Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/56185
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 3, 3, 1, 4, 1,2
1Department of Neurology, University of California, 2Program in Immunology, University of California, 3Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 4Department of Pathology, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, felç ve opticospinal iltihap transfer aquaporin-4 (AQP4) tarafından ikna etmek için bir iletişim kuralı mevcut-WT fareler içine AQP4- / - fareler belirli T hücrelerden. Buna ek olarak, seri optik Koherens tomografi görsel sistem disfonksiyon izlemek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Abstract

Bu tanınır iken o aquaporin-4 (AQP4)-Nöromyelitis optica (NMO), insan sinir sistemi (MSS) otoimmün demiyelinizan hastalık, her ikisi ile bir AQP4 hedefli modeli oluşturulması patogenezinde katılmak belirli T hücreleri ve antikorlar klinik ve histolojik CNS otoimmünite bulguları zorlu kanıtladı. Her ne kadar bu T hücreleri saf alıcı fareler için hastalık aktaramadı bağışıklama vahşi-tipi (WT) fare ile AQP4 peptidler T hücre çoğalması, elde edildi. Son zamanlarda, iki roman AQP4 T hücre epitopları, peptid (p) 135-153 ve p201-220, tespit edildi zaman immün yanıt-e doğru AQP4 T hücre reaktivite bu epitopları için öne AQP4-eksik (AQP4- / -) farelerde eğitim normalde timik tarafından denetlenir negatif seçim. AQP4- / - Th17 ağırlıklı olarak leptomeningeal iltihabı spinal kord ve görme sinirini ile ilişkili p135-153 veya p201-220 bağlı felç alıcı WT farelerde için astarlanmalıdır T hücreleri polarize. İltihabı çevreleyen görme sinirini ve iç retina katmanları (IRL) katılımı değişikliklerden seri optik Koherens tomografi (OCT) tecelli edildi. Burada, şimdi patojen AQP4 özgü T hücreleri ve nasıl onlar B ile işbirliği izin mekanizmaları incelemek için istihdam edilecek AQP4 hedefli CNS otoimmünite (ATCA), bu yeni vivo içinde model oluşturmak için kullanılan yaklaşımlar göstermek hücreleri NMO patogenezinde.

Introduction

Nöromyelitis optica (NMO) felç ve görme kaybı kalıcı nörolojik özürlülük1' e giden tekrarlayan bölüm oluşmasına neden olan bir merkezi sinir sistemi (MSS) otoimmün inflamatuvar demiyelinizan hastalıktır. NMO şu anda aquaporin-4 (AQP4), bol bol astrocytes3,4üzerinde ifade bir su kanalı hedefleme antikorlar (IGS) ile ilişkili olduğu gibi öncelikle humoral Otoimmün hastalık2 olarak kabul edilir. Ancak, CNS iltihap AQP4 IG5,6CNS giriş için bir önkoşuldur. Böylece, NMO anti-AQP4 IGS yalnız transferi ile bir model kurmak mümkün olmamıştır. (1) patojen AQP4 özgü IGS NMO hastalarda Igg11,2vardır bulguların, alt sınıf7 (2) T hücreleri NMO lezyonlar8,9 ' (3) NMO tanımlanan bir T hücre bağımlı IG ilişkilidir bazı MHC II genler ile (örneğin HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10ve (4) proinflamatuar AQP4 reaktif DR-kısıtlı Th17 hücreleri NMO hastalar11,12 ' tüm genişletilmiş belirtmek AQP4 özgü T hücreleri önemli bir rol var NMO patogenezinde. Böylece, nasıl AQP4 özgü T hücreleri NMO patogenezinde katkıda bulunabilir belirlemek için hayvan modelleri geliştirmek önemlidir.

Birkaç yıl önce birden fazla AQP4 T hücre epitopları vahşi-tipi (WT) fareler13,14 ve fareler15' te tespit edilmiştir. AQP4-reaktif T hücreleri saf alıcı fareler15,16opticospinal iltihap neden gözlendi iken, CNS hastalığı önemli klinik belirtileri gözlenen değil. Benzer şekilde, doğrudan aşılama WT farelerin AQP4 T hücre epitopları14,17, içeren peptidler ile veya aktarım bu belirleyicileri17hedefleme proinflamatuar T hücrelerinin, klinik belirtiler neden olmaz veya histolojik CNS otoimmünite kanıtı.

Son zamanlarda, o bağışıklama C57BL/6 AQP4-eksik (AQP4- / -) fare ile AQP4 peptid (p) 135-153 ya da p201-220, iki belirleyicileri MHC II (ı-Ab) bağlamak için öngörülen yüksek afinite18ile gözlenmiştir, güçlü CD4 elde edildi + T hücre yanıt-e doğru17. Buna ek olarak, bu iki peptidler sadece mütevazı proliferatif yanıtları WT farelerde elde edildi. Ayrıca, bu belirleyici AQP4- / - fareler T hücreleri tarafından tanınması için kullanılan T hücre reseptör (TCR) repertuar benzersiz. Toplu olarak, bu bulgular AQP4 T hücre tanıma timik negatif seçime göre düzenlenmiştir göstermektedir. AQP4 p135-153 veya p201-220-özel AQP4- / - donör fareler hücrelerden Th17 neredeyse % 100 saf alıcı WT farelerin felç indüklenen; Bu opticospinal infiltratlar T hücreleri, B hücreleri ve monosit ile ilişkili idi. Seri opticospinal Koherens tomografi (OCT) dinamik görsel sistem tutulumu gösterdi. Fareler AQP4 hedefli CNS T Hücre-aracılı otoimmünite (ATCA) ile kurtarıldı felç ve görsel sistem yaralanma. Kalıcı klinik hastalığa yol açan miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) p35 55 özel T hücreleri tarafından indüklenen EAE aksine yalnız T hücreleri tarafından indüklenen ATCA aksonal kaybı veya retina ganglion hücrelerinin (RGCs) azalma ile ilişkili değildi. Bizim sonuçları birden çok patojen AQP4 T hücre belirleyicileri vardır açıkça gösterdi. ATCA bu yeni model geliştirme nasıl bu hücreleri CNS iltihap neden ve nasıl onlar AQP4 özgü B hücreleri ve NMO patogenezinde tanıtmak için antikorlar ile işbirliği öğrenme patojen AQP4 özgü T hücrelerinin kontrol mekanizmaları eğitim için yararlıdır .

Mevcut raporunda, teşvik ve T hücre kaynaklı ATCA değerlendirmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz bağışıklama, T hücre kültürü ve Th17 polarizasyon için patojen AQP4 özgü T hücreleri, polarizasyon ve evlat edinen bu T hücreleri transferini onaylamak için Akış Sitometresi Analizi oluşturmak için kullanılan teknikleri ile başlar. Sonra klinik ve histolojik hastalığı ve kullanım, görsel sistem yaralanma alıcı farelerde izlemek için seri Ekim değerlendirmek için kullanılan yöntemleri açıklar.

Protocol

tüm hayvan prosedürler deneysel yönergeleri University of California, San Francisco kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış uygun olarak gerçekleştirilmiştir. C57BL/6 (H-2 b) kadın fareler, 8 hafta-in yaş, satın ve C57BL/6 AQP4 - / - fareler A. Verkman tarafından sağlanmıştır.

1. bağışıklama fareler AQP4 peptidler ile

  1. tam Freund hazırlamak ' s adjuvan (CFA) çalışma stok.
    1. İnce rendelenmiş hazırlanması bir harç ve havaneli kullanarak M. tuberculosis (H37Ra) eziyet.
    2. Ekle H37Ra eksik Freund için zemin ' s adjuvan 4 mg/mL nihai bir konsantrasyon için. CFA 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
  2. Erime liyofilize antijen (Ag) AQP4 peptid fosfat tamponlu tuz (PBS) son konsantrasyonu 1 mg/ml içinde. 4 ° C'de veya buz üzerinde
  3. CFA/peptid emülsiyon içeren derleme bir stopcock ile katıldı 2 radarı-kilit şırıngaların hazırlayın.
    1. Ekle bir cam radarı-kilit şırınga olmadan 2 erkek radarı-kilit bağlantıları ile 3-yönlü naylon stopcock pompalayacağız. Stopcock kolu şırınga doğru geçiş yaparak kapatın. Açık sonuna kadar tüp bebek hareket etmek belgili tanımlık tenkıye izin şırınganın getirin. Bu ek istikrar için bir tüp raf yerleştirin.
    2. Girdap CFA çalışma stok ve Ag çözüm. Peptid, 1:1 birim ekleme / CFA için açık şırınga. CFA/AG (4 x 50 µL) 200 µL fare gereklidir.
      Not: Genellikle, yaklaşık 1 mL hazırlık bağışıklama için kullanılabilir miktarı azaltacaktır stopcock kaybolur. Bu nedenle, bu gerekli Toplam hacim hesaplama dahil etmek önemlidir.
      Örnek: 5 farelerin bağışıklama için: (200 µL/hayvan x 5 hayvan) + 1 mL ilave birim 2 Toplam CFA/Ag gerekli mL =.
    3. Cam lavabo pompası içine şırınga ve yerinde tutarken eklemek, böylece stopcock yukarı doğru aydınlatmaktadır şırınga ters çevir. Stopcock kolu kullanılmayan kadın bağlantıya geçin. Dikkatle aşırı hava şırıngadan çıkarın için cam dalgıç basınç uygulayın. Sıvı stopcock ikinci erkek radarı-kilit bağlantı doldurur.
    4. İkinci bir cam şırınga (dalgıç tam olarak eklenen) stopcock ikinci erkek radarı-kilit bağlantı ekleyin. Bu aşırı hava mümkün olduğunca olarak içeren bir stopcock ile bağlı 2 cam şırınga kapalı bir sistem olmalıdır.
      5. Bir emülsiyon oluşturmak için
    5. karışımı sıvı dönüşümlü arasında yaklaşık 2 dk. yaklaşık 10 dakika süreyle buzda şırıngaları tekrar Chill için 2 şırınga ürpertici geçirmek itici itip hazırlık viskozite açık bir değişiklik kadar karıştırma , çok sert, beyaz emülsiyon içinde sonuçlanır. 4 ° C'de emülsiyon içeren şırıngalar soğutmak veya buz üzerinde korumak
  4. Tüm emülsiyon bir cam radarı-kilit şırıngaya aktarmak, boş cam şırınga kaldırmak ve enjeksiyon için 1 mL radarı-kilit şırınga ile değiştirin. Emülsiyon ile yeni şırıngaya doldur, stopcock kaldırmak ve bir iğne (25G x 5/8) takın.
  5. " su-test " emülsiyon tutarlılık için. Emülsiyon bir damla su küçük bir çanak sınırdışı. Emülsiyon, enjeksiyon için uygun olduğunu belirten dağıtmak değil.
    1. Emülsiyon yayılır eğer enjeksiyon için hazır değil; cam içine sıvı geri transfer batar ve mix ve chill emülsiyon ağırdır kadar sonra tekrar devam.
    2. Uygun tutarlılık elde kadar emülsiyon tekrar test edin.
  6. Donör AQP4 - / - fareler subkutan enjekte (SC) AQP4 peptid içeren emülsiyon ile. Her fare 4 x 50 µL SC enjeksiyon (200 µL toplam (100 µg peptid)) alır. İnguinal lenf düğümleri (LN) drenaj, alt karın, taraf ve aksiler LN. drenaj için her koltuk altı, medial göğüs duvarı her iki tarafında 4 siteleri ekle Evlat edinen transfer 1-2 aşılı donör fareler alıcı fare başına gerektirecektir.

