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Behavior

가역 냉각 유도 Deactivations 공부 장애물 메모리 걷는 고양이에 대뇌 피 질의 기여를

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56196

Summary

사지의 주의 깊은 조화를 요구 하는 자연 환경에서 복잡 한 운동에는 정수 리 피 질 영역 포함 됩니다. 다음 프로토콜 걷는 고양이에 메모리 기반 장애물 회피에 정수 리 지역 5의 역할을 설명 하기 위해 가역 냉각 유도 비활성화의 사용을 설명 합니다.

Abstract

복잡 한, 자연 지형에 빠르게 회피 운동 움직임을 조정 하 환경 장애에 대 한 감각 정보를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 고양이에 임박한 장애물에 대 한 시각적 정보 회피에 대 한 스테핑 조절 수 있습니다. 예상된 장애물에 의해 다리에 갑자기 촉각 입력 회피에 대 한 모든 4 개의 다리의 스테핑 수정 수 운동 적응 비전, 독립적인 발생할 수도 있습니다. 이러한 복잡 한 운동 조정 supraspinal 구조, 정수 리 피 질 등이 포함 됩니다. 이 프로토콜에는 정수 리 피 질 기여 고양이에 메모리 기반 장애 운동 평가를 가역, 냉각 유도 대뇌 피 질의 비활성화를 사용 하 여를 설명 합니다. Cryoloops로 알려진 작은 냉각 루프 특별히 비활성화 명백한 행동에 그들의 기여를 평가 하는 관심의 분리 된 영역에 형성 된다. 이러한 메서드는 고양이에서 메모리 기반 장애물 회피에 정수 리 지역 5의 역할을 명료 하 사용 되었습니다.

Introduction

자연, 고르지 못한 지형에 비전 또는 터치를 통해 취득 될 수 있다는 장애물에 대 한 감각 정보는 회피에 대 한 운동 빠르게 수정할 수 있습니다. 이 주의 조정 스테핑 움직임의 여러 피 질 영역1,2포함 한다. 예를 들어 지역 모터 피 질3,4 과 정수 리 피 질5,,67 의 장애물 회피와 같은 복잡 한 운동 작업 동안 연루 되었습니다. 네 발 동물, 장애물 회피에 필요한 단계 조음 앞 다리와 hindlegs에 확장 해야 합니다. 앞으로 운동 앞 및 hindleg 장애물 허가 (동물 신중 하 게 복잡 하 고, 자연 환경 스토킹 먹이 통해 자국으로 발생) 하는 사이, 지연 하는 경우 메모리에서 유지 관리 하는 장애물에 대 한 정보 사용 한 번 걷고 장애물에 스테핑 hindleg 다시 시작 합니다.

메모리 기반 장애물 운동 대뇌 피 질의 기여를 공부 하 개별 대뇌 피 질의 영역을 비활성화 하기 위한 실험 기법을 사용할 수 있습니다. 대뇌 피 질의 비활성화 냉각 유도는 명백한 행동8대뇌 피 질의 기여를 평가 하기 위한 가역, 안정적이 고 재현 방법을 제공 한다. Cryoloops 스테인레스 스틸 튜브에서 만든 loci의 높게 선택적이 고 개별 비활성화 보장 관심, 대뇌 피 질의 영역에 형성 된다. 일단 이식, 냉장된 메탄올은 cryoloop의 루멘을 통해 펌핑 냉각 루프를 바로 아래 피 지역 < 20 ° c. 이 임계 온도 아래 시 냅 스 전송 루프 바로 아래 피 지역에 저해입니다. 이러한 비활성화는 메탄올의 흐름을 중단 하면 되돌릴 수 있습니다. 이 방법은 감각 처리 및 동작9,10,11,12,13,,1415 에 대뇌 피 질의 기여를 공부 하는 데 사용 되었습니다. , 16 , 17, 뿐만 아니라 saccadic 눈 운동18 와 메모리 기반 장애물 운동19의 모터 제어.

이 프로토콜의 목적은 고양이 운동 조정에 대 한 정수 리 피 질 영역의 참여를 평가 하기 위해 가역 냉각 유도 deactivations를 사용 하는 것입니다. 특히, 메모리 기반 장애물 운동 또는 활성 정수 리 피 질 없이 시험 되었다. 이러한 방법은 성공적으로 걷는 고양이19에 메모리 기반 장애물 회피에 정수 리 지역 5의 역할을 설명 하기 위해 사용 되었습니다.

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Protocol

모든 절차는 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 연구 위원회의 가이드에 따라 실시 했다 (8 판, 2011)와 동물 관리에 캐나다 위원회 관리 및 실험 동물 (1993 년)의 사용에 가이드를의 했다 동물 관리에 대학 위원회의 웨스턴 온타리오 대학 동물 사용 소 위원회에 의해 승인.

다음 절차는 대뇌 피 질의 기여 걷는 고양이 운전 제어를 공부 하는 실험에 적용할 수 있습니다.

1입니다. 기구

  1. 장애물 메모리를 평가 하는 데 사용 하는 장치를 구성 합니다.
    참고: 장치는 2.43 m 긴, 29 cm 넓은 산책로 18 cm 높은 명확한 아크릴 벽 (그림 1)로 이루어져 있다. 장치에 따라 중간 좁은 슬롯 25.8 c m 넓은 x 3 m m 두꺼운 장애물을에 발생 하거나 걷는 표면 아래에 장착 된 레버를 사용 하 여 통로에서 제거 수 있습니다.
  2. 동물의 관심 먹고에 유지 되도록 하는 장애물을 올리거나 손을 사용 하지 마십시오. 대신, 장애 발생 될 수 있습니다 또는 동물 먹이 계속 실험을 수 있도록 산책로 아래 레버를 이동 하는 실험의 다리를 사용 하 여 낮 췄 다.
  3. 제대로 레버 시스템 장애 발생 하거나 연 인하 되도록 유지 합니다.
  4. 작은 높은 플랫폼을 사용 하 여 (23 cm 23 cm 넓은 x 16 cm 높이 x 길이)는 동물의 움직임을 안내 하는 부드러운 음식을 배치 됩니다 따라.
  5. 산책로의 중간 선에서 1.85 m 삼각대에 장착 된 이더넷 카메라 (54 프레임/s)를 사용 하 여 모든 시험을 기록 합니다.

2. 훈련 절차

참고: 성공적인 데이터 수집을 위한 행동 테스트 이전 훈련 기간 보장 각 동물 테스트 룸 및 장치에 acclimated 제대로 합니다. 새로운 환경에 반복된 노출 놀라운 또는 다른 스트레스 행동 감소에 도움이 됩니다.  새 환경 순응 동물 사이 다를 수 있습니다 고 1-2 개월의 훈련을 해야 할 수도 있습니다. 초기 새 환경 순응 세션 최대 5 분 길이에 초점과 먹는 동물의 동기 부여에 따라 있을 수 있습니다. 후속 세션 동물 (일반적으로 약 20-25 분)를 작동 하는 동기는 시간 기간 증가를 목표로 한다.

  1. 성숙한 취득 (> 6 개월) 어떤 무게 나 섹스의 상업적인 실험실 개종에서 국내 짧은 머리 고양이.
    참고: 음식과 협력 처리를 위해 일할 동기 연구에 포함 되어야 하는 동물을 고려할 때 선택 기준으로 구성 됩니다.
  2. 각 동물 1 m 긴 가죽 끈 연결 된 하네스 착용 적응 산책로의 중간점을 통해 보도 위에 선반에 가죽 끈 앵커.
    참고: 동물을의 긴장, 따라서 기구의이 부분 내에서 유지 하기 위해 동물을 장려 하지 않고 기구 중앙 부분을 따라 걸을 수 있습니다. 같은 경계를 설정 하는 것은 이동 테스트 주제와 작업에 대 한 유용 합니다.
  3. 부드러운 음식 배치 되는 플랫폼에서 먹을 수 있도록 산책로에 동물을 놓습니다.
    참고:이 초기 교육의 한 목표 동물 전달, 이동 하는 때 음식 플랫폼을 쉽게 다음과 같이 되도록 이며 마구와 가죽 끈 편안 하 게 걸을 수 있다. 긍정적인 증강으로 부드러운 음식을 사용 하 여 각 훈련 또는 테스트 세션을 통해 초점을 유지 하는 동물을 장려 하 고 쾌적 한 작업 환경을 승진 시킨다.
  4. 동물 처리, 어디 동물 산책로의 시작 지역으로 이동 해야 하는 인스턴스를 포함 하 여 편안 하 게 있는지 확인 합니다.

3. 행동 학습 및 프로토콜 테스트

참고: 장애물 메모리는 두 가지 패러다임에서 평가: 시각 종속 장애물 메모리 작업, 그리고 촉각 종속 장애물 메모리 작업. 두 패러다임 초기 교육 및 후속 테스트 하는 동안 사용 해야 합니다.

  1. 시각 장애 메모리
    1. 시각 장애 메모리 평가, 산책로 (그림 2A)에 장애를 발생 시킵니다. 장애물의 반대편에는 플랫폼을 놓습니다. 산책로의 시작 지역에서 동물을 놓습니다.
    2. 동물 음식, 플랫폼에서 먹을 수 있도록만 그것의 앞 다리와 장애물을 통해 스테핑 접근을 허용 합니다.
    3. 동물 계속 먹고, 낮은 장애물 등 그 어떤 추가 시각 또는 촉각 입력을 방지 하기 위해 보도와 같은 높이로 된다.
    4. 가변 지연 기간 이동 걷고; 다시 동물을 장려 하기 위해 다시 음식 전달 이 지연 1 보다 작은 수 s를 2 분 이상.
    5. 중요 한 것은, 장애물은 장애물을 배운된 회피 응답의 개발 습관 들 임을 방지 하기 위하여 결 석 재판 수행 합니다. 같은 시각 장애 결 석 재판에서 산책로의 시작 지역에서 동물을 배치 하기 전에 장애물 산책로에 발생 하지 않습니다 확인 합니다.
    6. Hindleg 전형적인 운동 동작 및 냉각 전에 그대로 시각 장애 메모리 확인 장애물-현재 및 장애물 결 석 재판에서 스텝을 관찰 합니다. 그 모든 4 개의 다리의 강화는 크게 상승 된 장애물-현재 재판에 동물 접촉 없이 장애물을 지울 수 있습니다 확인 하십시오.
      참고:이 확인에서 원조 수 있습니다 훈련 시험의 동영상을 보고.
  2. 촉각 장애물 메모리
    1. 촉각 장애물 메모리를 평가 하려면 (그림 2B) 산책로의 시작 지역에서 동물을 배치 하기 전에 장애물 산책로에 발생 하지 않습니다 확인 합니다.
    2. 장애물 슬롯의 반대편에 음식 플랫폼 쪽으로 걸을 동물 허용.
    3. 으로 동물을 먹고, 장애물의 모든 시각 입력을 방지 하는 음식 접시 아래 보도에 장애물을 올립니다.
    4. 식품은 앞으로 이동, note 동물 그것에 스테핑 전에 그들의 앞 다리와 장애물을 문의 한다.
    5. 계속 그들의 앞 축 및 hindlegs 사이 장애물을 벌리고 있는 동안 먹는 동물 허용. 이 시간 동안, 그것은 어떤 더 시각 또는 촉각 입력을 방지 하기 위해 보도와 플러시 되도록 장애물 낮은.
    6. 가변 지연 기간에 따라 다시 한번 걷고 다시 동물을 장려 하기 위해 음식을 전달 이동 합니다.
    7. 중요 한 것은, 장애물은 결 석 재판을 수행 하 고 지상을 접촉 habituation 장애물 및 배운된 회피 응답의 개발을 방지 하기 위한 발생 합니다.
      1. 이러한 촉각 장애물 결 석 재판에서 동물 접근이 고 3.2.1 단계에서 설명한 대로 음식 플랫폼에서 먹고. 그러나, 올리고 단계 3.2.3에서에서 음식 앞으로 이동 하기 전에 장애물 (단계 3.2.2) 낮은. 어디 동물 (3.2.4 단계)을 먹고 계속 수 유사한 지연 기간 (3.2.5 단계) 운동의 최종 계속 앞을 확인 합니다.
    8. Hindleg 정상 운동 동작 및 냉각 전에 그대로 시각 장애 메모리 확인 하 장애물-현재 및 장애물 결 석 재판에서 스텝을 관찰 합니다.

4. 비디오 분석

참고: 장애물 메모리를 평가, 분석 초기 교육 및 루프 주입 냉각 후 후속 테스트 중 포함 피크 단계 높이, 단계 클리어런스 및 발가락의 각 단계에 대 한 장애물 사이의 수평 거리 측정 시각 및 촉각 패러다임 (그림 2C).

  1. 사용자 지정 작성 된 스크립트를 사용 하 여 비디오를 분석 합니다.
  2. 모든 재판에 대 한 각 단계에 걸쳐 카메라에 가장 가까운 발가락의 위치를 표시 하 여 각 발을 추적 합니다.
  3. 발가락 각 단계 궤적 (그림 2C)의 가장 높은 지점에서 보도의 표면 사이의 수직 거리로 피크 단계 높이 측정 합니다.
  4. 장애물-현재 재판에서 장애물의 높이 의해 뺀 장애물 슬롯 위에 직접 단계 높이 단계 클리어런스를 측정 합니다.
  5. 또한, 발가락의 장애물-현재 시험의 각 단계 절정에 장애물 사이의 수평 거리를 측정 합니다.
  6. 장애물 메모리 기능 피크 단계 높이 장애물 결 석 재판에 스테핑 비해 장애물-현재 재판에 상승 확인 하 여 그대로 냉각 루프 주입 전에 확인 합니다.

5. 냉각 루프 (Cryoloop) 이식

  1. 지역 5와 7 이전에 보고 된 수술 절차8 (그림 3)에 따라 cryoloops를 양측 이식.
  2. 간단 하 게, 각 반구에 대 한 수행 craniotomy 및 durotomy 호스-클라크 좌표20 A15 A25 ansate과 측면 sulci 시점을 폭로 하.
  3. 위치 5 또는 7 정수 리 영역의 대뇌 피 질의 표면에 직접 접촉에 루프와 23 게이지 스테인레스 스틸 피하 튜브에서 모양의 루프 냉각 개별.
  4. 치과 아크릴 스테인리스 나사에 고정으로 두개골에 각 cryoloop의 자료를 보안 합니다.
  5. 닫고 추가 치과 아크릴; craniotomies 함께 피부 여백 아크릴 가장자리와 봉합을 그립니다.

6. 대뇌 피 질의 냉각 프로토콜

  1. 실험적인 체제
    참고: 테스트 룸에 동물을 데리고, 전에 냉각 회로 준비 하 고 테스트. 냉각 회로와 섭취 튜브 (3.2 m m 마약, 1.6 m m 아이디), 왕복 피스톤 펌프, 드라이 아이스 목욕 소계 (1.6 m m 마약, 0.5 m m 아이디; 튜브를 통해 연결 된 메탄올 저수지의 구성 그림 4)입니다. 또한, 디지털 온도계가 필요 합니다.
    1. 500 cc 드라이 아이스 얼음 목욕에 있는 메탄올의 200 mL를 추가 합니다. 입구와 출구의 냉각 회로 완료 하려면 더미 cryoloop 석판에 맞는 튜브 끝입니다.
    2. 두 남성 서 모 커플 커넥터와 열전대 와이어로 구성 된 케이블을 사용 하 여 모니터링 하는 지속적인 온도 대 한 디지털 온도계를 열전대 플러그를 연결 합니다. 이 케이블의 길이 한쪽 온도계에 연결 하면 동물의 머리에 도달 하기에 충분 한지 확인 합니다.
    3. 스위치를 사용 하 여 피스톤 펌프를 켭니다.
      참고: 메탄올 그려야 저수지, 통과 펌프 드라이 아이스 목욕 튜브에 흐르는 메탄올-75 ° c.에 냉각 하는 것입니다 어디에서 냉장된 메탄올 얼음 목욕을 종료 그리고 메탄올 저수지에 반환 하기 전에 연결 된 cryoloop를 통해 실행 됩니다.
    4. 있는지 확인 펌프 설정, 얼음 목욕, 내 튜브의 길이 더미 루프에 얼음 목욕에서 튜브의 길이 최적의 그런 더미 cryoloop 온도 정상 상태 약-5.0 ° c.를 도달할 수 있다
      참고:이 초기 설치 하는 동안 달성 같은 온도 종종 동일한 시스템 이식된 cryoloop을 사용 하는 경우 테스트 3.0 ± 1.0 ° C의 온도 달성 하기 위한 충분 한. 펌프는 cryoloop에 얼음 목욕에서 튜브의 길이 최소화 얼음 목욕에서 물속에 잠긴 튜브의 길이 증가의 속도 조정 하 여 충분 한 냉각을 달성에 어려움을 해결할 수 있습니다.
    5. 필요한 경우, 튜브 끝 피팅 통해 튜브의 끝을 스레딩 하 여 튜브의 섹션을 길게 하 고 플랜지 플랜징 도구로 튜브의 끝. 마찬가지로 플랜지 끝 커넥터를 사용 하 여 원하는 길이의 튜브를 연결 합니다.
    6. 모든 연결은 아늑한 고 아무 누수가 있는지 확인 합니다. 일단 초기 설정으로 만족, 펌프를 끄고, 그리고 더미 cryoloop; 제거 회로 지금 테스트 동물에 대 한 준비가 되어 있습니다.
  2. 행동 테스트
    1. 테스트 기구에 동물을 놓습니다. 머리 위로 마구 고 스트랩 snuggly 동물 주위를 확보 하십시오. 가죽 끈을 연결 합니다.
    2. 입구 및 출구 관을 노출 하는 이식된 cryoloop의 보호 캡을 제거 합니다. 맞는 튜브 끝 입구와 출구에 석판 튜브는 cryoloop의. 디지털 온도계 열전대 플러그를 연결 합니다.
    3. (3.1 단계)을 테스트 세션 또는 촉각 (3.2 단계) 장애물 메모리 재판 시작. 추가 시험의 모든 4 개의 종류에 따라 (시각적 장애물-현재, 시각적 촉각, 장애물 없는 장애물-현재, 촉각 장애물-결 석) 무작위 방식에서.
      참고: 일반적인 테스트 세션 메모리 기반 장애물 회피 설정 기준선 측정 하 냉각의 부재에서 관찰은 재판의 '따뜻한' 블록으로 구성 됩니다.
    4. 피스톤 펌프에 스위치와 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 분)의 온도 도달 하는 cryoloop에 대 한 기다립니다. 피스톤 펌프 전환 된 후에 다음, 재판의 '쿨' 블록을 실행 합니다. 재판의이 블록 동안 필요한 경우 냉각된 영역 메모리 기반에 기여를 평가 합니다. cryoloop의 온도에 3.0 ± 1.0 ° C 전체 블록에 걸쳐 유지 됩니다 확인 하십시오.
      참고: 모든 4 개의 시험 종류 해야 될 무작위로 산재 되는 블록에 걸쳐.
    5. 피스톤 펌프, 전환 된 후 재판의 마지막 'rewarm' 블록을 실행 하 고 그것의 원래 온도 cryoloop 반환 했습니다.
      참고: 기준선 스테핑 동작은 다시 설정이 블록 동안입니다. 다시, 모든 4 개의 시험 종류는 블록에 걸쳐 무작위로 interspersed 될 한다.
  3. 정리
    1. 행동 테스트 결론, 입구 및 출구 관에서 튜브를 제거 합니다. 튜브 끝에서 물방울 수 있습니다 하 고 동물을 자극 수 있습니다 잔여 메탄올의 의식 수 있습니다.
    2. 보호 캡 대체 됩니다 확인 하십시오. 식민지에 동물을 반환 하기 전에 가죽 끈과 하네스를 제거 합니다. 다음 테스트 날에 새 연결을 방지 하기 위해 튜브 커터를 사용 하 여 튜빙 끝 (3-4 m m)를 잘라 주세요.

7. 냉각의 정도 확인

  1. 행동 테스트의 끝에, 비활성화의 피 바로 아래에 이전에 보고 된 기법8을 사용 하 여 각 cryoloop의 지역으로 제한 되는지 확인 합니다.
    참고:이 수 확인 악곡 매핑12 는 열 이미징 카메라13,,1419.

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Representative Results

이 프로토콜은 장애물 메모리 걷는 고양이19에 정수 리 피 질 기여 검사를 성공적으로 사용 되었습니다. Cryoloops 정수 리 지역 5 및 7 세 성인 양측 이식 했다이 연구에 (> 6 개월) 여성 고양이 (그림 5A). 동물 냉각 (따뜻한, 제어 상태), 또는 5 또는 7 영역 때 양측 비활성화의 부재에 촉각 장애물 메모리 패러다임에 평가 했다.

그 연구에서 대표적인 결과 보여 그 때 지역 5는 양측 냉각, hindleg 장애물-현재 재판 (그림 5D, 블루)에 크게 감쇠 했다 스테핑. 따뜻한 조건에서 선행 및 후행 hindlegs에 대 한 평균 피크 단계 높이 9.5 ±2.2 cm 및 8.0 ±2.1 cm을 각각 이었다. 단방향 다변량 ANOVA는 지역 5, 냉각 하는 때 선행 및 후행 hindlegs에 대 한 피크 단계 높이 상당히 감소 되었다 4.3 ±2.2 cm 공개 (p < 0.0001) 3.4 ±1.4 c m (p < 0.0001), 각각. 장애물-현재 재판에 앞 다리의 또는 장애물 결 석 재판에서 어떤 다리의 피크 단계 높이 했다 5 지역 해제의 영향을 받지. 마찬가지로, 지역 7은 비활성화 될 때 피크 단계 높이 장애물-현재 또는 장애물 결 석 재판에 어떤 다리를 따뜻한 상태에서 다 하지 않았다.

또한, hindleg 단계 허가 했다 마찬가지로 영향을 지역 5 비활성화 되었습니다. 냉각 따뜻한와 지역 7에 비교 조건에서 단계 정리 최고의 hindleg 단계에서 4.7 ±2.2 cm로 감소 되었다 (p < 0.0001; 그림 5G) 후행 hindleg 단계에서 −5.6 ±1.4 c m (p < 0.0001). 피크 발생 전에 따뜻한에 지역 스테핑 달리 장애물 7 냉각된 조건 (그림 5G) 또한, 후행 hindleg의 단계 궤적 지역 5 비활성화에 의해 영향을 받았다.

전부, 피크 단계 높이, 단계 클리어런스 및 단계 궤적에 이러한 변화 지역 5는 비활성화 될 때 깊은 장애물 메모리 적자를 표시. 중요 한 것은, 지역 5 비활성화만 hindleg 장애물-현재 재판에 강화의 특성을 변경 하 고 스테핑 움직임을 만들 수 있는 능력을 손상 하지 않았다, 운동의이 관찰 된 변화 메모리, 아니라 모터 적자를 반영 합니다. 또한, 행동 테스트의 결론에서 수행 하는 열 화상 확인 각 루프는 개별적으로 각 반구 (그림 6)에 대 한 냉각 하는 경우는 냉각 지역 5 또는 7에 제한 했다. 따라서 전반적으로, 이러한 결과 고양이에서 메모리 기반 장애 운동에 정수 리 지역 5의 기여를 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1: 카메라를 묘사, 냉각 장치, 그리고 장애물 메모리는 cat.에서 평가 하는 데 사용 하는 기구를 걷고 다이어그램 2.43 m 긴, 29 cm 넓은 산책로 18 cm 높은 분명 유리 벽으로 둘러싸입니다. 산책로 따라 중간, 25.8 c m 폭 3 m m 두꺼운 장애물 산책로 아래 장착 된 레버를 사용 하 여 좁은 슬롯을 통해 보도에 발생 수 있습니다. 각 시험에 대 한 동물 산책로의 시작 영역에서 몇 단계 장애물에서 배치 됩니다. 음식 작은 상승 된 플랫폼에 배치는 (23 cm 23 cm 넓은 x 16 cm 높이 x 길이) 시작 지역 반대 장애물 슬롯의 반대편에. 모든 재판은 이더넷 카메라 삼각대 위에 장착 하 고 노트북에 저장 된를 통해 기록 됩니다. 이 그림에서 웡 수정 되었습니다. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 시각 및 촉각 장애물 메모리 작업 및 걷는 cat.에 장애물 메모리를 평가 하는 데 사용 하는 단계 측정을 묘사한 다이어그램 동물 식품 플랫폼 접근 (A) 시각 장애 메모리, 장애물을 평가 하는 보도에 발생. 만 그것의 앞 다리와 장애물에 스테핑 후 동물 은밀히 산책로의 표면에 접하게 되는 장애물을 낮춘으로 플랫폼에서 먹는 허용 됩니다. 가변 지연 기간에 따라 음식은 걷고 다시 동물을 장려 하기 위해 앞으로 이동 됩니다. (B) 촉각 장애물 메모리, 장애물을 평가 하기 위해 동물 음식 플랫폼 접근 산책로에 발생 하지 않습니다. 으로 동물을 먹고, 바로 음식 플랫폼 아래 보도에 장애는 자동으로 발생 합니다. 음식은 이동 앞으로 동물의 앞 다리를 일으키는 그것에 스테핑 전에 장애물을 문의 합니다. 동물의 앞 다리 및 hindlegs 사이 장애물을 벌리고 하는 동안 음식 플랫폼에서 먹는 계속 수 있습니다. 이 기간 동안 장애는 산책로에서 은밀히 인하 됩니다. 음식은 이동 앞으로 다시 한 번 걷고 다시 동물을 장려 합니다. Hindleg 단계 장애물 메모리를 평가 하기 위해 측정 된다. (C) 스테핑입니다 두 시각과 촉각 장애물 메모리 패러다임에 피크 단계 높이, 단계 정리 및 각 단계의 피크와 장애물 사이의 수평 거리를 측정 하 여 평가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3:는 cryoloop의 도식. 입구 및 출구 관에 맞는 보호 모자는 cryoloop에 의하여 이루어져 있다. 이러한 튜브는 스레드 게시물을 통해 실행 하 고 관심의 영역인 대뇌 피 질의 표면에 직접 접촉에 앉아 루프를 형성. microthermocouple cryoloop 온도 측정 하는 루프의 연합에 납땜입니다. 그 전선을 열 수축 튜브 (이 또한 스테인레스 스틸 튜브 랩)를 통해 다시 실행 하 고 커넥터에 연결 된. 전체 어셈블리는 치과 아크릴 두개골에 확보 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 냉각 회로. 메탄올 저수지, 왕복 피스톤 펌프, 얼음 목욕, 온도계, 및 cryoloop 냉각 회로 의하여 이루어져 있다. 냉각, 펌프 흡입 관 (1.6 m m 아이디) 통해 저수지에서 메탄올을 그립니다. 메탄올 소계 튜브 (0.5 m m 아이디)를 통해 펌프를 종료 하 고는 펌핑 통해 드라이 아이스 목욕 하는 배관에 흐르는 메탄올-75 ° c 냉각은 냉장된 메탄올 다음 얼음 목욕을 종료 하 고 메탄올 저수지에 반환 하기 전에 연결 된 cryoloop를 통해 실행 됩니다. 이 cryoloop 더미 루프 (이식 하지) 초기 설치 하는 동안 사용 될 수 있습니다 또는 시험 동물에 이식된 cryoloop 될 수 있습니다. cryoloop는 또한 행동 테스트를 통해 루프 온도 기록 하는 디지털 온도계에 연결 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 가역, 5 정수 리 영역의 냉각 유도 비활성화 장애물 메모리 적자 발생. (A) 정수 리 지역 5 (파랑) 및 7 (녹색) 왕 에 시험에 직접 이식 하는 cryoloops를 보여주는 고양이 뇌의 오른쪽 반구의 측면 19 d: 등, a: 앞쪽입니다. (EB-) 음모 바 단계 높이 ± SD 장애물-현재 (D B, )에 대 한 의미 묘사 및 장애물 결 석 재판 (C, E) 앞 다리 (C B, )와 hindlegs (D, E) 따뜻한 (빨간색), 지역 5에 대 한 냉각된 (파랑), 그리고 지역 7 냉각된 조건 ( 녹색)입니다. 지역 5는 비활성화 될 때 단계 높이 크게 장애물-현재 재판에서 선행 및 후행 hindlegs에 감소 되었다. (F) 각 냉각 조건에 대 한 평균 hindleg 단계 클리어런스 ± SD를 묘사한 작 바. 5 지역 비활성화 모두 선행 및 후행 hindleg 단계에 대 한 클리어런스를 감소 결과. (G) 피크의 각 단계와 각 냉각 조건에 대 한 장애물 사이의 평균 수평 거리를 묘사한 작 바. 5 지역, 냉각 하는 때 단계 궤도 더 많은 변수 되었고 7 냉각된 조건에 따뜻한 지역에서 크게 달랐다. p < 0.005, * *p < 0.0001, n.s.: 중요 하지. 이 그림에서 웡 수정 되었습니다. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 냉각 하는 동안 5 또는 7 영역의 제한 비활성화를 확인 하는 데 사용 하는 열 화상. (A) 사진 정수 리 영역 5, 7 오른쪽 반구의 접촉 cryoloops를 묘사. 탑 지, 바로 앞쪽 이다. 파선 정수 리 영역 5와 7 사이의 테두리를 나타냅니다. (CB-) 정수 리 외피 표면의 열 이미지 촬영 cryoloop 지역 5 (B) 또는 지역 7 (C)는 냉각 하는 때 3 ° c. 이 그림에서 웡 수정 되었습니다. 19 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

기술된 패러다임 고양이에 메모리 기반 장애물 운동 연구는 cryoloop를 사용 하 여 개별 피 질 영역의 deactivations 냉각 유도 사용 합니다. 시각과 촉각 장애물 메모리 패러다임은 동물 이동 음식 소스에 따라 동기 때 최소의 노력으로 발생 하는 자연 운동 행동을 악용 하는 대로 실행 하는 동물에 대 한 매우 간단 합니다. 따라서, 훈련 기간의 대부분 동물 테스트 룸 및 냉각 장비 acclimating 헌신적 이다. 대부분 동물 마구와 가죽 끈을 통해 기구에 편안 하 고 자연스럽 게 걷기 전에 곁에 되 고 반복적된으로 노출을 해야 합니다. 또한 테스트 하는 동안 피스톤 펌프의 소리 수 있습니다 혼란 또는 동물을 놀라게. 더미 cryoloop와 냉각 회로 완료 하 고 초기 훈련 기간 동안 펌프를 실행 펌프의 소리에 적응 하는 동물을 허용할 수 있습니다. 테스트 하기 전에 충분 한 훈련에도 불구 하 고 있을 것입니다 가능성이 동물 불안 하기 전에 테스트를 위해 제한 된 시간. 따라서, 충분 한 시간 적절 한 설치를 보장 하기 위해 헌신 하 고 시험장에 동물을 데 려 오 전에 문제 해결 후속 데이터 수집 최적화 됩니다.

펌프 속도 조정 하 여 충분 한 냉각을 달성 하는 어려움을 해결할 수 있습니다. 그러나, 주의 cryoloop의 입구 또는 출구 튜브 떨어져 강제 되 고 튜브와 함께 발생할 수 있습니다 증가 압력에 지불 되어야 합니다. 또는, 얼음 욕조에 잠긴 튜브의 길이 증가 진정 튜브 내에서 메탄올의 흐름에 더 많은 시간을 수 있도록. 또한,는 cryoloop에 얼음 목욕에서 출구 지점에서 튜브의 길이 가능한 한 짧게 보장 하는 것은 냉각의 손실을 최소화 됩니다. 그러나,이 거리도 해야 합니다 주어진된 행동 패러다임에 대 한 운동의 충분 한 범위 충분. 튜브는 냉각 효율을 최적화 하기 위해 유연한 거품 포장으로 격리 될 수 있습니다. 이러한 포장 또한 방울 응축의 동물에 떨어지는에서 배관 주위를 형성 하는 자극 하거나 동물을 놀라게를 방지할 수 있습니다. 테스트 하는 동안 튜브의 입구에 맞는 아늑한 보장 하 고 콘센트 튜브는 cryoloop의 cryoloop 어려운 연결을 만들 수 있습니다. 니트 릴 또는 라텍스 장갑 입고 튜브의 더 나은 그립을 제공할 수 있습니다. 동물을 편안 하 고 환자는 실험 튜브를 연결 하는 동안 필수적입니다 보장 합니다. 식품 동물을 유지 하는 고정 하 고 콘텐츠를 사용할 수 있습니다.

Cryoloops은 특정 영역 비활성화 되 면 행동에 높은 재현성 변화 저조한 정기적으로 냉각 수 있습니다. 존재와 같은 동물에서 대뇌 피 질의 비활성화의 부재에서 동일한 작업을 평가 하 여 사용 하는 동물의 전체 수를 줄일 수 있습니다. 또한, 냉각의 추가 지정 하는 특정 동작에 대뇌 피 질의 기여를 조작할 수 있습니다. 예를 들어 일방적이 고 양자 deactivations 행동의 가능한 lateralization 효과 검사 하는 같은 동물에서 수행할 수 있습니다. 또한, 냉각의 정도 검사 층 류 기여 하는 다양 한 수 있습니다. Cryoloops 3.0 ± 1.0 ° C에 외피 표면에 냉각 하 여 피 질 바로 아래에 각 루프의 모든 6 개의 레이어를 냉각 < 억제 신경 급격히 활동2220 ° C. Cryoloops 8.0 ± 1.0 ° C, 선택적으로 냉각만 supragranular 외피 층이 임계 온도 20 ° c.의 밑에 냉각 하는 수 또는 전체 외피 비활성화 뿐만 아니라 같은 표면 대뇌 피 질의 비활성화 동작 평가 대뇌 피 질의 기능21translaminar dissociations 허용 수 있습니다.

이러한 다양성에도 불구 하 고 다음과 같은 제한 사항이 실험 설계 시 고려 되어야 한다. 냉각은 주어진된 대뇌 피 질의 영역에 모든 셀 형식을 비활성화에 대 한 뛰어난 접근, 그것은 optogenetic 비활성화 기술로 얻을 수 있는 세포 특이성을 비활성화 하는 수단을 제공할 수 없습니다. 또한, 45의 최소 필요 냉각 s cryoloop 온도 기능 비활성화 3.0 ± 1.0 ° C의 임계 온도에서 안정화 하기 전에. 따라서, 기능 비활성화를 달성 하는 데 필요한 시간 범위에 대 한 고려 사항 선택의 실험 프로토콜에 통합 되어야 한다.

전반적으로, 냉각 시스템은 최소한의 유지 보수를 필요합니다. 튜브 및 커넥터 냉각 회로의 누수에 대 한 정기적으로 검사 되어야 한다. 저수지 내에서 메탄올 메탄올을 미 립 자 물질에서 무료로 매주 대체 되어야 한다. 이식된 cryoloops는 또한 최소한의 유지 보수를 필요합니다. 여백 다음 수술 스크럽 솔루션 3% 과산화 수소 솔루션으로 주기적으로 청소 됩니다. 적절 한 사용과 관리, 이식된 cryoloops는 몇 년 동안 정기적으로 냉각 될 수 있다. 이러한 대뇌 피 질의 냉각 절차는 다른 행동 패러다임10,,1112 또는 electrophysiological 녹음 준비13,14 대체 동물 모델 에에서 적응 시킬 수 있다 15,17,,1822.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 (NSERC), 그리고 혁신을 위한 캐나다 재단의 지원을 인정 한다. C.W. 여는 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다 대학원 장학금 (NSERC) 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera IDS Imaging Development Systems GmbH Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing Restek 25306 Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump Fluid Metering, Inc. Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask Sigma-Aldrich F9401
Teflon tubing Ezkem A051754
Microprobe thermometer Physitemp Model: BAT-12
Flanged tube end fittings Valco Instruments Co. Inc. CF-1BK Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers Valco Instruments Co. Inc. CF-W1 Extra washers
Flanging kit Pro Liquid GmbH 201553
Tubing connector Restek 25323
Tubing cutter Restek 25069
Male thermocouple connector Omega SMPW-T-M Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire Omega PP-T-24S Used to make cable connection to thermometer
MATLAB MathWorks n/a

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References

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동작 문제 130 Cortical 냉각 cryoloop 고양이 운동 장애물 회피 메모리
가역 냉각 유도 Deactivations 공부 장애물 메모리 걷는 고양이에 대뇌 피 질의 기여를
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Wong, C., Lomber, S. G. ReversibleMore

Wong, C., Lomber, S. G. Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat. J. Vis. Exp. (130), e56196, doi:10.3791/56196 (2017).

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