Summary
Denne protokol beskriver arbejdsgangen i et CRISPR/Cas9-baserede gen redigering system til reparation af punktmutationer i pattedyrsceller. Her bruger vi en kombinatorisk tilgang til gen redigering med en detaljeret opfølgende eksperimentelle strategi for måling indel dannelse på destinationsstedet — i det væsentlige, analysere onsite mutagenese.
Abstract
Kombinatorisk gen redigering bruger CRISPR/Cas9 og enkeltstrenget oligonukleotider er en effektiv strategi for korrektion af enkelt-base punkt mutationer, som ofte er ansvarlig for en lang række menneskelige arvelige sygdomme. Ved hjælp af en veletableret celle-baseret modelsystem, er punkt mutation af en enkelt-kopi mutant eGFP gen integreret i HCT116 celler blevet repareret ved hjælp af denne kombinatorisk tilgang. En analyse af korrigeret og ukorrigeret celler afslører både præcision af gen redigering og udviklingen af genetiske læsioner, når indels er lavet i ukorrigeret celler i DNA-sekvens omkring mål-webstedet. Her, er den specifikke metode brugt til at analysere denne kombinatorisk tilgang til gen redigering af et punkt mutation, kombineret med en detaljeret eksperimentelle strategi at måle indel dannelse på destinationsstedet, skitseret. Denne protokol beskriver en foundational tilgang og arbejdsgangen for undersøgelser med henblik på at udvikle CRISPR/Cas9-baserede gen redigering for behandling af mennesker. Afslutning af dette arbejde er, at ejendommen mutagenese finder sted som følge af CRISPR/Cas9 aktivitet i løbet af processen af punkt mutation reparation. Dette arbejde sætter i stedet en standardiseret metode til at identificere graden af mutagenese, som bør være et vigtigt og afgørende aspekt af enhver tilgang, der er bestemt til klinisk gennemførelse.
Introduction
Banebrydende undersøgelser af Mandecki (1986) påvist permanente ændringer i plasmid DNA ved hjælp af oligonukleotider omdannet til bakterier1, mens Walder og Walder (1986) foretaget tilsvarende undersøgelser i gær2. Kort tid derefter, offentliggjort Sherman og kolleger en række papirer, hvor enkeltstrenget oligonukleotider indført gærceller foretage arvelige ændringer i gener3. Med udgangspunkt i den skelsættende arbejde i mikrobiel celler, begyndte Kmiec og kolleger at udvikle unikke single-agent oligonukleotider, der rettet enkelt base reparation i pattedyrceller4. Dette koncept var baseret på biokemiske data, der viste, at molekyler bærer RNA binde mere stramt til målwebsted end de består udelukkende af DNA-baser. Selv om der var talrige rapporter om gen-redigering succes ved hjælp af kimære oligonukleotider5,6,7, forblev de redigering niveauer meget varierende mellem eksperimenter og på tværs af forskellige målcellen kombinationer.
Enkeltstrenget donor DNA foretrækkes til dobbelt-strenget donor DNA, fordi det er mindre tilbøjelige til at integrere på tilfældige steder i genomet8. Dog er eksogent indførte enkeltstrenget oligonukleotider udsat for hurtig forringelse af cellulære nukleaser. Flere strategier til at beskytte termini af oligonukleotider fra nedbrydning er blevet ansat. En exonuclease-beskyttet, enkeltstrenget DNA, der indeholder den ønskede sekvens var tilstrækkelig til at opnå en redigering effektivitet i 0,1-1% række6. Forbedret og mere ensartet Transfektion teknikker, kombineret med fænotypisk udlæsninger, tilladt for mere konsekvent, redigering af flere forskning grupper8,9,10,11, 12,13.
I de sidste 10 år, har der været en betydelig indsats for at gøre target-cellerne mere medgørlige gen redigering. Én strategi beskæftiger graduering af cellecyklus14,15,16. Mens redigering frekvenser under normale reaktionsbetingelser med enkeltstrenget oligonukleotider (ssODNs) føres ind i svævede kulturperler pattedyrceller mellem 0,1% og 1%, frekvenserne af genet redigering øget 3 til 5 gange når oligonukleotider blev introduceret i celler under deres overgang gennem S fase. I en særskilt serie af eksperimenter viste Brachman og Kmiec (2005), at relativt høje niveauer af præcise gen redigering (3-5%) blev indhentet når 2'3 ' dideoxycytosine (ddC) blev udruget i celler i 24 timer før tilsætning af oligonukleotid17 . ddC reducerer antallet af DNA replikation gaffel bevægelse, tyder på, at genet redigering af ssODNs i replikerende celler sandsynligvis indebærer inkorporeringen af ODNs i regioner af aktiv replikering11,18. Taget sammen, disse undersøgelser førte til det koncept, at donor DNA bliver indarbejdet i en voksende replikering gaffel som en del af den sande virkningsmekanisme af genet redigering, uafhængigt af om en dobbelt-strenget pause er til stede eller ikke19. Således sker korrektion af et punkt mutation eller udskiftning af et segment af DNA i kromosomet via en DNA parring og enkelt-strenget assimilation pathway.
Inducerende tilfældig dobbelt-strenget DNA pauser i voksende celler med små-molekyle agenter skaber et miljø, hvor DNA replikation begivenheder er gået i stå som cellen forsøg på at reparere skader20,21. Denne forbigående nedgang af replikering gafler giver mulighed for en mere effektiv penetration af kromatin struktur af enkeltstrenget redigering oligonukleotider, forbedre målet tilgængelighed15. Oprettelsen af dobbelt-strenget DNA bryder af stoffer som VP16, bleomycin, eller camptothecin22,23, har vist sig at stimulere gen redigering niveauer af næsten 10-fold, op til 6-8%. Men tilfældigt dobbelt-strenget DNA pauser er uønsket i en terapeutisk indstilling.
Gen redigering med programmerbare nukleaser og oligonukleotider er også stimuleret under celledeling24,25. Når nukleinsyre-baserede levering blev brugt til at udføre homologi-instrueret reparation i synkroniseret HCT 116 celler, Rivera-Torres og kolleger vist den samme stigning i målrettet aktivitet når transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) var beskæftiget med enkeltstrenget oligonukleotider, begge tilføres en replicerer celle befolkning26,27 . For nylig, Bialk og kolleger viste, at reparation af enkelt base mutationer med enkeltstrenget oligonukleotider og en bred vifte af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager Cas9 (CRISPR/Cas9) molekyler finder sted med højere effektivitet Hvornår den celle befolkning gennemkører S fase28. CRISPR molekyle består af RNA og funktioner til at identificere region inden for target DNA-sekvens, der er udpeget for kavalergang. Cas9 er en bakteriel enzym, hvis funktion er at kløve dobbelt-strenget DNA i et nucleolytic exchange reaktion. Således CRISPR positioner komplekset genomisk målsystemet, og Cas9 nukleasen udfører dobbelt-strenget pause. Lin et al. (2014) viste også betydningen af cellecyklus for at opnå høje frekvenser af genet redigering, bruger en modificeret CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) kompleks-medieret leveringssystem i primære neonatal fibroblaster, humane embryonale stamceller, og andre cell linjer24. Forholdet mellem gen redigering og cellecyklus progression til single-agent gen redigering er således gældende for kombinatorisk gen redigering bruger programmerbare nukleaser og donor DNA skabeloner. Mens den kombinatoriske tilgang til gen redigering har samlet en lang række partnere med donor DNA skabelon, bruger de fleste arbejdstagere i feltet CRISPR/Cas9 til at give den dobbelt-strenget pause funktion. Dette valg er baseret på lethed-i-brugen af denne særlige genetiske værktøj og den fleksibilitet, som det kan være ansat til at deaktivere genfunktion eller at indføre en fremmed stykke DNA i et bestemt websted. Generation af en knockout er teknisk lettere i forhold til et gen udskiftning, hvor inkorporering af "korrekte" eller normale kopier af et gen i webstedet sygdom skal udføres med præcision. En række forskere at identificere og studere brugen af specifikke lægemidler og reagenser, der aktiverer korrektion af mutant baser og indsættelse af normale genetiske sekvenser i den korrekte position på forhøjede frekvenser29.
