ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde doğal öldürücü (NK) hücreler olarak bilinen efektör lenfositler özellikle tumoral ortadan kaldırarak ve virally enfekte hücreleri anormal hücreler karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Diğer patolojik koşulları, bir dizi ile birlikte yaklaşık 30 bilinen monogenic kusur olarak tezahür fonksiyonel ya da klasik NK hücre eksikliği neden azalır veya yok sitotoksik etkinlik. Tarihsel olarak, sitotoksisite hantal, pahalı ve potansiyel olarak tehlikeli olan radyoaktif yöntemler ile araştırmış. Bu makalede NK hücre sitotoksik etkinliğini ölçmek için akıcı, klinik olarak geçerli Akış Sitometresi tabanlı yöntemi. Bu tahlil, periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya saf NK hücre hazırlıklar NK Hücre-aracılı sitotoksisite (NKCC) duyarlı olduğu bilinen bir hedef tümör hücre satırı ile birlikte farklı oranlarıyla inkübe. Hedef hücreleri önceden onların ayırımcılığa karşı efektör hücreler (NK hücreleri) izin vermek için bir floresan boya ile Etiketlenmiş. Kuluçka dönemi sonra öldürülen hedef hücreler özellikle ölü hücreleri nüfuz bir nükleik asit leke tarafından tanımlanır. Bu yöntem hem tanı ve araştırma uygulamaları hem de, Akış Sitometresi çok parametreli yetenekleri sayesinde mükellef, potansiyel olarak daha derin çözümlenmesi NK hücre fenotip ve işlevini etkinleştirme avantajı vardır.
Introduction
Doğal öldürücü (NK) hücreleri insan doğuştan gelen lenfositler eleştirel virally enfekte hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri ve diğer patojen tehditler 1,2ortadan kaldırılması içinde yer alan sofistike bir alt kümesidir. NK hücre litik granül sitotoksik proteinler, perforin ve granzymes gibi ev. Etkinleştirme, üzerine NK hücreleri doğrudan hedef hücre lizis ve apoptosis, sitokin ve Kemokin yayın ile birlikte sonuçlanan nereye cytolytic bu moleküller yerel olarak serbest bırakılır, immünolojik synapse bilinen onların hedefleri olan karmaşık bir etkileşim oluşturmak ve sonuçta devlet bir enflamatuar indüksiyon içinde 1,3,4.
İnhibitör Hofstede NK hücre reseptörleri ve hedef hücreleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir sistem yüzeyde ifade ligandlar ve NK hücre aktivasyonu etkinleştirme karmaşık bir dize içerir. Bir NK hücre aktivasyonu en çok çalışılan mekanizmaları "eksik" özdür. Nitekim, MHC kompleksi (MHC) veya insan lökosit antijeni (HLA) molekülleri, üzerinde büyük sınıf tespiti eksikliği enfekte veya hücreleri Tetikleyicileri NK hücre sitotoksisite dönüştürdü. Tümör ve virüs bulaşan hücreleri genellikle tümleyici böylece birincil NK olma, T Hücre-aracılı bağışıklık kaçmak için bu antijenleri hücre hedefler 1,3,4.
NK hücre işlevi değerlendirilmesi öncelikle kategorize içine degranulation ya da sitotoksisite deneyleri. Ancak, degranulation deneyleri, CD107a, degranulation ilişkili işaret akış sitometrik tespiti gibi sadece NK hücre aktivasyonu ve değil onların nihai işlevinin doğrudan hedef hücreleri 5,6,7,8öldürülmesi işaret etmektedir. Bu nedenle, bu sınırlama bir daha söylüyorum ve daha doğrudan alternatif olarak sitotoksisite deneyleri için müfettişler çekmiş olmalı.
Uzun süredir "altın T ve NK hücreleri Hücre-aracılı sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için standart" krom yayın tahlil (MKK) olduğunu. MKK radioactively hedef hücre 51Cr ile etiketleme ve onları ortak efektör hücreleri ile kuluçka içerir. Bu tahlil protein bağlı 51Cr gama sayarak ölçülen süpernatant, içine belgili tanımlık serbest bırakmak o hücre lizis sonuç ilke dolu olduğunu. Etkili, süre bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı sorunlu: yüksek malzeme maliyetleri, işleme ve bertaraf radyoaktif 51Cr, spontan yayın 51Cr ve zor standardizasyon - yapım o tamamen pratik 9,10.
Radyoaktif olmayan deneyleri, floresan etiketleme, enzim yayın ve hatta bioluminescence, ilgili bir dizi beri MKK 11,12,13,14alternatif olarak geliştirilmiştir. Biz burada bir Akış Sitometresi tabanlı yöntemi basit, hassas ve tekrarlanabilir NK hücre sitotoksik etkinliğini K562 hedef hücreleri üzerinde ölçüm için açıklamak. Bir insan erythroleukemic hücre satır HLA sınıf indirimli ifade ile ben ve onları NK Hücre-aracılı sitotoksisite 15özellikle duyarlı kılan ligandlar activatory NK reseptörleri için artan ifade K562 hücrelerdir. Bu tahlil K562 hücre carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) ile önceden etiketlenir ve işbirliği her iki periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) ile çeşitli oranları, kültürlü veya NK hücreleri 1saf. CFSE ayrımcılık hedef hücre efektör NK hücreleri 16,17sağlar bir istikrarlı, protein bağlayıcı floresan boya var. Co kuluçka sonra özellikle ölü hücreleri, membran permeating bir nükleik asit leke (malzemelerin tabloya bakın) öldürdü hedef hücreleri tanımlamak için kullanılır. Örnekleri sonra ölü (yani, leke +) yüzdesini belirlemek için bir Akış Sitometresi iktisap CFSE + hedef hücreleri.
Bu tahlil bir rutin tanı tarama olarak birincil veya ikincil Hemofagositik Lenfohistiyositozis ve orada olan yaklaşık 30 bilinen hataları NK hücre eksikliği, fonksiyonel veya klasik neden NK hücre bölmesi etkileyen monogenic kusurları için kullanılabilir. NK hücre etkinliği hastaların bağışıklık sulandırma hematopoietik hücre transplantasyonu veya post immunomodulatory terapi 18,19,20, aşağıdaki değerlendirmek için tekrarlayan, şiddetli herpes viral enfeksiyonlar ile ve temel araştırma uygulamaları bir dizi için araştırmak yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tahlil ayarlamadan önce NK hücre içeriğini seçim efektör nüfusu değerlendirilmek önerilir. Şekil 1 gösterir tipik bir CD56 (daha önce açık mavi) Boyama ve sonra (kırmızı) NK hücre zenginleştirme. NK hücreleri PBMCs % 15'e kadar oluşturan ve en az % 80 saf zenginleştirme sonra olmalıdır.
Bu tahlil akış sitometrik analizinde algılama iki parametre içerir: CFSE, aynı kanalı FITC; olarak tespit ve ölü hücre leke, APC (şekil 2AB) olarak aynı kanaldaki algılanabilir. Veri toplama sonra Şekil 2 gating stratejisinde verileri çözümlemek için kullanılır. Ölü (yani, ölü hücre leke +) K562 hedef hücreleri hedef popülasyon içinde ölü hücrelerin % sağlayan CFSE + nüfus dışında geçişli.
Denetim koşulları kendisi ve ayrı bileşenleri tahlil etkinliği sağlanmasında büyük önem taşımaktadır. Geçerli kabul edilmesi tahlil için sırayla aşağıdaki denetim koşulları (6-8) beklenmelidir: hedef hücreleri tek (koşul 6) hücre ölümüne neden < % 15 (şekil 3A). CFSE sinyal efektör hücreleri sadece (koşul 7) ve hücre ölümü-meli var olmak için tespit edilmelidir < %5 (şekil 3B). Hedef hücre (koşul 8) ara-aracılı öldürmek için hücre ölüm olmalı > %85 (şekil 3 c).
NK hücre işlevi üründe bir hastayla öldürme aktivite en az azalttı bekleniyor veya tüm oranları sağlıklı bir birey ile karşılaştırıldığında test. Paralel sağlıklı donör ve şekil 4 hasta hücreleri hedef hücre ölümü efektör-hedef hücre oranı azalan ile fark, önemli azalma gösterir.
Şekil 1: NK hücre içeriğini efektör nüfus içinde değerlendirilmesi. Boyama sonra temsilcisi çubuk grafik PBMCs (açık mavi) toplam veya NK hücreleri (kırmızı) CD56 için saf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hedef hücre algılama için strateji geçişi. A) ilk kapısı FITC-A/SSC-A mezarlığına ayarlanır. K562 hücre CFSE + olaylar geçişli. B) ölü K562 hücreleri (yani, ölü hücre için olumlu leke) sonraki APC-A/SSC-A komplo CFSE + hedef hücre nüfus içinde kapı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Denetim koşulları için temsilcisi veri. A) yüzdesi ölü hücre leke + K562 hücreleri ( Şekil 2gibi strateji geçişi) CFSE + kapı içinde durumu 6 ' (yalnızca hedef hücreleri) - negatif kontrol K562 hücre ölümü için. B) CFSE ve ölü hücre leke algılama durumu 7 (efektör hücreleri sadece - toplam PBMCs). C) yüzdesi ölü hücre leke + K562 hücreleri ( Şekil 2gibi strateji geçişi) CFSE + kapı içinde durumu 8 ' (hedef hücreleri + ara) - pozitif kontrol K562 hücre ölümü için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi veriler için çeşitli efektör-hedef hücre oranı seyreltme etkisi. Test efektör: hedef hücre oranları aşağıdaki gibidir: 50: 1, 25:1; 12.5:1; 6.25:1. veri arka plan (koşul #6) vardır-kaldırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Örnek | Koşul | Efektör (E): Hedef (T) |
| PBMCs | 1 - olumlu denetim için NK hücre sitotoksisite | 50:1 + IL-2 |
| 2 | 50: 1 | |
| 3 | 25: 1 | |
| 4 | 12.5: 1 | |
| 5 | 6.25: 1 | |
| 6 | Sadece T | |
| 7 - K562 ölüm için negatif kontrol | E sadece | |
| 8 - K562 ölüm için pozitif kontrol | T + ara | |
| NK hücreleri (saf) | 1 - olumlu denetim için NK hücre sitotoksisite | 5:1 + IL-2 |
| 2 | 5: 1 | |
| 3 | 2.5: 1 | |
| 4 | 1.25: 1 | |
| 5 | 0.625: 1 | |
| 6 | Sadece T | |
| 7 - K562 ölüm için negatif kontrol | E sadece | |
| 8 - K562 ölüm için pozitif kontrol | T + ara |
Tablo 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan NK hücre sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için geleneksel 51Cr yayın tahlil için basit ve düşük maliyetli bir alternatif yöntemdir. Bu yöntem hassas, tekrarlanabilir ve MKK gibi önceki standart yöntemlerine göre daha az zaman alıcı ve klinik her ikisi-ebilmek var olmak kullanılmış ve uygulamaları araştırma.
Tahlil toplam PBMCs ve zenginleştirilmiş NK hücreleri ile çalışsa da, hücre popülasyonlarının arındırmak için gerek kalmadan PBMCs kullanma seçeneğine zaman hasta örnekleri toplanan kan veya birkaç veya fakir kalite hücrelerin küçük birimlerle ilgili büyük bir yarar vardır. Bu tahlil sadece CFSE ve ölü hücre dışlama canlılığı leke kullanır. Yalnız bu iki parametre seyir daha fazla tazminat akış sitometrik analizinde gerektirmeyen yararı ile tanı amaçlı özlü ve yeterli bilgi sağlar.
Bu yöntem, temel NK hücre biyolojisi çalışma ve roman NK hücre hedefli tedaviler sınamak için de kullanılabilir. Bu bağlamda, akış cytometers sürekli genişleyen yeteneklerini çok yönlülük NK hücreleri ve faaliyetlerini multiparameter analiz için değil daha önce mümkün gibi SRA deneyleri ile izin bu tahlil için paha biçilmez bir unsuru tanıtmak. Alternatif hücre izleme ve diğer kanalları Floresanda canlılığı boyalar, müfettişler ihtiyaçlarını karşılamak kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı prototip NK hücre hedef K562 hücre satırı ile kullanım için optimize edilmiştir. Ancak, alternatif süspansiyon hedef hücre hatları için NK hücre sitotoksisite, HL-60, Daudi, U937 ve Raji gibi duyarlılık değişen derecelerde ile adapte edilebilir. Bu bağlamda, farklı hücre hatları farklı ve her Akış Sitometresi kadar floresan etiket alabilir gibi floresan boya ve hedef hücre etiketleme sırasında kullanılan bir serum konsantrasyonu her hedef hücre satırı için optimize olabilir unutmamak gerekir. Bu genellikle serum etiketleme sırasında kullanmamak için tavsiye edilir iken, hafif FBS % 0.5 ile iki nedenden dolayı Şoklama için seçti. İlk olarak, hedef hücre stresi azaltmak yardımcı olur ve böylece arka plan leke; İkinci olarak, günlük ayarlarını ayarlar, böylece tahlil tekrarlanabilirlik içinde yardım gerek kalmadan CFSE sinyal bizim Akış Sitometresi tespiti uygun aralığı içinde getiriyor. Ek protokol varyasyonları farklı E:T oranları ve kuluçka süreleri tahlil farklı harekete geçirmek koşullarına adapte test içerebilir. Daha uzun süre artmış spontan sürüm 9,16' neden eğilimi olsa efektör ve hedef hücreler NK sitotoksisite test etmek için ortak kültür süresi tarihsel olarak 4-16 h dan değişmekteydi. Bu floresan boyalar hücre bölünmesi seyreltilmiş olarak bizim yöntem, uzun kuluçka da öldürme veya üretimi, nedeniyle hedef hücreleri tarafından etiketleme floresan kaybına neden olabilir. Bu nedenle, incubations zaman pencerenin alt sonunda genellikle tercih edilir ve gecede kuluçka 6,16,22aşmaması gerekir.
Hangi değişkenler potansiyel olarak bu tahlil sonucunu etkiler dikkate almak önemlidir. Deneyim, K562 hedef hücreler özellikle sıcaklık değişikliklerine duyarlıdır. Bu nedenle, K562 hücreleri buzdolabında ama oldukça oda sıcaklığında muhafaza veya gereken bir oksijen CO2 kuluçka onların kullanmadan önce 37 ° C'de yerleştirilir. Aynı nedenle, tüm reaktifler iletişim kuralında belirtilen şekilde uygun sıcaklıklarda getirilmelidir. Bu hücreleri etkileyen başka bir parametre hücresel stres en aza indirmek için azaltılmalıdır Santrifüjü hızıdır. Ayrıca, efektör/hedef hazırlık ve az 30 dk için ortak kuluçka başlangıcı arasındaki gecikme süresini sınırlama maksimal öldürme etkinliği sağlamak ve tekrarlanabilirlik tahlil için gerekli olduğunu. CFSE sinyal genellikle güçlü olduğu için etiketleme ve Şoklama boyama tutarlılık sağlamak çok önemli olduğunda aynı şekilde, doğru pipetting, uygun hücreleri ve hassas kuluçka karıştırma zamanı. Son olarak, NK hücre sitotoksik yeteneği bile sağlıklı bireylerde son derece değişken ve bir dizi faktöre, gelişimsel sahne, cinsiyet, yaş ve ağırlığı 23,24,de dahil olmak üzere tarafından etkilenir25. Buna ek olarak, yukarı sağlıklı kontrol % 30'u için bir önemli azalma veya sitotoksik yeteneği tam kaybı kan çizdikten sonra 24 saatten fazla test görüntüler. Bu nedenle, bu taze saf kullanım PBMCs veya NK hücreleri mümkün olduğunda önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çakışma mali ilgi bildirin.
Acknowledgments
Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Merkezi, el yazması hazırlık ile ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
Tags
İmmünoloji sayı: 126 doğal öldürücü NK hücre sitotoksisite hücre lizis öldürmek K562 Akış Sitometresi krom yayın NK hücre sitotoksisite CFSE cepErratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was corrected from:
to:
