Summary
Dit artikel geeft een gedetailleerde procedure voor de solide fase synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA gemodificeerd op de C2'- O- positie. UV-vis en cirkelvormige dichroïstische fotometrische analyses worden gebruikt om structurele aspecten te kwantificeren en karakteriseren, dwz enkelstrengen of dubbelstrengen.
Abstract
Solide fase synthese is gebruikt om kanonieke en gemodificeerde polymeren van nucleïnezuren, specifiek van DNA of RNA, te verkrijgen, waardoor het een populaire methodologie is voor toepassingen in verschillende velden en voor verschillende onderzoeksdoeleinden. De hierin beschreven procedure richt zich op de synthese, zuivering en karakterisering van dodecamers van RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' die nul, een of twee modificaties bevinden op de C2'- O- positie bevatten. De probes zijn gebaseerd op 2-thiophenylmethylgroepen, opgenomen in RNA-nucleotiden via standaard organische synthese en geïntroduceerd in de overeenkomstige oligonucleotiden via hun respectievelijke fosforamidieten. Dit rapport maakt gebruik van fosforamidietchemie via de vier kanonieke nucleobasen (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), evenals 2-thiophenylmethylfunctionaliseerde nucleotiden gemodificeerd bij de 2'- O- positie; De methode is echter vatbaar voor een grote varZestig aanpassingen die door de jaren heen zijn ontwikkeld. De oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een steun met gecontroleerde poriënglas (CPG), gevolgd door splitsing uit de hars en deprotectie onder standaard omstandigheden, dat wil zeggen een mengsel van ammoniak en methylamine (AMA) gevolgd door waterstoffluoride / triethylamine / N-methylpyrrolidinon. De overeenkomstige oligonucleotiden werden gezuiverd via polyacrylamide-elektroforese (20% denaturerende) gevolgd door elutie, ontzouten en isolatie via omgekeerde fase chromatografie (Sep-pak, C18-kolom). Kwantificering en structurele parameters werden beoordeeld via respectievelijk ultraviolet-zichtbare (UV-vis) en circulaire dichroïstische (CD) fotometrische analyse. Dit rapport streeft ernaar om als bron en begeleider te dienen voor beginners- en deskundige onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het starten van dit vakgebied. Er wordt verwacht dat deze werkzaamheden worden ingezet als nieuwe technologieën en methodologieën worden ontwikkeld. De beschrijving van de methodologieën en technieken binnen dezeS document komt overeen met een DNA / RNA synthesizer (opgeknapt en gekocht in 2013) die fosforamidietchemie gebruikt.
Introduction
Solid-fase synthese om oligonucleotiden van DNA / RNA te verkrijgen is een krachtig hulpmiddel dat sinds de jaren 1970 1 , 2 , 3 verscheidene toepassingen in verschillende velden heeft gediend door fosforamidiet bouwstenen 4 te gebruiken . Voorbeelden van zijn brede invloed zijn: het effect ervan op etikettering ( via click chemistry reacties) 5 , structurele probing 6 en antisense technologieën 7 , evenals de toelichting van biologische mechanismen 8 , 9 , bron als genetisch materiaal 10 , en de studie van Verschillende natuurlijke en / of chemische wijzigingen 11 , 12 , onder vele anderen. De wijziging die we hier gebruiken, vertegenwoordigt de eerste stap in onze inspanningen om RNA-oligonucleotiden te verkrijgen die bevattenFotoactieve probes om tijdelijke controle van de structuur en functie van dit belangrijke biopolymeer mogelijk te maken.
De synthese van RNA-sequenties met dodecameren: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [augustus AUU CCG UAG] -3' (onderstreept posities vertegenwoordigt de opname van een C2'- O -thiophenylmethyl modificatie ) Vormt de focus van deze studie. De sequenties werden gekozen om de kwantificering en meting van RNA-strengen mogelijk te maken als enkele strengen, of als hun corresponderende duplexstructuren (geen andere secundaire structuren werden voorgesteld als thermodynamisch stabiel). CD werd gebruikt om de structurele parameters te bepalen, dwz duplexvorming en thermische denaturatieovergangen.
Synthese
De algemene werkwijze voor het verkrijgen van deze oligonucleotiden is geïllustreerd in Figuur 1 en volgt de stapsgewijze werkwijze: geautomatiseerde vaste-fase synthese → DeprOtectie → zuivering → kwantificering → karakterisering. Figuur 2 toont de monomeereenheden die nodig zijn in deze procedure. De vaste-fase synthese van RNA is vergelijkbaar met die van DNA, omdat het gebaseerd is op fosforamidietchemie ( Figuur 2 , links) en het gebruik van base-labiele beschermende groepen voor de nucleofiele exocyclische aminen op G, A en C, bijvoorbeeld , Acetyl, benzoyl, fenoxyacetyl, t- butyl of N , N- dimethylformamide ( Figuur 2 , rechts). Nog een aspect om te overwegen in RNA, door de aanwezigheid van de C2'-OH groep (ontbreekt in de deoxyoligonucleotide biopolymeren), is de aanvullende stap die moet worden opgenomen voor de bescherming en de daaropvolgende afbescherming van deze nucleofiele positie. In dit opzicht zijn silicium gebaseerde beschermende groepen uitgegroeid tot een aantrekkelijke strategie door hun potentieel als biorthogonale delen (specificallY beschermd in aanwezigheid van fluoride), met de tert- butyldimethylsilyl (TBDMS) en triisopropylsilyloxymethyl (TOM) groepen als populaire keuzes ( Figuur 2 , linksonder).
In dit werk werd de geautomatiseerde synthese uitgevoerd op een DNA / RNA synthesizer die standaard fosforamidietchemie gebruikt. De fabrikantinstellingen op het instrument omvatten een geautomatiseerde verdunningsstap bij het gebruik van de commerciële versies van de fosforamidieten voor DNA, of de mogelijkheid om te verdunnen bij volumes die door de gebruiker zijn ingesteld. We hebben echter besloten om het RNA fosforamidiet te wegen en handmatig te verdunnen, omdat: 1) de prijs van de kanonische fosforamidieten van RNA hoger is (in sommige gevallen tot 50 keer duurder); 2) de gemodificeerde fosforamidieten worden vaak in kleine hoeveelheden verkregen; En 3) het bedrag van verspild materiaal bij gebruik van een geautomatiseerde verdunningsstap (ingesteld door fabrikant) is groot. Daarnaast hebben we gebruikt: 1) in de handel verkrijgbare vaste steunen( Bijv . CPG) die een beschermde nucleobase bevat om als het 3'-einde te functioneren; En 2) commerciële fosforamidieten (kanonieke nucleobasen) beschermd met een TBDMS-groep op de C2'- O- positie. De gedetailleerde lijst van de synthese stappen wordt verschaft in Figuur 3 en Tabel 1 , samen met verdere beschrijving en opmerkingen voor stappen die zijn aangepast voor de RNA synthese. Figuur 4 illustreert verder de stapsgewijze opbrengsten die worden waargenomen voor elke stap na het selecteren van de 'Trityl Monitor' optie, die de trityl kation kwantitatief vrijgegeven van elke detritylatiestap kwantificeert.
Het is op te merken dat typisch, in onze ervaring, de beperkende factor was het verkrijgen van de fosforamidiet die de gewenste modificatie bevat. Dat is de ontwikkeling van een synthetische methodologie die het mogelijk maakt om wijzigingen op geselecteerde locaties op te nemen. In dit rapport richten wij ons op deIncorporation van een gemodificeerd nucleotide waarvoor we de bijbehorende synthetische methodologie, de C2'- O- thiophenylmethylgroep hebben vastgesteld. Deze groep is klein in grootte en heeft geen invloed op de vaste-fase synthese op welke manier dan ook. Aangezien de opneming van deze groep in oligonucleotiden van RNA is gemeld, samen met structurele en thermodynamische parameters 4 , worden hierin geen aspecten van de organische synthese die leidt tot de gemodificeerde fosforamidieten beschreven.
Deprotectie, zuivering en karakterisering
De afbescherming van de exocyclische aminen en ß-cyanoethylgroepen komt in dezelfde stap als die van de splitsing van de CPG-hars voor. Wij hebben de gebruikelijke omstandigheden toegepast om de verkregen hars te verhitten in aanwezigheid van een waterige oplossing van AMA, gevolgd door splitsing van de C2'- O- silylgroepen in aanwezigheid van fluorideionen en vervolgens zuivering via gelelektroforese. Terwijl deze standaardomstandigheden vaak modificaties die labiel basische omstandigheden of fluoride-ionen mildere omstandigheden 13, 14, bijvoorbeeld methanol / kaliumcarbonaat (MeOH / K 2 CO 3) of butylamine nodig zijn geworden. Zo is een andere groep beschermende groepen op de overeenkomstige fosforamidieten nodig. Verder hebben we gekozen voor elektroforese als het voorkeursalternatief om de beschermde oligomeren te zuiveren, gezien onze vorige ervaring met deze methode en het gebrek aan andere instrumenten. HPLC kan echter alternatief gebruikt worden als een effectieve methode 15 . Karakterisering van de gezuiverde oligonucleotiden werd uitgevoerd via massaspectrometrie, matrix geassisteerde laser desorptie / ionisatietijd van de vlucht (MALDI-TOF), onder toepassing van een gerapporteerde procedure door onze groep 16 .
Structurele karakterisering en daarbij Mal stabiliteit van de verkregen duplexen werden uitgevoerd via CD. Specifiek maken we gebruik van CD om de thermische denaturatieovergangen van gemodificeerde en ongewijzigde oligonucleotiden van RNA te bepalen door de afname van de ellipticiteit van de band te bepalen bij ca. 270 nm, evenals de verdwijning van de band (met negatieve ellipticiteit) met een A max bij 210 nm. Een spectra vergelijking voor en na hybridisatie wordt verschaft om hun verschillen te illustreren en de validatie van de werkmethodologie te verschaffen. Het gebruik van CD wordt algemeen geaccepteerd bij de bepaling van structurele motieven in nucleïnezuren en aminozuren 17 en kan derhalve worden gebruikt als hulpmiddel om diverse structurele en thermodynamische parameters 18 te bepalen ; Er zijn echter niet veel voorbeelden waar de techniek wordt gebruikt om thermische denaturatieovergangen te beoordelen. Sommige gevallen omvatten de bepaling van thermische stabiliteit op DNA dat G-quadruplexen bevatAss = "xref"> 19 , 20 of in duplexen en haarspelden van RNA 21 .
Dit rapport is bedoeld om de niet-deskundige lezer of kijker te voorzien van een aantal instrumenten die een goed begin van dit soort onderzoek mogelijk maken. Het zal dienen om te verbeteren en te vergelijken met methodologieën en technieken bij andere onderzoekslaboratoria die betrokken zijn bij deze opwindende wetenschapswetenschap. De inhoud van dit rapport voegt aan de bestaande protocollen van deze technologie uit verschillende bronnen toe, en verrijkt en vergemakkelijkt de ervaring met een visuele hulpmiddel voor elke stap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vaste-fasesynthese van RNA-oligonucleotiden
- Bereiding van oplossingen die elk fosforamidiet bevatten (tabel 1).
- Tel het aantal nucleotiden en pas in de n + 1 vergelijking (waar n = aantal nucleotiden) die overeenkomen met elke basis en vul de tabel in met de ontbrekende waarden. Volume = 0,15 ml per nucleotide bij een concentratie van 0,1 M, opgelost in watervrij acetonitril.
- Weeg elk fosforamidiet in ovengedroogde 10 ml amberflessen (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) en plaats onmiddellijk onder vacuüm met behulp van een droogmiddel die een droogmiddel bevat.
- Vul de droogmiddel met droog argon, verwijder de fles en verdun onmiddellijk met de bijbehorende hoeveelheid acetonitril (watervrij) voordat u het instrument vastzit.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u gasdichte spuiten gebruikt en te allen tijde een watervrije atmosfeer houdt. - Verwijder de septa uit de fles en plaats op de mAchine, via een flesveranderingsfunctie.
OPMERKING: dit proces vereist een extra 0,15 ml (vandaar het overtollige volume in de n + 1 vergelijking hierboven) van elke oplossing om de lijn voorafgaand aan de synthese te prikken.
- Opstelling van sequentie- en solidefasesynthese met behulp van de software ( Figuur 3 ).
- Klik op het software icoon ( bijv . OligoNet 1.0.1) en selecteer Instrument naam> OK . Maak een nieuwe synthese door Bestand> Nieuwe Synthese> Bestelling .
- Invullen: datum; RunID; Selecteer instrument; Volgorde naam; Sequentie (5'-tot-3'-einde). Onder | cyclus, toewijzen van de eerder gemaakte methode ( figuur 3 ). Kies de eindprocedure, ( laat oligonucleotide gebonden aan de CPG-hars)> handleiding.
- Selecteer DMT Off> (TCA behandeling in de laatste stap om een 5'-OH groep aan het einde van de synthese te verkrijgen) ; Bestand opslaan > Opslaan alsEn geef een naam voor het experiment.
- Verzend het bestand om de synthese te starten. Bestelling> Stuur bestelling naar synthesizer en selecteer kolom 1-4 . Open het synthesizervenster en kies trityl monitor | kies functie | trity> monitor elke stap .
- Herhaal de stappen als nodig, afhankelijk van het aantal gelijktijdige synthetische oligonucleotiden (let op dat alle orders dezelfde methode moeten hebben, dwz dezelfde koppeltijden en volgorde van gebeurtenissen).
- Begin de synthese synthesizer> Bereid je voor om te beginnen . Plaats de kolommen met het gewenste 3'-uiteinde op de posities die op het instrument zijn aangegeven. Klik op het instrument op Start> Nee (voor ABI voorbereiding).
- Zodra de synthese is voltooid, verwijder de kolom uit het instrument en plaats een rondbodemkolf, gevolgd door drogen onder verminderde druk gedurende ongeveer 0,5 uur.
OPMERKING: Het is aan te bevelen om te controleren of er een diep oranje kleur in rand is waargenomenOm koppelingen (stappen 1.2.4 - 1.2.7) om mogelijke fouten van de trityl monitor functie te vermijden.
- Deprotectie en zuivering van RNA-oligonucleotiden.
- Open de kolom door de zwarte dop te draaien en alle (of de helft, afhankelijk van de behoefte of het doel) van de witte hars in een 1,6 ml centrifugebuis over te brengen. Voeg 0,5 ml van een methylamine (40% in water) / ammoniak (40% in water) bij 1: 1 toe.
- Bevestig de centrifuge buisdop met parafilm en verwarm deze met 1,5 uur tot 60 ° C met een hitteblok.
OPMERKING: Een zwaar voorwerp kan bovenop de buis geplaatst worden om ervoor te zorgen dat de ammoniakconcentratie constant in de reactibuis blijft. - Verwijder van het hitteblok en langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Centrifugeer het monster kort om de inhoud te verdraaien, en plaats de supernatant over op een nieuwe centrifugebuis.
- Bevroren de monsters door onderwaterbuisjes in vloeibaar stikstof (of droogijs / ethanolbad) en concentreer tot droogte tijdens het spinnenIn een centrifuge onder verminderde druk.
- Re-suspender vaste stoffen in 0,4 ml triethylamine / N-methylpyrrolidinon / triethylamine-trihydrofluoride (2: 2: 3 verhouding) oplossing. Hitte tot 60 ° C gedurende 1,5 uur gevolgd door langzame koeling tot kamertemperatuur.
- Voeg 0,04 ml van een NaOAc oplossing (3M, pH 5,5 - aangepast met HC1) toe, gevolgd door zacht mengen met een pipetpunt. Voeg ethanol (1 ml) toe en afkoel tot ca. -70 ° C (droogijs / ethanolbad) gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer bij 15.000 rpm en 4 ° C gedurende 10 minuten. Gebruik een pipet om de aliquot te extraheren en de resulterende pellet te drogen onder verminderde druk.
- Re-suspender de verkregen vaste stof in laadbuffer (0,2 ml, 90% aq. Formamide, 1 mM EDTA) en meng tot het mengsel homogeen is.
- Laad suspensie op een eerder bereide polyacrylamidegel (20% denatureren, afmetingen van de put: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Breng een stroom door de gel aan tot de bromfenol blauwe marker tussen 1 / 2-2 / 3 ligtOnder de gel (gel afmetingen: ~ 21,5 cm x 30 cm).
- Verwijder de gel van de staander en plaats de gelinhoud van het glas naar plastic wrap (aan beide zijden bedekt) en plaats een dunne laagchromatografie (TLC) plaat bedekt met silica (bevattende fluorescerende kleurstof bij 254 nm) om de banden te visualiseren Gebruik van een UV-lamp (λ max = 254 nm).
- Gebruik een markering om de positie te definiëren waar de bovenband zich bevindt en snijd het met een nieuw scheermesje. Plaats gel die het RNA (zonder plastic wrap) bevat, in een 50 ml kegelbuis en druk op kleine stukken met een glazen staaf.
- Schors de gelresiduen in een NaCl aq. Oplossing (2 mM en 1 mM EDTA) en schud de suspensie bij 37 ° C gedurende 12 uur. Centrifugeer de conische buis gedurende 10 minuten.
- Afval door gebruik te maken van een omgekeerde fase C18 patroon.
- Bereid de cartridge op met een 10 ml spuit door te wassen met:
Acetonitril (10 ml)
H2O (tweemaal 10 ml)
5 mM NH4 Cl aq. Oplossing (3 ml)
Oplossing die RNA bevat, zorg ervoor dat geen van de gelresiduen wordt giet. - Was met H 2 O (driemaal, 10 ml).
- Uittreksel uit de kolom met behulp van een 60% aq. Methanol oplossing (3 ml)
- Bereid de cartridge op met een 10 ml spuit door te wassen met:
- Concentreer onder verminderde druk en heroplos in RNase-vrij water (0,3 ml)
- Bereid een verdunde oplossing (10 μL) op en plaats 1 μL op het UV-vis instrument ( bijv . Nanodrop) om het UV-vis spectrum (200-450 nm) te meten.
- Gebruik de wet van Beer Lambert om de concentratie van de verkregen oplossing te bepalen:
Waar A = verkregen absorptie; Ε = berekende molaire extinctiecoëfficiënt; C = concentratie en l = 0,1 voor een padlengte van 1 mm. - Bereken de molaire extinctiecoëfficiënten voor de oligonucleotiden; Hier berekend met een on line calculatorDie gebruik maakt van DINAMelt software (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- Concentratie bepaling en karakterisering via MALDI-TOF.
- Laad monsters op een MALDI plaat met behulp van een pipet tip geladen met een C18 tip om te ontzellen, en spot elke oligonucleotide.
- Was de tip met 50% acetonitril (10 μL x 2). Equilibreer de tip met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA; 10 μL x 2). Laadpunt met monster (typisch 100-150 pmol).
- Was de tip met 0,1% TFA (10 μL x 2), en daarna met water (10 μL x 2).
- Verwijder het monster in een oplossing die de gewenste matrix bevat; We gebruikten een oplossing van: 10 μl 25 mM-2,4,6-trihydroxyacetofenonmonohydraat (THAP), 10 mM ammoniumcitraat en 300 mM ammoniumfluoride in 50% acetonitril.
- Plaats direct op de MALDI-plaat door 0,9 μL te plaatsen (gevolgd door luchtdrogen) en herhaal eventueel de procedure.
OPMERKING: Alle spectra werden verkregen op de reflector positieve modus.
- Laad monsters op een MALDI plaat met behulp van een pipet tip geladen met een C18 tip om te ontzellen, en spot elke oligonucleotide.
2. RNA Structure Analysis via CD
- Voorbereiding van oplossingen voor CD.
- Bereid 0,25 ml bevattende het gemodificeerde RNA [3 uM], NaCl [10 mM], natriumfosfaat buffer [10 mM, pH 7,2] en MgCl2 [5 mM]. Het monster is klaar voor analyse zoals dat is, vooral als het een unimoleculaire overgang vertegenwoordigt.
- Als het doel is om duplexstructuren of bimoleculaire overgangen te analyseren, voegt u nu complement (1 molar equivalent, indien van toepassing), of ga verder met de onderstaande stap.
- Plaats het monster op een hitteblok, voorverwarmd tot 90 ° C, en zet de hitte uit om de lage koeling te regelen tot kamertemperatuur (typisch 2 - 4 uur).
- Spectra acquisitie
- Bereid een blanco-oplossing (NaCl 10 mM natriumfosfaat pH 7,3 10 mM, MgCl2 5 mM), overdracht tOa micro-cuvette (1 cm padlengte, 250 μL minimumvolume) en plaats op een houderpositie van de monsterwisselaar binnen het instrument.
- Plaats het monster met RNA in een andere microcuvette en plaats in de monsterwisselaar. Bij het meten van een thermische denaturatie-overgang, voeg een oliebedje zorgvuldig toe zonder de waterlaag te verstoren en de kap van de cuvette vast te zetten met een stuk Teflon tape.
- Open de stikstoftank om een stroom te geven die de luchtvlotter op het instrument beweegt naar ca. 40. Schakel de koeler in.
- Schakel het instrument in en open het software Spectra Manager icoon, en open het acquisitie venster Spectra Measurement .
- Vuil het instrument met stikstof gedurende 5 minuten voor de aankoop.
- Verkrijg de spectra met de volgende parameters Meet> Parameters en stel de parameters als volgt in:
- Onder Algemeen selecteert u: Scan 200-350 nm; Kanalen CD en HT: DataToonhoogte bij 0,1 nm; Scansnelheid bij 100 nm / min; Bandbreedte bij 1 nm; Aantal accumulaties bij 5.
- Kies onder de cel een temperatuur van 20 ° C. Onder controle wordt de sluiter geopend en automatisch gesloten. Kies onder informatie de naam, concentratie, operator.
- Ga onder de gegevens naar de gewenste map. Klik op OK .
- Verkrijg de spectrummeting > Sample meting , plaats de positie (s) van de cuvetten in de sample-wisselaar 1-6 en klik op OK .
- Bij het nemen van een thermische denaturatie-overgang:
- Sluit Acquisitie software Bestand> Sluit een nieuw programma op en open een variabele Temperatuurmeting> Meet> Parameters .
- Pas de volgende parameters aan om een thermische overgang op te nemen, die als gewenst kan worden aangepast:
- Selecteer onder Temperatuur de starttemperatuur: 4 ° C; Interval: 0,2; taRget: 90 ° C; Gradiënt: 1 ° C / min; Wacht 0 s. Onder Start / Einde selecteert u Start conditie en eindtoestand zoals gewenst.
- Onder Algemeen selecteert u 3 kanalen, CD / HT / Abs; Bandbreedte: 1 nm; Golflengte: 270 nm (of als gewenst). Under Control, niets selecteren. Selecteer onder Informatie , naam, concentratie, operator.
- Ga onder de gegevens naar de gewenste map. Klik op OK .
- Koel monsters tot 4 ° C en wacht 5 minuten bij deze temperatuur voordat u een spectrummeting krijgt.
- Data work-up voor spectra.
- Met behulp van de functie op de software trekt u het lege spectrum van de doelverwerving af om rekening te houden met achtergrondsignalen die voortvloeien uit het buffersysteem dat in gebruik is: Spectra Analyse> Bestand> Open .
- Zodra een leeg bestand en een spectrabestand zijn geopend, sleept u View 2 onder View 1 (aan de linkerkant van het scherm).
- Klik op PrOverdragen> aftrekken> OK of uitwisseling van gegevens> OK .
- Extract data als een ASCII-bestand: Bestand> Exporteer en selecteer ASCII .
- Gebruik software om het overeenkomstige spectrum te plotten. Verlenging van data is optioneel in gevallen waarin de signaal-ruisverhouding lager is dan verwacht. Deze transformatie kan worden toegepast door de gladde data-optie toe te passen.
- Data work-up voor thermische denaturatie transities.
- Extract data uit het JASCO bestand als een ASCII bestand.
- Bepaal de ellipticiteitspunten als functie van de temperatuur. Typisch is het vergemakkelijken van de data noodzakelijk, afhankelijk van de golflengte die wordt onderzocht. In sommige gevallen vertoonde het gebruik van de golflengte bij 210 nm grotere variaties tussen percelen die vereffening vereisen. Afhankelijk van het monster en de concentraties werden echter een aantal berekeningen uitgevoerd met behulp van de rauwe data.
- Om de thermische deksel te berekenenaturation transities (Tm) waarde verkrijgen van een eerste afgeleide van de kromme. De maxima of minima waren een indicatie van deze parameter. Zoals in de vorige stap, vereisen sommige gevallen dat de gegevens vergemakkelijkt werden om de meest nauwkeurige waarde te verkrijgen.
OPMERKING: Experimenten werden typisch uitgevoerd in triplicaat, wat resulteerde in de bijbehorende gemiddelde en standaardafwijking voor de meting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De synthese van RNA-dodecamers die nul-, een- of twee-2-thiophenylmethyl-modificaties bij de C2'- O- positie bevatten, wordt samen met zijn overeenkomstige zuivering en karakterisering beschreven. Verder is een gedetailleerde beschrijving van de structurele analyse die via CD is uitgevoerd, opgenomen.
De vier strengen van RNA (inclusief een streng met een complementaire sequentie) werden verkregen door middel van vaste fase synthese, die werd gevolgd door een zuiveringsopbrengst tussen 300-700 nmol van elk oligonucleotide. Massaspectrometrie werd uitgevoerd door het afsplitsen van ~ 150 pmol van elk monster en vervolgens op een plaat te deponeren voor MALDI-TOF analyse ( Figuur 5 ). Kwantificering werd uitgevoerd via ultraviolette fotometrische analyse van elke oplossing, terwijl CD werd gebruikt om de vorming van duplexstructuren te identificeren en hun corresponderende T m te registreren. Geen duidelijk verschil wordt waargenomen tussen canonische en gemodificeerde oligonucleotiden via UV-vis spectroscopie, of het vergelijken van enkelstrengige monsters of duplexstructuren vergelijkt. Er worden echter kleine wijzigingen waargenomen bij het meten van hun CD spectra ( Figuur 6 ). Bovendien, Tm metingen van de drie duplex structuren vertoonden een duidelijke waarde die indicatief is voor de destabilisatie veroorzaakt door de inbouw van de 2'-O-thiofenylmethyl modificatie op één van de strengen werd.
Figuur 1 : Procedure om RNA-strengen te verkrijgen. Solid-fase cyclus met behulp van CPG als de vaste drager en 5-ethylthiotetrazol als de activator: ( i ) detritylation; ( Ii ) koppeling; ( Iii ) oxidatie; Iv ) capping en op nieuwe cyclus; Om de overeenkomst te gevenDing oligonucleotide ( v ) ondersteund op de CPG hars en die alle beschermende groepen bevat; En de daaropvolgende afbescherming in aanwezigheid van base en fluoride ( vi ) om het uiteindelijke RNA-oligonucleotide te leveren voor verdere analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Structuren van fosforamidieten en beschermende groepen. De chemische structuur van de fosforamidiet bevattende silyl gebaseerde C2'- O- groepen en base labiele groepen op de exocyclische aminen van A, G en C. De O- TBDMS groep werd in deze studie gebruikt. Klik hier om een groter versio te bekijkenN van deze figuur.
Figuur 3 : Stepwise Synthesis of Correspondent Oligonucleotides. De cyclus werd bewerkt zoals getoond en een toets voor de gebruikte codes en stromingssnelheden wordt rechts weergegeven. De stapsgewijze synthese werd geplakt van de software die wordt aangeboden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Vertegenwoordiging van de verkregen opbrengsten en het volgen van individuele koppelingen. Het getoonde voorbeeld is aangepast aan de synthese van het complement om een typische oligonucleotide synthes te tonenis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 : MS van oligonucleotiden (ON) 1-3. MALDI-TOF van ON 1 - 3 (boven naar beneden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 : CD-spectra van enkel- en dubbelstrengs RNA, Canonical en Modified. CD spectra van monsters die nul ( 1 , A), één ( 2 , B) of twee bevatten (
Tabel 1: Berekening van fosforamidietoplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit manuscript is om als gids te dienen voor onderzoekers op het gebied, beginner of deskundige, om succesvol het bereiken of verbeteren van de synthese van oligonucleotiden van DNA of RNA. De beschreven methodologie richt zich op het gebruik van vaste-fase synthese door gebruik te maken van een geautomatiseerde DNA / RNA synthesizer via standaard fosforamidiet chemie. Het rapport beschrijft een stap-voor-stap afbeelding van de synthese, zuivering en karakterisering van RNA dodecamers. Daarnaast wordt het gebruik van CD gebruikt om secundaire structurele motieven en thermische denaturatieovergangen te identificeren.
Het is belangrijk om op te merken dat dit werk kan worden aangepast aan andere omstandigheden, dwz verschillende merken van apparatuur, wijzigingen, beschermende groepen en / of reagentia in de vaste-fase synthese. Daarom kan verbetering worden bereikt bij het veranderen van één of meer van de vele parameters die bij dit proces betrokken zijn of door aanpassingen in de reactieomstandigheden. ikN aanvulling, wordt de gedetailleerde structurele analyse hierin (via CD) verwacht een alternatieve benadering van onderzoekers op dit gebied te verschaffen, die typisch analoge analyses via UV-vis uitvoeren.
De berekeningen om de massa's van de fosforamidieten vast te stellen voor de vaste-fase-synthese werden gebaseerd op de onderstaande sequenties, en de vier oligonucleotiden werden bereid en gezuiverd op dezelfde run (onderstreepte posities wijzen op de aanwezigheid van een 2'- O- thiophenylmethylmodificatie) . Alle berekeningen en waarden zijn opgenomen in tabel 1
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
Misschien is het belangrijkste aspect bij het behandelen van RNA betrekking op de gevoeligheid ervan tegen de afbraak door ribonucleasen, en zijn eHydrolyse onder waterige oplossingen ondergaan en in aanwezigheid van metaalionen 24 . Derhalve moeten RNase-vrije condities ten alle tijden 25 worden afgedwongen 25, zoals hierna volgt: 1) al water werd autoclaaf in aanwezigheid van diethylpyrocarbonaat (0,1% w / v, DEPC); 2) alle glaswerk was autoclaaf, in een oven (150 ° C, overnacht) gebakken, en gespoeld met DEPC behandeld water; 3) alle buizen en pipet tips zijn gekocht van fabrikanten in hun RNase-vrije vorm; 4) handschoenen werden te allen tijde gebruikt en het werk werd uitgevoerd in een aangewezen kap; En 5) alle oppervlakken en uitrusting werden voortdurend gedroogd met RNase-ontsmettingsoplossingen die verkrijgbaar zijn bij diverse fabrikanten. Alle gezuiverde RNA's werden verdeeld in kleine porties en opgeslagen bij -20 ° C of -80 ° C, afhankelijk van de gebruiksfrequentie, terwijl ongeklede of onzuiverde harsen bij 20 ° C werden opgeslagen. Zoals we eerder hebben aangegeven 16 , oligonucleotiDes verkregen op de hierin beschreven wijze en in maten tussen 10-34 nucleotiden lang een hogere stabiliteit vertonen dan andere rapporten 26 . Daarom wordt de lezer verwezen naar andere opslagprocedures bij het verwerken van langer RNA's 27 .
De stapsgewijze opbrengsten (berekend via de detritylationstap) in de geautomatiseerde synthese waren tussen 97-100% en zijn een indicatie van goede koppelingsdoeltreffendheden, in het bijzonder van die welke zijn gemodificeerd. Totale opbrengsten van 30 - 75% werden verkregen na splitsing uit de hars, deprotectie en zuivering ( via gelelektroforese), die overeenkomen met ~ 300 - 750 nmol geïsoleerde oligonucleotiden. Op overeenkomstige wijze heeft de integratie van de modificaties geen invloed gehad op de totale opbrengst van de RNA-strengen. Hoewel deze reeksen als aanvaardbare hoeveelheden kunnen worden beschouwd, is de synthese van oligonucleotiden groter dan ~ 50 nucleotiden (vorige, ongepubliceerde data in ons laboratorium) Kan significant beïnvloed worden door stapsgewijs rendementen onder 98%. Zodoende moeten bepaalde voorzorgsmaatregelen genomen worden indien strengen groter dan 50 nucleotiden gewenst zijn, bijvoorbeeld de bron van het acetonitril naar hogere kwaliteit wijzigen, de tijd van blootstelling van de fosforamidieten in de atmosfeer minimaliseren, het instrument programmeren om de fosforamidieten te verdunnen tot een set Waarde tijdens het gebruik van nieuwe flessen van de kanonische fosforamidieten elke keer, gebruik HPLC zuivering in plaats van elektroforetische analyse en / of gebruik mildere ontbeschermingsomstandigheden.
Massaspectra (MALDI-TOF MS) voor alle oligonucleotiden werden uitgevoerd in een positieve modus op een ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF massaspectrometer. Alle monsters werden bereid met de werkwijze hierin en voorbeelden van de spectra voor ON 1 beschreven - 3 zijn weergegeven in figuur 5.
Alle experimenten worden typisch uitgevoerd in triplicate. Alle spectra en experimentele opstelling werden uitgevoerd op een spectropolarimeter uitgerust met een rechthoekige 6-cel houder. Alle glaswerk was gewassen met een RNase verwijderingsoplossing en grondig gespoeld met RNase-vrij water. Alle monsters werden weggegooid na elke meting. Het is belangrijk om erop te wijzen dat op de hoogspanningspanning nauwkeurig aandacht moet worden besteed (HT is een parameter die door het instrument wordt gemeten). Dit kan een indicatie zijn van de verzadiging in het signaal en vormt derhalve een bedreiging voor de juistheid en validiteit van de gegevens. Deze parameter is monsterafhankelijk en dient zodanig te worden gehouden dat het signaal op elk gewenst moment niet hoger is dan 500 mV. Voorbeelden voor CD-spectra verkregen vóór en na hybridisatie van ON 1 - 3 zijn weergegeven in Figuur 6 .
Bovendien verhoogt de concentratie in de natriumzouten (en andere buffersystemen), of met behulp van andere buffersystemen, Bijvoorbeeld HEPES, of MOPS, resulteert in verhoogde geluiden onder 220 nm. Aangezien de band bij 210 nm van bijzonder belang is om de vorming van een A-vorm duplex te volgen, werd de maximale concentratie in natriumionen gehouden tot ~ 10 mM.
We tonen ook aan dat het gebruik van CD dezelfde parameters geeft als die die worden verkregen uit ultraviolette spectroscopie. Ten slotte beschrijven en illustreren we de procedure voor het synthetiseren, zuiveren en karakteriseren van gemodificeerde en ongewijzigde RNA oligonucleotiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Voorbereiding van dit manuscript werd ondersteund via start-up fondsen van de Universiteit van Colorado Denver (JMRE). AF zou graag willen steunen van een award voor onderzoek en creatieve activiteiten (RaCAS, CU Denver). Financiering van het Bureau van Onderzoeksdiensten, Universiteit van Colorado Denver om publicatiekosten te dekken, wordt erkend. Wij danken de leden van het lab mevrouw cassandra herbert en meneer yannick k. dzowo voor hun bijdragen in het videogedeelte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).