For nylig, Rivera-Torres et al. 30 brugt kombinatorisk gen redigering, at drage fordel af den dobbelt-strenget pauseaktivitet af et specielt designet CRISPR/Cas9-system og af genetiske oplysninger fra et enkeltstrenget oligonukleotid donor DNA skabelon, at reparere en punkt mutation i etenkelt kopi af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (eGFP) genet integreret i HCT116 celler. At forfatterne benyttede sig af denne godt karakteriseret model cellelinie at vurdere specificiteten af kavalergang omkring mål-webstedet. Dataene, der afslører heterogenitet på målwebstedet findes især i celler, der ikke indeholder en korrigeret punkt mutation. I dette manuskript, vi detalje og fokusere på den metode, der bruges af disse arbejdstagere til at undersøge ejendommen mutationsmønstre heterogenitet lavet af CRISPR/Cas9 gen redigering.
Protocol
følgende protokol omfatter arbejde med pattedyrceller; fortrolighed med steril teknik/celle kultur forventes.
1. cellelinie og dyrkningsbetingelserne
- gøre 500 mL af medium for kulturen i HCT 116 celler: McCoy ' s 5A ændret medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin (dette er komplet medium).
Bemærk: Vokse HCT 116-19 celler i en T-75 eller T-175 kolben før plating. Når 90% sammenflydende, hver T-75 kolben vil give 8,4 x 10 6 celler, omtrent fem 10-cm plader, og hver T-175 vil give 18,4 x 10 6 celler, omtrent femten 10-cm plader.
2. Høst celler fra kolben
- Opsug væk medium, vask med Dulbecco ' s Phosphate-Buffered saltvand uden calcium og magniesium (PBS) (10 mL for T-75 eller 25 mL T-175) og aspirat.
- Tilføj trypsin dråbevis kolben ved hjælp af en 2-mL pipette (2 mL T-175 eller 1 mL for T-75). Kolben anbringes i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min at tillade celler at løsrive.
- Tryk på kolben for at sikre at alle celler er forskubbet og derefter slukke med komplet medium ved at sprede det over hele overfladen af kolben (8 mL for T-175 eller 4 mL T-75).
- Pipetteres op og ned flere gange til at bryde op celle klumper og overføre celler til en 15 mL konisk slange
- Før spinding cellerne ned, tage 10 µL fra de 15 mL konisk og kombinere det med 10 µL af trypan blå til at tælle cellerne. Sammenpresse cellerne af spinning i 5 min på 125 x g og 16 ° C.
3. Tælle celler
- overføre 10 µL af cellerne blandes med trypan blå til hemocytometer. Tælle 4 gitrene omkring ydersiden (hver gitter indeholder 16 pladser).
- Tage den gennemsnitlige celletal fra hver sæt af seksten hjørne firkanter.
- Ganges med 10.000 (10 4).
- Ganges med det samlede rumfang af medium bruges til at høste cellerne til at korrigere for fortynding fra trypan blå tilføjelsen.
Bemærk: Formatet ligning til beregning af volumen for at resuspend cellerne følger:
4. Plating cellerne
- For hver 10 cm plade af celler der skal synkroniseres, tilsættes 5 mL af komplette mellemstore og 6 µM af aphidicholin (12 µL af en 2,5 mM bestand i 200-bevis ethanol).
- Overføres 100 µL af re suspenderede celle pellet, 2,5 x 10 6 celler, hver 10 cm plade og swirl forsigtigt at blande.
- Ruger plader på 37 ° C og 5% CO 2 til 16-24 h at synkronisere celler på G1/S grænsen.
5. Releasing celler fra Aphidicolin synkronisering
- 4 h før målretning, Aspirér medium, vask med PBS, Aspirér PBS, og tilsættes 5 mL af komplette mellemstore
- Læg den tilbage i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO 2 til 4 h
6. RNA kompleksbindende
- Enter mutant eGFP gensekvens i Zhang Lab ' s online generator 25 (http:// crispr.mit.edu/), og vælg Guiden CRISPR sekvenser, der binder med nærhed til mål-webstedet. Opnå CRISPR guiden sekvenser fra en kommerciel kilde.
- Opbevares CRISPR RNA (crRNA), aktivering af trans crRNA (tracrRNA) og Cas9 protein ved 20 ° C og anvendes ifølge producenten forslag.
- Mix RNA i equimolar koncentrationer til 45 µM. tilføje 6,75 µL af en 200 µM bestand af crRNA og 6,75 µL af en 200 µM bestand af tracrRNA til en 1,5 mL centrifugeres tube. Tilføje 16.50 µL af TE Buffer til at gøre en endelige mængden af 30 µL.
- Varme ved 95 ° C i 5 min i en varme blok eller PCR maskine.
Forsigtig: Hot! - Giver mulighed for at afkøle til stuetemperatur.
Bemærk: Hvis du bruger en PCR-maskine, sat til afkøling til 0,2 ° C/s. - Udføre følgende trin for hver prøve.
- Fortyndes 2.22 µL af crRNA:tracrRNA kompleks i 2.78 µL af TE Buffer (10 mM Tris, pH 8,0 og 0,1 mM EDTA, pH 8,0) til en endelige mængden af 5 µL.
- Fortyndes 1,67 µL af Cas9 Protein fra en 60 µM bestand i 3,33 µL af lav-serum medium til endelige mængden af 5 µL.
- Mix 5 µL af Cas9 protein med 5 µL af kompleksbundet RNA
7. Høst cellerne for målretning
- aspirat medium, vask med 5 mL PBS, Aspirér PBS, og der tilsættes 1 mL af pre varmede trypsin til hver 10cm plade. Læg pladerne i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min.
- Tryk på 10 cm plade for at sikre alle celler er forskubbet og derefter slukke med 4 mL af komplette mellemstore ved at sprede det over hele overfladen af pladen.
- Pipetteres op og ned flere gange at bryde op celle klumper og overføre cellerne til en 15 mL konisk tube.
- Før spinding cellerne ned, tage 10 µL fra 15 mL konisk røret og kombinere det med 10 µL af trypan blå til at tælle cellerne. Sammenpresse cellerne af spinning i 5 min på 125 x g og stuetemperatur.
- Opsug mediet og skylles med 5 mL PBS. Sammenpresse cellerne af spinning på 125 x g i 5 min ved stuetemperatur.
8. Tælle celler
- overføre 10 µL af cellerne blandes med trypan blå til hemocytometer. Tælle 4 gitrene omkring ydersiden (hver gitter indeholder 16 pladser).
- Tage den gennemsnitlige celletal fra hver sæt af seksten hjørne firkanter.
- Ganges med 10.000 (10 4).
- Ganges med det samlede rumfang af medium bruges til at høste cellerne til at korrigere for fortynding fra trypan blå tilføjelsen.
Bemærk: Følgende er formatet ligning til beregning af volumen for at resuspend cellerne. Genopslæmmes det krævede antal celler i serumfrit McCoy ' s 5A ændret medium.
9. målretning prøver
- overføre 100 µL af cellesuspension (5 x 10 5 celler) fra trin 8,1 til hver elektroporation 4-mm hul kuvette. Tilføje 10 µL af RNP komplekse fra trin 6.7 til 100 µL af celler på en 5 x 10 5 celle tæthed. Tilføje ODN (2 µM) til hver prøve.
Bemærk: For en positiv kontrol, tilføje 1 µL af eGFP på 1 µg/µL udtrykker plasmidet- tage rack til en elektroporation maskine, let svip til hver prøve og placere dem i salen. Electroporate på 250 V, LV; 2 pulser, 1 s; 13 ms; unipolære pulse.
- Overføre rack'et tilbage til emhætten. Overføre hver prøve til en godt indeholdende 2 mL af komplette mellemstore jegn en 6-godt plade. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 i 72 timer før kontrol for korrektion niveauer.
10. Analyse af genet redigeret celler og Transfektion effektivitet
- Opsug mediet og cellerne vaskes med 2 mL PBS. Opsug PBS og tilsæt 500 µL af pre varmede trypsin til hver brønd af 6-godt plade. Læg pladerne i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min.
- Tryk på pladen for at sikre alle celler er forskubbet og derefter slukke med 1 mL af komplette mellemstore ved at sprede det over hele overfladen af brønden.
- Passere cellerne i en 1,5 mL centrifugeglas og pellet ved 5.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Opsug mediet. Genopslæmmes celle pellet i 500 µL af FACS buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA og 2 µg/mL propidium Iodid i PBS).
- Måle celle fluorescens (eGFP +) ved flowcytometri.
- Beregne korrektion effektivitet som procentdelen af de samlede levende eGFP-positive celler over det samlede antal af levende celler i hver prøve, som beskrevet i Rivera Torres mfl 30.
11. DNA Sekvensanalyse
- Electroporate de synkroniserede og frigivne HCT 116-19 celler i en koncentration på 5 x 10 5 celler/100 µL med RNP komplekse på 100 pmols og 72NT ODN på 2,0 µM.
- Overfør celler til 6-godt plader og tillade dem at genvinde til 72 h.
- Sortere cellerne individuelt i 96-brønd plader ved hjælp af en FACS sorteringsanlæg med en 488 nm (100 mw) laser for eGFP +/-, som beskrevet i Rivera-Torres mfl 30.
Bemærk: Ikke alle brønde vil med held vokse. - Udvide cellerne over 6 uger og høste som beskrevet i trin 7.
- Fra de brønde, der har vækst, isolere cellulære gDNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig DNA isolering kit (Se Tabel af materialer) og forstærke det område omkring målet base via PCR (718 bp; fremad primer 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' og vende primer 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
- Udføre DNA-sekventering analyse på prøverne.
Representative Results
Vi brugte et modelsystem til at undersøge gen redigering i pattedyrceller, som er afhænger af korrektion af et punkt mutation er indlejret i eGFP genet integreret som en enkelt kopi i HCT116 celler. Det er vigtigt at bemærke, at dette er et enkelt-kopi gen; således, en mindre kompliceret visning af DNA ændringer eller mutagenese kan gøres. Figur 1A viser mutant eGFP gensekvens med målrettede base, den tredje base af stop-codon TAG, fremhævet med rødt. 72-base oligonukleotid, som er delvist supplement til den ikke-transskriberede strand af eGFP-genet (72NT) og er designet til at fremkalde base udveksling fra en G til et C, er også illustreret. Desuden er en CRISPR, udpeget som 2C, med den angivne protospacer sekvens i en 5' 3' retning, også afbildet i figur 1A. For at udføre denne gen-redigering reaktion, vi brugte en ribonucleoprotein (RNP) bestående af CRISPR (cr) RNA og tracr (tr) RNA koblet til renset Cas9 protein (figur 1B), i stedet for ved hjælp af et pattedyr udtryk vektor bestående af Cas9-gen og den passende specifikke guide RNA sekvens.
Når den specielt designede RNP partikel er leveret med enkeltstrenget oligonukleotid i HCT116 celler af elektroporation, gen redigering, fremgår af reparation af en enkelt base mutation i eGFP, er observeret efter 72 h inkubation ved hjælp af en flow forskellige. Funktionelle reparation er observerbare af fremkomsten af grønne fluorescens i målrettede celler, celler, der kan også være adskilt fra hele befolkningen af sortering på grund af denne fluorescens. Som vist i figur 2, kan en gradvis dosis-respons ses som de koordinerede niveau af RNP og 72NT stigning. Molekylær ratio, picomoles af RNP og micromolar koncentration af 72NT som vist i figur, er baseret på optimal doseringer bruges i gen-redigering reaktioner, der er afhængige af indførelsen af Cas9 og specifikke guide RNA fra transfekteret udtryk vektorer. Indsatser i figur 2 viser en gen-redigering reaktion udført i mangel af RNP partikel. Her, korrigeres ca 1% af de målrettede celler ved en 10-fold højere koncentration af 72NT oligonukleotid bruges i enkelt-agent gen-redigering reaktion.
For at fastslå, hvis genetiske heterogenitet findes på mål hjemmeside-den såkaldte on-site mutagenese effekt-vi besluttede at undersøge resultatet af genet redigering aktivitet i individuelle celler. Mens meget mere besværlige end behandlingen af den samlede befolkning, et sandt foranstaltning af genetiske fodspor eller læsioner kan være konstateret, hvornår genomet af alsidighed udvidet celler er undersøgt. Vi gentog forsøget beskrevet i figur 2, denne gang, kun bruger 100 pmol af RNP komplekse og 2,0 µmol af 72NT oligonukleotid. Som blev ovenfor, HCT 116 celler synkroniseret i 24 timer med aphidicholine og anholdt på G1/S grænse. 4 h bagefter, cellerne blev frigivet og gen-redigeringsværktøjer blev indført ved elektroporation. 72 h senere, cellerne blev analyseret ved hjælp af FACS og sorteret individuelt i 96-brønd plader (den eksperimenterende proces er illustreret i figur 3). Celler viser grønne fluorescens blev sorteret ved flowcytometri i individuelle brønde på en 96-brønd plade for klonal ekspansion. Vigtigere, var celler mangler eGFP udtryk også isoleret og sorteret i en lignende måde for ekspansion på samme betingelser.
Efter 14 dage af vækst, havde de fleste af de enkelte kloner udvidet tilstrækkeligt til at aktiverer DNA isolation. Som sådan, 16 kloner af eGFP-positive prøver blev valgt, og den genetiske integritet omkring mål-webstedet blev analyseret af DNA-sekventering. Oplysninger, der omgiver DNA sekvensen af alleler i befolkningen blev genereret ved hjælp af Sanger sekventering, samlet bruger sekvens visualisering software for at sammenligne sekvensen af en vildtype allel (figur 4A). Webstedet snit af RNP kompleks er angivet med en sort pil, beliggende på grønne bar (2C crRNA). Som også vist i figur 4Aindeholder alle 16 eGFP-positive celler den forudsagte nukleotid exchange på destinationsstedet. Den konverterede C rest er fremhævet med rødt, og peak profil afspejler det nøjagtige ændring er fastsat under den eGFP-positive sekvens. I en lignende måde, 15 ikke-grønne klonede isolerer, tilstrækkelig udvidet til at aktiverer DNA-ekstraktion og sekventering, blev analyseret for heterogenitet på destinationsstedet. Som forudsagt, i cirka halvdelen af prøver, blev ingen DNA base exchange observeret. Dette afspejles i vedligeholdelse af G restprodukt ved mål-webstedet, som vist i figur 4B. Den resterende del af de klonede udvidelser undersøgt i disse eksperimenter vises en heterogen population af sletning mutationer, derfor tegnede sig for manglen grønne fluorescens. Sletning størrelsen varierede fra en base til 19 baser. Det er vigtigt at bemærke, at vi har kun undersøgt 15 prøver af eGFP-positive celler, og mens vi tror, at dette er ganske repræsentativ for typen af genetiske læsioner efterladt af CRISPR/Cas9 aktivitet, der er en mulighed for, at andre typer eller former for indels kunne være til stede i målgruppen.
Tilsammen bekræfte de resultater, der vises i figur 4 den fænotypiske udlæsning i eGFP targeting system. Konvertering af G til C nukleotid muliggør fremkomsten af grønne fluorescens i korrigeret HCT116 celler. Ingen base substitution omkring målwebstedet er blevet observeret i kloner isoleret i dette eksperiment eller i tidligere eksperimenter27,28. Dataene viser også, at cellerne ikke at gennemgå gen redigering via point-mutation reparation forblive ukorrigeret, men i nogle tilfælde, ikke uændret, med en række genetiske heterogenitet omkring mål-webstedet.
Figur 1. (A) model system for gen redigering af mutant eGFP genet. De relevante segmenter af vildtype og muterede eGFP gen med den målrettede codon, beliggende midt i rækkefølgen, der vises i grøn og rød, henholdsvis. Nukleotid indskyde nemlig exchange er fed og understreget. Den fremhævede baser i blå repræsenterer 2C CRISPR protospacer sekvens, og de orange baser fremhæve webstedet PAM. Oligonukleotid disse forsøgsdyr er 72 baser i længde, idet phosphorothioate ændrede sammenkædninger på de tre terminal baser; 72-mer er rettet mod ikke-transskriberede (NT) strand (72NT). (B) CRISPR/Cas9ribonucleoprotein forsamling reaktion. crRNA giver målet specificitet (20 baser, røde afsnit) svarende til 2C protospacer sekvens og en interaktion domain (blå) med tracrRNA (grøn). crRNA og tracrRNA er udglødet i equimolar koncentrationer. Cas9 protein (grå) er føjet til komplet RNP forsamling. Guide RNA'er (gRNAs) direkte og aktivere Cas9 endonuklease, som så spaltes target-DNA. Den nederste del af figuren viser 2C frø sekvens og sekvensen der skal tracrRNA. Dette tal blev ændret fra Rivera-Torres, N. fl. (2017). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Gen redigering er dosisafhængig når instrueret af RNP og ssODN. Synkroniseret og udgivet HCT 116-19 celler blev electroporated med 24-120 pmol af CRISPR/Cas9 RNP og 0,6-3,0 µM af 72mer. Efter en 72-h tilbagebetalingsperioden, blev gen-redigering aktivitet målt ved hjælp af en flow Flowcytometret. Gen redigering vises som korrektion effektivitet (%), bestemmes af antallet af levedygtige eGFP-positive celler divideret med antallet af levedygtige celler i befolkningen. Fejllinjer er fremstillet af tre sæt af data point genereret over tre separate eksperimenter ved hjælp af grundlæggende beregninger af standardafvigelsen. Indsatte: Single-agent gen redigering. Gen-redigering aktivitet instrueret af enkeltstrenget oligonukleotid (72NT) i mangel af RNP komplekse identiske betingelser er præsenteret som en funktion af stigende koncentration. Dette tal blev ændret fra Rivera-Torres, N. fl. (2017). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksperimentelle strategi til isolering af enkelt celle kloner. Celler udstiller eGFP udtryk blev scoret som positive og sorteret ved hjælp af en flow Flowcytometret som enkelt celler i individuelle brønde for klonal ekspansion. Celler mangler eGFP udtryk blev isoleret og sorteret i en lignende måde og udvidet under de samme betingelser. DNA var så isoleret og eGFP-gen blev forstærket og underkastes Sanger sekvensering til at analysere den gen-redigering aktivitet omkring mål-webstedet. Dette tal blev ændret fra Rivera-Torres, N. fl. (2017). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. (A) allel analyse af eGFP-positive celler udvidet som en klonal befolkning. Isoleret alsidighed og udvidede eGFP-positive prøver (seksten kloner) blev analyseret på webstedet omkring målrettede base og DNA fra hver høstet, renset, forstærkes og sekventeret. Allel analyse blev udført ved hjælp af Sanger sekventering, samles ved hjælp af sekvens visualisering software og i forhold til sekvensen af en vildtype allel, som er illustreret øverst i figuren. Webstedet snit af RNP kompleks er indiceret som en lille sort pil ligger på grønne bar (2C crRNA). (B) Allel analyse af eGFP-negative celler udvidet som en klonal befolkning. 15 individuelle prøver, udvidet fra kloner med oprindelse fra befolkningens ukorrigeret var tilfældigt udvalgt og analyseret for indel dannelse på webstedet omkring målet nukleotid. Som blev ovenfor, allel analyse udført ved hjælp af Sanger sekvensering og samles ved hjælp af en sekvens visualisering software. Igen, sekvensen af en vildtype allel øverst i figuren, sammen med webstedet snit af RNP, præsenteres. Dette tal blev ændret fra Rivera-Torres, N. fl. (2017). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Gen redigering er blevet mainstream videnskabelig disciplin primært på grund af fremkomsten af CRISPR/Cas9-system. Denne bemærkelsesværdige pathway, som letter adoptiv immunitet i bakterieceller, har været repurposed som en molekylær værktøj hen til muliggøre genomisk ændring i menneskelige kromosomer. CRISPR/Cas9 naturlige funktion er at forhindre virale DNA ved at indføre dobbelt-strenget DNA pauser fører til fragmenteringen30,31. Denne aktivitet resulterer i ødelæggelse af invaderende eksogene DNA og fører til prokaryote immunitet, der undertrykker efterfølgende infektion ved den samme viral partikel. Utroligt, dette system udstiller lungerne adfærd, idet det kan genaktivere specifikke CRISPR gRNA lavet af tidligere infektion begivenheder.
Effektiviteten og nøjagtigheden af genet forstyrrelser katalyseret af CRISPR/Cas9 har været brugt i mange eukaryote genetiske systemer hvor målet var at forhindre en fungerende gen32,33. Når reduceret til dens basale niveau, består processen af to grundlæggende skridt. Først er en dobbelt-strenget pause, mens andet er baseret på de iboende proces af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) for at fuldføre knockout. I de fleste tilfælde, de dobbelt-strenget pause resultater i skabelsen af blunt-ended, uengagerede kromosomale segmenter og enzymer involveret i NHEJ reagere på den kromosomale pause og handle for at forbinde brudt enderne. Denne proces kan undertiden indebære tab af individuelle nukleotider på webstedet afhuggede. Tabet af endnu et par baser kan forårsage en frameshift, og funktionelle udtryk ophører. Brug af CRISPR/Cas9 at skabe genetisk knockout af engagerende den naturlige proces af NHEJ har revolutioneret Eukaryot genetik; tabet af DNA på målwebstedet er både forudsigelig og forventede.
I modsætning til gen knockout, har en række forskere været engageret i forsøget på at omdirigere og genbruge CRISPR/Cas9 aktivitet mod processen med homologi-instrueret reparation. Formålet med undersøgelserne er gen korrektion. I denne strategi, er CRISPR/Cas9 kombineret med en donor DNA-skabelon, der indeholder genetiske oplysninger, til at reparere en medfødt fejl eller til at indsætte mutationer i sund gener. Tidlige rapporter fremhæve CRISPR/Cas9 bemærkelsesværdig evne til at katalysere homologi-instrueret reparation angivet (direkte eller indirekte) at processen opstod i en meget præcis mode24,34. Vores laboratorium har studeret homologi-instrueret reparation eller gen korrektionen ved hjælp af enkeltstrenget oligonukleotider i et forsøg på at definere mekanisme og regulerende kredsløb omkring det15,17,18 ,23. Vi har fokuseret primært på genet redigering enkelt punkt mutationer, da dette er den mest grundlæggende genetiske mutation kendt for at være ansvarlig for mange arvelige sygdomme. Vores grundlæggende viden om gen redigering førte os at sætte spørgsmålstegn ved nøjagtigheden af CRISPR/Cas9 aktivitet i disse reaktioner, siden CRISPR/Cas9 funktion i gen knockout resulterer i dannelsen af indels. Vi brugte en veldefineret modelsystem, snarere end en ikke-valgbar endnu klinisk relevante gen, for at studere on-site mutagenese i en decideret reduktionistiske mode. Ved hjælp af et simpelt mål gen, ved hvilken gene korrektion kan måles på begge genotypiske og fænotypiske niveauer, begrundet vi at heterogenitet forekommende på destinationsstedet kunne identificeres på en pålidelig og robust måde.
Vores data bekræfter, at det veletablerede gen redigering system, bestående af en mutant eGFP gen integreret i HCT116 celler, kan give grundlæggende oplysninger om generation over genetiske læsioner og processen med on-site mutagenese. CRISPR/Cas9 og enkeltstrenget oligonukleotid donor DNA molekyler arbejder i tandem kan føre til den præcise reparation af punkt mutation i eGFP-genet. Vi foreslår en ny model for reparation af punktmutationer, en molekylær pathway som donor-DNA fungerer som en replikering skabelon til reparation af mutant basen, en proces, vi har kaldt nøjagtige30. Målgruppen, ikke udviser den korrigerede fænotype, viser en bred vifte af celler der indeholder heterogene og bredt spænder DNA indels omkring mål-webstedet. I cirka halvdelen kloner isoleret fra befolkningens ukorrigeret, blev sletning mutagenese observeret på destinationsstedet. Da ingen tidligere betænkning har tilkendegivet, at enkeltstrenget oligonukleotider fungerer som enkelt-agent gen-redigeringsværktøjer kan fremkalde indels på destinationsstedet, vi konkludere, at CRISPR/Cas9 aktivitet er ansvarlig for disse mutationer.
I dette manuskript leverer vi en detaljeret metode, så genetisk heterogenitet på mål-webstedet kan måles på en pålidelig og robust måde. Mens en enorm mængde af opmærksomhed er blevet betalt til analysen og kortlægning af off-site mutagenese, er det sandsynligt, at en heterogen mutation lavet på mål-webstedet vil have en større effekt på succes eller fiasko af genet redigering i den kliniske arena. Yderligere teknologier eller modificerede Cas9 proteiner kan være nødvendig at forbedre præcisionen af homologi-instrueret reparation af medfødte fejl i pattedyrceller35. Nogle af disse teknologier omfatter brugen af hjælpeansatte oligonukleotider til at fungere som en bro, holde de kromosomale ender sammen og at undgå den ødelæggende virkning af NHEJ. Definere graden af heterogenitet på målwebstedet som følge af gen-redigering aktivitet er og skal være en vigtig del af enhver protokol designet for terapeutisk intervention.
Disclosures
Forfatterne har noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
| Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
| Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
| Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
| CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
| S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
| IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
| Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
| Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
| 6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
| Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
| Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
References
- Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
- Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
- Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
- Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
- Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
- Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
- Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
- Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
- Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
- Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
- Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
- Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
- Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
- Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
- Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
- Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
- Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
- Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
- Wang, Z., Zhou, Z. -J., Liu, D. -P., Huang, J. -D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
- Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
- Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a, Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
- Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
- Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
- Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
