ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
मात्रात्मक मानव प्राकृतिक किलर कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह cytometry-आधारित विधि यहाँ दिखाया गया है।
Abstract
सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर, effector लिम्फोसाइटों प्राकृतिक हत्यारा (एन. के.) कक्षों के रूप में जाना जाता है एक आवश्यक भूमिका न्यायपालिका कोशिकाओं के खिलाफ विशेष रूप से टुमोरल को नष्ट करने और virally संक्रमित कोशिकाओं, में होस्ट रक्षा खेल। लगभग 30 ज्ञात monogenic दोष, अन्य रोग स्थितियों की एक मेजबान के साथ पैदा में प्रकट या तो कार्यात्मक या क्लासिक एन सेल की कमी, कम या अनुपस्थित साइटोटोक्सिक गतिविधि। ऐतिहासिक दृष्टि से, cytotoxicity रेडियोधर्मी विधियों, जो बोझिल, महंगे और संभावित रूप से खतरनाक हैं के साथ जांच की गई है। यह आलेख एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि मात्रा ठहराना करने के लिए एक सुव्यवस्थित, चिकित्सकीय लागू प्रवाह cytometry-आधारित विधि का वर्णन करता है। इस परख में, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) या शुद्ध एन सेल तैयारी एन सेल-मध्यस्थता cytotoxicity करने के लिए (NKCC) संवेदनशील हो जाना एक लक्ष्य ट्यूमर कोशिका लाइन के साथ सह-अलग अनुपात में incubated हैं। लक्ष्य कक्ष पूर्व उनके भेदभाव effector कोशिकाओं (एन. के. कोशिकाओं) से अनुमति देने के लिए एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किए गए हैं। ऊष्मायन अवधि के बाद, मारे गए लक्ष्य कक्ष एक न्यूक्लिक अम्ल दाग, जो विशेष रूप से व्याप्त मृत कोशिकाओं द्वारा पहचाने जाते हैं। इस विधि दोनों नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों और, प्रवाह cytometry की मल्टी-पैरामीटर क्षमताओं करने के लिए धन्यवाद करने के लिए उत्तरदायी है, संभवतः एन सेल phenotype और समारोह के एक गहरे विश्लेषण को सक्षम करने के जोड़ा लाभ है।
Introduction
प्राकृतिक हत्यारा (एन) कोशिकाओं मानव सहज लिम्फोसाइटों गंभीर virally संक्रमित कोशिकाओं, रूपांतरित कोशिकाओं, और अन्य रोगजनक खतरों 1,2के उन्मूलन में शामिल का एक परिष्कृत सबसेट हैं। एन सेल lytic granules साइटोटोक्सिक प्रोटीन, perforin और granzymes जैसे घर। सक्रियण पर, एन. के. कोशिकाओं प्रत्यक्ष लक्ष्य सेल lysis और apoptosis, cytokine और chemokine रिलीज के साथ में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse, जिसके तहत इन cytolytic अणुओं स्थानीय रूप से रिलीज़ किए गए हैं, के रूप में जाना जाता है अपने लक्ष्य के साथ एक जटिल सहभागिता फार्म और अंततः एक सूजन की प्रेरण में 1,3,4राज्य।
एन सेल सक्रियण को सक्रिय करने की एक जटिल स्ट्रिंग शामिल है और एन. के. बीच निरोधात्मक बातचीत कक्ष रिसेप्टर्स और ligands लक्ष्य कोशिकाओं, एक कसकर नियंत्रित प्रणाली बनाने की सतह पर व्यक्त की। एन सेल सक्रियण के सबसे अधिक अध्ययन तंत्र में से एक 'अनुपलब्ध स्व' है। वास्तव में, मैं histocompatibility जटिल (MHC), या मानव श्वेताणु प्रतिजन (एचएलए) अणुओं, पर प्रमुख वर्ग का पता लगाने की कमी संक्रमित या कोशिकाओं ट्रिगर्स एन सेल cytotoxicity में तब्दील हो। ट्यूमर और वायरस-संक्रमित कोशिकाओं आम तौर पर downregulate टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा, इस प्रकार प्राथमिक NK बनने से बचने के लिए इन एंटीजन सेल लक्ष्य 1,3,4।
एन. के. cell फ़ंक्शन का मूल्यांकन degranulation या cytotoxicity में मुख्य रूप से वर्गीकृत है assays. हालांकि, degranulation assays, प्रवाह cytometric degranulation जुड़े मार्कर CD107a, का पता लगाने जैसे केवल सांकेतिक एन सेल सक्रियण और उनके परम काम, लक्ष्य कक्षों के 5,6,7,8सीधा हत्या का नहीं है। इसलिए, इस सीमा के जांचकर्ताओं cytotoxicity assays करने के लिए एक अधिक कह और अधिक प्रत्यक्ष विकल्प के रूप में आकर्षित किया है।
लंबे समय तक "गोल्ड सेल-मध्यस्थता साइटोटोक्सिक गतिविधि दोनों टी और एन. के. कोशिकाओं का आकलन करने के लिए मानक" क्रोमियम रिलीज परख (सीआरए) है। सीआरए radioactively 51Cr के साथ लक्ष्य कक्षों की लेबलिंग और उन्हें effector कोशिकाओं के साथ सह incubating शामिल है। इस परख प्रोटीन-बाउंड का 51करोड़ तैरनेवाला, जो गामा की गिनती द्वारा मापा जा सकता है में रिलीज में परिणाम है कि सेल lysis सिद्धांत में डूबी है। इस परख, प्रभावी है, जबकि विभिन्न कारणों के लिए समस्याग्रस्त है: उच्च सामग्री लागत, हैंडलिंग और रेडियोधर्मी 51करोड़ का निपटान, 51करोड़ की सहज रिहाई और मुश्किल मानकीकरण - यह पूरी तरह अव्यावहारिक 9,10बनाने।
गैर-रेडियोधर्मी assays, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, एंजाइम रिलीज, और यहां तक कि bioluminescence, शामिल की एक संख्या के बाद से सीआरए 11,12,13,14करने के लिए विकल्प के रूप में विकसित किया गया है। हम यहाँ सरल, संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि पर K562 लक्ष्य कक्षों की माप के लिए एक प्रवाह cytometry-आधारित विधि का वर्णन। एक मानव erythroleukemic सेल लाइन एचएलए वर्ग की कम अभिव्यक्ति के साथ मैं और जो उन्हें एन सेल-मध्यस्थता cytotoxicity 15करने के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील बनाता है बढ़ अभिव्यक्ति activatory NK रिसेप्टर्स, के लिए ligands की K562 कोशिकाओं रहे हैं। इस परख में K562 कोशिकाओं carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ पूर्व लेबल किए गए हैं और या तो परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) के साथ विभिन्न अनुपात में सह-सुसंस्कृत या एन. के. कोशिकाओं 1शुद्ध। CFSE भेदभाव effector एन. के. कोशिकाओं 16,17से लक्ष्य कक्षों की अनुमति देता है एक स्थिर, प्रोटीन-बाइंडिंग फ्लोरोसेंट रंजक है। सह ऊष्मायन के बाद, विशेष रूप से मृत कोशिकाओं की झिल्ली permeating, एक न्यूक्लिक अम्ल दाग (सामग्री की तालिका देखें) मारे गए लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। नमूने तो मृत (यानी, दाग +) का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर प्राप्त कर रहे हैं CFSE + लक्ष्य कोशिकाओं।
इस परख monogenic दोष लगभग 30 ज्ञात दोष एन सेल की कमी या तो कार्यात्मक या क्लासिक के कारण हैं, जो की एन सेल डिब्बे, को प्रभावित करने के लिए और प्राथमिक या द्वितीयक hemophagocytic lymphohistiocytosis के लिए एक नियमित नैदानिक जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। यह भी बारम्बार, गंभीर दाद वायरल संक्रमण प्रतिरक्षा पुनर्गठन hematopoietic कोशिका प्रत्यारोपण या पोस्ट प्रतिरक्षण निश्चायक थेरेपी 18,19,20, के बाद का मूल्यांकन करने के लिए, के साथ और बुनियादी अनुसंधान अनुप्रयोगों के एक मेजबान के लिए रोगियों में एन सेल गतिविधि की जांच करने के लिए उपयोगी है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
परख अप सेट करने से पहले, यह उच्च अनुशंसित है कि एन सेल सामग्री पसंद की effector जनसंख्या में मूल्यांकन किया। चित्रा 1 से पता चलता है एक ठेठ CD56 धुंधला हो (पहले हल्का नीला) और (लाल) एन सेल संवर्धन के बाद। एन. के. कोशिकाओं अप करने के लिए 15% PBMCs के समावेश और संवर्धन के बाद कम से कम 80% शुद्ध होना चाहिए।
इस परख में प्रवाह cytometric विश्लेषण शामिल है दो पैरामीटर का पता लगाने: CFSE, FITC; के रूप में एक ही चैनल में detectable और एक मृत सेल दाग, APC (चित्रा 2 एबी) के रूप में एक ही चैनल में detectable. डाटा अधिग्रहण के बाद, गेटिंग रणनीति चित्रा 2 में डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है। मृत (यानी, मृत सेल दाग +) K562 लक्ष्य कक्ष उपलब्ध कराने के लक्ष्य की गई आबादी के भीतर मारे गए कक्षों की % CFSE + जनसंख्या, बाहर gated हैं।
नियंत्रण की स्थिति ही है और इसके अलग-अलग घटकों की परख प्रभावशीलता सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण हैं। निम्न नियंत्रण की स्थिति में (6-8) मान्य माना जाता हो करने के लिए परख के लिए आदेश में, उम्मीद की जानी चाहिए: लक्ष्य कक्ष केवल (शर्त 6) कोशिका मृत्यु में परिणाम चाहिए < 15% (चित्र 3A)। कोई CFSE संकेत के लिए effector कोशिकाओं केवल (हालत 7), और कोशिका मृत्यु होना चाहिए नहीं पाया जा चाहिए < 5% (चित्र 3 ख)। के बीच मध्यस्थता की हत्या लक्ष्य कक्षों (हालत 8) के लिए, कोशिका मृत्यु होना चाहिए > 85% (आंकड़ा 3C)।
एन सेल समारोह में दोष के साथ एक रोगी की हत्या गतिविधि में सबसे कम है की उम्मीद है या सभी अनुपात एक स्वस्थ व्यक्ति की तुलना में परीक्षण किया। स्वस्थ दाता और चित्रा 4 में रोगी कोशिकाओं के समानांतर effector-लक्ष्य कक्ष अनुपात को कम के साथ लक्ष्य कोशिका मृत्यु में अंतर, महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है।
आकृति 1: NK effector जनसंख्या के भीतर कक्ष की सामग्री का आकलन. धुंधला के बाद प्रतिनिधि हिस्टोग्राम PBMCs (हल्का नीला) कुल या एन. के. कोशिकाओं (लाल) CD56 के लिए शुद्ध। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: लक्ष्य कक्षों का पता लगाने के लिए रणनीति Gating. A) प्रारंभिक गेट एक FITC-A/SSC-A साजिश में सेट किया गया है। K562 कोशिकाओं के रूप में की घटनाओं CFSE + gated हैं। B) मृत K562 कोशिकाओं (यानी, मृत सेल के लिए सकारात्मक दाग) CFSE + लक्ष्य कोशिका जनसंख्या के भीतर क्रमिक APC-A/SSC-A साजिश में gated हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रतिनिधि डेटा नियंत्रण स्थितियों के लिए. ए) के मृत सेल दाग + K562 प्रतिशत कोशिकाओं (में चित्र 2के रूप में रणनीति gating) CFSE + गेट के भीतर हालत 6 में (लक्ष्य केवल कक्ष) - नकारात्मक नियंत्रण K562 कोशिका मृत्यु के लिए। B) CFSE और मृत सेल दाग हालत 7 में पता लगाना (effector कोशिकाओं को केवल - कुल PBMCs)। C) के मृत सेल दाग + K562 प्रतिशत कोशिकाओं (में चित्र 2के रूप में रणनीति gating) CFSE + गेट के भीतर हालत 8 में (लक्ष्य कक्षों + बीच) - सकारात्मक नियंत्रण K562 कोशिका मृत्यु के लिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: कमजोर पड़ने के प्रभाव विभिन्न effector-लक्ष्य कक्ष अनुपात के लिए प्रतिनिधि डेटा. परीक्षण effector: लक्ष्य कक्ष अनुपात इस प्रकार हैं: 50: 1, आपके; 12.5: 1; 6.25:1. डेटा हैं पृष्ठभूमि (हालत #6)-निकाल दिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नमूना | हालत | Effector (E): लक्ष्य (T) |
| PBMCs | 1 - एन सेल cytotoxicity के लिए सकारात्मक नियंत्रण | 50:1 + IL-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | T केवल | |
| 7 - K562 मौत के लिए नकारात्मक नियंत्रण | E केवल | |
| 8 - K562 मौत के लिए सकारात्मक नियंत्रण | T + बीच | |
| एन. के. कोशिकाओं (शुद्ध) | 1 - एन सेल cytotoxicity के लिए सकारात्मक नियंत्रण | 5:1 + IL-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0.625: 1 | |
| 6 | T केवल | |
| 7 - K562 मौत के लिए नकारात्मक नियंत्रण | E केवल | |
| 8 - K562 मौत के लिए सकारात्मक नियंत्रण | T + बीच |
तालिका 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित विधि एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि का आकलन करने के लिए पारंपरिक 51करोड़ रिलीज परख के लिए एक सीधा और लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। इस विधि संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और पिछले मानक विधियों, CRA, की तरह से कम समय लेने वाली और नैदानिक दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं और अनुप्रयोग अनुसंधान।
परख कुल PBMCs और समृद्ध एन. के. कोशिकाओं के साथ काम करता है, जबकि PBMCs सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए की आवश्यकता के बिना का उपयोग करने के लिए विकल्प है एक महान लाभ से मरीजों के नमूने एकत्र रक्त या कुछ या गरीब गुणवत्ता की कोशिकाओं के छोटे संस्करणों के साथ काम करते हैं। इस परख केवल CFSE और मृत सेल अपवर्जन व्यवहार्यता दाग का इस्तेमाल करता है। इन दो मापदंडों पर अकेला देख संक्षिप्त और पर्याप्त जानकारी आगे प्रवाह cytometric विश्लेषण में मुआवजा नहीं की आवश्यकता का जोड़ा लाभ के साथ नैदानिक प्रयोजनों के लिए प्रदान करता है।
इस विधि भी बुनियादी NK कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन और उपन्यास एन सेल-लक्षित चिकित्सा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस संबंध में, यह परख, multiparameter विश्लेषण एन. के. कोशिकाओं और उनकी गतिविधियों के लिए नहीं assays सीआरए की तरह के साथ पहले संभव अनुमति देने के लिए बहुमुखी प्रतिभा का एक अमूल्य तत्व प्रवाह cytometers की कभी विस्तार क्षमताओं परिचय। वैकल्पिक सेल ट्रैकिंग और व्यवहार्यता रंजक, अन्य चैनलों में, fluorescing जांचकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए उपलब्ध हैं।
इस प्रोटोकॉल prototypical एन सेल लक्ष्य K562 कोशिका पंक्ति के साथ उपयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हालांकि, यह वैकल्पिक निलंबन लक्ष्य सेल लाइनों के लिए एन सेल cytotoxicity, HL-60, Daudi, U937 और Raji जैसे करने के लिए संवेदनशीलता की डिग्री बदलती के साथ अनुकूलित किया जा सकता। इस संबंध में, यह ध्यान दें कि विभिन्न सेल लाइनों को प्रतिदीप्त लेबल अलग है, और प्रत्येक प्रवाह cytometer के लिए ले सकता है के रूप में और सीरम सेल लक्ष्य लेबलिंग के दौरान इस्तेमाल किया फ्लोरिसेंट डाई की एकाग्रता प्रत्येक लक्ष्य सेल पंक्ति के लिए, अनुकूलित किया जा करने के लिए है हो सकता है के लिए महत्वपूर्ण है। यह आम तौर पर सीरम के दौरान लेबल का उपयोग कर से बचने के लिए सिफारिश की है, जबकि हम मामूली FBS 0.5% के साथ दो कारणों के लिए शमन के लिए चुना। सबसे पहले, यह लक्ष्य सेल तनाव को कम करने में मदद करता है और इस प्रकार पृष्ठभूमि दाग; दूसरा, यह दैनिक सेटिंग्स समायोजन, परख का reproducibility व्यक्ति में इस प्रकार सहायता की आवश्यकता के बिना हमारे प्रवाह cytometer का पता लगाने की उचित सीमा के भीतर CFSE संकेत लाता है। अतिरिक्त प्रोटोकॉल रूपों अलग E:T अनुपात और ऊष्मायन बार परख विभिन्न सक्रियकरण की स्थिति के लिए अनुकूलित करने के लिए परीक्षण शामिल हो सकता है। हालांकि लंबी अवधि में वृद्धि सहज रिलीज 9,16परिणाम करते हैं effector और एन. के. cytotoxicity का परीक्षण करने के लिए लक्ष्य कक्षों की सह संस्कृति की अवधि 4-16 ज से, ऐतिहासिक रूप से बताया गया है। इन फ्लोरोसेंट रंजक कोशिका विभाजन पर पतला कर रहे हैं के रूप में हमारे विधि में, अब इन्क्यूबेशन भी फ्लोरोसेंट हत्या या प्रसार, कारण लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा लेबलिंग की हानि में परिणाम हो सकता है। इस प्रकार, incubations समय विंडो के निचले अंत में आम तौर पर पसंद कर रहे हैं और वे रात भर ऊष्मायन 6,16,22से अधिक नहीं होनी चाहिए।
यह ध्यान दें की जो को प्रभावित कर सकते हैं चर संभावित रूप से इस परख के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, K562 लक्ष्य कक्ष तापमान परिवर्तन करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं। इसलिए, K562 कक्षों चाहिए प्रशीतित लेकिन बल्कि कमरे के तापमान पर रखा या नहीं उनके उपयोग से पहले 37 ° C पर एक humidified CO2 इनक्यूबेटर में रखा गया। एक ही कारण के लिए, सभी अभिकर्मकों के लिए उपयुक्त तापमान प्रोटोकॉल में दर्शाई के रूप में लाया जाना चाहिए। इन कोशिकाओं को प्रभावित करने वाले किसी अन्य पैरामीटर होते हैं गति, जो सेलुलर तनाव को कम करने के लिए कम किया जाना चाहिए है। इसके अलावा, सीमित effector/लक्ष्य तैयार करने और कम से कम 30 मिनट के लिए सह ऊष्मायन की शुरुआत के बीच अंतराल समय अधिक से अधिक हत्या गतिविधि को सुनिश्चित करने और reproducibility की परख करने के लिए आवश्यक है। CFSE संकेत आम तौर पर मजबूत है के रूप में, लेबल और शमन धुंधला में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं इसी तरह, सटीक pipetting, कोशिकाओं और सटीक ऊष्मायन के उचित मिश्रण समय जब। अंत में, एन सेल साइटोटोक्सिक की क्षमता भी स्वस्थ व्यक्तियों में अत्यधिक परिवर्तनशील है और विकास मंच, लिंग, उम्र, और वजन 23,24,सहित कारकों की एक संख्या से प्रभावित है25. इसके अलावा, ऊपर 30% करने के लिए स्वस्थ नियंत्रण के एक महत्वपूर्ण कमी या साइटोटोक्सिक क्षमता का पूरा नुकसान से अधिक 24 घंटे के बाद रक्त आकर्षित परीक्षण किया तो प्रदर्शित करें। इसलिए, यह कोशिकाओं जब भी संभव हो उपयोग हौसले से शुद्ध PBMCs या NK के लिए सिफारिश की है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक कोई वित्तीय हित के विरोध की घोषणा।
Acknowledgments
हम उसकी सहायता पांडुलिपि की तैयारी के लिए जिल Narciso, UCLA Immunogenetics केंद्र, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
Tags
इम्यूनोलॉजी समस्या 126 प्राकृतिक किलर एन सेल cytotoxicity सेल lysis हत्या K562 प्रवाह cytometry क्रोमियम रिलीज एन सेल cytotoxicity CFSE सेलErratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was corrected from:
to:
