Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/56174
Automatic Translation
1,2, 3, 2,3
1Program in Neuroscience, The College of Wooster, 2Department of Biology, The College of Wooster, 3Program in Biochemistry, Cellular, and Molecular Biology, The College of Wooster

Summary

Denne protokollen beskriver disseksjon og immunostai-av voksen Drosophila melanogaster hjernen vev. Spesielt fremhever denne protokollen bruken av Drosophila sopp kropp og photoreceptor nerveceller som eksempel neuronal delsett som nøyaktig kan brukes å avdekke generelle prinsipper mange aspekter av neuronal utvikling.

Abstract

Nervesystemet utvikling omfatter en sekvensiell serie av hendelser som koordineres av flere signalveier og regulatoriske nettverk. Mange av proteiner involvert i disse baner er evolutionarily konservert mellom pattedyr og andre eukaryoter, for eksempel frukt fly Drosophila melanogaster, noe som tyder på at lignende organisering prinsipper finnes under utviklingen av disse organismer. Viktigere, har Drosophila vært brukt mye å identifisere cellulære og molekylære mekanismer regulere prosesser som kreves i pattedyr inkludert neurogenesis, differensiering, axonal veiledning og synaptogenesis. Fluer har også blitt brukt med hell å modellere en rekke menneskelige neurodevelopmental sykdommer. Her beskriver vi en protokoll for trinnvis microdissection, fiksering og immunofluorescent lokalisering av proteiner i voksen Drosophila hjernen. Denne protokollen fokuserer på to eksempel neuronal bestander, sjampinjong kroppen nerveceller og retinal fotoreseptorer, og inkluderer valgfrie trinnene for å spore individuelle sopp kroppen nerveceller med mosaikk analyse med en Repressible celle markør (MARCM)-teknikk. Eksempeldata fra både vill-type og mutant hjerner vises sammen med en kort beskrivelse av en kriteriene for axonal veiledning mangler. Mens denne protokollen høydepunkter to veletablerte antistoffer for å undersøke morfologi av sopp kropp og photoreceptor nerveceller, andre Drosophila hjernen regioner og lokalisering av proteiner i andre områder av hjernen kan også være undersøkt bruker denne protokollen.

Introduction

Selv om Drosophila nervesystemet er mindre enn mennesker og gnagere, gir sin kompleksitet en kraftig, imøtekommende modell for å forstå sine virveldyr kolleger. I mange tilfeller kode genomer virveldyr og fluer ligner proteiner som styrer mekanismer av nervesystemet utvikling. Faktisk, kreves mange av genene for neuronal utvikling i virveldyr har orthologs i fluer, inkludert de som er involvert i signalveier at kontroll mønstre, neurogenesis og axonal veiledning1,2,3 ,4,5. Netrin er for eksempel en ligand kreves for axonal veiledning i pattedyr og D. melanogaster6,7,8. Mens netrin var opprinnelig isolert fra embryonale chick hjernen vev6, har studier avdekket at netrin spiller en bevart rolle under utviklingen av embryonale sentralnervesystemet (CNS) i Drosophila8. Andre studier har brukt genetisk skjermer i embryonale Drosophila CNS for å identifisere bevarte ligander og reseptorer kreves for pathfinding i både Drosophila og virveldyr9.

Mens embryonale fly CNS har vært brukt mye i siste for å identifisere ligander reseptorer og intracellulær signalnettverk proteiner kreves for axonal veiledning8,9, har siste verk undersøkt måtene som mange av disse proteinene også styre pathfinding beslutninger under senere stadiene av utviklingen. Spesielt har sopp kroppen (MB) og retinal photoreceptor nervecellen utvikling (figur 1) gitt innsikt i mekanismer som kontroll pathfinding, synapse formasjon, axon beskjæring og flere andre aspekter av neuronal utvikling10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor neurons koble fly netthinnen til områder av voksen hjernen kalt lamina og forlengede og er avgjørende for videresending visuell informasjon til hjernen (anmeldt av18,19), mens sopp kroppen nerveceller sentralt ligger i fly hjernen og kreves for læring og hukommelse20,21. Både photoreceptor neurons og iboende neurons av sopp organer, kalt Kenyon celler, benytte evolusjonært bevarte diffusible og kontakt-avhengige axonal veiledning mekanismer for å finne sine etter synaptic mål. I tillegg til å være synlig i voksen fluer, kan photoreceptor og MB neurons også direkte visualiseres i larver og pupae antistoffer eller reporter, gener,22,,23,,24,,25. Muligheten til å enkelt visualisere disse to sett av neurons på ulike utviklingsmessige tidspunkt har fremmet bruken som suveren modeller for mange aspekter av neuronal utvikling.

I tillegg brukes som modell for å forstå mekanismene av normal nervesystemet utvikling, har nyere studier vist at fluer kan også tjene som nøyaktige modeller av en rekke menneskelige sykdommer, inkludert skjøre X syndrom (FXS)26 , Intellektuelle funksjonshemming (ID),27,,28,,29,,30,,31, og andre32. For eksempel for å studere molekylære funksjonen til ZC3H14, et gen nylig knyttet til menneskelige intellektuelle handikap, vi opprettet et fly modell av ID ved å bruke en null allelet fly ZC3H14 ortholog, kalt Nab230. Fluer mangler Nab2 har alvorlige minne impairments og utvidet poly(A) haler, recapitulating hva er observert i menneskelige pasienter eller pasienten avledet cellen linjer33,34. Viktigere, vise fluer mangler Nab2 også alvorlig hjernen morfologi defekter i deres voksen sopp organer34, analog med hva er observert i fluer mangler FXS syndrom genet, FMR135. Dermed kan fluer tjene som en viktig modell organisme både normale hjernens utvikling og sykdommer som forstyrrer den.

Til slutt, tilgjengelighet av høy gjennomstrømning metoder å overvåke atferd, kombinert med det store utvalget av tilgjengelige genetisk verktøy, gjør Drosophila en modell organisme valgfrihet for å identifisere områdene av hjernen som kontrollerer komplekse atferd, som læring og hukommelse, søvn, frieri, tørst og andre36,37,38,39. Et spesielt nyttig verktøy som er i midten av et fly genetiker "verktøykasse" er GAL4/UAS systemet (figur 2). Dette systemet40,41 bruker vev bestemte uttrykk for Gal4 transcriptional aktivator for å forhøye uttrykket av gener eller effekter av transgener nedstrøms av en oppstrøms aktivere sekvens (UAS). Modifikasjoner av dette systemet har tillatt forskere til, for eksempel kontroller nøyaktig excitability av bestemte neurons42,43, overexpress eller sammenleggbare bestemte gener rundt44, 45, analysere sanntid kalsium dynamikken i vivo46og express reporter gener merke neuronal overleveringslinjer41. Kombinasjonen av GAL4/UAS systemet med mitotisk rekombinasjon også tillatt for etableringen av mosaikk analysen med en Repressible celle markør (MARCM) system12,47. MARCM har blitt brukt mye i enkelt Nevron sporing for å identifisere mobilnettet signalnettverk komponenter kreves for axonal veiledning12,47. Selv om disse og andre teknikker har gitt en rekke verdifulle innsikt på cellulære mekanismer kreves for nervesystemet fungerer, krever de fleste at Drosophila hjernen først være dissekert; forsiktig fjerning av hjernen er nødvendig for å beholde riktig hjernen morfologi og tilkobling mønstre mellom områder av hjernen. Følgende protokollen bruker sopp kropp og photoreceptor nerveceller someksempel neuronal populasjoner som fører deg gjennom dissection og immunofluorescent flekker av voksen Drosophila hjerner.

Protocol

1. drosophila melanogaster genetikk og valgfrie varme sjokk prosedyrer

  1. Når fluene har passert og F1 avkom er klekket, få kvinner og/eller menn av aktuelle genotype. Avhengig av regionen hjernen etterforsket, skal samles daglig og atskilt med sex slik at avhengig av alder og/eller dekket av hvit mønstre av hjernen kan lettere skilles.
    Merk: Valgfritt: Hvis fluer brukes for mosaikk analyse med en Repressible celle markør (MARCM) analyse 12 , 47, embryoer larvene, eller pupae skal varme sjokkert over 37 ° C i 30-45 minutter til indusere mitotisk rekombinasjon. For å målrette bestemte regioner av sopp organer for MARCM analyse, bør varme sjokk være tidsbestemt Ifølge tidsplanen etter 12 og beskrevet i figur 5 B. Hvis bruker MARCM for å undersøke hjernen regioner enn sopp organer, skal piloten eksperimenter utføres for å fastslå den optimale fasen skal varme-sjokkert. Mens trinnene er skrevet i hensyn til eclosed flyr, pharate voksne kan også bli dissekert bruke fremgangsmåten når pupal saken er fjernet.

2. Disseksjon stasjon forberedelse

  1. posisjon stereomicroscope og lys kilde med tilknyttet fiber optisk goosenecks på en stor Borstemmaskin. Å fremme stødig håndbevegelser og redusere hånd " riste " mens dissekere, er det viktig at det finnes tilstrekkelig hånd og arm resten plass rundt mikroskopet. Kontroller at det er ca 8-10 inches på hver side av mikroskopet og 4-6 inches mellom foten av mikroskopet og kanten av benken.
  2. Fyll 2 eller 3 brønner i et glass 9-godt eller 3-vel parabolen med 1.0 mL PTN bufferen (0.1 M natrium fosfatbuffer pH 7.2, 0,1% ikke-ionisert surfactant, se materialer tabell for komplett buffer komponenter) og sted den dissecting ligger på is. Nylig dissekert hjernen vil bli overført til denne parabolen og lagret før fiksering trinnet.
    1. Merk: Hvis live bildebehandling, disseksjon bufferen skal 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) eller HL3 buffer 48. Hvis intracellulær protein lokalisering, kan PBS også brukes som en alternativ buffer for disseksjon og fiksering. Etter fiksering, permeabilization av celle membraner skal deretter utføres med PTN vasker med 0,1% eller 0,3% ikke-ionisert vaskemiddel.
    2. Hvis PBS brukes for disseksjoner og fiksering, pipette-spisser skal skylles minst en gang med en detergent inneholder buffer (for eksempel PTN) slik at hjernen henger til plastikk pipe tips under overføring til microcentrifuge rør.
  3. Bruker en tom 35 mm glass eller plast Petriskål, konstruere en disseksjon parabol med en silikon-elastomer. Kort, bland elastomer komponentene ifølge produsenten ' s retninger, hell i 35 mm retter, og la den danner natten på en flat overflate. Elastomer inneholder disseksjon retter bør brukes til å beskytte fine tips av dissekere tang, som kan lett bli ødelagt hvis kontakt er gjort mellom tang og en hardere overflate, som et glass rett. Vi kjøper ofte kommersielt tilgjengelig silikon belagt retter fra nettforhandlere. For å øke kontrasten under disseksjoner, silikon elastomer disseksjon retter som inneholder deaktivert kull (og dermed farget svart) er spesielt nyttige.

3. Voksen hjernen disseksjon prosedyren

  1. Anesthetize 3-5 dagers gammel voksen D. melanogaster med CO 2 eller ved hjelp av is. Hvis bruker is, flyr plass ampullen inneholder flyr opp ned (plug slutt ned) i en isen bøtte for ~ 5 min. plassere ampullen oppned i isen hindrer bli lodged i maten. Når fluene har vært anesthetized, plassere fluene på et kaldt metall pute eller Petriskål sitter i isen eller på en CO 2 emitting fly pad. Hvis dissekere hjerner å analysere neurodegeneration, eldre fluer kan også brukes.
  2. Sted litt (150-200 µL) av PTN midt i disseksjon parabolen bruker en overføring pipette eller en p200 pipette for å opprette en " boble " av PTN. Plasser disseksjon rett under stereomicroscope og justere belysning og fokus slik at boblen av PTN fyller synsfelt og jevnt opplyst.
  3. Manipulere fluer slik at de " buken opp " (dvs., ventral side opp) mens du ligger på metall eller CO 2 pad.
  4. Bruke ett par #5 tang, forstå magen av en flue å være dissekert og holde tak i fly, helt senk det i PTN på disseksjon parabolen.
    Merk: For resten av protokollen, alle trinnene bør utføres mens hodet er neddykket i PTN.
  5. Bruker et par #5 tang, forstå grunnlaget for den fly snabel og trekk på to par Tang fra hverandre koble fly hodet fra kroppen. Kast magen og brystkasse. I dette trinnet er det viktig at hodet ikke er utgitt og lov til å flyter på overflaten av PTN. Når hodet er flytende, kan det være svært vanskelig å forstå igjen uten å knuse hjernen.
    Merk: Bruker denne metoden, er forbindelser mellom hjernen og ventrale kuttet. Hvis intakt forbindelser mellom disse områdene av CNS, bør en alternativ disseksjon protokoll, for eksempel 49 , 50, følges. Hvis snabel løsner fra fly hodet før hodet fjernes, vil det være et hull der Snabel var. I dette tilfellet forstå fly hodet på kanten av hullet i nærheten ett øye. Deretter fjerne hodet med en moderat mengde kraft mens du trekker to par av Tang fra hverandre. Noen ganger når hodet fjernes fra kroppen, gut og/eller ventrale nerve ledningen restene knyttet til hodet og må fjernes før du fortsetter dissection.
  6. Mens ett par tang fatter på snabel, sekundet par bør forstå mediale kanten av høyre fly øyet. Sakte, trekke Tang fra hverandre. Dette trinnet skal utføres med en liten mengde jevn kraft. Som tang sakte flytte fra hverandre, bør snabel trekk fra hodet og opprette et sentralt hull i hodet cuticle. Forkaste Snabel med de første par tang uten å slippe den mediale delen av høyre øye fra de andre parene.
    Merk: Voksen D. melanogaster hjernen er i den caudal (dvs. bakre/bak) regionen fly hodet. Dermed bør fatte regionen av hodet unngås. Ideelt sett bare de rostral (dvs., foran) del av hodet nær mediale netthinnen skal fattast direkte av tang. Hjernen og tilknyttede luftrøret skal nå vises gjennom sentrale hullet i cuticle. På denne tiden, alle trevlet tråder på luftrøret stikker fra hullet kan bli fjernet og forkastet.
  7. Med andre par pinsett, forstå mediale kanten av venstre netthinnen (på kanten av sentrale hullet i hodet cuticle). Hvis du vil fjerne Netthinne og tilknyttede cuticle, trekkes langsomt Tang fra hverandre i 180 ° vinkel. Som netthinnen dissociates fra den underliggende optikk lobe, bør du føle litt bedre spenning. Gå sakte å unngå å rive optikk lobe.
    Merk: Skille tang for fort i dette trinnet kan føre de rev av the optikk lobe eller forstyrrelse av sopp kropp strukturer. Noen ganger, cuticle fjernes men stykker av netthinnen vil forbli knyttet til optikk lobe. Hvis imaging sopp organer, er det ikke helt nødvendig å fjerne hele netthinnen. Analyse av andre hjernen områder (for eksempel netthinnen Nevron innervering av fiberoptisk hjernen lobes) kan imidlertid kreve netthinnen fjernes helt som beskrevet av 48 , 51.
    Merk: Som netthinnen er langsomt atskilt fra den underliggende optikk flik av hjernen, optikk lobe bør være observerbare som en ugjennomsiktig hvit struktur dekket med hvite, trevlet luftrøret. Når en netthinnen er fjernet, kan det bli forkastet. Når du analyserer pathfinding retinal neurons, bør bestemt forsiktighet utvises i dette trinnet for å hindre skade optikk lobe. En fokusert på disseksjon og live bildebehandling av photoreceptor neurons er også tilgjengelige 48.
  8. Nå nøye fjerne så mye av synlig luftrøret som mulig. Luftrøret kan allerede inneholde eller senere fylle med luft, forårsaker hjerner til å flyte, og muligens tapt under senere immunostai-trinn. Hvis du vil fjerne luftrøret, plukke den utenfor hjernen med en veldig skarp #5 tang.
  9. Fjern gjenværende netthinnen og omkringliggende cuticle ved begge par tang til å forstå den mediale delen av venstre fly netthinnen. Nøye rive netthinnen i to for å fjerne deler av netthinnen og cuticle. I noen tilfeller beviser fjerner gjenværende cuticle uten å knuse hjernen spesielt utfordrende. I disse tilfellene vi har funnet at de gjenværende trådene ventrale kan i stedet fattast av ett par tang mens andre par tang nøye fjerne sist av cuticle.
  10. Bruker en p200 pipette, flytte dissekert hjernen til en brønn på 9 - eller 3-godt parabolen med PTN. Hjernen til den likt anleggspreg skal være gruppert sammen i samme godt og holdt på is. Hjernevev rettes innen én time etter disseksjon. Hjernen kan være fast i små grupper og samlet hvis et større antall hjerner. I de fleste tilfeller, en erfaren forsker kan vanligvis dissekere en hjerne og overføre den til glass samling parabol på ca 3-5 min.

4. Fiksering og Immunofluorescent flekker prosedyre

  1. bruker en p200 pipette, overføre dissekert hjernen fra 9-vel rett til en 0,5 mL microcentrifuge rør fylt med 0,5 mL 4% paraformaldehyde fortynnet i PTN. Minst 10-15 hjernen til den likt anleggspreg kan kombineres i en microcentrifuge tube. Alle trinnene (til montering av hjernen på lysbilder) er fullført i 0,5 ml microcentrifuge rør.
    Advarsel: Paraformaldehyde (PFA) skal håndteres i avtrekksvifte. PFA avfall skal lagres og spesialavfall. 20% paraformaldehyde kjøpt i glass ampuller kan aliquoted inn i microcentrifuge rør og lagret ved 20 ° C til nødvendig.
  2. i avtrekksvifte, ruge hjerner i 4% paraformaldehyde etter 20 min med langsom fart rocking ved romtemperatur.
  3. Etter fiksering, tillate hjerner til å bosette til bunnen av microcentrifuge rør av tyngdekraften.
    Merk: Noen ganger hjernen kan holde til side av microcentrifuge røret. Hvis dette skjer, er det vanligvis nyttig å dreie sidelengs røret mellom pekefingeren og tommelen eller svært forsiktig trykke røret på benken å fremme senkingen av hjernen.
  4. Fjern bindemiddel bruker en p1000 Pipetter og utføre to " rask " vasker med 500 µL av PTN, slik at hjernen til å bosette til bunnen av microcentrifuge røret mellom vasker. Under disse rask vasker, når alle hjernen har avgjort av tyngdekraften til bunnen av microcentrifuge røret, kan PTN umiddelbart utskiftes frisk buffer; ingen ekstra vask tid kreves.
    Merk: Vanligvis forlater ekstra buffer i røret er best å risikere hjernen fjerning. Nøye undersøkelse pipette tips er ofte nødvendig å sikre at ingen hjerner har blitt feilaktig fjernet fra røret. Hvis hjerner har vært ved et uhell pipetted i spissen, dispensere dem tilbake i microcentrifuge røret, venter hjerne til å bosette seg og deretter fortsette å fjerne alle ekstra PTN er.
  5. Etter siste rask vask, bruke en p1000 pipette til å utføre tre " lang " vasker: legge til 500 µL av PTN og vask for 20 min ved romtemperatur på en rocker/nutator. Alle fremtidige " lang " vasker bør være i 20 minutter.
    Merk: Etter disse vasker, fast hjernen kan være lagret over natten ved 4 ° C i PTN.
  6. Fjerne siste vask med en p1000 pipette og Inkuber hjernen på en rocker eller nutator i romtemperatur i 0,5 mL blokkerer løsning [PTN + 5% normal geit serum (NGS)] for minst 30 min ved romtemperatur.
    1. Geit sekundære antistoffer brukes i påfølgende protokollen trinn. Hvis sekundære antistoffer fra en annen art vil bli brukt, normal serum fra at arter (snarere enn NGS) bør brukes i løsningene blokkerer og antistoff.
  7. Bruker en p1000 pipette, fjerne blokkering løsning og legge primære antistoffer fortynnet i PTN (PTN + 5% NGS + utvannet primære antistoff). Når du bruker en primær antistoff for første gang, den optimale fortynning som antistoff bør fastsettes empirisk.
    Merk: For å visualisere sopp kroppen nerveceller, antistoffer gjenkjenne Fas2 blir vanligvis brukt. Disse antistoffene er tilgjengelige fra utviklingsmessige studier Hybridoma Bank (DSHB) som antistoff 1 d 4 og bør fortynnes 1:20 i PTN + 5% NGS.
    Merk: For å visualisere photoreceptor nerveceller, antistoffer gjenkjenne chaoptin blir vanligvis brukt. Chaoptin antistoffer er tilgjengelige fra DSHB som antistoff 24B10 og bør fortynnes 1:20 i PTN + 5% NGS.
    Merk: Fiksering prosessen vanligvis eliminerer fluorescens fra fluorescerende protein som grønne fluorescerende protein (GFP). Derfor, når du bruker MARCM til å analysere axonal veiledning av individuelle MB neurons, bruke et antistoff gjenkjenne GFP.
  8. Ruge hjerner i primære antistoff løsning på en rocker/nutator 2-3 netter på 4 ° C.
  9. Etter inkubasjon med primære antistoffer tillate hjerner til å bosette til bunnen av microcentrifuge rør og deretter fjerne den primære antistoff løsningen.
  10. Bruker en p1000 pipette, utføre 2 " rask " vasker og 3 " lang " 20 min vasker med 0,5 mL PTN som beskrevet ovenfor i trinn 4.4 og 4.5, nøye slik at hjernen for å slå av tyngdekraften til bunnen av microcentrifuge røret mellom hver Wash
  11. Incubate hjernen for 3t ved romtemperatur med riktig fluorescently-merket sekundære antistoffer. Sekundær antistoffer er vanligvis utvannet i 0,5 mL av PTN + 5% NGS i en konsentrasjon av 1:200.
    Merk: Når fluorescerende sekundære antistoffer er lagt, hjernen bør holdes i mørket for resten av eksperimentet.
    Merk: I tilfelle gjenværende GFP fluorescens gjenstår, når MARCM analyse det anbefales å bruke en sekundær antistoff merket med en fluorophore har lignende eksitasjon/utslipp bølgelengder som GFP (f.eks Fluoroscein isothyocyanate (FITC) eller Alexa488).
  12. Etter videregående antistoff inkubasjon tillate hjerner til å bosette til bunnen av microcentrifuge rør og fjerne sekundære antistoff løsningen.
  13. Utføre 2 " rask " vasker og 3 " lang " 20 min vasker med 0,5 mL PTN som beskrevet ovenfor i trinn 4.4 og 4.5, nøye slik at hjernen for å bosette til bunnen av microcentrifuge rør mellom hver Wash
  14. Etter tredje " lang " 20 min vask, bruk en p200 pipette fjerne så mye buffer som mulig.
  15. Legge til 75 µL av fluorescerende anti-fade montering middels til hjernen. Pipetter hjerner og montering medium i pipette spissen en gang å blande. Ikke invertere røret siden hjernen sitter fast på cap eller sider av microcentrifuge røret.
    Merk: Etter suspensjon av hjernen i montering medium, rør kan innpakket i aluminiumsfolie å bremse fluorophore slukke og lagret på 4 ° C over natten. Hvis nødvendig, hjernen kan lagres i flere dager på 4 ° C, men bør ideelt monteres på lysbilder snarest.

5. Montering voksen D. melanogaster hjernen på mikroskopet lysbilder og bildebehandling

  1. bygge en " bro " lysbilde. Plasser to " base " coverslips ca 1 cm fra hverandre på et positivt ladet lysbilde. Kontroller at positivt ladede siden av lysbildet vender. Overholde coverslips til lysbildet som fingernegl polsk som vist i Figur 3 A. Det er vanligvis nyttig å forsegle hver base cover slip med negl polsk å sikre montering media ikke veken under disse base dekket slips tre ytterkant. La fingernegl polsk tørke (10-15 min) før du fortsetter.
  2. Plasser lysbildet under stereomicroscope og Pipetter montering media løsning som inneholder dissekert hjernen i mellomrommet mellom de to coverslips. For å gi mer kontrast, er det nyttig å manøvrere svanehals lysene slik at de er parallelle med benk toppen.
  3. Fjern ekstra montering media fra lysbildet med en pipette, være forsiktig med å Pipetter hjernen ut av lysbildet.
  4. Veken bort ekstra montering medier. Det gjør hjernen skal plasseres mer presist i neste trinn.
  5. Med et par pinsett og stereomicroscope, plassere hjernen på lysbildet i et rutenettmønster med antennal lobes vender opp.
  6. Plasserer en cover slip (den " bro ") over hjernen ( Figur 3 A). Bruke fingernegl polsk for å forsegle sidene av broen cover slip der de kontakte den " base " cover følgesedler.
  7. Bruker en p200 pipette, sakte fylle center hulrommet under broen med fersk monterer medier ( Figur 3 B). Plasser en dråpe om gangen i åpne utkanten av center dekkglassvæske og la montering media å veken under center bro dekkglassvæske. Fortsett til hele hulrommet er fylt med montering media, og forsegle toppen og bunnen med klart fingernegl polsk.
  8. Når den fingernegl polske er tørt, bilde lysbildene umiddelbart eller lagrer i en lystette stramt lysbildet på -20 ° C.
  9. Innen en uke, image hjernen ved hjelp av laser-skanning AC confocal mikroskop med eksitasjon lasere og filtrere kuber passer til valgt fluorescerende sekundære antistoffer. Z-stakk bilder av sopp kroppen nerveceller hentes vanligvis 20 X eller 40 X mål. Avbildning av netthinnen photoreceptor neurons kan kreve høyere forstørrelse.

Representative Results

Metoden beskrevet ovenfor gir pålitelig og reproduserbar visualisering av nesten alle regionen av voksen Drosophila hjernen. Her har vi fokusert på sopp organer og photoreceptor nerveceller, men andre studier har brukt lignende metoder for å visualisere områder av hjernen som den pars intercerebralis52, klokken neurons53,54, og antennal Lobe projeksjon neurons55, blant mange andre. Viktigere, kan denne teknikken brukes å visualisere både hele hjernen strukturer samt individuelle neurons i de strukturene som bruker teknikker som MARCM12,47. Figur 4 figur 5og figur 6 viser flere forskjellige typer data fra sopp organer og photoreceptor nerveceller i voksen hjernen som kan genereres ved hjelp av dette disseksjon og immunostai-teknikk.

Først kan metoden beskrevet ovenfor brukes direkte visualisere sopp kroppen morfologi enten antistoffer som gjenkjenner Fasciculin 2 (Fas2) eller reporter gener i sopp kroppen nerveceller34. Som vist i Figur 4A og figur 4BFas2 antistoffer kan brukes til å visualisere α, β, og (i mindre grad) γ lobes av sopp organer i voksen Drosophila hjerner. Fas2 er en celle-celle adhesjon protein kreves for Nevron fasciculation og uttrykkes på høye nivåer i den α og β lobes23,56,57, gjør det en pålitelige og veletablerte markør for disse sopp kroppen nerveceller. Spesielt, kan rund-formet ellipsoid kroppen ligger i den sentrale regionen av voksen hjernen også visualiseres ved hjelp av denne antistoff (Figur 4A).

Feil i axonal veiledning proteiner føre ofte til ufullstendig penetrant sopp kroppen mutant fenotyper15,34,35. Derfor, i de fleste tilfeller, flere dusin hjerner bør fotografert og analysert. For eksempel krysse sopp kroppen β lobe axons Nab2 null fluer feilaktig hjernen midtlinjen. Denne "krysse" eller β lobe "fusion" fenotypen er vanligvis observert i ~ 80% av voksen Nab2 null flyr men er hovedsakelig fraværende fra vill-type kontroller og kan klassifiseres som liten, middels eller fullføre fusion34. "Fusion" av β lobes over midtlinjen resultater fra feil kontralateral projeksjon av axons til den motsatte hjerne halvkulen. Som vist i Figur 4C og i34,35, refererer liten fusion til β lobes forbundet med en "tynn strand i Fas2-positive fiber," mens moderat fusion refererer til mer vesentlig tilkoblede β fliker som viser litt redusert lobe tykkelse på midtlinjen. Komplett (eller "ekstreme") fusion refererer til β fliker som er fullstendig tilkoblet og viser ingen reduksjon i lobe tykkelse eller Fas2 flekker på midtlinjen. Omfanget av sopp kroppen β lobe fusion kan kvantifisert og vises som demonstrert i 34,35 eller som en tabell som viser prosentandelen av hjernen viser hver type morfologi defekt.

I tillegg til farging med Fas2 antistoffer, kan MARCM teknikk12,47,48 også brukes til å visualisere axon veiledning beslutninger av individuelle GFP+ neurons i sopp kroppen lobes. MARCM benytter mitotisk rekombinasjon under utvikling opprette individuelle neurons eller clonally relaterte grupper av nerveceller, merket med GFP (figur 5et). MARCM gir en måte å generere et lite antall nevroner som helt mangler et protein i en ellers heterozygote fly. Som sådan, er denne teknikken spesielt nyttig i å analysere funksjonene axonal veiledning av proteiner som er også viktige for generelle organismebiologi levedyktighet12,47. Homozygous null neurons merket med GFP kan sammenlignes direkte for å kontrollere neurons merket med GFP i en vill-type genetisk bakgrunn. Videre, avhengig av når utvikle larver eller pupae er varme-sjokkert, forskjellige klasser av sopp kroppen nerveceller kan være målrettet (figur 5B).

Et eksempel på typen data som er generert ved hjelp av denne teknikken er vist i figur 5C, hvor vill-type (dvs.kontroll) MARCM kloner genereres som et eksempel. For å generere individuelle GFP+ sopp kroppen nervecellene vist i figur 5C, utvikle F1 var Larvene opprinnelig plassert på 25 ° C. Ca 5-6 dager etter larver (ALH), pupae var varme sjokkert i 30 min på 37 ° C og deretter returnert til 25 ° C før eclosion. Etter voksen klekking hjernen ble dissekert i PTN fast og samtidig inkubert med antistoffer gjenkjenne Fas2 (1 d 4, utvannet 1:20 i PTN) og GFP (utvannet 1:500 i PTN). Hjernen ble deretter inkubert med sekundær antistoffer og montert på lysbilder som beskrevet ovenfor. GFP+ cellene ble identifisert og fotografert bruker laser-skanning AC confocal mikroskop og maksimale intensitet anslag ble opprettet ved hjelp av ImageJ. Som vist i figur 5C, kontroll GFP+ neurons generert i α og β lobes colocalize med Fas2 og avslutte før du kontakter midtlinjen som skiller de to Drosophila hjerne halvkulene. En enkelt axon prosjekter peke, bifurcates, og deretter prosjekter både på ryggen og medialt til skjemaet i α og β lobes. Flere tidligere studier har brukt denne teknikken til å undersøke om visse proteiner må studere celledeling selvstendig for mange aspekter av axonogenesis, inkludert filtypen, pathfinding, forgrening eller beskjæring10, 11,12,13,14,15,16,17,34.

I tillegg til sopp organer, kan axonal pathfinding beslutninger av netthinnen photoreceptor neurons (R-celler) også visualiseres ved hjelp av disseksjon metoden beskrevet over (og av de disseksjon metodebeskrevet i referanse48). Hver ommatidia innen fly øyet inneholder 8 photoreceptor nevroner som kan deles inn i tre grupper (figur 1): R1-R6 celler som prosjektet axons å den overfladiske lamina av hjernen optikk lobe; R7 celler som prosjektet axons til dypere M6 lag av medulla; og R8 celler som prosjektet axons til mellomliggende M3 laget av den forlengede19,58. Projeksjon mønster av hver klasse av photoreceptor har vært studert og sammen disse neurons har blitt brukt som modell for å forstå signalveier involvert i axon veiledning19,59. Viktigere, alle photoreceptor axons kan lett visualiseres i dissekert Drosophila hjernen immunostaining av voksen, pupal, eller larver vev bruker et antistoff som anerkjenner chaoptin, en celle overflaten glykoprotein24, 60 , 61. reporter gener uttrykke GFP eller β-galactosidase i hvert R-celle type (R1-R6 R7 og R8 celler) har også blitt bygget og kan brukes til å visualisere hver klasse av photoreceptor62. Siden hver type R-celle ender i et annet lag av utvikle optikk lobe, har disse journalister tillatt for detaljert sammenligninger av signalveier kreves for hver celle skal finne sine mål. Et eksempel på uttrykket mønstrene produsert av to av disse reporter genene i kombinasjon med chaoptin lokalisering (som kan brukes som en markør av alle photoreceptor neurons) er vist i figur 6. For å visualisere R7 fotoreseptorer, hjernen som inneholder R7-spesifikke Rhodopsin4-LacZ reporter genet dissekert og farget med antistoffer mot chaoptin og β-galactosidase. Rhodopsin 4 (Rh4) er uttrykt i et delsett av R7 celler63; Rh4 selskapet kan derfor brukes til å kjøre reporter genuttrykk i bare disse cellene. Som forventet, avslutter R7 celler i dypere M6 laget av medulla (merket med en gul prikkelinje figur 6). På samme måte hjernen uttrykke β-galactosidase fra arrangøren av Rhodopsin 6 (Rh6), som er uttrykt i R8 fotoreseptorer63, ble dissekert og immunostained ved hjelp av antistoffer gjenkjenne chaoptin og Β-galactosidase. Som vist i figur 6, R8 fotoreseptorer avsluttet på R3 laget av detmedulla. Selv om ikke vises her, kan Rh1-LacZ også brukes å visualisere oppsigelse av R1-R6 fotoreseptorer i lamina.

Figure 1
Figur 1: Voksen Drosophila melanogaster hjernen består av funksjonelt atskilte, men sammenhengende områder. (A) en oversikt over den voksne D. melanogaster hjernen vises, sentralt sopp organer og eksterne retinal photoreceptor neurons. (B) forstørret diagram av voksne sopp kroppen axon pakker (også kalt lobes) som gjenkjennes av Fas2 antistoffer. Iboende neurons av sopp organer, kalt Kenyon celler, prosjekt axons peke fra ryggen ligger cellen legemer (cellen legemer utelatt fra diagrammet) og forskjellige lobe strukturer. I voksen hjernen, skjemaet γ lobes (vist inne rød) fra en enkelt mediale bunt av axons, mens dorsal α og mediale β lobes (i blått) skjema fra et enkelt axon som bifurcates under pathfinding prosessen. Α ' / β' neurons utvikle axonal fliker som delvis overlapper med de av α/β neurons, men er ikke anerkjent av Fas2 antistoffer og er utelatt fra diagrammet. (C) Retinal neurons er avgjørende for videresending visuell informasjon fra netthinnen til optikk lobe. Axons prosjektet fra cellen legemer ligger i netthinnen (beige) og danne forbindelser med post synaptic målcellene i lamina eller forlengede. R1-R6 photoreceptor celler (vises i rødt) form bestemte tilkoblinger med celler i det ytterste laget av optikk lobe, kalt lamina. R7 photoreceptor celler (gul) synapse med mål i M6 laget av margen, mens R8 celler (vist i grønt) prosjekt axons til litt mer overfladisk M3 lag av margen. Del C tilpasset med tillatelse fra Macmillan utgivere Ltd: Nature Neuroscience (referanse64, copyright (2011)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: The GAL4/UAS systemet kan brukes til målrettet genuttrykk. For å få fluer uttrykke en genet av interesse ("Gene X") i en vev bestemt mønster, må fluer inneholde både en transgene uttrykke Gal4 transcriptional aktivator protein under kontroll av et bestemt vev-enhancer og en transgene inneholder Gal4 DNA bindende sekvens (kalt oppstrøms aktivere rekkefølgen eller UAS) ved Gene X. vanligvis, denne kombinasjonen oppnås ved mating foreldrenes fluer som alle inneholder en transgene og velger for F1 avkom begge. I den resulterende F1 generasjonen, Gal4 måles og vil binde seg til UAS aktivere transkripsjon av Gene X på en bestemt måte som vev. Viktigere, kan ulike UAS inneholder effekter av transgener brukes sammen med den samme GAL4 "driver". En transgene uttrykke Gal4 i sopp organer (MBs) kan for eksempel kombineres med en UAS inneholder transgene express GFP, en transgene som banker ned uttrykk for et genet av interesse ved hjelp av RNA-interferens eller en UAS-transgene som produserer en reporter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Montering hjerner i forberedelse til immunofluorescence bildebehandling. (A) hjerner er montert på SuperFrost pluss lysbilder med en bro cover å hindre utflating av hjernen. To "base" cover slips følges et Superfrost pluss positivt ladet lysbilde med klart fingernegl polsk og dissekert hjerner plasseres på lysbildet mellom dem. En klar "bro" cover slip er plassert over hjernen og overholdt base dekket papirlapper. (B) en gang fingernegl polsk har tørket, Vectashield er sakte pipetted under broen å bevare fluorescens av sekundær antistoffer. Klart fingernegl polsk brukes deretter til å forsegle toppen og bunnen av "bridge" cover slip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Sopp kroppen axons kan være tydelig visualisert ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner Fas2. (A) voksen Drosophila hjernen ble dissekert, fast, og inkubert med antistoffer gjenkjenne Fas2. Primære antistoffer ble anerkjent ved hjelp av Alexa488-kombinert geit-anti-mus sekundære antistoffer og hjernen ble montert på positivt ladet lysbilder og fotografert ved hjelp av en laser skanning AC confocal mikroskop. Bisymmetrically ligger sopp kroppen cellen legemer forlenge axons peke, bifurcate og danne axon pakker (også kalt lobes). Axons som danner den ytterst prosjektering α fliker og medialt prosjektering β lobes express Fas2. Kritisk, avslutte β lobes av vill-type fluer før hjernen midtlinjen. Sentralt ellipsoid kroppen kan også bli visualisert bruker 1 d 4 antistoff. (B) medialt-projeksjon γ lobe axons av voksen Drosophila sopp kroppen også uttrykke Fas2 og kan visualiseres ved hjelp av 1 d-4 antistoff. Uttrykk for Fas2 i γ lobe axons er vanligvis mindre enn α og β lobes. (C) sopp kroppen axons Nab2 null hjerner (genotype: Nab2ex3/Nab2ex3) mis prosjektet contralaterally og ofte mangler lobes. Nab2 null hjernen ble dissekert, fast og farget med 1 d 4 antistoff visualisere sopp kroppen α og β γ lobes. Maksimale intensitet Z stabel anslag samt individuelle optisk deler fokusert på midtlinjen regionen vises. Mens vill-type sopp kroppen β lobe axons cross sjelden hjernen midtlinjen, har Nab2 null hjerner varierende mengder mis projeksjon over midtlinjen til den kontralateral hjerne halvkulen, noe som resulterer i "smeltet" β lobes. Som definert i referanser34,35, mild fusion refererer til < β lobes med bare flere "tråder" axons krysset midtlinjen, moderat fusion referer til situasjoner der Fas2 positive β lobe neurons krysser hjernen midtlinjen men β flik bredde på midtlinjen er redusert, og fullstendig fusion referer til situasjoner der det er ingen reduksjon av β lobe tykkelse som lobes krysser hjernen midtlinjen. Siden ellipsoid kroppen uttrykker også Fas2, optisk seksjoner viser midtlinjen er ofte mer nyttig visualisere β lobe fusion. Spesielt, er mangler lobes også ofte observert (betegnet her med hvit stjerne). Data i del C brukes i kvantifisering av sopp kroppen fenotyper fra referanse34, med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : MARCM kan brukes til å visualisere axons enkelt neurons. (A) mosaikk analyse med en Repressible celle markør (MARCM) bruker FLP recombinase-mediert mitotisk rekombinasjon på FRT steder å lage to ulike datter celler. I dette eksemplet inneholder alle cellene en sopp kroppen-spesifikke GAL4 protein på et separat kromosom. Etter mitotisk rekombinasjon i cellen divisjon, en datter celle (øverst) uttrykker GFP (eller membranen bundet CD8-GFP) og inneholder to mutant alleler av en genet av interesse, mens andre datter cellen (nederst) arver to vill-type (WT) alleler og en transgene uttrykke Gal80 protein bruker en tubulin promoter. Gal80 hemmer Gal4, så celler produserer Gal80 vil være ikke-fluorescerende og bør være enten heterozygote eller homozygous vill-type. Bare celler som er GFP+ inneholder to kopier av det muterte allelet. Legg merke til at bare én av flere metoder for å generere GFP+ celler som inneholder også to mutant alleler av en genet av interesse vises; se12,45,56 andre eksempler. (B) siden utviklingen av sopp kroppen nerveceller begynner med γ nerveceller, så α'/ β' neurons, og slutter med α/β neurons, hver klasse av Nevron kan selektivt være målrettet og visualisert ved varme sjokkerende på ulike utviklingsmessige tidspunkt. Som beskrevet i 12, en 40 min varme sjokk på 37 ° C som oppstår ≤2.5 dager etter larver klekking (ALH) vil spesifikt målrette den ble; neurons, mens varme sjokk som oppstår 3.5-4.5 dager ALH (i slutten L3 larvestadiet) vil målrette α'/ β' neurons, og en varme sjokk at o ccurs mellom 5-7 dager ALH (under pupal utvikling) vil målrette α/β neurons. (C) personlige vill-type axons var visualisert ved hjelp av MARCM. Vill-type ~ 5-6 dagers gammel pupae (genotype: hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, badekar > Gal80; OK107-GAL4/+) var varme sjokkert over 37 ° C i 40 minutter å indusere mitotisk rekombinasjon. Hjernen ble dissekert, fast og farget med antistoffer anerkjenne GFP (1:500) og Fas2 (1:20). Hjernen ble deretter inkubert med fluorescently merket sekundære antistoffer og visualisert ved AC confocal mikroskopi. I denne eksempeldata fra en "kontroll" genotype, GFP positive celler generert ved hjelp av MARCM er vill-type og i stedet for med to genetmut alleler, inneholde to genetWT alleler. Sopp kroppen β lobes (visualisert ved hjelp av antistoffer gjenkjenne Fas2) avslutte før de når hjernen midtlinjen; Α lobe neurons er også til stede. For å vise større detalj, vises en zoomet i lys av en enkelt hjernen halvkule i den nederste raden av bilder. Del C ble tilpasset med tillatelse fra referanse34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Photoreceptor axons kan også bli visualisert. Voksen hjerner uttrykke β-galactosidase i R7 fotoreseptorer (venstre, med Rh4-LacZ) eller R8 fotoreseptorer (høyre, med Rh6-LacZ) ble dissekert, faste, og inkubert med antistoffer gjenkjenning av β-galactosidase eller chaoptin. Hjernen ble deretter inkubert med fluorescently merket sekundære antistoffer og visualisert ved bruk av laser AC confocal mikroskopi. Enkelt optisk deler vises fra hver hjernen. Til venstre, kan flere R7 photoreceptor axons (piler) sees i dypere M6 laget av medulla (vist ved den gule stiplede linjen). Til høyre avslutte R8 photoreceptor axons (piler) i ytre M3 laget av medulla (vist ved den grønne stiplede linjen). Siden R7 fotoreseptorer express enten Rh3 eller Rh4 og R8 fotoreseptorer express enten Rh5 eller Rh663, kan alle R7 eller R8 fotoreseptorer visualiseres ved hjelp av et enkelt LacZ reporter gen. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Disseksjon og visualisering metoden beskrevet over kan brukes i en rekke immunostaining og live tenkelig søknadene. Vi har skissert en generell immunostai-protokoll og har fremhevet en måte der MARCM kan brukes til å visualisere axonal morfologi av individuelle sopp kroppen nerveceller. Dessuten, disse generelle framgangsmåtene kan også brukes for imaging andre hjernen regioner i fast eller nylig dissekert voksen hjerner48,65. Live bildebehandling kan gi en mer effektiv fremgangsmåte når analysere uttrykk mønstre enhancer feller, reporter gener eller etterligne linjer66, for eksempel. Å hindre fange gjenstander fra celledød under live bildebehandling av GFP i unfixed vev, hjernen bør være dissekert i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) eller HL3 media48montert på broen lysbilder i 1 x PBS (eller HL3) og fotografert i mindre enn 15-20 min. omsorg bør også tas å fjerne så mye luftrøret som mulig fra dissekert hjernen før bildebehandling, siden det kan forstyrre visualisering av GFP fluorescens.

Mens flekker betingelser for å vurdere morfologi av sopp kropp og photoreceptor neurons er relativt godt etablert24,61,67, lokalisering av et bestemt protein av interesse i disse celle kanskje krever omfattende feilsøking og optimalisering. Spesielt skal flere viktige tiltak, inkludert antistoff fortynning, blokkerer buffer komponent konsentrasjon og fiksering, være optimalisert for å generere mest reproduserbare og pålitelige resultater. Først bør den optimale konsentrasjonen av primære antistoff fastsettes. Selv om kommersielt tilgjengelig antistoffer ofte har en foreslått fortynning (og vi ofte først starte med den konsentrasjonen), disse verdiene avgjøres sjelden empirisk på Drosophila vev. Derfor teste en rekke primære antistoff fortynninger som rekkevidde over og under produsentens Start forslag ofte resulterer i mer spesifikk farging. Mens primære antistoff fortynning kan ha en betydelig effekt på flekker nøyaktighet og bør kan nettopp bestemmes, tid hjernen er ruges i primære antistoff som inneholder kan løsninger variere betydelig med liten effekt på det samlede resultatet. For eksempel har vi observert lignende resultater når rugende dissekert hjerne med Fas2 antistoffer primære antistoffer for to, tre eller enda fire dager på 4 ° C. Selv om vi anbefaler minst to netter, har vi også ruges hjerner i primære antistoff løsning for en enkelt natt og fått reproduserbar flekker. Viktigere, hjelper begrense tiden hjerner er ruges i sekundære antistoffer til 3t ved romtemperatur (eller en natt på 4 ° C) grense uspesifisert binding av sekundær antistoffer til hjernevev.

Andre, kan det være nødvendig å bruke flere "blocking" reagenser for å eliminere uønskede bakgrunn signal. Alternativene inkluderer øker konsentrasjonen av NGS ~ 10%, legge til 1-10% Bovine Serum Albumin (BSA) til blokkering og primær/sekundær antistoff løsninger eller før adsorpsjon av primære antistoffer overnatting på 4 ° C med Drosophila embryo (se Referanse68, avsnitt 2.9, trinn 3).

Mens vi har skrevet ovenfor protokollen bruker PTN som foreslåtte bufferen for alle fiksering, kan vask, og antistoff inkubasjon trinn, vev fiksering i andre buffere (som PLP og PEM, oppført i Materialer tabell) resultere i dype forskjeller i signalstyrken. For eksempel har tidligere studier vist at Cyclin E er undetectable i larver imaginal plater når vev er løst i tradisjonelle 4% paraformaldehyde fortynnet i PBS, men er klart synlig når vev er løst i PLP buffer (Ken Moberg, personlig kommunikasjon, og referanse69). Endringer i bufferen komponenter, endre klokkeslett og temperatur for vev fiksering kan også påvirke immunofluorescent flekker og kan bestemmes empirisk hvis nødvendig. Vanligvis fiksering tid skal være lang nok å tillate tilstrekkelig crosslinking av cellulære komponenter og langsiktig vedlikehold av samlet mobilnettet morfologi samtidig begrenset nok til å unngå over-crosslinking og "begrave" av protein epitopes. Derfor når utgangspunktet optimalisere flekker betingelsene for en nyervervede primære antistoff, vi vanligvis begrenser fiksering tid til ca 20 min og ofte løse vev på kaldere temperaturer.

Flere kontroller skal inkluderes i alle immunofluorescence eksperiment for å undersøke spesifisiteten av primære og sekundære antistoffer og effekten av effekter av transgener/genetisk bakgrunn på observerte fenotypen. For å fastslå om primære antistoffer brukes spesielt gjenkjenner protein av interesse, skal vev fra fluer mangler dette protein og/eller vev overexpressing proteinet inkluderes som kontroller. Tillegg av overflødig renset antigen protein kan også bli inkludert for å finne ut om det primære antistoffet gjenkjenner andre epitopes i fly hjernen. Til slutt, alle fluorescerende signal når primære antistoffer utelates representerer uspesifisert binding av valgte sekundære antistoffer.

Flere viktige kontroller bør også inkluderes for å vurdere bidrag av genetisk bakgrunn eller tilstedeværelse av effekter av transgener til farging intensitet eller neuronal morfologi. For eksempel fluene brukes i MARCM eksperimentet i figur 5 inneholder flere effekter av transgener (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, badekar > GAL80 og OK107-GAL4), hver bør analyseres separat for effekter på sopp kroppen morfologi. På en aller minste, sjampinjong kropp morfologi av fluer bør som inneholder både OK107-GAL4 og UAS-CD8-GFP bli analysert. Det kan også være nødvendig å vurdere effekten av varme sjokk og Flp recombinase produksjon på sopp kropputvikling ved å analysere fluer som inneholder både hsFLP og FRT82B. Selv om MARCM kan gi betydelig innsikt om et bestemt protein selvstendig kontrollerer axonal veiledning, kan antall kontroller å nøyaktig denne konklusjonen være en mindre begrensninger av denne teknikken. Mindre komplisert eksperimenter gjelder også lignende kontroller. For eksempel tar et eksperiment der GAL4/UAS systemet brukes i kombinasjon med en RNAi transgene å pusse uttrykk for et protein av interesse for alle neurons. I dette eksperimentet, minst to effekter av transgener vil være til stede: en pan-nevrale GAL4-driver, for eksempel elav-GAL4, og UAS-RNAi transgene. Morfologi av sopp kroppen nerveceller i fluer som inneholder hvert av disse effekter av transgener alene bør undersøkes i tillegg til eksperimentelle tilstanden der flyr havn både effekter av transgener i samme fly.

Til slutt, for å avgjøre om protein av interesse uttrykt i sopp kroppen nerveceller er det vanligvis nødvendig å co flekken hjernen med antistoffer mot Fas2. Fluorescerende proteiner som GFP og RFP membranen bundet CD8-GFP kan eventuelt også uttrykkes ved hjelp av GAL4/UAS systemet og brukt i kombinasjon med antistoffer gjenkjenne protein av interesse. Siden Fas2 bare gjenkjenner fasciculated axons som sopp kroppen α og β lobes, har bruk av GAL4-drevet, membran-bundet CD8-GFP vært spesielt nyttig for merking sopp kroppen nerveceller.

Feil i axonal veiledning er ofte ikke 100% penetrant og selv hjernen til den likt anleggspreg kan vise noen variasjon. Derfor når analysere nylig generert mutant alleler feil i sopp kroppen eller photoreceptor pathfinding, skal en kombinasjon av forskjellige alleler og tilnærminger benyttes. De fleste studier i litteraturen bruker flere ulike tilnærminger til å undersøke om et protein spiller en celle autonome rolle i å kontrollere axonal veiledning: jeg) analyse av pathfinding mangler i homozygous null fluer (fortrinnsvis med forskjellige null alleler), ii) analyse av pathfinding mangler i fluer mangler protein bare interesse neurons (vanligvis via RNAi), iii) MARCM analyse av pathfinding feil og iv) redde eksperimenter der genet er nytt uttrykt i nervecellene i homozygous null flyr. Ideelt sett bør flere dusin hjerner per genotype bli analysert for feil i neuronal morfologi.

Selv om protokollen beskrevet her hovedsakelig fokuserer på immunofluorescent lokalisering av proteiner i fast vev, blir flere fremtidige anvendelser av denne teknikken utviklet til bildet live hjernevev. Når hjernen er dissekert (vanligvis i celle kultur medier), kan de deretter kultivert i flere dager på 25 ° C. Disse ex vivo culturing metoder blir utviklet for å undersøke en rekke biologiske prosesser, som protein aktivitet som fremmer axon regenerasjon etter skade70,71, intracellulær signalnettverk dynamics72, og nevrale utvikling73.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Changhui Pak og Alysia Vrailas Mortimer for utgangspunktet undervisning SMK hjernen disseksjon teknikken. Vi takker også medlemmer av Ken Moberg lab, spesielt Chris runder, for kritisk lesing manuskriptet. Antistoffer gjenkjenne Fas2 (1 d-4) og chaoptin (24B10) ble innhentet fra utviklingsmessige studier Hybridoma banken. Antistoff 24B10 ble avsatt til DSHB med Seymour Benzer og Nansi Colley24,60,61, antistoff 1 d 4 ble avsatt til DSHB av Corey Goodman 22,23,56. Fly aksjer anskaffet fra Bloomington lager Center. Vi ønsker også å takke Ohio landbruket forskning og utvikling Center (OARDC) MCIC Imaging Center for bruk av AC confocal mikroskopet å image hjernen i figur 4A og B. SMK støttes av et stipend fra NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Fas2 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4
Chaoptin Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 24B10
GFP Antibody Aves Lab GFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody ThermoFisher A-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody ThermoFisher A-21236
20% paraformaldehyde Electron Microscope Services RT15713
VectaShield Vector Labs H-1000
SuperFrost Plus Slides ThermoFisher 99-910-01
Coverslips ThermoFisher 12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Na phosphate Buffer dibasic Sigma S3264
Triton X 100 Sigma X100-100ml
fingernail polish Electron Microscope Services (EMS) 72180
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
nutator/rocker Fisher 22-363-152 or 88-861-041
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
Name Company Catalog Number Comments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer 2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer 0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4 BL458 Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4 BL 854 GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4 BL 7362 GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64305 GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4 BL 4440 GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP BL 64296 GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO BL 5145 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP BL5146 MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4 BL 44408 MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4 BL44406 MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4 BL 44407 MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO BL 5137 GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP BL 5139 MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO BL 28832 MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80 BL 5140 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80 BL 5135 MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reichert, H. Evolutionary conservation of mechanisms for neural regionalization, proliferation and interconnection in brain development. Biol Lett. 5 (1), 112-116 (2009).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  4. Oortveld, M. A., et al. Human intellectual disability genes form conserved functional modules in Drosophila. PLoS Genet. 9 (10), 1003911 (2013).
  5. Sanchez-Soriano, N., Tear, G., Whitington, P., Prokop, A. Drosophila as a genetic and cellular model for studies on axonal growth. Neural Dev. 2, 9 (2007).
  6. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  7. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  8. Harris, R., Sabatelli, L. M., Seeger, M. A. Guidance cues at the Drosophila CNS midline: identification and characterization of two Drosophila Netrin/UNC-6 homologs. Neuron. 17 (2), 217-228 (1996).
  9. Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
  10. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (3), 001743 (2010).
  11. Hattori, D., et al. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition. Nature. 449 (7159), 223-227 (2007).
  12. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  13. Reynaud, E., et al. Guidance of Drosophila Mushroom Body Axons Depends upon DRL-Wnt Receptor Cleavage in the Brain Dorsomedial Lineage Precursors. Cell Rep. 11 (8), 1293-1304 (2015).
  14. Reuter, J. E., et al. A mosaic genetic screen for genes necessary for Drosophila mushroom body neuronal morphogenesis. Development. 130 (6), 1203-1213 (2003).
  15. Ng, J. Wnt/PCP proteins regulate stereotyped axon branch extension in Drosophila. Development. 139 (1), 165-177 (2012).
  16. Lai, Y. W., et al. Drosophila microRNA-34 Impairs Axon Pruning of Mushroom Body gamma Neurons by Downregulating the Expression of Ecdysone Receptor. Sci Rep. 6, 39141 (2016).
  17. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  18. Borst, A., Helmstaedter, M. Common circuit design in fly and mammalian motion vision. Nat Neurosci. 18 (8), 1067-1076 (2015).
  19. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35 (5), 827-841 (2002).
  20. Schurmann, F. W. Fine structure of synaptic sites and circuits in mushroom bodies of insect brains. Arthropod Struct Dev. 45 (5), 399-421 (2016).
  21. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  22. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  23. Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
  24. Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7929-7933 (1982).
  25. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36 (1), 15-26 (1984).
  26. Wan, L., Dockendorff, T. C., Jongens, T. A., Dreyfuss, G. Characterization of dFMR1, a Drosophila melanogaster homolog of the fragile X mental retardation protein. Mol Cell Biol. 20 (22), 8536-8547 (2000).
  27. Androschuk, A., Al-Jabri, B., Bolduc, F. V. From Learning to Memory: What Flies Can Tell Us about Intellectual Disability Treatment. Front Psychiatry. 6, 85 (2015).
  28. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3 (1), 91-104 (2009).
  29. van der Voet, M., Nijhof, B., Oortveld, M. A., Schenck, A. Drosophila models of early onset cognitive disorders and their clinical applications. Neurosci Biobehav Rev. 46, Pt 2 326-342 (2014).
  30. Pak, C., et al. Mutation of the conserved polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14/dNab2, impairs neural function in Drosophila and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12390-12395 (2011).
  31. Gatto, C. L., Broadie, K. Drosophila modeling of heritable neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 21 (6), 834-841 (2011).
  32. van Alphen, B., van Swinderen, B. Drosophila strategies to study psychiatric disorders. Brain Res Bull. 92, 1-11 (2013).
  33. Kelly, S. M., et al. A conserved role for the zinc finger polyadenosine RNA binding protein, ZC3H14, in control of poly(A) tail length. RNA. 20 (5), 681-688 (2014).
  34. Kelly, S. M., et al. The Drosophila ortholog of the Zc3h14 RNA binding protein acts within neurons to pattern axon projection in the developing brain. Dev Neurobiol. 76 (1), 93-106 (2016).
  35. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  36. Yamamoto, D., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat Rev Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
  37. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology (Bethesda). 25 (6), 338-346 (2010).
  38. Ueno, T., et al. Identification of a dopamine pathway that regulates sleep and arousal in Drosophila. Nat Neurosci. 15 (11), 1516-1523 (2012).
  39. Vogelstein, J. T., et al. Discovery of brainwide neural-behavioral maps via multiscale unsupervised structure learning. Science. 344 (6182), 386-392 (2014).
  40. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  41. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  42. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  43. Hodge, J. J. Ion channels to inactivate neurons in Drosophila. Front Mol Neurosci. 2, 13 (2009).
  44. Neumuller, R. A., Perrimon, N. Where gene discovery turns into systems biology: genome-scale RNAi screens in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 471-478 (2011).
  45. Ni, J. Q., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  46. Seelig, J. D., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).
  47. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).
  48. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  49. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), (2011).
  50. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (12), 1472-1474 (2011).
  51. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  52. Liu, Y., Liao, S., Veenstra, J. A., Nassel, D. R. Drosophila insulin-like peptide 1 (DILP1) is transiently expressed during non-feeding stages and reproductive dormancy. Sci Rep. 6, 26620 (2016).
  53. Shafer, O. T., Helfrich-Forster, C., Renn, S. C., Taghert, P. H. Reevaluation of Drosophila melanogaster's neuronal circadian pacemakers reveals new neuronal classes. J Comp Neurol. 498 (2), 180-193 (2006).
  54. Rieger, D., Shafer, O. T., Tomioka, K., Helfrich-Forster, C. Functional analysis of circadian pacemaker neurons in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 26 (9), 2531-2543 (2006).
  55. Hillebrand, J., et al. The Me31B DEAD-Box Helicase Localizes to Postsynaptic Foci and Regulates Expression of a CaMKII Reporter mRNA in Dendrites of Drosophila Olfactory Projection Neurons. Front Neural Circuits. 4, 121 (2010).
  56. Goodman, C. S., Davis, G. W., Zito, K. The many faces of fasciclin II: Genetic analysis reveals multiple roles for a cell adhesion molecule during the generation of neuronal specificity. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 479-491 (1997).
  57. Fushima, K., Tsujimura, H. Precise control of fasciclin II expression is required for adult mushroom body development in Drosophila. Dev Growth Differ. 49 (3), 215-227 (2007).
  58. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  59. Hadjieconomou, D., Timofeev, K., Salecker, I. A step-by-step guide to visual circuit assembly in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 76-84 (2011).
  60. Van Vactor, D. Adhesion and signaling in axonal fasciculation. Curr Opin Neurobiol. 8 (1), 80-86 (1998).
  61. Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human. Cell. 52 (2), 291-301 (1988).
  62. Tahayato, A., et al. Otd/Crx, a dual regulator for the specification of ommatidia subtypes in the Drosophila retina. Dev Cell. 5 (3), 391-402 (2003).
  63. Cook, T., Desplan, C. Photoreceptor subtype specification: from flies to humans. Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).
  64. Hakeda-Suzuki, S., et al. Goal collaborates with Flamingo in conferring synaptic-layer specificity in the visual system. Nat Neurosci. 14 (3), 314-323 (2011).
  65. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).
  66. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  67. Crittenden, J. R., Skoulakis, E. M., Han, K. A., Kalderon, D., Davis, R. L. Tripartite mushroom body architecture revealed by antigenic markers. Learn Mem. 5 (1-2), 38-51 (1998).
  68. Muller, H. A. Immunolabeling of embryos. Methods Mol Biol. 420, 207-218 (2008).
  69. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  70. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  71. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 575-597 (2012).
  72. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  73. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 129 mobilnettet biologi nevrovitenskap Drosophila melanogaster disseksjon immunofluorescence hjernen axon veiledning pathfinding AC confocal mikroskopi
Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen <em>Drosophila melanogaster</em> hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M.… More

Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. J. Vis. Exp. (129), e56174, doi:10.3791/56174 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter