Summary
פרוטוקול הקרנה יעילים מוצג לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים astroglial התמיינות בתאי גזע glioblastoma (GSCs). וזמינותו מבוסס על עיתונאי התמיינות תאי גזע לפיה הביטוי GFP משופרת (eGFP) הוא מונע על ידי האמרגן GFAP האנושית.
Abstract
גליובלסטומה (GBM) הוא הגידול במוח העיקרי הנפוץ ביותר וקטלני ביותר אצל מבוגרים, גורם בערך 14,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית לבדה. חציון ההישרדות לאחר אבחון הוא פחות מ-15 חודשים עם כימותרפיה כריתה, קרינה, temozolomide כירורגית מקסימלי. האתגרים הכרוכים בפיתוח טיפולים יעילים יותר GBM הפכו ליותר ויותר ברורה, כולל invasiveness הלא מתפשר שלו, עמידותו טיפולים סטנדרטיים, שלה המורכבות הגנטית הסתגלות מולקולרית ואת subpopulations של GBM תאים עם דמיון פנוטיפי לתאי גזע נורמלי, במסמך זה מתייחסים כאל תאי גזע glioblastoma (GSCs). בגלל GSCs נדרש עבור התקדמות וצמיחה של גידול, טיפול המבוסס על בידול מייצג של קיימא לטיפול אפנות עבור אלה neoplasms חשוכת מרפא.
הפרוטוקול הבא מתאר אוסף של הליכים להקים על תפוקה גבוהה הקרנת פלטפורמה מכוון הזיהוי של מולקולות קטנות המקדמים GSC astroglial בידול. הליבה של המערכת הוא חלבון חומצי fibrillary (GFAP) גליה הבידול כתב-בונה. הפרוטוקול מכיל כללי ההליכים הבאים: (1) הקמת קווי הכתב של בידול GSC; (2) בדיקה/אימות הרלוונטיות של הכתב קיבולת העצמי-חידוש/clonogenic GSC; (3) קיבולת גבוהה cytometry זרימה מבוסס והתרופות הקרנה.
פלטפורמת ההקרנה מספקת גישה פשוטה וזולה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמים GSCs בידול. יתר על כן, ניצול של ספריות של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA מחזיק את פוטנציאל הזיהוי של סוכנים ניתן יהיה לשנות את ייעודו במהירות רבה יותר. כמו כן, טיפולים המקדמים התמיינות תאי סרטן צפויים לפעול בסינרגיה עם טיפולים שוטפים "סטנדרט של טיפול", אשר הוכחו היעד ולחסל התאים הסרטניים הבדיל יותר בעיקר.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גידולים מכילים אוכלוסיה קטנה של תאים, כינה את תאי הגזע הסרטניים (CSCs) או ייזום-גידול תאים, אשר אחראים על התקדמות הגידול, גרורות, עמידות בפני כימותרפיה-רדיו-טיפולים אלטרנטיביים 1, 2. הנוכחות של תאי הגזע הסרטניים, שלהם progenies הבדיל יותר בתוך גידולים נחשב גורם חשוב בקידום intratumoral הטרוגניות, ובכך מייצג משוכה גדולה בטיפול סרטן3. גידול תאים היררכיה, שמספקת התיאוריה תאי סרטן, נתן השראה לפיתוח אסטרטגיות חדשות לטיפול סרטן 4. גישה אחת הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לזהות ומעכבות איתות המסלולים הידועים להידרש במהלך התפתחות של האיבר המושפע. אכן, אנחנו ואחרים בעבר פרסמו מסמכים מרובים המתארת את הדרישה מתמשך תאי גזע-רלוונטי איתות מסלולים עצביים סוניק הקיפוד, דרגה ב גליובלסטומה5,6,7. עבודה זו סייעה תוך שהשרף מתהווה הרציונל מספר ניסויים קליניים GBM. הגישה השניה הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לקדם את הבידול שלהם. גישה זו קיבלה הרבה תמיכה בשל תוצאות חיוביות קליניים וקליניים בטיפול לוקמיה פרומיאלוציטית חריפה עם חומצות retinoic (ATRA, אנלוגי של ויטמין A). כאן ATRA נמצאה כדי להסיר את החסימה ההבשלה ולקדם סרטן התא בידול8. לאחרונה, Piccirillo ועמיתיו באלגנטיות הראו כי BMP-4 מקדמת GSC בידול לתוך האסטרוציטים משמעותית אנטי-GBM אפקטים במבחנה , ויוו9.
הרציונל שבבסיס המחקר הנוכחי מבוסס על גישה "הנדסה הפוכה" עבור מיקוד GSCs. בהתחשב את הטרוגניות עצום נוכח ב- GBM, עם בידול המסכן של גולת הכותרת של סרטן, שאלנו אם אנחנו יכולים לקדם את הפנוטיפ למענך - בידול לתוך מצב דמוי אסטרוציט. כאן, אין לנו ידיעה מוקדמת מסלולים איתות לשמור על GSCs הדגימה גידול נתון אך מעדיף מכוונים להשיג הפנוטיפ הרצוי (למשל GFAP חיוביות).
הדו ח מתאר את ההליכים המשמשים ליצירת GSC בידול כתב-קווים מן התמרה חושית של תרבויות מועשר-GSC GSC שבטים. הקווים neurosphere גליובלסטומה המשמשים הוקמו במעבדה של פרופסור אנג'לו Vescovi של חולים עם אבחנה של גליובלסטומה ראשי בבית החולים סן רפאלה - מילאנו, איטליה. קווים אלה נחקרו בהרחבה מספר פרסומים 6,10,11,12,13,14. מומלץ מאוד כי אנשים המעוניינים ביישום טכניקות אלה במעבדה שלהם לקבוע את הרלוונטיות של הכתב קיבולת התחדשות עצמית תאי סרטן בתאים הם מתכננים ללמוד (זה נכון גם לגבי שום כתב). פרוטוקול מפורט לאחד במבחנה clonogenic מבחני מקובלים בתחום מסופק כדי להשיג את זה15,16. לבסוף, פרוטוקול מפורט המתאר את הניצול של בידול הכתב-בשורות מסך סמים מבוסס cytometry זרימה מסופק בסוף. ראוי לציין, באופן דומה למערכת בידול astroglial המתוארים כאן, יש לנו בהצלחה הוקמה ואנו לאמת GSC כתב שורות שילוב של הכתב (בידול עצביים) MAP2:GFP. לכן, למתודולוגיות לתאר זה נייר ניתן להחיל ללמוד התמיינות לתוך שושלות תאים שונים.
כמה מן הדמויות בדו"ח זה ניתן למצוא בפרסום האחרונים:"Atracurium Besylate סוכנים אחרים חסימת עצב-שריר לקדם astroglial בידול, לרוקן glioblastoma תאי גזע18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: Astroglial ומערכות העיתונאי lentivirus עצביים נרכשו כמו ההכנות lentiviral ארוזים מראש, מרוכז. נדרש ידע בסיסי של טכניקת cytometry זרימה. כמו כן, לשימוש מלא של פרוטוקול זה המשתמש יהיה עליך גישה cytometer זרימה עם תפוקה גבוהה קיבולת (מקבל 96-ובכן צלחות כמקור לדוגמה).
1. lentiviral כתב תעתיק המערכת
הערה: בניתוח כל זרימה cytometric, השתמש תאים הורים, הלא-transduced, או transduced-וקטור תאים (שאינם פלורסנט) להקמת פלורסצנטיות בסיסית. כמו כן, שים לב לכך כל השלבים שבו נקרא trituration מכני, להיות עדין. Trituration קשים יכול להרוג מספר משמעותי של GSCs שברירי ולהשפיע לתוצאות cytometry זרימה.
- צלחת עונה 1 פרק 106 תאים ב- 2 מ של תאי גזע עצביים מלאה מדיום הגידול לתוך צלחת 6-multiwell.
- מגלי תאים על-ידי הוספת כתב lentivirus-ריבוי של זיהום (moi) שווה ל- 5.
- להוסיף 2 µL של polybrene עבור ריכוז סופי של 8 µg/mL.
- דגירה התאים-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה.
- למחרת, החלף את מדיום הגידול להסיר וירוס לא מאוגד. מקם את הצלחת בחזרה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 ולאחר תקופת דגירה של 24 שעות.
- קציר 0.5 mL מהנפח הכולל; ספין למטה תאים ב- g x 360 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר צינור חרוטי 15-mL, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. להוסיף 0.5 מ של מדיום הגידול תאי גזע עצביים טרי בתאי שנותרה וחוזרים את הצלחת החממה עבור המשך הרחבתה.
- להוסיף 200 µL של דיסוציאציה ריאגנט ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
- מביצועם תאים על-ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
הערה: trituration קשים עלולה לגרום משמעותי הריגת GSCs, דיסוציאציה מלאה מושגת בדרך כלל לאחר 20 - 30 פעמים. - כדי למזער את התא מצורף או צבירת, להוסיף 800 µL מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) עבור אמצעי אחסון הסופי של 1 מ"ל.
- העברת µL 200 של השעיה תא כל טוב של צלחת 96-multiwell.
- עבור הליך זה, להשתמש cytometer זרימה של benchtop עם יכולת 96-ובכן צלחת מצויד עם לייזר כחול על עירור, עם היכולת של זיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק. לבצע ניתוח תזרים cytometric עם עשרת התאים קיימא עבור כל רכישה.
- לקבוע את אחוז תאים GFP-חיוביות על ידי cytometry זרימה.
2. subclone ובחירת, הרחבה, אימות
- צלחת בתאים µL 100 תאי גזע עצביים בינוני-צפיפות של תאים 0.7 לכל טוב של צלחת 96-multiwell.
- תרבות שיבוטים למשך 11 ימים-CO 37 ° C ו-5%2. שלב זה הוא מאוד תלוי סוג התא, סביר להניח יחייב התאמה המבוססת על הקו תא בשימוש. ככלל, מיקרומטר 100 קוטר ≥ כדור היא אינדיקציה טובה נוכחות של clonogenic GSCs, neurospheres.
- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד עם מסנן FITC, מארק הבארות המכילים neurosphere יחיד איפה ~ 1-5% של התאים GFP-חיוביות.
הערה: קביעת שהאחוז המדויק של תאי ה-GFP-חיובית אינה קריטית גם בנקודה זו. כל אחד subclones מאוחר יותר יוערך על ידי cytometry זרימה. שלב זה מבוצע כדי להפחית את הסכום הכולל מספר שיבוטים כדי להיות מנותח בדגש על neurospheres שמקורן מאת מובחן, GFAP-שלילי, GSC. - הרחב שיבוטים שנבחרו כתב עד ישנם מספר מספיק של תאים עבור ניתוח לפי cytometry זרימה. טוב תת confluent של צלחת 6-multiwell המכיל ≤ 1.5x105 תאים למ"ל צריך לספק מספר מספיק של תאים.
הערה: הליך מפורט עבור בידוד ו הרחבה של GSCs הוא זמין 17.
3. קביעה של הביטוי GFAP:GFP על ידי Cytometry זרימה
- הקציר של aliquot של תאים (0.5 מ ל) של כל כתב שיבוט ופקדים שאינם transduced כדי לקבוע את האחוז המדויק של תאים GFP-חיוביות. בהתחשב שיבוטים כתב הכוללות תאים GFP-חיוביות ~ 1-5%.
- לסובב תאים ב- g x 360 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
- כל גלולה, להוסיף 200 µL של ריאגנט דיסוציאציה תא, דגירה הצינורות בתוך אמבט מים מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
- Triturate תאים בעדינות כדי להשיג השעיה תא בודד (בדרך כלל בין 20-30 פעמים).
- כדי למזער את התא מצורף או צבירת, להוסיף 800 µL HBSS נפח סופי של 1 מ"ל.
- העברת µL 200 לאדם טוב של צלחת 96-multiwell מהשעיה בכל תא.
- עבור הליך זה, להשתמש cytometer זרימה של benchtop עם יכולת 96-ובכן צלחת. לבצע ניתוח תזרים cytometric עם עשרת התאים קיימא עבור כל רכישה.
4. ELDA Assay התחדשות עצמית כדי לאמוד את הקיבולת Clonogenic
הערה: עבור פקדים, הן הורים, שאינם transduced, כמו גם הבעת-GFP lentivirus transduced תאים, אמור לשמש כדי לקבוע את הפוטנציאל clonogenic היחסית של הקווים כתב בידול GSC לתרבויות GSC המקורי שממנו הם היו נגזר.
- מביצועם בידול-כתב subclones לתוך תא בודד המתלים כמתואר לעיל.
- צלחת בתאים הצלחות 96-multiwell 100 µL של תאי גזע עצביים מלאה מדיה הצמיחה ב צפיפויות תא הנע בין 5 ל 500 תאים לכל טוב.
- תקופת דגירה תאים של 9 ל- 11 ימים-CO 37 ° C ו-5%2.
- ציון חיובי בארות על ידי פריט חזותי ישיר של neurospheres תחת מיקרוסקופ אור. גם להתייחס "חיובית" אם הוא מכיל לפחות neurosphere גדול יחיד.
- חבר את הנתונים: סה כ בארות ניתח ואת מספר בארות חיובי באמצעות הממשק המקוון ELDA זמין ב http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.
5. סמים ספריית דילול הכנה
- להסיר לוחות ספריית אחסון ב- 80 ° C, מכסים ברדיד אלומיניום (להגן על תרכובות רגישים לאור). להפשיר במשך כ 30 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר.
- השתמש pipettor רב-ערוצי של 12 ערוצים כדי לדלל תרכובות ספריה עד 0.2 מ מ בינוני מלא תאי גזע עצביים. לדלל דימתיל סולפוקסיד 10% צמיחה בינוני
הערה: הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד צריך להיות 0.1% בעת הוספת תאים. ריכוז גבוה יותר של דימתיל סולפוקסיד בתרבות עלול לגרום רעילות. מסיבה זו, מומלץ לבדוק רגישות דימתיל סולפוקסיד בקו תא בשימוש, לפני הטיפול. - השתמש דימתיל סולפוקסיד כפקד הרכב לטיפול תאים הנמצאים בעמודות ימינה ושמאלה של כל צלחת (עמודים 1 ו- 12; וולס A עד H).
- מכסה צלחות ספריית מדולל עם רדיד אלומיניום, להחזיר את הצלחות הספרייה המקורי למקפיא-80 ° C לאחסון לטווח ארוך.
6. סמים מסך
הערה: תאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד צריך לשמש כדי להגדיר את פלורסצנטיות בסיסית ולהתאים gating.
- צלחת 5 x 103 תאים בצלחת 96-multiwell ב µL 99 של מדיום הגידול מלאה תאי גזע עצביים.
- שימוש pipettor רב-ערוצי של 12 ערוצים, יטפל בתאים עם תרכובות ספריית מדולל-ריכוז סופי של 2 מיקרומטר (1 µL של 0.2 מ מ סמים לתוך µL 99 תא השעיה) או עם דימתיל סולפוקסיד (בקרה). דגירה הלוחות עבור 72 h-CO 37 ° C ו-5%2.
- שימוש pipettor רב-ערוצי של 12-ערוץ להוסיף 150 µL של התא דיסוציאציה ריאגנט מכל קידוח, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
- מביצועם תאים על-ידי בעדינות triturating עם pipettor רב-ערוצי ערוץ 12 עד לתא בודד ההשעיה מושגת (בדרך כלל בין 20-30 פעמים). כמות הזמן הנדרשת מביצועם neurospheres לחלוטין משתנים בין GSC שורות. בעוד הכימית דיסוציאציה תא המומלץ (ראה חומרים) מוגנת דגירה עד 45 דקות לא היתה השפעה על יכולת הקיום מרובות שורות GSC נבדק, ודא עבור כל קו GSC לשמש ההקרנה.
הערה: עוצמת הקול הסופי בכל אחד מהם צריך להיות בערך 250 µL (µL 100 של השעיה תא + µL 150 של ריאגנט דיסוציאציה תא) - לקבוע את אחוז התאים לבטא הכתב GFAP:GFP על ידי cytometry זרימה. להשתמש באסטרטגיה המגביל סטנדרטי. ראשית, העלילה קדימה ואת הצד מחליקי כדי לקבל תחושה כללית של גודל התא ואת הכדאיות. אז במקום שער על האוכלוסייה קיימא תא בודד. זוהי האוכלוסיה אשר ייקבעו פלורסצנטיות ירוק (eGFP). בכל תרכובת גורמת לעלייה באחוז GFP-חיוביות תאים על ידי מעל שלוש סטיות תקן השליטה (שטופלו דימתיל סולפוקסיד) נחשבת חיובית "להיט". הסף הזה צריך להיות מותאם על פי היישום הספציפי ולא את הרצוי לכתחילה.
הערה: התפוקה גבוהה מסך מומלץ שימוש של subclone העיתונאית GSC יחיד. בעקבות זיהוי פגע, כל פגע לאמת נגד subclones כתב נוספים מ- GSC באותה השורה. כדי להגביר את הביטחון עבור כניסות נכון הוא גם ממליץ בדיקה תרכובות נגד הכתב subclones מבודד neurospheres GSC שונים קווים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה קווים neurospheres החולה-derived עצמאית היו transduced עם הכתב astroglial lentivirus קידוד עבור חלבון פלורסנט-ירוק (GFP) התמזגו במסגרת עם קלטת ההתנגדות Zeocin, מונע על-ידי הרכיב יזם GFAP האנושית ( איור 1). הבא שיבוטים בודדים היו מבודדים על ידי ציפוי 0.7 תאים לכל טוב בצלחת טוב 96 (איור 2), זאת בעקבות זרימת cytometric קביעת אחוז התאים לבטא GFP (איור 3). שיבוטים Neurosphere, שמקורם תאים בודדים, המכיל ≤5% GFP-חיוביות תאים מכונים GL (נמוך GFAP) בעוד שיבוטים המכיל ≥75% GFP תאים חיוביים מכונים GH (GFAP גבוהה), נחשבים להיות מבודלים יותר לעומת GL subclones (איור 4).
כדי לזהות סוכנים מסלולים אשר עשויות לשלוט בידול astroglial ב GSCs, מסך מולקולה קטנה סמים באמצעות שתי ספריות אוסף קליניים NIH בוצעה. תאים טופלו במשך 72 שעות עם סוכנים ספריית 727 מאוסף קליניים NIH I ו- II, לקבוע ריכוז של 2 מיקרומטר, או אמצעי אחסון שווה של דימתיל סולפוקסיד כפקד. ההשפעה של סוכנים אלה נבדק על הכדאיות תא בקווים כל שלנו נגזר החולה GBM neurosphere בריכוזים החל 0.2 µM 20 מיקרומטר, לפני ההקרנה סמים. הריכוז נעשה שימוש ב פרוטוקול זה מותר לנו לזהות תרכובות כי הצליחו ליצור בידול astroglial באותו זמן, זה למזער את ההשפעות הרעילות באופן פוטנציאלי את המטרה בשל ריכוז גבוה של התרופה.
בעקבות דגירה, קבענו את אחוז התאים לבטא הכתבת GFAP-GFP מאת cytometry זרימה. תוכניות בסיסיות עבור הכדאיות ואת האחוזים של תאים GFP-חיוביות היו נחושים בבארות לפחות שלוש על כל צלחת ספריה ולאחר להיט חיובי היה נחוש כמו עלייה באחוז התאים GFP-חיוביים של שלוש סטיות תקן מעל בסיסית (דימתיל סולפוקסיד) את הסף המינימלי של 25% GFP תאים חיוביים. זיהינו 12 תרופות המושרה מספקת עלייה באוכלוסייה GFP-חיוביות (טבלה 1).
איור 1: Astroglial בידול מערכת הכתב.
תרשים סכמטי של הכתב GFAP:GFP pGreenZeo. GSCs לא מבטא את השילוב המתאים של גורמי שעתוק הדרושים להפעיל את המקדם גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP), ולכן לא יבטא GFP (החלונית העליונה). עם זאת, כאשר גורמי שעתוק המתאים קיימים (למשל כאשר התאים רוכשים מגורל astroglial - להבדיל) יזם GFAP הופכת לפעילה ולאחר התאים יבטא GFP הכתב (פאנל התחתונה). (GSC - תאי גזע Glioma, T2A-חלבון לינקר, זיאו-R - Zeocin ההתנגדות ג'ין, TF - גורם שעתוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בידול Astroglial - בחירה Subclone.
תמונות נציג של subclones GSC HSR-GBM1 רמות נמוכות (GL) או רמות גבוהות (GH) של הכתב GFAP:GFP באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (40 X הגדלה מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Cytometry זרימה מצפני פלורסצנטיות ירוק.
קו neurosphere החולה-derived HSR-GBM1 היה transduced עם GFAP:GFP כתב lentivirus, subclones מרובים נבחרו בהתבסס על הביטוי GFP בתא neurosphere ייזום- ולא מאושרות על-ידי cytometry זרימה. שיבוטים אלה היו בשם GL (GFAP נמוכה) או GH (GFAP גבוהה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אפיון פונקציונלי HSR-GBM1 GFAP:GFP subclones.
GL subclones הם יותר clonogenic במבחנה כמצוין על-ידי גדל תדרים GSC אשר נמדדים על ידי קיצוני הגבלת דילול ניתוח (ELDA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| שם | קיפול עלייה GFP + תאים | תיאור | מחסום הדם מוח | ההסתברות הבנק סמים |
| Vinorelbine | 8.97 | כימותרפיה אנטי mitotic | - | 0.88 |
| Diphenoxylate | 13.89 | Antidiarrheal | + | 0.96 |
| Lomerizine | 10.89 | הדם / מוחין מרחיב כלי דם | נה | נה |
| Phenprobamate | 10.73 | נוגד חרדה / שריר מרפה, מרכזי מתנהג | נה | נה |
| 6-Azauridine | 15.07 | Antimetabolite / אנטי ויראליים | נה | נה |
| Irinotecan | 14.14 | Topisomerase אני מעכב | + | 0.63 |
| Atracurium Besylate | 8.16 | להרפיית שרירי השלד nondepolarizing | + | 0.93 |
| Glimepiride | 8.75 | תרופות נגד סוכרת | + | 0.73 |
| Hexachlorophene | 9.83 | חיטוי | + | 0.92 |
| דיגוקסין | 8.23 | Cardiotonic גליקוזיד | - | 0.72 |
| Flecainide | 10 | סוכן אנטי-הפרעה בקצב הלב | + | 0.86 ולגובה |
| Nisoldipine | 5.05 | הדם | - | 0.95 |
טבלה 1: מולקולות קטנות גרימת ביטוי כתב GFAP-GFP ב HSR-GBM1 GL-1
12 תרכובות שנמצאו כדי להגדיל את האחוז של תאים GFP-לבטא באופן משמעותי (קיפול עלייה מוצג), עמדו בקריטריונים המחמירים של ≥ 3 סטיות תקן מעל לקו הבסיס, שטופלו דימתיל סולפוקסיד תאים, ועם לא פחות מ 25% GFP-חיוביות תאים. היכולת ואת ההסתברות של סוכן נתון לחצות את מחסום הדם מוח (סמים הבנק (−). קיצור: NA (מידע לא זמין).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ואילו רוב המחקרים הקודמים של GSCs התמקדה בעיקר סמני שמגדירים אותם, במחקר זה החלטנו לנקוט בגישה הפוכה. אנו מתמקדים בעיקר progenies הבדיל שנוצר על ידי GSCs (למשל, תאים לבטא astroglial סמנים עצביים). כאן אנחנו מדגימים את הניצול של תרופה מבוססת תא תפוקה גבוהה מערכת, אשר מבוססת על הביטוי תלוי-יזם GFAP האנושי GFP הסינון. כל הניסויים בוצעו ניצול שורות תאים גליובלסטומה החולה נגזר neurosphere. פרוטוקול מפורט המתאר את הבידוד והרחבה של קווים אלה מתואר גאלי ואח17.
המערכת לא רק סייעו לנו הזיהוי של מולקולות קטנות אשר המסוגלים גרימת התמיינות של GSCs אלא גם עזר לנו לקבוע באופן חד משמעי כי הביטוי של דה מרקר התמיינות astroglial GFAP קובע קיבולת clonogenic של תאים GBM בודדים על-ידי השוואת GSC תדרים. וזמינותו ELDA פותחה על ידי Yifang Hu, גורדון ק. סמית. הקוראים מוזמנים לקרוא את כתב היד עבור הבנה מעמיקה של assay החוזקות והמגבלות15. היווצרות המושבה הבקיע שלב הוא מאוד תלוי סוג התא, סביר להניח יחייב התאמה המבוססת על הקו הסלולרי משמש. יתר על כן, ככלל, אנו משתמשים כדור קוטר ≥100 מיקרומטר בתור סימן טוב כי neurosphere היה מקורו של clonogenic GSC.
יתר על כן, הסם נתאר כאן מערכת הסינון מאפשר הזיהוי של הרומן משעולים (במיוחד תעבורה אצטילכולין וסידן) הדרושים כדי לשמור על GSCs במדינה מובחן (ראה טבלה 1). ריכוז התרופה החל עשויות להשתנות בהתבסס על הקו ספריית ותא מנוצל. כמו כן, הזמן הדרוש התמיינות ייתכן שיהיה עליך ההתאמה. יתר על כן, אימות tumorigenic של סמים כניסות דורש חניכה הגידול ויוו assay 18.
שעשויות להיות מגבלה מינור של טכניקה זו היא בידול ספונטנית בלתי נמנע מתרחש בתרבות בכל תאי מועשר, תופעה זו נוטה לגדול עם מספר קטעים בתרבות, והוא שונה בין subclones בודדים. אכן, הבחנו בידול ספונטני ב subclones שלנו בדרך כלל לאחר המעבר 15. לכן, אנחנו מוגבל שלנו ניתוחים בידול לתרבויות במספרים. המעבר שלא יעלה על חמישה.
לכן, אולי נקודה קריטית ביותר במתודולוגיה זו היא לשמור במבחנה passaging של אלה GSCs למינימום, כאשר עובד במבחנה, כדי לשמור על צפיפות תרבות מתחת 1.5x105 תאים/מ ל.... יתר על כן, מומלץ מאוד כי כל תרופה "מכה" מאומת נגד subclones כתב נוספים מ- GSC באותו הקו, כמו גם, נגד הכתב subclones מבודד שונות הנגזרות החולה GSC neurospheres קווים. זה יגדיל את ביטחון אמיתי "להיט" בהישג יד.
צדדיות של המתודולוגיה שמתואר פרוטוקול חזקים זה מחזק את הערך הטיפולי של הבחנה תאי סרטן תחת השפעת סמים, צריך לעזור בזיהוי תרופות חדשות כמו פוטנציאליים הרומן אסטרטגיות טיפוליות עבור GBM וגידולים אחרים. לבסוף, וזמינותו עשוי להיות מוטבת כדי לשמש עם תאי גזע עצביים ללא אמצעים, סוגי סרטן אחרים, ועם כתבים התמיינות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו חלקית בתמיכתם NIH R01CA187780.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
