ़ते मीडिया से भर जाता है, तो साफ नाखून पोलिश के साथ ऊपर और नीचे सील ।
  8. एक बार नख पॉलिश ड्राई हो जाए तो स्लाइड को तुरंत इमेज करें या किसी lightproof टाइट स्लाइड बॉक्स में-20 & #176; C.
    9. एक सप्ताह के भीतर
  9. , छवि दिमाग एक लेज़र का उपयोग कर उत्तेजना पराबैंगनीकिरण और फ़िल्टर चुना फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त cubes के साथ फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग । Z-ढेर मशरूम शरीर ंयूरॉंस की छवियां आम तौर पर प्राप्त कर रहे है का उपयोग कर 20X & #160; या 40X & #160; उद्देश्य । रेटिना photoreceptor न्यूरॉन्स की इमेजिंग उच्च आवर्धन की आवश्यकता हो सकती है.

Representative Results

ऊपर वर्णित विधि वयस्क Drosophila मस्तिष्क के वस्तुतः किसी भी क्षेत्र के विश्वसनीय और प्रतिलिपि दृश्य के लिए अनुमति देता है । यहां हम मशरूम निकायों और photoreceptor न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन अन्य अध्ययनों से इस तरह के पार्स intercerebralis५२, घड़ी न्यूरॉन्स५३,५४, और antennal के रूप में मस्तिष्क क्षेत्रों कल्पना करने के लिए इसी तरह के तरीकों का इस्तेमाल किया है पालि प्रक्षेपण ंयूरॉंस५५, कई अंय लोगों के अलावा । महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक के लिए दोनों पूरे मस्तिष्क संरचनाओं के रूप में अच्छी तरह से उन संरचनाओं जैसे MARCM12,४७जैसे तकनीकों का उपयोग कर के भीतर व्यक्तिगत ंयूरॉंस कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6 इस विच्छेदन और immunostaining तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है कि वयस्क दिमाग में मशरूम निकायों और photoreceptor न्यूरॉन्स से डेटा के कई विभिन्न प्रकार के शो.

सबसे पहले, विधि ऊपर वर्णित करने के लिए सीधे मशरूम शरीर की कल्पना या तो एंटीबॉडी है कि Fasciculin 2 (Fas2) या रिपोर्टर जीन मशरूम शरीर ंयूरॉंस में व्यक्त की पहचान का उपयोग कर सकते है आकृति विज्ञान३४। के रूप में चित्रा 4ए और चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, Fas2 एंटीबॉडी α, β, और (एक हद तक कम करने के लिए) की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वयस्क Drosophila दिमाग में मशरूम निकायों के γ पालियों । Fas2 एक सेल सेल आसंजन प्रोटीन ंयूरॉन fasciculation के लिए आवश्यक है और α और β पालियों में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है23,५६,५७, यह इन मशरूम की एक विश्वसनीय और अच्छी तरह से स्थापित मार्कर बनाने शरीर ंयूरॉंस । विशेष रूप से, इस परिपत्र के आकार का ellipsoid शरीर वयस्क मस्तिष्क के मध्य क्षेत्र में स्थित भी इस एंटीबॉडी (चित्रा 4ए) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है ।

axonal मार्गदर्शन प्रोटीन में दोष अक्सर पूरी तरह से व्याप्ति मशरूम शरीर उत्परिवर्ती phenotypes15,३४,३५के कारण । इसलिए, ज्यादातर परिस्थितियों में, कई दर्जन दिमाग और छवि का विश्लेषण किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, मशरूम शरीर β पालि axons Nab2 नल मक्खियों के मस्तिष्क midline पार अनुपयुक्त । इस "पार" या β पालि "फ्यूजन" phenotype आमतौर पर वयस्क Nab2 नल मक्खियों के ~ ८०% में मनाया जाता है, लेकिन जंगली प्रकार के नियंत्रण से मुख्य रूप से अनुपस्थित है और थोड़ा के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, उदारवादी, या पूरा फ्यूजन३४. विपरीत मस्तिष्क गोलार्द्ध में axons के गलत contralateral प्रक्षेपण से midline परिणाम भर में β पालियों के "फ्यूजन" । के रूप में चित्रा 4सी में दिखाया गया है और३४,३५में विस्तृत, मामूली फ्यूजन β पालियों को संदर्भित करता है एक "Fas2 की पतली किनारा-सकारात्मक तंतुओं से जुड़े," जबकि मध्यम संलयन अधिक काफी हद तक जुड़ा हुआ β पालियों को दर्शाता है कि midline में एक थोड़ा कम पालि मोटाई दिखाओ । पूर्ण (या "चरम") फ्यूजन β पालियों कि पूरी तरह से जुड़े हुए हैं और पालि मोटाई या midline पर Fas2 धुंधला में कोई कमी दिखाने के लिए संदर्भित करता है । मशरूम शरीर β पालि संलयन की हद तक मात्रा जा सकता है और प्रदर्शित के रूप में ३४,३५ में या एक तालिका के रूप में दिखाया गया है आकृति विज्ञान दोष के प्रत्येक प्रकार के दिमाग का प्रतिशत दिखा ।

Fas2 एंटीबॉडी के साथ धुंधला के अलावा, MARCM तकनीक12,४७,४८ भी मशरूम शरीर पालियों के भीतर व्यक्तिगत GFP+ न्यूरॉन्स के axon मार्गदर्शन फैसलों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MARCM विकास के दौरान mitotic पुनर्संयोजन का इस्तेमाल व्यक्ति ंयूरॉंस, या क्लोनिंग ंयूरॉंस के समूहों से संबंधित है, GFP (चित्रा 5ए) के साथ चिह्नित । MARCM ंयूरॉंस की एक छोटी संख्या है कि पूरी तरह से एक अंयथा heterozygous मक्खी के भीतर एक प्रोटीन की कमी उत्पंन करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है । जैसे, इस तकनीक को विशेष रूप से प्रोटीन के axonal मार्गदर्शन कार्यों का विश्लेषण करने में उपयोगी है कि समग्र जीव व्यवहार्यता के लिए भी आवश्यक है12,४७। Homozygous नल न्यूरॉन्स GFP के साथ चिह्नित सीधे नियंत्रण न्यूरॉन्स एक जंगली प्रकार आनुवंशिक पृष्ठभूमि में GFP के साथ चिह्नित करने के लिए तुलना की जा सकती. इसके अलावा, जब लार्वा विकसित करने या कोषस्थों गर्मी चौंका, मशरूम शरीर ंयूरॉंस के विभिंन वर्गों (चित्रा 5बी) लक्षित किया जा सकता है पर निर्भर करता है ।

इस तकनीक का उपयोग करके जेनरेट किए गए डेटा के प्रकार का एक उदाहरण चित्रा 5सीमें दिखाया गया है, जहां वाइल्ड-टाइप (यानी, नियंत्रण) MARCM क्लोन एक उदाहरण के रूप में उत्पन्न होते हैं. व्यक्तिगत GFP उत्पंन करने के लिए+ मशरूम शरीर ंयूरॉंस चित्रा 5सीमें दिखाया गया है, विकासशील F1 लार्वा शुरू में 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थित थे । लगभग 5-6 दिन लार्वा सेने (एएलएच) के बाद, कोषस्थों ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सदमे में गर्मी थे और फिर eclosion तक 25 डिग्री सेल्सियस के लिए लौट आए । वयस्क सेने के बाद, दिमाग ptn में विच्छेदित किया गया, फिक्स्ड, और साथ में एंटीबॉडी पहचानने Fas2 के साथ मशीन (1D4, ptn में 1:20 पतला) और GFP (ptn में 1:500 पतला) । दिमाग तो माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन और ऊपर वर्णित के रूप में स्लाइड पर घुड़सवार थे । GFP+ कोशिकाओं की पहचान की और एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप और अधिकतम तीव्रता अनुमानों ImageJ का उपयोग कर बनाया गया था का उपयोग कर छवि थे । चित्रा 5सीमें प्रदर्शन के रूप में, नियंत्रण GFP+ न्यूरॉन्स α और β पालियों में उत्पन्न Fas2 के साथ colocalize और midline कि दो Drosophila मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग से संपर्क करने से पहले समाप्त. एक एकल axon परियोजनाओं पूर्वकाल, bifurcates, और फिर दोनों पृष्ठीय और औसत दर्जे की परियोजनाओं के लिए α और β पालियों के रूप में । पिछले कई अध्ययनों से इस तकनीक का उपयोग किया है कि क्या कुछ प्रोटीन axonogenesis के कई पहलुओं के लिए सेल डिवीजन autonomously का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं की जांच, विस्तार सहित, pathfinding, बंटी, और/ 11,12,13,14,15,16,17,३४.

मशरूम निकायों के अलावा, रेटिना photoreceptor न्यूरॉन्स (आर-कोशिकाओं) के axonal pathfinding फैसलों को भी ऊपर वर्णित विच्छेदन विधि का उपयोग करते हुए विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है (साथ ही विच्छेदन विधि डे द्वारासंदर्भ४८) में पकड़वाया । मक्खी आंख के भीतर प्रत्येक ommatidia 8 photoreceptor न्यूरॉन्स कि तीन समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है (चित्रा 1): R1-R6 कोशिकाओं, जो परियोजना axons मस्तिष्क ऑप्टिक पालि के सतही लेमिना को शामिल; R7 कोशिकाएं, जो मज्जा की गहरी M6 परत को axons परियोजना; और R8 कोशिकाओं है, जो परियोजना axons मज्जा19,५८के मध्यवर्ती एम 3 परत करने के लिए । photoreceptor के प्रत्येक वर्ग के प्रक्षेपण पैटर्न बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और एक साथ इन न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक axon मार्गदर्शन में शामिल संकेत रास्ते को समझने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है19,५९. महत्वपूर्ण बात, सभी photoreceptor axons आसानी से वयस्क, ुपाल, या लार्वा ऊतकों की immunostaining द्वारा विच्छेदित Drosophila दिमाग में visualized किया जा सकता है एक एंटीबॉडी है कि chaoptin पहचानता का उपयोग कर, एक सेल भूतल ग्लाइकोप्रोटीन24, ६० , ६१. रिपोर्टर जीन व्यक्त GFP या β-galactosidase प्रत्येक R-कक्ष प्रकार (R1-R6, R7, और R8 कोशिकाओं) में भी निर्माण किया गया है और photoreceptor६२के प्रत्येक वर्ग कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । के बाद से प्रत्येक प्रकार के R-सेल विकासशील ऑप्टिक पालि के एक अलग परत में समाप्त होता है, इन पत्रकारों को सही ढंग से अपने लक्ष्य को खोजने के लिए प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए आवश्यक संकेतन रास्ते की विस्तृत तुलना के लिए अनुमति दी है । chaoptin स्थानीयकरण के साथ संयोजन में इन रिपोर्टर जीन के दो द्वारा उत्पादित अभिव्यक्ति पैटर्न का एक उदाहरण (जो सभी photoreceptor न्यूरॉन्स के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) चित्रा 6में दिखाया गया है । R7 photoreceptors कल्पना करने के लिए, R7-विशिष्ट Rhodopsin4-LacZ रिपोर्टर जीन युक्त दिमाग और chaoptin और β-galactosidase के लिए एंटीबॉडी के साथ विच्छेदित किया गया । Rhodopsin 4 (Rh4) R7 कक्षों के सबसेट में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है६३; Rh4 प्रमोटर इसलिए केवल इन कोशिकाओं में रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उम्मीद के रूप में, R7 कोशिकाओं मज्जा के गहरे M6 परत में समाप्त (एक पीला बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित चित्रा 6). इसी तरह, दिमाग Rhodopsin 6 (Rh6) प्रमोटर, जो विशेष रूप से R8 photoreceptors६३में व्यक्त किया जाता है से β-galactosidase व्यक्त कर रहे थे और immunostained का उपयोग कर एंटीबॉडी पहचानने chaoptin और β-galactosidase. के रूप में चित्रा 6में दिखाया गया है, R8 photoreceptors मज्जा की R3 परत पर समाप्त हो गया। हालांकि यहां नहीं दिखाया गया है, Rh1-LacZ भी लेमिना में R1-R6 photoreceptors की समाप्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: वयस्क Drosophila melanogaster मस्तिष्क कार्यात्मक अलग लेकिन परस्पर जुड़े क्षेत्रों के होते हैं । (क) वयस्क melanogaster मस्तिष्क की एक रूपरेखा दिखाया गया है, केंद्र स्थित मशरूम निकायों और परिधीय रेटिना photoreceptor न्यूरॉन्स पर प्रकाश डाला. (ख) वयस्क मशरूम शरीर axon बंडलों के बढ़े हुए आरेख (भी पालियों कहा जाता है) कि Fas2 एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । मशरूम निकायों के आंतरिक न्यूरॉन्स, Kenyon कोशिकाओं कहा जाता है, परियोजना axons पृष्ठीय स्थित कोशिका निकायों से पूर्वकाल (कोशिका निकायों इस आरेख से लोप) और अलग पालि संरचनाओं के रूप में । वयस्क मस्तिष्क में, γ पालियों (लाल रंग में दिखाया गया है) axons का एक औसत दर्जे का बंडल से फार्म, जबकि पृष्ठीय α और औसत दर्जे का β पालियों (नीले रंग में दिखाया गया है) एक ही axon से फार्म bifurcates प्रक्रिया के दौरान pathfinding । α '/β ' न्यूरॉन्स axonal पालियों कि आंशिक रूप से α के उन लोगों के साथ ओवरलैप का विकास/β न्यूरॉन्स, लेकिन Fas2 एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं कर रहे हैं और इस आरेख से छोड़ा जाता है. (ग) रेटिना न्यूरॉन्स रेटिना से ऑप्टिक पालि के दृश्य जानकारी relaying में महत्वपूर्ण हैं । रेटिना (बेज रंग) में स्थित कोशिका निकायों से Axons परियोजना और लेमिना या मज्जा में पोस्ट-synaptic लक्ष्य कोशिकाओं के साथ फार्म कनेक्शन. R1-R6 photoreceptor कोशिकाओं (लाल रंग में दिखाया गया है) ऑप्टिक पालि की बाहरी परत में कोशिकाओं के साथ विशिष्ट कनेक्शन फार्म, लेमिना बुलाया । R7 photoreceptor कोशिकाओं (पीला) मज्जा के M6 परत में लक्ष्य के साथ synapse, जबकि R8 कोशिकाओं (हरे रंग में दिखाया गया है) axons के थोड़ा और अधिक सतही एम 3 परत करने के लिए परियोजना मज्जा । भाग सी मैकमिलन प्रकाशकों लिमिटेड से अनुमति के द्वारा अनुकूलित: प्रकृति तंत्रिका विज्ञान (संदर्भ६४, कॉपीराइट (२०११)) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: GAL4/यूएएस प्रणाली लक्षित जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ऊतक विशिष्ट पैटर्न में ब्याज की एक जीन ("जीन एक्स") व्यक्त मक्खियों को प्राप्त करने के लिए, मक्खियों दोनों एक ऊतक विशिष्ट बढ़ाने और एक transgene Gal4 डीएनए युक्त के नियंत्रण में Gal4 transcriptional उत्प्रेरक प्रोटीन व्यक्त transgene शामिल होना चाहिए बाध्यकारी अनुक्रम (कहा जाता है ऊपर अनुक्रम को सक्रिय करने या यूएएस) जीन एक्स के निकट आम तौर पर, इस संयोजन संभोग माता पिता मक्खियों कि प्रत्येक एक transgene होते है और F1 संतान है कि दोनों को शामिल करने के लिए चयन द्वारा प्राप्त की है । परिणामस्वरूप एफ1 पीढ़ी में, Gal4 व्यक्त किया जाएगा और यूएएस के लिए बाध्य करने के लिए एक ऊतक विशिष्ट तरीके से जीन एक्स की प्रतिलेखन सक्रिय करेंगे । महत्वपूर्ण बात, अलग यूएएस-युक्त transgenes एक ही GAL4 "ड्राइवर" के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मशरूम निकायों (एमबीएस) में एक transgene व्यक्त Gal4 एक यूएएस-युक्त transgene के साथ संयुक्त किया जा सकता है GFP व्यक्त करने के लिए, एक transgene कि आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग कर ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक देता है, या एक यूएएस-transgene है कि एक रिपोर्टर पैदा करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए तैयारी में बढ़ते दिमाग। (ए) दिमाग के दिमाग को समतल रोकने के लिए एक पुल कवर के साथ SuperFrost प्लस स्लाइड पर बढ़ रहे हैं । दो "आधार" कवर स्लिप्स एक Superfrost प्लस का पालन कर रहे है सकारात्मक-स्पष्ट नाखून पॉलिश और विच्छेदित दिमाग के साथ स्लाइड का आरोप लगाया तो उन दोनों के बीच स्लाइड पर रखा जाता है । एक स्पष्ट "पुल" कवर पर्ची दिमाग के ऊपर रखा गया है और आधार कवर पर्ची का पालन किया । (ख) एक बार नख पॉलिश सूख जाने के बाद Vectashield को द्वितीयक एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए पुल के नीचे धीरे से pipetted है. साफ़ नख पॉलिश तो "पुल" कवर पर्ची के ऊपर और नीचे सील करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: मशरूम शरीर axons स्पष्ट रूप से एंटीबॉडी कि Fas2 पहचान का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । (क) वयस्क Drosophila दिमाग, विच्छेदित कर रहे थे स्थिर, और एंटीबॉडी पहचानने Fas2 के साथ मशीन । प्राथमिक एंटीबॉडी Alexa488-युग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी और दिमाग का उपयोग कर मांयता प्राप्त थे पर चढ़कर सकारात्मक स्लाइड का आरोप लगाया और एक लेजर फोकल सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग का उपयोग कर imaged । Bisymmetrically स्थित मशरूम शरीर कोशिका निकायों axons पूर्वकाल, bifurcate, और फार्म axon बंडलों (भी पालियों कहा जाता है) का विस्तार । Axons जो पृष्ठीय रूप से पेश α पालियों और औसत दर्जे का-पेश β पालियों व्यक्त Fas2. गंभीर रूप से, जंगली प्रकार मक्खियों के β पालियों मस्तिष्क midline से पहले समाप्त । केंद्र स्थित ellipsoid शरीर भी 1D4 एंटीबॉडी का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । (ख) वयस्क Drosophila मशरूम शरीर का औसत दर्जे का γ पालि axons भी व्यक्त Fas2 और 1D4 एंटीबॉडी का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । सामान्यतया, γ पालि axons में Fas2 की अभिव्यक्ति α और β पालियों की तुलना में कम है । (ग) Nab2-अशक्त दिमाग का मशरूम शरीर axons (जीनोटाइप: Nab2ex3/Nab2ex3) एमआईएस परियोजना contralaterally और प्रायः कमी पालियों में है. Nab2-अशक्त दिमाग विच्छेदित, स्थिर, और 1D4 एंटीबॉडी मशरूम शरीर α, β, और γ पालियों कल्पना के साथ दाग थे । अधिकतम तीव्रता Z-स्टैक अनुमानों के साथ ही midline क्षेत्र पर केंद्रित व्यक्तिगत ऑप्टिकल अनुभाग दिखाए जाते हैं । जबकि जंगली प्रकार मशरूम शरीर β पालि axons शायद ही कभी मस्तिष्क midline पार, Nab2-अशक्त दिमाग contralateral मस्तिष्क गोलार्द्ध में midline भर में गलत प्रक्षेपण की मात्रा बदलती है, "जुड़े" β पालियों में जिसके परिणामस्वरूप । संदर्भ३४,३५में परिभाषित के रूप में, हल्के संलयन & #60 को संदर्भित करता है; β पालियों के साथ केवल कई "किस्में" axons पार midline, उदारवादी फ्यूजन स्थितियों को संदर्भित करता है जहां Fas2 सकारात्मक β पालि न्यूरॉन्स मस्तिष्क midline पार लेकिन β पालि midline पर चौड़ाई में कमी आई है, और पूरा फ्यूजन स्थितियों को संदर्भित करता है जहां β पालि मोटाई की कोई कमी नहीं है के रूप में पालि मस्तिष्क midline पार । चूंकि ellipsoid शरीर भी Fas2 व्यक्त करता है, ऑप्टिकल वर्गों midline दिखा रहा है अक्सर β पालि संलयन visualizing में अधिक उपयोगी होते हैं । विशेष रूप से, लापता पालियों भी अक्सर (सफेद तारे के साथ यहां चिह्नित) मनाया जाता है । भाग C में डेटा का उपयोग ठहराव३४से मशरूम बॉडी phenotypes की अनुमति के साथ किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : MARCM एकल न्यूरॉन्स की axons कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (क) एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण mitotic साइटों पर FLP recombinase मध्यस्थता FRT पुनर्संयोजन का उपयोग करता है दो अलग बेटी की कोशिकाओं को बनाने के लिए । इस उदाहरण में, सभी कोशिकाओं को एक अलग गुणसूत्र पर एक मशरूम शरीर विशिष्ट GAL4 प्रोटीन होते हैं । कोशिका विभाजन के दौरान mitotic के बाद, एक बेटी सेल (ऊपर) GFP व्यक्त (या झिल्ली सीडी बाध्य-GFP) और ब्याज की एक जीन के दो उत्परिवर्ती alleles होता है, जबकि दूसरी बेटी कोशिका (नीचे) दो जंगली-प्रकार (WT) वारिस और एक transgene Gal80 प्रोटीन एक tubulin प्रवर्तक का उपयोग कर व्यक्त । Gal80 Gal4 रोकता है, तो किसी भी Gal80 उत्पादन कोशिकाओं गैर फ्लोरोसेंट होगा और या तो heterozygous या homozygous वंय-प्रकार होना चाहिए । केवल उन कोशिकाओं है कि GFP है+ उत्परिवर्ती एलील की दो प्रतियां शामिल होंगे । ध्यान दें कि GFP+ कोशिकाओं है कि भी ब्याज की एक जीन के दो उत्परिवर्ती alleles होते पैदा करने के लिए कई तरीकों में से केवल एक दिखाया गया है; कृपया12,४५,५६ अंय उदाहरणों के लिए देखें । (ख) मशरूम शरीर न्यूरॉन्स के विकास के बाद से γ न्यूरॉन्स के साथ शुरू होता है, तो α '/β ' न्यूरॉन्स, और समाप्त होता है α/β न्यूरॉन्स के साथ, प्रत्येक वर्ग के ंयूरॉन चुन कर लक्षित किया जा सकता है और विभिन्न विकासात्मक समय बिंदुओं पर चौंकाने वाली गर्मी से visualized. के रूप में 12में वर्णित है, ३७ डिग्री सेल्सियस है कि लार्वा सेने (एएलएच) के बाद २.५ दिनों ≤ होता है पर एक ४० मिनट गर्मी सदमे विशेष रूप से γ लक्ष्य होगा; न्यूरॉन्स, जबकि गर्मी झटका है कि होता है ३.५-४.५ दिन एएलएच (देर से L3 लार्वा चरण में) α लक्ष्य होगा '/β ' न्यूरॉन्स, और एक गर्मी सदमे कि हे 5-7 दिनों के बीच ccurs एएलएच (ुपाल development के दौरान) α/β न्यूरॉन्स लक्ष्य होगा । (ग) व्यक्तिगत वंय-प्रकार axons MARCM का उपयोग कर visualized थे । जंगली-प्रकार ~ 5-6 दिन पुरानी कोषस्थों (जीनोटाइप: hsFLP, यूएएस-सीडी-GFP; FRT82B, यूएएस-सीडी-GFP/FRT82B, टब & #62; Gal80; OK107-GAL4/+) mitotic पुनर्संयोजन के लिए प्रेरित करने के लिए ४० मिनट के लिए ३७ ° c पर हैरान गर्मी थे । दिमाग विच्छेदित, स्थिर थे, और एंटीबॉडी पहचानने GFP (1:500) और Fas2 (1:20) के साथ दाग । दिमाग तो फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल और फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा visualized के साथ मशीन थे । एक "नियंत्रण" जीनोटाइप से इस उदाहरण डेटा में, MARCM का उपयोग कर उत्पन्न GFP सकारात्मक कोशिकाओं जंगली प्रकार हैं और दो जीनmut alleles युक्त के बजाय, दो जीनWT alleles होते हैं. मशरूम शरीर β पालियों (का उपयोग कर visualized एंटीबॉडी पहचानने Fas2) मस्तिष्क midline तक पहुंचने से पहले समाप्त; α पालिक न्यूरॉन्स भी मौजूद हैं । अधिक विवरण दिखाने के लिए, एक एकल ब्रेन गोलार्द्ध के दृश्य में ज़ूम की गई छवियों की निचली पंक्ति में दिखाया जाता है । भाग सी संदर्भ३४से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : Photoreceptor axons की कल्पना भी की जा सकती है । वयस्क दिमाग R7 photoreceptors में β-galactosidase व्यक्त (छोड़ दिया, का उपयोग कर Rh4-LacZ) या R8 photoreceptors (ठीक है, का उपयोग कर Rh6-LacZ), स्थिर तय, और एंटीबॉडी के साथ मशीन β-galactosidase या chaoptin पहचानने । दिमाग तो फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी और लेजर द्वारा visualized फोकल माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के साथ मशीन थे । एकल ऑप्टिकल वर्गों प्रत्येक मस्तिष्क से दिखाया जाता है । बाईं ओर, कई R7 photoreceptor axons (तीर) मज्जा की गहरी M6 परत में समाप्त देखा जा सकता है (पीला बिंदीदार रेखा द्वारा दिखाया गया) । सही पर, R8 photoreceptor axons (तीर) मज्जा के बाहरी एम 3 परत में समाप्त (हरी बिंदीदार रेखा द्वारा दिखाया गया) । चूंकि R7 photoreceptors एक्सप्रेस या तो Rh3 या Rh4 और R8 photoreceptors एक्सप्रेस या तो Rh5 या Rh6६३, सभी R7 या R8 photoreceptors एक एकल LacZ रिपोर्टर जीन का उपयोग कर visualized नहीं किया जा सकता है । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

विच्छेदन और दृश्यावलोकन विधि ऊपर वर्णित immunostaining और लाइव इमेजिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है । हम एक सामान्य immunostaining प्रोटोकॉल रेखांकित किया है और एक ही रास्ता है जिसमें MARCM व्यक्ति मशरूम शरीर ंयूरॉंस की axonal आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर प्रकाश डाला है । इसके अलावा, इन सामान्य प्रक्रियाओं भी स्थिर या हौसले से विच्छेदित वयस्क दिमाग में इमेजिंग अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है४८,६५. लाइव इमेजिंग एक अधिक कुशल दृष्टिकोण प्रदान जब बढ़ाने जाल, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण कर सकते हैं, या लाइनों की नकल६६, उदाहरण के लिए । unGFP के स्थिर ऊतक में लाइव इमेजिंग के दौरान सेल मौत से कलाकृतियों पर कब्जा रोकने के लिए, मस्तिष्क 1x फास्फेट में विच्छेदित किया जाना चाहिए खारा (पंजाब) या HL3 मीडिया४८, 1x पंजाब में पुल स्लाइड पर घुड़सवार (या HL3), और कम से 15-20 मिनट में imaged । देखभाल इमेजिंग से पहले विच्छेदित मस्तिष्क से जितना संभव हो उतना श्वासनली निकालने के लिए भी लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह GFP प्रतिदीप्ति के दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकता है ।

जबकि मशरूम शरीर और photoreceptor ंयूरॉंस की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए दाग की स्थिति अपेक्षाकृत अच्छी तरह से कर रहे है24,६१,६७, इन सेल में ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन के स्थानीयकरण की स्थापना प्रकार व्यापक समस्या निवारण और ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है । विशेष रूप से, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने सहित कई महत्वपूर्ण कदम, बफर घटक एकाग्रता को अवरुद्ध, और निर्धारण, सबसे प्रतिलिपि और विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. सबसे पहले, प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता निर्धारित किया जाना चाहिए । हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी अक्सर एक कमजोर पड़ने का सुझाव दिया है (और हम अक्सर शुरू में कि एकाग्रता का उपयोग करके प्रारंभ), इन मूल्यों को शायद ही कभी Drosophila ऊतकों पर empirically निर्धारित कर रहे हैं । इसलिए, प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का परीक्षण है कि ऊपर और निर्माता के शुरू सुझाव के नीचे की सीमा अक्सर अधिक विशिष्ट धुंधला में परिणाम है । जबकि प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने सटीकता धुंधला पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है और ठीक होना चाहिए निर्धारित किया जाना चाहिए, समय दिमाग प्राथमिक एंटीबॉडी में मशीन है समाधान युक्त समग्र परिणाम पर थोड़ा प्रभाव के साथ काफी भिंन हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, हम 4 डिग्री सेल्सियस पर दो, तीन, या यहां तक कि चार दिनों के लिए Fas2 एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ विच्छेदित दिमाग मशीन जब इसी तरह के परिणाम देखा है । यद्यपि हम अनुशंसा करते हैं, हम भी एक रात के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में दिमाग की मशीन है और प्राप्त प्रतिलिपि धुंधला । महत्वपूर्ण बात, समय दिमाग की मात्रा को सीमित माध्यमिक एंटीबॉडी में कमरे के तापमान पर 3 ज (या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रात) में मदद करता है मस्तिष्क ऊतक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी सीमा है ।

दूसरा, यह अवांछित पृष्ठभूमि संकेत को खत्म करने के लिए अतिरिक्त "अवरुद्ध" एजेंट का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. विकल्प को NGS की एकाग्रता में वृद्धि शामिल है ~ 10%, 1-10% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) को जोड़ने के अवरुद्ध और प्राथमिक/माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान, या पूर्व प्राथमिक एंटीबॉडी के सोखना के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात Drosophila भ्रूण (देखें संदर्भ६८, अनुभाग २.९, चरण 3) ।

जब तक हम ऊपर सभी निर्धारण, धोने के लिए सुझाए गए बफर के रूप में PTN का उपयोग प्रोटोकॉल लिखा है, और एंटीबॉडी गर्मी कदम, अंय बफ़र्स में ऊतक निर्धारण (जैसे PLP और PEM के रूप में, सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध) में गहरा मतभेद हो सकता है सिग्नल की शक्ति । उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि Cyclin ई लार्वा काल्पनिक डिस्क में undetectable है जब ऊतकों पारंपरिक 4% पंजाब में पतला paraformaldehyde में तय कर रहे हैं, लेकिन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है जब ऊतकों PLP बफर में तय कर रहे है (केन Moberg, व्यक्तिगत संचार, और संदर्भ६९) । बफर घटकों में परिवर्तन के अलावा, ऊतक निर्धारण के लिए समय और तापमान में फेरबदल भी काफी immunofluorescent दाग को प्रभावित कर सकते हैं और अगर जरूरत empirically निर्धारित किया जा सकता है. आम तौर पर, निर्धारण समय पर्याप्त सेलुलर घटकों के पर्याप्त crosslinking और कुल मिलाकर सेलुलर आकृति विज्ञान के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए अनुमति देने के लिए काफी लंबे समय से अधिक crosslinking और प्रोटीन epitopes के "दफनाने" को रोकने के लिए सीमित किया जा रहा होना चाहिए । इसलिए, जब शुरू में एक नए अधिग्रहीत प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए धुंधला स्थिति का अनुकूलन, हम आमतौर पर निर्धारण समय सीमा लगभग 20 मिनट और अक्सर ठंडा तापमान पर ऊतकों को ठीक करेंगे ।

कई नियंत्रण किसी भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता के साथ ही मनाया phenotype पर transgenes/आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव की जांच करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए । पता लगाने के लिए कि क्या प्राथमिक एंटीबॉडी विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है ब्याज की प्रोटीन को पहचानता है, मक्खियों से ऊतक इस प्रोटीन की कमी और/या प्रोटीन व्यक्त ऊतक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए । अतिरिक्त शुद्ध प्रतिजन प्रोटीन के अलावा यह भी निर्धारित करने के लिए कि प्राथमिक एंटीबॉडी मक्खी मस्तिष्क में अन्य epitopes पहचानता शामिल किया जा सकता है । अंत में, किसी भी फ्लोरोसेंट संकेत वर्तमान जब प्राथमिक एंटीबॉडी लोप कर रहे है गैर के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है विशिष्ट चयनित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा बाध्यकारी ।

कई महत्वपूर्ण नियंत्रण भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि या transgenes की उपस्थिति की तीव्रता या न्यूरॉन आकृति विज्ञान धुंधला करने के लिए योगदान का आकलन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, चित्रा 5 में MARCM प्रयोग में प्रयुक्त मक्खियों में एकाधिक transgenes (hsFLP, यूएएस-सीडी-GFP, FRT82B, टब & #62; GAL80, और OK107-GAL4) शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक मशरूम शरीर आकृति विज्ञान पर प्रभाव के लिए अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए । एक बहुत ही कम से कम, दोनों OK107-GAL4 और यूएएस-सीडी-GFP युक्त मक्खियों की मशरूम शरीर रचना विज्ञान विश्लेषण किया जाना चाहिए । यह भी गर्मी सदमे और hsFLP और FRT82B दोनों युक्त मक्खियों का विश्लेषण करके मशरूम शरीर के विकास पर Flp recombinase उत्पादन के प्रभाव का आकलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । हालांकि MARCM कि एक दिया प्रोटीन autonomously नियंत्रण axonal मार्गदर्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, को सही ढंग से इस निष्कर्ष बनाने के लिए आवश्यक नियंत्रण की संख्या इस तकनीक की एक छोटी सी सीमा हो सकती है । कम जटिल प्रयोगों में, इसी तरह के नियंत्रण भी लागू होते हैं । उदाहरण के लिए, एक प्रयोग ले जहां GAL4/यूएएस प्रणाली एक RNAi transgene के साथ संयोजन में प्रयोग किया जा रहा है सभी न्यूरॉन्स में ब्याज की एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति पछाड़ना । इस प्रयोग में कम से दो transgenes मौजूद होंगी: एक पैन-न्यूरॉन GAL4 ड्राइवर, जैसे कि elav-GAL4, और यूएएस-RNAi transgene । अकेले इन transgenes में से प्रत्येक युक्त मक्खियों में मशरूम शरीर ंयूरॉंस की आकृति विज्ञान प्रयोगात्मक हालत के अलावा जांच की जानी चाहिए जहां मक्खियों एक ही मक्खी में बंदरगाह दोनों transgenes ।

अंत में, निर्धारित करने के लिए कि ब्याज की प्रोटीन मशरूम शरीर में व्यक्त किया जाता है न्यूरॉन्स यह आमतौर पर सह करने के लिए आवश्यक है-Fas2 के लिए एंटीबॉडी के साथ दिमाग दाग. वैकल्पिक रूप से, GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, आरएफपी, या सीडी बाध्य झिल्ली-GFP भी GAL4/यूएएस प्रणाली का उपयोग कर व्यक्त किया जा सकता है और एंटीबॉडी ब्याज के प्रोटीन पहचानने के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया । चूंकि Fas2 केवल fasciculated axons कि मशरूम शरीर α और β पालियों के रूप में पहचानता है, GAL4-चालित, झिल्ली-बाउंड सीडी-GFP का उपयोग मशरूम शरीर ंयूरॉंस अंकन के लिए विशेष रूप से उपयोगी किया गया है ।

axonal मार्गदर्शन में दोषों अक्सर १००% व्याप्ति नहीं कर रहे है और यहां तक कि एक ही जीनोटाइप के दिमाग कुछ परिवर्तनशीलता दिखा सकते हैं । इसलिए, जब मशरूम शरीर या photoreceptor pathfinding में दोषों के लिए नव जनित उत्परिवर्ती alleles विश्लेषण, विभिंन alleles और दृष्टिकोण का एक संयोजन का उपयोग किया जाना चाहिए । साहित्य में अधिकांश अध्ययनों की जांच करने के लिए कई विभिंन तरीकों का उपयोग करें कि क्या एक प्रोटीन axonal मार्गदर्शन को नियंत्रित करने में एक सेल स्वायत्त भूमिका निभाता है: i) homozygous नल मक्खियों में pathfinding दोषों का विश्लेषण (अधिमानतः अलग परमाणु का उपयोगll alleles), द्वितीय) pathfinding दोषों के विश्लेषण में केवल ंयूरॉंस में ब्याज की कमी के प्रोटीन (आमतौर पर RNAi के माध्यम से), iii) pathfinding दोषों के MARCM विश्लेषण, और iv) बचाव प्रयोग जहां जीन फिर से व्यक्त की है न्यूरॉन्स में homozygous अशक्त मक्खियों. आदर्श रूप में, जीनोटाइप प्रति कई दर्जन दिमाग ंयूरॉन आकृति विज्ञान में दोषों के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए ।

हालांकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित मुख्य रूप से निश्चित ऊतक के भीतर प्रोटीन के immunofluorescent स्थानीयकरण पर केंद्रित है, इस तकनीक के कई भविष्य अनुप्रयोगों छवि रहते मस्तिष्क ऊतक के लिए विकसित किया जा रहा है । एक बार दिमाग (आमतौर पर सेल संस्कृति मीडिया में) विच्छेदित कर रहे हैं, वे तो 25 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए संस्कृति हो सकता है । इन पूर्व विवो संवर्धन तरीकों जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता की जांच करने के लिए विकसित किया जा रहा है, ऐसी प्रोटीन गतिविधि है कि axon पुनर्जनन निम्नलिखित चोट७०,७१, intracellular को बढ़ावा देता है संकेतन गतिशीलता७२, और ंयूरॉन विकास७३।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम शुरू में अध्यापन SMK मस्तिष्क विच्छेदन तकनीक के लिए Changhui पाक और Alysia Vrailas मोर्टिमर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी केन है Moberg लैब समूह के सदस्यों को धंयवाद, विशेष रूप से क्रिस दौर, गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए । एंटीबॉडी पहचानने Fas2 (1D4) और chaoptin (24B10) के विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक से प्राप्त किए गए. एंटीबॉडी 24B10 को Seymour बेंजी द्वारा DSHB को जमा किया गया और नानसी Colley24,६०,६१, एंटीबॉडी 1D4 कोरी DSHB 22,23,५६द्वारा Goodman में जमा किया गया । फ्लाई स्टॉक को ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर से प्राप्त किया गया. हम भी करने के लिए धंयवाद ओहियो कृषि अनुसंधान और विकास केंद्र (OARDC) MCIC इमेजिंग केंद्र के उपयोग के लिए छवि के दिमाग में चित्र 4a और B. SMK से एक अनुदान के द्वारा समर्थित है niched (1 R15 HD084241-01A1) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Fas2 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4
Chaoptin Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Antibody Aves Lab GFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody ThermoFisher A-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-21236
20% paraformaldehyde Electron Microscope Services RT15713
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Na phosphate Buffer dibasic Sigma S3264
Triton X 100 Sigma X100-100ml
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
nutator/rocker Fisher 22-363-152 or 88-861-041
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
Name Company Catalog Number Comments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4 BL458 Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4 BL 854 GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4 BL 7362 GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64305 GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4 BL 4440 GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64296 GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO BL 5145 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP BL5146 MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 BL 44408 MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 BL44406 MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 BL 44407 MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO BL 5137 GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP BL 5139 MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO BL 28832 MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80 BL 5140 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 BL 5135 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome

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Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M.… More

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. J. Vis. Exp. (129), e56174, doi:10.3791/56174 (2017).

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