2. T hücre kültürü ve proinflamatuar T hücre polarizasyon

  1. 10-12 gün sonra aşılama, LN fareler toplamak.
    1. Bir buz tepsisinde 60 mm Petri bir hücre süzgeç (Kafes boyutu 70 µm) ile donatılmış ve soğutulmuş RPMI medya ile % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS) ve 100 U/mL penisilin-100 µg/mL streptomisin (kalem-strep) (DC'de) içeren yemekleri hazırlamak.
    2. CO 2 servikal çıkığı tarafından takip, maruz Euthanize fareler. % 70 etanol farelerde bırakın ve sonra her footpad bir diseksiyon kurulu pin.
    3. Deri Ensizyon kasığından boyun ve her bacak kısmak. Karın zarını uzak cilt çekin ve tautly kuruluna pin. Kasık ve aksiler LN teşrih ve buz üzerinde DC'de içeren Petri kabına yerleştirin. 19
    4. aynı bağışıklama grup içindeki tüm hayvanlardan LN evlat edinen transfer deneyler için birleştirmek. İçin akış sitometrik analizleri Vβ kullanım LN bireysel hayvanlardan ayrı.
  2. FLN DC'de içeren bir 50 mL santrifüj tüpü üzerine içeren hücre süzgeç koyun. 5 mL steril enjektör pompası düz sonu LN hücreleri hücre kurtarma kolaylaştırmak için DC'de 20-30 mL ile yıkama süzgeç aracılığıyla basın için kullanın. LN hücre kültürü için zamana kadar işlem boyunca buzda korumak.
  3. Yıkama iki kez, 393 x g 5 min için de centrifuging. Sonra ikinci yıkama, T hücre medya (TCM) LN hücrelerde resuspend. TCM içeren RPMI ile % 10 ısı-inaktive FBS, 292 µg/mL L-glutamine, 110 µg/mL sodyum pyruvate ve 55 µM 2-mercaptoethanol ve kalem-strep. Genellikle, bir birim olarak donör fare başına 5 mL TCM kullanılır.
  4. Hücreleri hesaplama FLN. Yaklaşık 3-6 x 10 7 LN hücreleri aşılı fare donör başına beklenen verimidir. 3-4 x 10 bir kenara bir nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil için 6 (Bölüm 3 aşağı bakınız).
  5. Kültürler evlat edinen transfer (Bölüm 6) için polarize ayarla.
    1. Th17 polarize kültür 5 x 10 mL 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL rekombinant fare İnterlökin (Il) -23 ile başına 6 LN hücre hazırlamak ve 10 ng/mL rekombinant fare Il-6 TCM içinde.
    2. Alternatif olarak, bir kültür 5 x 10 mL 10 µg/mL Ag ile başına 6 LN hücre Th1 polarizasyon için hazırlamak ve 10 ng/mL rekombinant fare IL-12 TCM '.
    3. 2 mL (1 x 10 7 hücreleri) polarize kültür karışımı kuyu başına 12-şey plaka ekleyin. 2-4 donör fareler LN hücrelerden bir 12-şey plaka doldurur. 72 h. için oksijen bir kuluçka %5 CO 2 37 ° C'de kültürleri korumak
    4. Görsel olarak kültür için harekete geçirmek, 48 h LN hücreleri denetleyin ve 72 h. aktif hücre geniş kümeler oluşturacak ve T hücreleri daha Pleomorfik olma boyutu artacaktır. Metabolizma artışı bir şeftali turuncuya değişen ortamda, pH düşürücü neden olur. PH medya sararma düşük ise, 1 mL taze TCM toksisite kalan 24 h hücrelerde engellemek için ekleyin
    5. Bölüm 6 için devam et evlat edinen transfer için. Kutuplaşma verimliliği (ICS), boyama hücre içi sitokin tarafından descr doğrulanmadıBölüm 5'te ibed.
  6. LN bireysel fareler için yüzey Vβ ifade (Bölüm 4) akış sitometrik çözümlemesi kullanarak kültürler ayarlayın.
    1. 5 x 10 6 mL 10 µg/mL TCM Ag ile başına LN hücreleri hazırlayın.
    2. Başına 12-şey plaka kuyuya kültürünün Ekle 2 mL (1 x 10 7 hücreleri). Kültürler 10 gün boyunca oksijen kuluçka %5 CO 2 37 ° C'de muhafaza edilmelidir. Bölüm 4'e devam.

3. Nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil

Not: Bu bölüm 2.4 devam ediyor.

  1. 3-4 mL tüp, 2 x 10 LN hücrelerinin TCM mL başına 6 hücre hazırlayın.
  2. Hücreleri tüp birkaç kez ters çevirme tarafından karışımı yavaşça ve sonra steril bir yalak transfer.
  3. Kullanıma 96-şey yuvarlak plaka 100 µL hücre iyi ücret için çok kanallı bir pipettor alt doku kültürü plaka. Genellikle, ineklemek 4 Ag konsantrasyonları ve hiçbir Ag başvuru test için 15 wells plaka.
  4. Ag çeşitli konsantrasyonlarda TCM, genellikle 80, 20, 5, 1 ve 0 µg/mL (2 x hisse senetleri için) sulandırmak. Her konsantrasyon 100 µL nüsha 40, 10, 2.5 son bir konsantrasyon için ekleyin. 0.5 ve 0 µg/mL. Yaklaşık 72 h 37 için kuluçkaya ° C.
    Not: adımlar 3.5 3.7 ile radyoaktif malzemeler içerir. Uygun kullanım, izleme ve radyoaktif malzemelerin atılması yürütülen, kurumsal ve hükümet yönetmeliklerine göre.
  5. Çalışan bir hisse senedi çözüm 3 H-timidin hazırlamak (40 µCi/mL) ile 1 MCI 3 H-timidin 25 mL RPMI ekleme ve bu 4'te mağaza ° C. damlalıklı 0.5 mL steril yemlik içine çalışma çözeltisi.
  6. Ekle 25 µL 3 H-timidin (1 µCi) de bir çok kanallı damlalıklı kullanarak başına. Bir ek 18 h 37 için kuluçkaya ° C.
  7. Hücreleri üzerine bir 96-şey hücre hasat kullanarak bir cam filtre mat hasat ve % 70 etanol ile durulayın. Kuruduktan sonra filtre mat 5 mL mercek sıvı olan bir plastik örnek torbaya kapatın. Her şey bir mercek sayaç kullanarak ölçü radyoaktivite.

4. Akış Sitometresi Analizi için hücre yüzey TCR Vβ ifade

Not: Bu bölüm 2.6 devam ediyor. Fare TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 ve 5.2, 6, 7, 8.1 ve 8.2, 8.3, 9, antikor 10b, 11, 12, 13, 14 ve 17a ticari TCR Vβ ifade sınamak için kullanılabilir.

  1. TCR Vβ tespiti için birkaç kez pipetting T hücre kültür plaka çıkarmak ve bir tüp için hücreleri transfer.
  2. Yıkama ile %2 FBS, % 0,1 sodyum azid ve 2 mM EDTA PBS içeren FACS arabellek (FB).
    3. İyi başına
  3. 1 x 10 5-3 x 10 yoğunluğu bir V-alt 96-şey plaka hücrelere transfer 6 hücre. Tüm Vβ panel test Eğer hücreleri birden çok wells (test edilen Vβ başına bir de) içine dağıtılması.
  4. Ölü hücreleri ile ücretsiz aminler nekrotik hücreleri tarafından maruz canlı/ölü canlılığı boya boyama tarafından akış sitometrik çözümleme dışı bırakmak. Üretici takip ' s yönergeler Santrifüjü ve canlılığı boya resuspension için. Yordamlar boyama hücre boyunca 10-20 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya, ışıktan hücreleri korumak ve buz üzerinde tutmak
  5. Kuluçka sonra plaka bir kez FB yıkayın. TCR Vβ algılamak için CD4 için 1: 100 seyreltme antikor içeren FB 100 µL hücrelerde askıya alma (Klon RM4-5) ve TCR Vβ. 15-60 dakika buz üzerinde kuluçkaya
  6. Plaka bir kez FB yıkama ve hücreleri 200 µL % 4 paraformaldehyde PBS içinde seyreltilmiş ekleyerek düzeltmek. Buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. FB plaka yıkama ve Akış Sitometresi tarafından analiz.

5. Akış sitometrik analiz için hücre içi sitokin üretim

  1. (ICS) Boyama hücre içi sitokin için T hücre kültürleri 1:1,000 seyreltme protein taşıma inhibitörü reaktif (örneğin, GolgiPlug) ile TCM, ICS önlemek için önce 4 h tedavi sitokin salgısının. O zaman, T hücreleri 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 500 ng/mL ionomycin protein üretim teşvik için etkinleştirmeniz.
  2. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 37 ° C'de kültürünün 4 h sonra hücreler kültür plaka çıkarmak ve transfer santrifüj tüpü (15-50 mL).
  3. Yıkama FB ile. FB ve 5 x 10 5 için iyi başına 3 x 10 6 hücre yoğunluğu bir V-alt 96-şey plaka aktarmak hücrelerde resuspend.
  4. Leke hücreleri (Bölüm 4.2) açıklandığı gibi canlılık boya. Kuluçka sonra plaka bir kez yıkama FB.
  5. Antikorlar yüzey işaretleyicileri algılanması için aşağıdaki gibi ekleyin:
    1. 1: 100 seyreltme antikor, CD4 için içeren FB 100 µL hücrelerde yüzey işaretleyicileri tespiti için askıya (RM4-5 clone).
    2. İsteğe bağlı olarak, B220 için antikor içerir (clone 30-F11) ve CD11b (M1/70 clone), B hücreleri ve monosit/makrofajlar, sırasıyla çoğunluğuna geliştirmek için bir 1: 100 seyreltme. Genel olarak, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 ve PerCP-Cy5.5 anti-CD11b de çalışır. Antikor/fluorochrome conjugates seçimi Akış Sitometresi Analizi için kullanılmak üzere yapılandırma tarafından güdümlü ve en uygun konsantrasyonlarda antikorlar ampirik olarak belirlenen.
    3. 15-60 dakika buz üzerinde kuluçkaya
  6. FB plakalı yıkama ve fiksasyon/Permeabilization çözüm için buz üzerinde 20 dk 200 µL hücrelerde resuspend. Bu hücreleri tamir ve membranlar permeabilize.
  7. Permeabilization hücre zarı, hücre içi boyama sırasında korumak için perma/yıkama arabellek (PW) (seyreltilmiş 1:10 10 X stoktan) FB yerine kullanın. PW 200 µL wells yıkayın.
  8. İçin ICS, 1: 100 seyreltme antikorların interferon (IFN) için hazır olun-γ ve IL-17A kullanarak 1 x PW. Bir seçenektir APC anti-IFN-γ (Klon XMG1.2) ve PE anti-IL-hangi inşaat su kuyusu 17A (Klon eBio17B7). Hücre içi antikor kokteyl 100 µL hücrelerde resuspend ve en az 15 dakikadır kuluçkaya. Gece 4'te boyama devam etmek mümkündür ° C.
  9. Yıkama PW 200 µL wells ve Akış Sitometresi için içinde FB resuspension.
  10. Paralel olarak, günahı bir örnek (FB hücrelerde antikorlar olmadan) dedektörü gerilim ve tek lekeli örnekleri her bireysel fluorochrome (yani, hücre veya tek bir antikor/fluorochrome ile lekeli tazminat boncuklar) için optimize etmek için hazır olun tazminat yayılma değerlerini belirlemek.
  11. Akış Sitometresi kullanarak, elde ≥ 10.000 hücreleri (olaylar), canlı (LIVE/ölü-negatif) CD4 çoğunluğuna + hücreleri. B220 T hücrelerinin doğru geçişi sağlamak için dışlamak + ve CD11b + hücreleri (B hücreleri ve monosit/makrofajlar, sırasıyla). CD4 içinde + T hücre subpopulation, IFN-γ (Th1 soy) veya IL-17A (Th17 soy) ifade hücre yüzdesi belirleyin.

6. Evlat edinen Transfer olan patojenik AQP4 özgü T hücre

Not: Bölüm 2,5 bu adımı takip: T hücre kültür ve proinflamatuar T hücre polarizasyon.

  1. Yeniden elde etmek çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetting ve 50 mL tüp aktarılması tarafından 12-şey plakaları hücrelerden polarize. Maiğne kadar buzda intain.
  2. Hücreleri saymak, iki kez soğuk PBS yıkama ve PBS 1 x 10 8 hücre/mL süspansiyon hazırlamak. Genel olarak, bir saat içinde hücre enjekte.
  3. Yavaşça dönen tarafından hücreleri mix ve 1 mL şırınga enjeksiyon anda aktarmak. Yönetmek (2 x 10 7) hücrelerinin 200 µL intravenöz (IV) her fare kuyruğu aracılığıyla damar.
  4. Enjekte 200 ile her alıcı fare IP ng B. boğmaca toksin seyreltilmiş PBS 200 µL içinde o gün ve 2 gün sonra. İzlemek fare günlük klinik hastalığın belirtileri için.

7. Klinik değerlendirme ATCA

günlük CNS otoimmünite klinik belirtileri için alıcı fareler
  1. inceleyin. Genel olarak, fare AQP4 özgü T hücrelerinin evlat edinen transferden sonra 5-8 gün CNS otoimmünite belirtileri gösterir. Fareler klinik nörolojik disfonksiyon belirtileri gösterir. Değerlendirme bir fare normal yeteneği tanımlamak için saf fare üzerinde gerçekleştirmek yararlıdır.
  2. Değerlendir fareler için kuyruk kaybı sesi. Fareyi yavaşça kuyruk tabanında tutun ve dik kaldırın. Sarkmalarının sürekli olduğunu kuyruk kayıp olarak açıklanan bir kuyruk sesi (1 puan). Kuyruk sesi kayıptır kez klinik hastalık ilk belirtisi.
    3. Sırtını düz bir yüzeye fare yerleştirerek
  3. düzeltilmesi için test refleks. Yavaş keşfetmiş olduğu truncal incoordination belirtisi (2 puan). Saf fare tamamen sağ yeteneği herhangi bir yavaşlık bir işlev bozukluğu olarak attı bu yüzden sırtında, yerleştirmek için herhangi bir girişimi karşı olacaktır. Fareyi bu refleks için 3 - 4 kez test normaldir.
  4. Değerlendir duruş ve ambulation. Fareler başlamak bir değişiklik bir düşürücü içinde kaynaklanan ya da kalça ambulation sırasında duruş göstermek (2.5 puan). Daha fazla monoplegia, bir arka komple felç sonuçlarında hastalığı (3.0 puan) uzuv ve (3.5 puan) parapleji, tam felç her iki arka bacaklarda. Orta quadraparesis, tüm dört kol ve bacaklar, zayıflığını sonuçları çok yavaş ileri hareketi (4 puan). Şiddetli quadraparesis hemen hemen hiç ileri hareketi sağlar (4.5 puan). Son olarak, ağır hastalığı ile onlar can çekişen olmak veya (5 puan) ölür.
  5. Yönetici alternatif olarak, sıvı ya da katı gıda 1 mL serum fizyolojik ı.p. %5 glikoz elde etmek için yeteneğini kaybetmezsin farelere kullanım takviyesi ile sıvı dehidratasyon ve gıda yoksunluğu karşı koymak için bardak, yüksek kalori jel ve pastırma softies jel. Ötenazi can çekişen fareler.

8. Doku hazırlık ve Histoloji

  1. 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine ile fareler anestezi ve her footpad bir diseksiyon kurulu pin.
    2. Kalp açığa
  2. açık göğüs yukarı. Kan çıkış izni için karaciğer deşmek. Kelebek iğne PBS ve % 10 formalin için ayrı bir rezervuar kullanarak bir miniflow değişken hız pompa tüp takın. İğneyi kalbine sol ventrikül yerleştirin ve 5 mL % 10 formalin 25 mL tarafından izlenen PBS ile sıvı.
  3. Çıkarın baş ve gözler. İşlem gözleri ve 20 daha önce açıklandığı gibi retina. Göz yuvaları arasında kesme, makas burun eklemek ve posterior anterior kafatası her iki tarafta kesti.
    1. Kafatasını, görme sinirini ortaya çıkarmak, optik hemisferlerine kesmek ve bir kaset 2 köpük pedler arasında gerçekleşti.
    2. % 10 formalin (24 saat) ve o zaman % 50 etanol (24 saat) ve % 70 etanol sonra transfer bırakın.
  4. Beyin ve omurga kaldırmak ve yerine % 10 formalin içinde. Bölüm beyin koronal düzlemde seri olarak; Bölüm spinal kordonlar sagittal içinde (yaklaşık yarısı) ve seri koronal (yaklaşık 20 kesit fare başına) uçak.
  5. Düzenli olarak parafin katıştırma için işlem merkezi sinir sistemi örnekleri. 8 µm kalınlığında bölümleri Hematoksilen ve Eozin (görme sinirini) veya hızlı mavi Hematoksilen-Luxol ve Eozin (beyin ve omurilik) leke.
  6. Optik sinir iltihabı çevreleyen zarları (optik nörite) ve sinir içinde veya ağırlıklı olarak çevreleyen zarları (optik perineuritis) varlığı için değerlendirmek.
  7. Saymak meninjeal ve parenkimal inflamatuar foci (> 10 kümelenmiş mononükleer hücreler) her fare için beyin ve omurilik örneklerinde.

9. Vivo Optik Koherens tomografi (OCT) tarafından Imaging retina

Not: spektral etki alanı OCT retina görüntüleme farelerin tutarlı vizörün ulaşmak için depo donatımı (örneğin, TruTrack göz izci ile Spectralis) kullanarak gerçekleştirilir yön ve hareket dışlayıcıları azaltmak.

  1. 5 dk önce görüntüleme, öğrenciler %1 tropicamide (bir damla göz başına) ile dilate ve anestezi indüksiyon odasında 2 litre başına min (% 1.5 isoflurane), sürekli bir akış sağlamak yansıması için fare yer. Isı mindere açmak ve sonrası anestezi kurtarma kafes hazırlayın.
  2. Görüntüleme silindir üzerinde fareyi getirin ve anestezi akışı buna göre yönlendirin. Gözleri ile %0,3 HİDROKSİPROPIL methylcellulose göz nemli tutmak için ve kırılma süreklilik sağlamak için korumak. Özel bir kontakt lens incelenmesine göz kulak yerleştirin.
  3. Kızıl ötesi fundus görüntü tarafından güdümlü lazer ışını optik sinir kafasına ortalanır sağlanması da göze doğrudan. Dikey ve yatay OCT taramalar onaylamak retina lazer için dik bırakır.
  4. B-taramaları gerçekleştirmek 25 yüksek çözünürlüklü modu ve rasterize 30 ortalama olarak A-tarar.
  5. Her iki gözde Imaging sonra Kontakt lens kaldırmak ve oftalmik jel uygulayın. Fare sıcak kurtarma kafesi terk.

10. İşleme ve analiz, Ekim

  1. görüntüleme yazılımı otomatik bölümleme için modüler kullanın.
    1. El ile doğru kesimleri, membran (ILM) ve iç Pleksiform tabaka (IPL) sınırlama iç karşılık gelen iç retina sınırlarını gösteren Katmanlar (IRL) 21.
    2. Retina Sinir lifi tabakası (RNFL) ve ganglion hücre Katmanı (un) IRL sınırları içinde bulunan ve örtüşmeyen doğrulayın.
  2. 1, 2 ve 3 mm optik disk ve bir elektronik tablo dosyasına verme merkezli çaplarda erken tedavi Diyabetik retinopati çalışma (ETDRS) 2 ızgara kullanarak hesaplamak IRL kalınlıkları. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı her retina tabakasının kalınlığı her kılavuz sektör sayı ortalaması alınarak hesaplar. Bu nedenle, optik sinir başı için karşılık gelen orta segment, söz konusu değildir.
  3. , Her zaman bir noktada gruplar arasında istatistiksel fark analiz. Her iki gözde kullanarak her fare için bir değiş tokuş edilebilir korelasyon matrisi ve intra konu arası göz korelasyon 21 için ayarlamaları ile denklemler tahmin Genelleştirilmiş analiz.

Representative Results

Bu protokol için biz C57BL/6 AQP4- / - fareler donör T hücreleri kullanılır. Oysa bu iki peptidler çok zayıf T hücre indüklenen patojenik T hücre epitopları içeren bu fare ile AQP4 p135-153 ya da p201-220, subkutan bağışıklama drenaj Lenf bezleri (Resim 1), yanıtlarında güçlü proliferatif T hücre elde edildi WT farelerde yayılma. İçinde karşılaştırma, aşılama ile AQP4 p91-110, patojenik olmayan AQP4 T hücre determinant13veya MOG p35-55, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE)22,23 neden olan T hücreleri aktive bir miyelin peptid içeren ,24, T hücre çoğalması AQP4- / - ve WT fareler benzer büyüklüğü indüklenen. Akış Sitometresi boyama tarafından TCR kullanımı analiz bireysel Vβ'ın ya da Vβ aileler, gösterdiği için AQP4- / - fareler p135-153 ve p201-220-özel T hücrelerden benzersiz TCR kapsayacağını kullanılmaktadır. Bu belirleyici patojenik T hücre yanıt normalde timik negatif tarafından düzenlenir seçici hiper-hızla çoğalmak-in AQP4 p135-153 ve p201-220 AQP4- / - fareler, hem de benzersiz TCR kullanımı (Resim 2), belirtilen seçimi, bu iletişim kuralını AQP4- / - donör T hücreleri kullanmak için önemini vurgulamış.

ATCA indüksiyon için evlat edinen transferi önce AQP4 peptid astarlanmalıdır fareler hücrelerden lenf nodu tüp bebek üç gündür Th17 veya Th1 polarize koşullarında kültürlü. Ölçüde donör CD4 kutuplaşma+ T hücreleri hücre içi sitokin (ICS) Boyama tarafından onaylandı ve Akış Sitometresi (şekil 3) tarafından ölçülür. Saf alıcı fareler intravenöz 2 x 107 donör AQP4 peptid özgü T hücreleri enjekte edildi. Yaklaşık altı gün sonra neredeyse % 100 alıcı farelerin CNS otoimmün hastalığı, yumuşak kuyruk ve hind kol felci (şekil 4) dahil olmak üzere klinik belirtileri geliştirdi. Th17 polarize AQP4 özgü T hücrelerinin Th1 polarize AQP4 özgü T hücreleri daha daha ağır klinik hastalık indüklenen. Th17 AQP4 peptid özel alınan ve tam hind felç (parapleji) geliştirilmiş bir temsilcisi fare Video 1' de gösterilen. EAE MOG özgü Th17 hücre yönetim sonra geliştirilen fare aksine, klinik hastalık AQP4 özgü Th17 hücreleri tarafından indüklenen alıcı fareler kurtarıldı. EAE, MOG p35 55 özel Th17 hücreleri tarafından indüklenen gelince klinik hastalık AQP4 p135 153-özel tarafından indüklenen veya p201 220 özel Th17 hücreleri CNS parankimi ve meninkslerde (şekil 5) mononükleer hücre infiltrasyonu ile ilgili oldu. Lezyonlar daha meninkslerde parankimi CNS otoimmünite AQP4 özgü Th17 hücreleri tarafından indüklenen için de bol miktarda.

Histolojik değerlendirme ve tarafından seri Ekim AQP4 özel optik sinir tutulumu gösterilmiştir ve mononükleer hücrelerin varlığı ile karakterize edildi her iki indüklenen optik sinir iltihabı MOG özgü Th17 hücreleri. Optik perineuritis AQP4 özgü Th17 hücreleri neden ise MOG özgü Th17 hücreler şiddetli optik nörite (şekil 5) indüklenen. Seri OCT kullanarak, optik sinir iltihabı şişme bebekleri açıktı ve klinik hastalık AQP4 özgü veya MOG özgü Th17 hücreleri (şekil 6) tarafından indüklenen için iç retina tabakası (IRL) kalınlığı artar. AQP4 Th17 kaynaklı CNS otoimmünite için IRL kalınlık fareler temele döndürülen klinik hastalık kurtarıldı. Buna ek olarak, MOG özgü Th17 tarafından indüklenen EAE sürekliliği IRL inceltme ile denk ve biz daha önce17, gösterildiği gibi retina ganglion hücrelerinin kaybı ile ilişkili.

Figure 1
Resim 1 : AQP4 p135-153 ve p201-220 temin AQP4- / - fareler, ama WT fareler sağlam T Hücre proliferasyonu. Fareler aşı SC CFA içinde belirtilen peptidler ile. On gün sonra Lenf bezleri kaldırıldı ve ya hiç antijen veya bağışıklama için kullanılan peptid kültürlü. Nükleer silahların yayılmasına karşı 3H-timidin birleşme (ortalama ± SEM, 5 deney temsilcisi) tarafından ölçüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : AQP4- / - fareler AQP4 özgü T hücreleri kullanmak benzersiz TCR kapsayacağını. AQP4- / - ve WT fareler ile belirtilen peptidler aşı. On gün sonra Lenf bezleri kaldırıldı ve Bağışıklama için kullanılan peptid ile kültürlü. Hücre hasat edildi. TCR Vβ kullanımı Akış Sitometresi tarafından analiz (± SEM, yani n = 5). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Proinflamatuar polarizasyon donör AQP4 özgü T hücrelerinin. On gün sonra aşılama ile AQP4 p135-153 ya da p201-220, lenf nodu hücre hasat ve bağışıklama polarize olmayan koşullarda, Th1 veya Th17 polarize koşulları için kullanılan peptid ile kültürlü. Th17 veya Th1 polarizasyon ICS ve Akış Sitometresi tarafından Il-17 veya IFN-γ, sırasıyla incelenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Th17 polarize AQP4 özgü T hücreleri neden felç WT alıcı farelerde. WT alıcı fareler 2 x 107 donör Th17 polarize AQP4 p135-153 veya p201 220 özel T hücreleri AQP4- / - fareler aldım. MOG özgü T hücreleri Th17 polarize olumlu bir denetim olarak görev yaptı. -Den sonuçlanmak are 8 deneyler temsilcisi (n = 5/grup). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : AQP4 özel Th17 hücreleri neden opticospinal iltihap WT farelerde. Alıcı fare 2 x 107 donör Th17 AQP4 p135-153 - veya p201-220-astarlanmalıdır Th17 hücrelerden AQP4- / - fareler veya Th17 MOG p35 55 özel hücreleri alınan ve 10 gün sonra kurban edildi. Spinal kord ve optik sinir doku hazırlanan ve H ile lekeli & inflamasyon ve demiyelinizasyon kanıtı için değerlendirmek için E/LFB, sırasıyla. 5 fare/grubu temsilcisi sonuçlarıdır. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Optik sinir iltihabı AQP4 özgü Th17 hücreleri tarafından indüklenen boyuna retina Ekim tarafından izlenen WT alıcı fare gün 0 2 x 107 donör Th17 polarize AQP4 p201 220 özel veya MOG p35 55 özel T hücreleri alınan. Gün 0 (önce yönetim T hücreleri) tarafından Ekim incelenmiş ve sonra günlerde 4, 7, 8, 9 10, 11 14 ve 21. IRL kalınlık ölçüm (ortalama ± SEM) yapıldı. İstatistik saf denetimi ile bir karşılaştırma gösterir. 3 deneyler (5 fare/grup) temsilcisi sonuçlarıdır. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

AQP4 NMO IgG birincil hedef 20053olarak tespit edilmiştir. Sonra bir AQP4 hedefli hayvan modeli CNS otoimmünite kurmak önemli olacağını kabul edildi. Böyle bir model nasıl AQP4 özgü T ve B hücreleri CNS otoimmünite gelişiminde katılmak araştırmaya ve aday therapeutics NMO için test etmek için yararlı olabilir. Her ne kadar klinik veya histolojik hastalık14,17AQP4 özgü T hücre epitopları vahşi tipi farelerde ilk 201013, T hücreleri bu epitopları için yanıt bildirildi tanımlaması neden olmaz. CNS otoimmünite AQP4 için bağışıklık reaktivite dayalı bir model oluşturmak için yetersizlik bir bilmece 2015 zaman kadar kaldı Jones, vd. 25 donör AQP4 p135 153 astarlanmalıdır AQP4- / - fareler T hücrelerden WT farelerde CNS otoimmünite klinik ve histolojik belirtileri neden yeteneğine keşfetmiştir. İlgi, AQP4 p135-153 MHC II (ı-Ab) yüksek afinite17ile bağlamak için tahmin edilmektedir. Tek bir diğer AQP4 amino asit dizisi, 201-220, ı-Ab benzer yüksek afinite ile bağlamak için tahmin edilmektedir. Gerçekten de, biz bu AQP4 p135-153 ve p201-AQP4- / -ama değil WT, fareler sağlam yayılması temin 220 hem gözlenen. Burada, nasıl bir izole ve encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - ve p201-220-reaktif T hücrelerden AQP4- / - fareler genişletin göstermiştir. WT alıcı fareler Transfer edildiğinde, donör AQP4 reaktif Th17 hücre mononükleer hücre infiltratlar spinal kord ve optik sinir eşlik etti felç indüklenen. Afferent görsel sistem yaralanma iyi AQP4 seropositive NMOSD26olan hastalarda bilinmektedir. Burada, optik sinir iltihabı AQP4 reaktif ve MOG reaktif Th17 hücreleri tarafından indüklenen ayrı görülmektedir. AQP4 özgü Th17 hücreleri optik perineuritis indüklenen ise MOG özgü Th17 hücreler şiddetli optik nörite indüklenen. Ayrıca tarafından seri Ekim AQP4 özgü ve MOG özgü T hücreleri tarafından indüklenen optik sinir iltihabı izlemek için kullanılan teknikleri anlatmıştık. Diğer araştırmacılar şimdi ATCA patojenik mekanizmaları üzerinde odaklanmış kendi çalışmaları ilerletmek için burada açıklanan protokoller uygulamak gerekir.

Bir kolayca bizim protokolündeki üç olası tehlikelere önleyebilirsiniz. İlk, evlat edinen ATCA transferini AQP4- / - donör fareler AQP4 özgü T hücrelerden kullanımını gerektirir. Özellikle, donör WT AQP4 p135 153 özel T hücreleri ATCA alıcı WT fareler neden olmadı. İkinci olarak, bir "su-test" peptit/CFA emülsiyon bağışıklama farelerin AQP4- / - (iletişim kuralı adım 1.5) önce bir damla ile gerçekleştirmek önemlidir. SC enjeksiyon için uygun olduğunda emülsiyon suda dağıtmak değil. Emülsiyon çekilmesini, bir emülsiyon bir kez daha karıştırın, daha soğuk ve su-sınama işlemini yineleyin. Son olarak, aktif donör CNS antijen spesifik T hücreleri CNS otoimmünite T hücreleri dinlenme daha verimli bir şekilde ikna etmek. Bir görsel olarak donör T hücreleri evlat edinen transfer için hasat öncesinde ışık mikroskop altında bu kültürleri incelemeniz gerekir. Hızla hücre bölünmesi kolayca tespit kümeleri oluşturabilir. Kültürleri çok aktive T hücre içerdiğinde, Ayrıca, medya pembe turuncu ya da sarı, pH azalma nedeniyle bile için geçiş. Bir de yayılması için donör AQP4 astarlanmalıdır lenf nodu T hücre aktivasyonu tarafından 3H-timidin birleşme, protokolü adım 3'te açıklandığı gibi değerlendirebilirsiniz.

İki patojen AQP4 T hücre epitopları (1) MHC II ile yüksek ilgi bağlamak ve (2) AQP4- / -ama değil WT güçlü proliferatif yanıtları temin için tahmin bizim keşfimiz fareler bu belirleyicileri hedefleme T hücreleri normal olduğunu göstermektedir timik negatif seçim17tarafından kontrol. AQP4 p135-153 ve p201-220 AQP4- / - farelerde tanınması için kullanılan TCR kapsayacağını benzersiz (Şekil 2), çoğu da klonal silme timik medüller epitel hücreleri tarafından aracılı ile tutarlı olduğu. Diğer tolerogenic mekanizmaları normalde bağışıklık yanıtı için AQP4 engel. Bizim ilk rapor17sonra başka bir grup de AQP4 p201-220 bir encephalitogenic T hücre determinant27içerdiğini gösterdi. Ne zaman α/β (TCRα- / -) T hücre eksikliği fareler yeniden AQP4- / - ile CD4+ T hücreleri, bir encephalitogenic AQP4 özgü T hücre yanıtı, ama bunda ima değil bir AQP4 özgü humoral yanıt, temin mümkün WT fareler AQP4 özgü B hücre yanıtları, AQP4 özgü T hücre yanıtlarını benzer negatif seçim tabi değildir. Nitekim, WT farelerde AQP4 özgü T hücreleri tarafından tek başına indüklenen ATCA ile gözlenen değil, spinal kord akson ve kaybı RGCs, patojen AQP4 özel antikorlar katılımı gerektirebilir. Bu AQP4 hedefli CNS otoimmünite fare modelleri biz normalde AQP4 özgü T hücre ve B hücre bağışıklık kontrol tolerogenic mekanizmaları ile ilgili daha fazla bilgi edinmek gibi gelişmeye devam edecektir açıktır.

Diğer modelleri AQP4 hedefli CNS otoimmünite, aynı zamanda gelişmiş6,16,olmak28,29,30. Her biri NMO patogenezinde için ilgili belirli yönleri çalışmak için avantajlar sunuyor. AQP4 özgü T hücreleri WT fareler6,16,29tespit edilmiştir. Bu AQP4 özgü T hücreleri CNS otoimmünite histolojik değişiklikler neden ama benzer şekilde gözlemler farelerde, WT sıçan AQP4 özgü T hücreleri önemli klinik hastalığın belirtileri neden olmaz. Bu nedenle, T hücre ve B hücre AQP4 özgü bağışıklık yanıtı WT farelerde kısıtlama dayanıklılık mekanizmaları da fareler çalışır durumda. Ne olursa olsun, bir fare modelleri mekanizmaları hastalık patogenezinde ilgili eğitim için kullanma içinde gücü hafife alınmamalı. Knock out, transgenik ve muhabir fareler zenginliği avantajlı olabilir. Ayrıca otoimmünite birkaç temel buluşları fare EAE modeller kullanılarak yapılmış kabul edilmelidir. Örneğin, bu T Hücre klonlar bir öz-antijen için özel gösteri Otoimmün hastalık31,32, otoimmüniteye33 T hücre costimulation rolü ve keşfi aracılık Th17 farklılaşma34 için gelişimsel yolu ilk açıklanan fare EAE modelleri kullanma. Geliştirdiğimiz ATCA fare modeli kullanarak, bir anda geliştirme ve düzenleme, patojen AQP4 özgü bağışıklık yanıtı içinde vivo çalışmada bulunmasını NMO patogenezi ile ilgili önemli bilgiler sağlamak vardır.

Disclosures

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, PP Ho, L. Steinman, A.J. yeşil ve Ra Sobel yok açıklamaları rapor. S.S. Zamvil Yardımcısı editörü Nöroloji, Neuroimmunology ve Neuroinflammation ve Neuroimmunology uluslararası toplum için Danışma Kurulu üyesidir. Günlük klinik araştırma, İmmünoloji günlük ve Nörolojik bilimler dergisiYayın kurulu hizmet vermiştir ve bir ulusal kurumları grant İnceleme Komitesi üyesi oldu çalışma bölümü ve ulusal multipl skleroz Derneği (NMSS) Sağlık (NIH) klinik Neuroimmunology ve Beyin Tümörleri (CNBT). O bir danışman olarak görev yaptı ve alınan honoraria Biogen Yunanistan'dan IDEC, EMD-Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech ve Teva Pharmaceuticals, Inc ve hizmet vermiştir veya veri güvenliği izleme kurullarında Lilly, BioMS, Teva ve Opexa tedavi için hizmet vermektedir. Şu anda, Dr Zamvil NIH, NMSS, Maisin Vakfı, Biogen ve Celgene araştırma hibe desteği alır.

Acknowledgments

Destek S.S.Z. için Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (RO1 AI073737 ve RO1 NS092835-01), ulusal multipl skleroz Derneği (RG 4768, RG 5179 ve RG 5180), Maisin Vakfı ve Guthy Jackson yardım Vakfı sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5 (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6 (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. , (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13 (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80 (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).

Tags

İmmünoloji sayı: 126 Nöromyelitis optica aquaporin-4 Akış Sitometresi T hücre evlat edinen transferi CNS otoimmünite optik Koherens tomografi
Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A.,… More

Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter