Summary
Сложные передвижения в натуралистическом сред, требующих тщательной координации конечностей включает регионы теменной коры. Следующий протокол описывает использование обратимых охлаждения индуцированной деактивации продемонстрировать роль теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в пешеходных cat.
Abstract
На комплекс, натуралистический ландшафт сенсорной информации о экологические препятствия может использоваться для быстрой адаптации опорно движений для избежания. Например в Кот, визуальная информация о предстоящем препятствие может модулировать степпинг для избежания. Опорно-адаптация также может произойти независимо от видения, как внезапное тактильные вклад ногу препятствием ожидаемых может изменять шагая все четыре ноги для избежания. Такой комплекс опорно-двигательной координации включает в себя supraspinal структуры, такие как теменной коре. Этот протокол описывает использование обратимых, охлаждение индуцированной корковых деактивации оценить вклад теменной коре локомоции памяти руководствуясь препятствие в Кот. Маленькие охлаждения петли, известный как cryoloops, формируются специально для деактивации дискретных областей интереса для оценки их вклада в открытой поведение. Такие методы использовались для уточнения роли теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в Кот.
Introduction
На натуралистических, неровной местности сенсорную информацию о препятствие, которое может быть приобретено через видение или touch, можно быстро изменить двигательный аппарат для избежания. Это тщательная координация шаговые движения включает в себя несколько корковых регионах1,2. Например во время сложных опорно-задач, таких как препятствием избежание замешаны области моторной коры3,4 и теменной коре5,6,7 . В четвероногих животных шаг модуляции, необходимые для избежания препятствий должны распространяться на передних и задних конечностей. Если вперед локомоции задержка между foreleg и hindleg зазор препятствие (которые могут возникнуть как животное топчет тщательно через жертвой преследования сложных, натуралистических окружающей среды), информация о препятствие, сохранена в памяти используется для руководства hindleg, переступая через препятствие, однажды гуляя резюме.
Экспериментальные методы, направленные для отключения отдельных корковых областях может использоваться для изучения корковых вклад в памяти руководствуясь препятствие локомоции. Охлаждение индуцированной корковых деактивации обеспечивает обратимым, надежных и воспроизводимых метод оценки корковых вклад открытой поведение8. Cryoloops, сделанные из нержавеющей стали, трубы формируются специфичные для области коры интерес, обеспечивая весьма селективный и дискретные деактивация локусов. После имплантации, охлажденные метанола прокачивается через просвет cryoloop охлаждает область коры непосредственно под цикла < 20 ° C. Ниже этой критической температуры ингибируется синаптической передачи в регионе коры непосредственно под петлю. Такое отключение может быть отменено лишь путем прекращения потока метанола. Этот метод был использован для изучения корковых вклад сенсорной обработки и поведения9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, а также управления двигателем скачкообразных глаз движения18 и память руководствуясь препятствие локомоции19.
Целью настоящего Протокола является использование обратимых охлаждения индуцированной деактиваций для оценки участия париетальной корковых зон для опорно-двигательной координации в Кот. В частности память руководствуясь препятствие локомоции был рассмотрен с или без активного теменной коре. Эти методы были использованы для успешно демонстрирующих роль теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в пешеходных кошка19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены во исполнение национального исследовательского совета руководство для ухода и использования лабораторных животных (восьмое издание; 2011) и Канадский совет по животных уход Руководство по уходу и использование экспериментальных животных (1993) и были одобрен университета Западного Онтарио животных использования Подкомитет Совета университета по лечению животных.
Следующая процедура может применяться для экспериментов, изучая корковых вклад опорно-двигательного аппарата управления в пешеходных cat.
1. аппарат
- Постройте аппарат используется для оценки препятствий памяти.
Примечание: Аппарат состоит из 2,43 м длиной, 29 см широкий аллеи окружена высокой акриловый стены 18 см (рис. 1). Узкие слот на полпути вдоль аппарат позволяет 25,8 см широкий x 3 мм толщиной препятствием для быть подняты на или удалены из дорожки с помощью рычага, монтируется под ходьбу. - Чтобы сохранить внимание животного на еде, Избегайте использования руку для поднятия или опускания препятствие. Вместо этого препятствие можно поднимать или опускать, используя экспериментатора ногу рычаг под дорожкой, позволяя экспериментатор продолжать кормление животного.
- Должным образом поддерживать рычажная система для обеспечения что препятствие можно поднимать или опускать шепнул.
- Использовать маленькие повышенных платформа (23 см длиной x 23 cm широкий x 16 см высотой) после которой мягкую пищу помещается, руководство движения животного.
- Запишите все испытания с использованием ethernet камеры (54 кадров/сек), установленной на штатив 1.85 m дорожки от средней линии.
2. Подготовка процедуры
Примечание: Для успешного сбора, период обучения, предшествующих поведенческого тестирования гарантирует, что каждое животное должным образом приспособиться к тестирования номер и аппарат. Многократное воздействие Роман окружающей среды будет помощь в сокращении поразительные или другие стрессовые поведения. Адаптационного может варьироваться между животными и может потребовать 1-2 месяца обучения. Первоначальный адаптационного сессий может быть до 5 минут в длину в зависимости от направленности и мотивация животного есть. Последующих сессиях должны стремиться к увеличению продолжительности времени, которое животное является мотивирован, чтобы работать (обычно около 20-25 мин).
- Приобрести Зрелые (> 6 месяцев) внутренних коротких волос кошки заводчик коммерческой лаборатории любого веса или пола.
Примечание: Мотивация к работе для производства продовольствия и совместной дислокации составляют критерии отбора, при рассмотрении которых животные должны быть включены в исследование. - Акклиматизироваться каждое животное, чтобы носить ремень безопасности, к которому прилагается поводок длиной 1 м. Якорь поводке на полке над дорожкой через середину дорожки.
Примечание: Это позволяет животное, чтобы ходить вдоль центральной части аппарата без какой-либо напряженности, способствуя тем самым животное, чтобы оставаться в рамках этой части аппарата. Создание таких границ полезен для работы с движущейся испытуемого. - Поместите животное на дорожки, позволяя ему поесть от платформы, на которой размещается мягкую пищу.
Примечание: Одна из целей этой начальной подготовки заключается в обеспечении, что животное легко следующим питание платформы при перемещении вперед и можно спокойно ходить с упряжь и свора. Использование мягкой пищи в качестве позитивного армирование поощряет животное, чтобы сосредоточиться на протяжении каждой сессии обучения или тестирования и способствует комфортную рабочую среду. - Убедитесь, что животное комфортно с обработкой, включая случаи, когда животное должны быть перемещены в начало области дорожки.
3. Поведенческие обучение и протокол испытания
Примечание: Препятствие памяти оценивается в двух парадигм: визуально зависимых препятствие памяти задачи, а задачи памяти зависящих от тактильных препятствие. Во время начальной подготовки и последующего тестирования следует использовать обе парадигмы.
-
Визуальные препятствие памяти
- Чтобы оценить памяти визуального препятствие, поднимите препятствие на дорожки (рисунок 2A). Место платформы на дальней стороне препятствие. Поместите животное в районе начала дорожки.
- Разрешить животное подход пищи, переступая через препятствие с только его передними ногами для того, чтобы съесть от платформы.
- Как животное продолжает питаться, ниже препятствие, таким образом, что она становится вровень с дорожкой для предотвращения любого дальнейшего зрительной или тактильной входов.
- После периода переменной задержки перемещения препровождает еда снова призвать животное, чтобы возобновить ходить; Эта задержка может быть меньше, чем 1 s свыше 2 мин.
- Важно отметить, что выполните испытания, где отсутствует препятствие препятствие и разработки уроков избежания ответа во избежание привыкания. В таких визуальных препятствие отсутствие испытаний убедитесь, что препятствие не возникает на дорожки до размещения животных в области начало дорожки.
- Соблюдайте hindleg, шагая в препятствие настоящее и препятствие отсутствие испытаний для проверки типичный двигательного поведения и нетронутыми визуальные препятствие памяти до охлаждения. Убедитесь, что животное может очистить препятствия без контакта, и что шагать все четыре ноги значительно поднимается в испытаниях препятствие-по настоящее время.
Примечание: Смотреть видео обучение судебных процессов может помочь в этой проверки.
-
Тактильные препятствие памяти
- Чтобы оценить тактильные препятствие памяти, убедитесь, что препятствие не возникает на дорожки до размещения животных в области начало дорожки (Рисунок 2Б).
- Разрешить животное ходить к платформе пищи, на той стороне слот препятствие.
- Как животное ест, поднимите препятствие на дорожки под блюдо еда, предотвращая любой визуальный ввод препятствие.
- Как пища перемещается вперед, обратите внимание, что животное должно связаться препятствие с их передние конечности до шагая над ним.
- Разрешить животное продолжать еды во время трансграничных препятствие между их план - и задних конечностей. В это время ниже препятствие, так что он становится вровень с дорожкой для предотвращения любого дальнейшего зрительной или тактильной входов.
- После периода переменной задержки переместите препровождает еда еще раз призвать животное, чтобы возобновить ходить.
- Главное, выполнить испытания, где отсутствует препятствие и для предотвращения привыкания к препятствие и разработки уроков избежания ответа происходит не foreleg контакт.
- В эти тактильные препятствие отсутствие судебных разбирательств у животных подход и съесть от платформы продуктов питания, как описано в шаге 3.2.1. Однако поднимать и опускать препятствие (шаг 3.2.2) прежде чем двигаться вперед еда в шаге 3.2.3. Убедитесь, что аналогичный период задержки, где животное разрешается продолжить еды (шаг 3.2.4) предшествует окончательное продолжение локомоции (шаг 3.2.5).
- Наблюдать за hindleg, шагая в настоящее время препятствием и препятствие отсутствие испытания для проверки нормального двигательного поведения и нетронутыми визуальные препятствие памяти до охлаждения.
4. видео анализ
Примечание: Для оценки препятствий памяти, анализы во время начальной подготовки и последующего тестирования после охлаждения цикла имплантации включают количественное определение высоты пика шаг, шаг распродажа и расстояние по горизонтали между ног и препятствие на пике каждого шага для визуальные и тактильные парадигмы (рис. 2 c).
- Анализ видео с помощью пользовательских написанные скрипты.
- Для каждого судебного разбирательства отслеживать каждую ногу, пометив положение ног ближе к камере на протяжении каждого этапа.
- Измерьте высоту шаг пик как перпендикулярное расстояние между ног и поверхности дорожки на самой высокой точке траектории каждый шаг (рис. 2 c).
- В настоящее время препятствием испытаниях измерьте зазор шаг как шаг высота непосредственно над препятствием слот, вычитанным Высота препятствий.
- Кроме того Измерьте расстояние по горизонтали между ног и препятствие на пике каждого шага в испытаниях препятствие-по настоящее время.
- Убедитесь, что возможности памяти препятствие нетронутыми до охлаждения цикла имплантации, проверяя, что пик шаг высота возводится в препятствие-настоящее время испытаний по сравнению с шагая в препятствие отсутствие судебных разбирательств.
5. охлаждение имплантации цикла (Cryoloop)
- На двустороннем уровне имплантата cryoloops над районами 5 и 7 согласно сообщалось ранее хирургических процедур8 (рис. 3).
- Короче говоря для каждого полушария, выполните краниотомии и durotomy Хорсли-Кларк координаты20 A15 A25 подвергать этапе ansate и боковой борозды.
- Положение отдельных охлаждения петли, фасонные из подкожного трубки из нержавеющей стали 23-го калибра с цикла в непосредственный контакт с поверхностью коры теменной области 5 или 7.
- Закрепите основание каждого cryoloop к черепу Стоматологическая акрил, закреплены винтами из нержавеющей стали.
- Закройте craniotomies с дополнительной стоматологической акрил; оформить края кожи до акриловая кромки и шовный материал вместе.
6. корковые охлаждения протокол
-
Экспериментальные установки
Примечание: Прежде чем чего животное в комнату, тестирования, подготовлен и испытаны охлаждения. Контур охлаждения состоит из метанола водохранилища с впускную трубку (3,2 мм диаметр, 1,6 мм в.д.), поршневой насос поршневой и ванна сухого льда, подключенных через политетрафторэтилена трубки (1.6 мм O.D., 0.5 мм и.д.; Рисунок 4). Кроме того необходим цифровой термометр.- Добавьте сухой лед 500 cc 200 мл метанола в ледяной бане. Концы подходят трубы плотно на входе и выходе Макетные cryoloop чтобы завершить контур охлаждения.
- Присоедините вилку термопары к цифровой термометр для непрерывного мониторинга состоит из двух мужчин термопара разъемы и термопара проволоки кабелю температуры. Убедитесь, что длина кабеля достаточно, чтобы достичь головы животного, когда один конец подключен к термометр.
- Включите насос поршневой, с помощью переключателя.
Примечание: Метанол должен быть составлен из водохранилища, прошли через насос для ванны сухого льда, где течет метанола в трубке будет охлаждаться до-75 ° C. Охлажденные метанола будет затем выйти из ледяной ванне и запустить через прилагаемый cryoloop до возвращения в водохранилище метанола. - Убедитесь, что установка насоса, длина труб в ледяной ванне и длина шланга от ледяной ванне Макетные петли являются оптимальными, таким образом, что Макетные cryoloop температура может достигать стабильного состояния около -5.0 ° C.
Примечание: Такой температуры, достигнутые в ходе этой начальной установки часто являются достаточными для достижения температуры теста 3.0 ± 1,0 ° C, когда та же система используется для охлаждения имплантированных cryoloop. Трудности в достижении достаточного охлаждения может быть решена, регулируя скорость насоса, увеличение длины трубы, погруженной в ледяной ванне, и/или минимизации длины труб от ледяной ванне cryoloop. - При необходимости, удлинить секции труб, резьбы к концу трубки через штуцер конец трубки и фланец конце трубки с инструментом отбортовки. Прикрепите трубы нужной длины с аналогичным образом фланцевый конец с помощью разъема.
- Убедитесь, что все соединения плотно и отсутствие утечек присутствуют. После того как удовлетворены первоначальной настройки, выключите насос и удалять Макетные cryoloop; цепь теперь готов для тестирования животного.
-
Поведенческое тестирование
- Поместите животное на тестирование аппарат. Слайд ремень над головой и закрепите ремень ожидающий вокруг животного. Прикрепите поводок.
- Снимите защитный колпачок имплантированных cryoloop подвергать впускных и выпускных труб. Fit труб заканчивается плотно на входе и выходе трубы cryoloop. Подключите термопары к цифровой термометр.
- Начало сессии тестирования с помощью visual (шаг 3.1) или тактильные (шаг 3.2) препятствие памяти суда. Следуйте с дополнительные испытания всех четырех типов (визуальные препятствие-по настоящее время, визуальные препятствие отсутствие, тактильные препятствие-по настоящее время, тактильные препятствие-отсутствует) случайным образом.
Примечание: Типичный сеанс тестирования состоит из блока «теплый» судебных разбирательств, где память руководствуясь препятствием избежание наблюдается в отсутствие охлаждения для установления базовых мер. - Включите насос поршневой и ждать cryoloop до температуры 3.0 ± 1,0 ° C (1-2 мин). Затем запустите «cool» блок испытания после включении поршневой насос. В ходе этого блока испытаний при необходимости, оценки вклада охлаждением области памяти гидом. Убедитесь, что температура cryoloop поддерживается на 3.0 ± 1,0 ° C на протяжении всего блока.
Примечание: Все четыре суда типа должны быть случайно interspersed во всем блоке. - Запустить последний блок «согревать» испытаний после выключения поршневой насос, и cryoloop вернулся в его оригинальной температуры.
Примечание: Базовый степпинга поведение воссоздан во время этого блока. Опять же все четыре суда типа должны быть случайно interspersed во всем блоке.
-
Очистка
- По завершении поведенческое тестирование удалите трубки из впускных и выпускных труб. Быть сознательным остаточного метанола, который может капать из трубы концы и может раздражать животного.
- Убедитесь, что защитный колпачок заменяется. Удаление упряжь и Свора до возвращения животного в колонии. Обрежьте концы труб (3-4 мм) используя труборез для предотвращения Дырявый соединения на следующий день тестирования.
7. Проверка степени охлаждения
- В конце поведенческое тестирование подтверждают, что степень деактивации ограничен для региона коры непосредственно под каждый cryoloop с помощью сообщалось ранее методы8.
Примечание: Это может быть проверен с термоклина сопоставления12 или тепловой тепловизионные камеры13,14,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол успешно использовался для изучения теменной коре вклад препятствие памяти в пешеходных кошка19. В этом исследовании, cryoloops были имплантированы на двусторонней основе над теменной области 5 и 7 в трех взрослых (> 6 месяцев) кошки (Рисунок 5A). Животные были оценены в парадигме памяти тактильные препятствие в отсутствие охлаждения (теплый, контроля состояния), или когда область 5 или 7 была двусторонней отключена.
Представитель результаты этого исследования показывают, что, когда область 5 охлаждался на двусторонней основе, hindleg степпинг был значительно ослаблены в испытаниях препятствие-настоящее время (рис. 5 d, синий). В теплых условиях высота шаг означает пик для начальные и конечные конечности был 9,5 см ±2.2 и 8.0 ±2.1 см, соответственно. Односторонняя многомерный дисперсионный анализ показал, что при охлаждении области 5, высоты ступеньки пик для начальные и конечные конечности значительно сократилось до 4,3 см ±2.2 (p < 0.0001) и 3,4 см ±1.4 (p < 0.0001), соответственно. Пик шаг высота передних ног в препятствие-настоящее время исследованиях или любой ноги в препятствие отсутствие испытаний не затрагивается область 5 деактивации. Аналогично высоты ступеньки пик для любого ноги в настоящее время препятствием или препятствие отсутствие судебных разбирательств не отличаются от теплого состояния при деактивации районе 7.
Кроме того Распродажа hindleg шаг был аналогичным образом влияет на область 5 была обезврежена. В условиях сравнения как теплые, так и область 7 охлаждением, Распродажа шаг был сокращен до 4,7 см ±2.2 в ведущих hindleg шаг (p < 0,0001; Рисунок 5 g) и −5.6 ±1.4 см на конечные hindleg шаге (p < 0.0001). Кроме того шаг траектории конечные hindleg пострадал от области 5 деактивации, как пик произошло перед препятствием, в отличие от степпинга в тепло и области 7 условия охлаждения (рис. 5 g).
Вообще такие изменения в пик шаг высота и распродажа шаг, шаг траектории указанных дефицитов памяти глубокие препятствие, когда области 5 была обезврежена. Главное как отключение области 5 только изменены характеристики hindleg, шагая в настоящее время препятствием испытаниях и не ослабить способность делать шаговые движения, эти наблюдаемые изменения в опорно отражают памяти, не моторного дефицита. Кроме того Тепловидение в заключение поведенческое тестирование подтвердил, что охлаждение ограничен областью 5 или 7 при каждом цикле охлаждался индивидуально для каждого полушария (рис. 6). Таким образом, в целом, эти результаты демонстрируют вклад теменной области 5 локомоции памяти руководствуясь препятствие в Кот.
Рис 1: диаграмма с изображением камеры, охлаждения оборудования и ходьба аппарат используется для оценки памяти препятствие в кат 2,43 м длиной, 29 cm широкий аллея прилагается 18 см высокими стенами ясно оргстекла. На полпути вдоль дорожки, 25,8 см широкий 3 мм толщиной препятствием может быть поднят на дорожке через узкие слот с помощью рычага, монтируется под дорожкой. Для каждого судебного разбирательства животное помещается пару шагов от препятствия в области начальной дорожки. Еда помещается на небольшой повышенных платформа (23 см длиной x 23 cm широкий x 16 см высотой) на обратной стороне препятствие слот напротив стартовой области. Все испытания регистрируются через Ethernet камеры смонтированы на вершине штатив и сохраненные на ноутбуке. Этот рисунок был изменен с Wong et al. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема, изображающие визуальные и тактильные препятствие памяти задачи и шаг измерений, используемых для оценки памяти препятствие в пешеходных кат. (A), чтобы оценить визуальных препятствий памяти, препятствие возникает на дорожки, как животное приближается к платформе пищи. После переступая через препятствие с только его передние конечности, животное разрешается съесть от платформы, как препятствие опускается тайно становится вровень с поверхностью дорожки. После периода переменной задержки еда перемещается вперед для поощрения животного, чтобы возобновить ходить. (B) для оценки тактильные препятствие памяти, препятствие не вызывается на дорожки, как животное приближается к платформе пищи. Как животное ест, препятствие возникает молча на дорожки непосредственно под платформу пищи. Пища перемещается вперед вызывая Передние конечности животного связаться препятствием перед шагая над ним. Животное разрешается продолжить еды от платформы продовольствия при трансграничных препятствие между его передних и задних конечностей. В это время препятствие тайно снижен с дорожками. Пища перемещается вперед еще раз призвать животное, чтобы возобновить ходить. Hindleg шаги измеряются для оценки препятствий памяти. (C) степпинга оценивается в обе парадигмы памяти визуальные и тактильные препятствие путем измерения высоты пика шаг, шаг распродажа и расстояние по горизонтали между пиковыми каждый шаг и препятствие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схема cryoloop. Cryoloop состоит из защитный колпачок, который приспосабливает над входным и выходным отверстием трубы. Эти трубы проходят через резьбовые пост и образует цикл, который сидит в непосредственный контакт с поверхностью коры над области интереса. Microthermocouple припаять на союз цикла для измерения температуры cryoloop. Его провода запустить обратно через трубки термоусадочные (который также является оболочкой для труб из нержавеющей стали) и прикреплены к разъему. Вся Ассамблея крепится к черепа с зубной акрил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: контур охлаждения. Контур охлаждения состоит из метанола водохранилище, поршневой насос поршневой, ледяной ванне, термометр и cryoloop. Охладить, насос оформляет метанола из водохранилища через впускную трубку (1.6 мм в.д.). Метанол выходит из насоса через трубы из политетрафторэтилена (0,5 мм в.д.) и перекачивается через баня сухого льда, где течет метанола в трубке охлаждается до-75 ° C. Охлажденные метанола затем выходит из ледяной ванне и проходит через прилагаемый cryoloop перед возвращением в водохранилище метанола. Этот cryoloop может быть Макетные петлю (не имплантируются) используются во время начальной установки, или может быть имплантированными cryoloop в тестовых животных. Cryoloop также подключен к цифровой термометр для записи температуры цикла поведенческое тестирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: обратимым, охлаждение индуцированной деактивации теменной области 5 приводит в препятствие памяти дефицита. (A) бокового зрения правого полушария головного мозга кота, показаны cryoloops, имплантированных непосредственно над теменной области 5 (синий) и 7 (зеленый), изучены в Wong et al. 19 D: спинной, A: передней. (EB–) Бар участки с изображением означает шаг высота ± SD для препятствие-настоящее время (D B, ) и препятствие отсутствие испытаний (C, E) передние конечности (, Б) и задних конечностей (D, E) для теплой (красный), площадь 5 охлаждением (синий) и область 7 охлаждением условия ( зеленый цвет). Шаг высота значительно сократилось в начальные и конечные конечности в настоящее время препятствием испытаниях при деактивации области 5. (F) бар сюжет, изображающие среднее hindleg шаг Распродажа ± SD для каждого условия охлаждения. Деактивация области 5 привели к уменьшенным зазором для как начальные и конечные hindleg шаги. (G) бар сюжет, изображающие среднее расстояние по горизонтали между пик каждый шаг и препятствием для каждого условия охлаждения. При охлаждении области 5, шаг траекторий были более разнообразны и значительно отличались от теплой и зона 7 охлаждением условий. p < 0,005, **p < 0,0001, н.с.: не значительные. Этот рисунок был изменен с Wong et al. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Тепловидение используется для подтверждения ограничены деактивации во время охлаждения района 5 или 7. (A) фотография, изображающая cryoloops контакте с теменной области, 5 и 7 правого полушария. Верхней спинной, право в передней. Пунктирная линия представляет собой границу между теменной области 5 и 7. (CB–) Тепловые изображения поверхности теменной коры сфотографировали, когда области cryoloop над районом 5 (B) или 7 (C) была охлаждена до 3 ° C. Этот рисунок был изменен с Wong et al. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описывается парадигма использует охлаждения индуцированной деактиваций дискретных корковых областей с помощью cryoloop с целью изучения памяти руководствуясь препятствие передвижения в Кот. Визуальные и тактильные препятствие памяти парадигмы достаточно просты для животных для выполнения как они эксплуатируют натуралистический двигательного поведения, которые происходят с минимальными усилиями, когда животное является мотивирован, чтобы следовать за движущегося источника питания. Таким образом большинство периода обучения посвящен акклиматизации животных испытаний номер и охлаждающее оборудование. Большинство животных требуют многократного воздействия носить ремень безопасности и будучи привязанным через поводка перед пешком удобно и естественно на аппарат. Кроме того во время тестирования, звук поршневой насос может отвлечь или испугать животное. Завершить контур охлаждения с Макетные cryoloop и запуск насоса во время начальной подготовки может позволить животное, чтобы акклиматизироваться к звуку насоса. Несмотря на достаточную подготовку до начала испытаний, вероятно, будет ограниченное время для тестирования, прежде чем животное становится беспокойной. Таким образом посвящено достаточно времени для обеспечения правильной установки и устранения неполадок до чего животное в зале тестирования будет оптимизировать сбор последующих данных.
Трудность достижения достаточного охлаждения могут быть решены путем корректировки скорость насоса. Однако внимание следует уделять все большее давление, которое может привести с труб, были вынуждены покинуть входе или на выходе трубы cryoloop. Кроме того длина трубы, погруженной в ледяной ванне может быть увеличена до дать больше времени для охлаждения потока метанола в трубы. Кроме того обеспечить как можно более коротким длина трубопровода от точки выхода из ледяной ванне с cryoloop сведет к минимуму потерю охлаждения. Однако это расстояние также должны быть достаточно долго позволить достаточный диапазон передвижения для данного поведенческая парадигма. Трубка может быть изолирован с ЭППУ обертывания для оптимизировать эффективность охлаждения. Такой перенос может также предотвратить капли конденсата, которые образуют вокруг трубки от падения на животном, которые могут раздражать или испугать животное. Во время тестирования, обеспечивая уютно подходят трубы на входе и выходе трубы cryoloop можно сделать подключение cryoloop трудно. Ношение нитрил или латексные перчатки может обеспечить лучшее сцепление с поверхностью трубы. Обеспечение того, что животное комфортно и пациент в то время как экспериментатор придает труб имеет важное значение. Еда может использоваться держать животное, стационарные и контента.
Cryoloops может быть охлаждена регулярно, давая высокую воспроизводимость изменения в поведении при деактивации конкретной области. С оценки той же задачи в присутствии и отсутствии корковых дезактивации в то же самое животное, общее количество животных, используемых может быть сокращен. Кроме того степень охлаждения может манипулировать, чтобы уточнить корковых вклад определенное поведение. Например односторонние и двусторонние деактиваций может выполняться в то же самое животное для изучения возможных латерализации эффекты поведения. Кроме того можно варьировать степень охлаждения для изучения ламинарные взносов. Охлаждение cryoloops на поверхности коры до 3,0 ±1, 0 ° C, все шесть слоев коры непосредственно под каждый цикл охлаждаются в < 20 ° C, ингибирующих нейронов пики активности22. Кроме того cryoloops может быть охлаждена до 8,0 ±1, 0 ° C, который селективно охлаждает только supragranular корковых слоев ниже этой критической температуры 20 ° c. Оценка поведения с таких поверхностных корковых деактивации, а также полный корковых Деактивация может разрешить translaminar диссоциацией кортикальной функции21.
Несмотря на такой универсальности следующие ограничения должны рассматриваться в ходе экспериментального дизайна. В то время как охлаждение является отличный подход для отключения всех типов клеток в данном регионе кортикального слоя, он не может предоставить средства дезактивации с сотовой конкретности, которая может быть достигнута с optogenetic методами дезактивации. Кроме того, охлаждения требует минимум 45 s до температуры cryoloop стабилизации при критической температуре 3.0 ±1, 0 ° C для функциональных деактивации. Таким образом соображения для промежутка времени, необходимых для достижения функциональной деактивации должны быть включены в экспериментальный протокол выбора.
В целом система охлаждения требует минимального обслуживания. Шланги и соединители охлаждения должны регулярно проверяться на наличие утечек. Метанол в водохранилище следует заменить еженедельно обеспечить, что метанол свободен от твердых частиц. Имплантированные cryoloops также требуют минимального обслуживания. Поля являются периодически чистить с 3% раствором перекиси водорода, следуют решения хирургических скраб. С правильного использования и ухода имплантированных cryoloops может быть охлаждена регулярно на протяжении многих лет. Эти корковых охлаждения процедуры могут быть адаптированы для других поведенческих парадигмы10,11,12 или электрофизиологических запись подготовки13,14 в альтернативных моделях животных 15,,1718,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы с благодарностью признаем поддержку канадской институтов здравоохранения исследования, естественные науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) и Канадский фонд для инноваций. К.В было поддержано, Александр Грэм Белл Канада аспирантов стипендии (СЕНТИ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
