Summary
Complexe motoriek in naturalistische omgevingen vereisen zorgvuldige coördinatie van de ledematen omvat de regio's van de pariëtale cortex. Het volgende protocol beschrijft het gebruik van omkeerbare koeling-geïnduceerde deactivering om aan te tonen van de rol van de pariëtale gebied 5 bij geheugen-geleide obstakel vermijden in de wandelende kat.
Abstract
Op complexe, naturalistische terrein, kan sensorische informatie over milieu obstakel worden gebruikt snel aanpassen motorische bewegingen voor vermijden. Bijvoorbeeld in de kat, kan visuele informatie over een dreigende belemmering moduleren intensivering voor vermijden. Locomotor aanpassing kan ook optreden los van visie, zoals plotselinge tactiele ingangen aan de been door verwachte obstakel kunnen wijzigen de intensivering van alle vier poten voor vermijden. Dergelijke complexe motorische coördinatie impliceert supraspinal structuren, zoals de pariëtale cortex. Dit protocol beschrijft het gebruik van omkeerbare, koeling-geïnduceerde corticale deactivering te beoordelen van de pariëtale cortex bijdragen aan geheugen-geleide obstakel motoriek bij de kat. Kleine koeling lussen, bekend als cryoloops, zijn speciaal gevormd om het deactiveren van de afzonderlijke regio's van belang zijn voor hun bijdragen aan een openlijke gedrag beoordelen. Dergelijke methoden zijn gebruikt om het toelichten van de rol van de pariëtale gebied 5 bij geheugen-geleide obstakel vermijden bij de kat.
Introduction
Op naturalistische, oneffen terrein, kunt sensorische informatie over obstakel, die kan worden verkregen via de visie of touch, snel wijzigen motoriek voor vermijden. Deze zorgvuldige coördinatie van stepping bewegingen omvat meerdere corticale gebieden1,2. Bijvoorbeeld, zijn gebieden van motorische cortex3,4 en6,7 van de5,van de pariëtale cortex betrokken tijdens complexe motorische taken zoals het obstakel te vermijden. In viervoetig dieren, moeten stap modulaties vereist voor obstakel te vermijden gelden voor zowel de voorpoten als de achterpoten. Als vooruit voortbewegen is vertraagd tussen de voorpoot en hindleg obstakel goedkeuring (die zich kan voordoen als een dier zorgvuldig door middel van een complexe, naturalistische omgeving stalking prooi loopvlakken), wordt informatie over het obstakel gehandhaafd in het geheugen gebruikt om te begeleiden de hindleg intensivering over het obstakel eens wandelen wordt hervat.
Experimentele technieken, gericht op het deactiveren van discrete corticale gebieden kunnen worden gebruikt om te studeren corticale bijdragen aan geheugen-geleide obstakel motoriek. Koeling-geïnduceerde corticale deactivering biedt een omkeerbaar, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de corticale bijdragen aan een openlijke gedrag8. Cryoloops vervaardigd van roestvast stalen buizen zijn specifiek voor de corticale interessegebied, vormige zorgen voor zeer selectieve en discreet deactivering van loci. Zodra geïmplanteerd, gekoeld methanol door het lumen van een cryoloop gepompt koelt de regio cortex direct onder de lus aan < 20 ° C. Kritische temperatuur, wordt synaptische transmissie in de regio van de cortex direct onder de lus geremd. Dergelijke deactivering kan worden omgekeerd door simpelweg ophouden de stroom van methanol. Deze methode is gebruikt voor het bestuderen van de corticale bijdragen aan zintuiglijke verwerking en gedrag9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, evenals de motorische controle van het saccadic oog bewegingen18 en geheugen-geleide obstakel motoriek19.
Het doel van dit protocol is met omkeerbare koeling-geïnduceerde deactiveringen te beoordelen van de betrokkenheid van de pariëtale corticale gebieden voor motorische coördinatie bij de kat. Specifiek, werd geheugen-geleide obstakel motoriek onderzocht met of zonder actieve pariëtale cortex. Deze methoden zijn gebruikt om aan te tonen met succes de rol van de pariëtale gebied 5 bij geheugen-geleide obstakel vermijden in de wandelende kat19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met inachtneming van de National Research Council gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (achtste editie; 2011) en de Canadese Raad op Animal Care's gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (1993), en werden goedkeuring door de University of Western Ontario dierlijke gebruik subcommissie van de Universiteitsraad op Animal Care.
De volgende procedure kan worden toegepast op experimenten studeren corticale bijdragen aan motorische controle in de wandelende kat.
1. apparaat
- Bouw van de apparatuur die wordt gebruikt om te beoordelen obstakel geheugen.
Opmerking: Het apparaat bestaat uit een 2.43 m lang, 29 cm breed wandelpad omsloten door 18 cm hoge heldere acryl muren (Figuur 1). Een smalle sleuf halverwege langs het apparaat maakt een 25,8 cm breed x 3 mm dikke hinderpaal worden opgeworpen op of verwijderd uit de loopbrug met behulp van een hendel onder het lopen oppervlak gemonteerd. - Vermijd het gebruik van de hand te verhogen of verlagen van het obstakel om ervoor te zorgen dat de aandacht van het dier wordt gehandhaafd op het eten. In plaats daarvan het obstakel kan worden verhoogd of verlaagd met de de experimentator been te gaan, de hefboom onder de loopbrug, waardoor de experimentator te blijven voeden van het dier.
- Het systeem van de hefboom om ervoor te zorgen dat het obstakel kan worden verhoogd of verlaagd geruisloos goed te onderhouden.
- Gebruik een kleine verhoogde platform (23 cm lang x 23 cm breed x 16 cm hoog) op welke zacht voedsel wordt geplaatst, om het begeleiden van de bewegingen van het dier.
- Het opnemen van alle proeven met behulp van een ethernet-camera (54 frames/sec) gemonteerd op een statief 1.85 m afstand van de middellijn van de loopbrug.
2. opleiding Procedures
Opmerking: Voor succesvolle data-acquisitie, een opleidingsduur voorafgaand aan het testen van de gedragsmatige zorgt ervoor dat elk dier is goed acclimated aan de testen kamer en apparatuur. Herhaalde blootstelling aan een nieuwe omgeving zal helpen bij het verminderen van verrassende of andere stressvolle gedrag. Acclimatisering kan variëren tussen dieren en 1-2 maanden van de opleiding kan vereisen. Eerste acclimatisering sessies mogelijk tot 5 min. lengte afhankelijk van de focus en de motivatie van het dier te eten. Volgende sessies moeten streven naar het verhogen van de duur van de tijd dat het dier is gemotiveerd om te werken (doorgaans ongeveer 20-25 min).
- Verwerven volwassen (> 6 maanden oud) binnenlandse kort haar katten uit een commerciële laboratorium Fokker van gewicht of geslacht.
Opmerking: Motivatie om te werken voor voedsel en een coöperatieve dispositie omvatten de selectiecriteria bij het overwegen welke dieren moeten worden opgenomen in de studie. - Acclimatiseren van elk dier aan het dragen van een harnas waaraan een 1 m lange riem is gekoppeld. Het verankeren van de leiband op een plank boven de loopbrug over het middelpunt van de loopbrug.
Opmerking: Dit maakt het mogelijk het dier te lopen langs het centrale deel van het apparaat zonder enige spanning, aldus kan bijdragen tot het dier binnen dit gedeelte van het apparaat te blijven. Tot de oprichting van dergelijke grenzen is handig voor het werken met een bewegend onderwerp van de test. - Plaats het dier op de loopbrug, zodat het eten van het platform waarop zacht voedsel wordt geplaatst.
Opmerking: Eén van de doelstellingen van deze initiële opleiding is ervoor te zorgen dat het dier gemakkelijk het voedsel platform volgt wanneer verplaatst naar voren en comfortabel kunt lopen met de kabelboom en riem. Het gebruik van zacht voedsel als positieve versterking stimuleert het dier blijven richten tijdens elke training of testen sessie en een comfortabele werkomgeving bevordert. - Ervoor zorgen dat het dier comfortabel met behandeling is, met inbegrip van gevallen waar het dier moet worden verplaatst naar het gebied van de start van de loopbrug.
3. gedrags Training en testen van Protocol
Opmerking: Het obstakel geheugen wordt beoordeeld in twee paradigma's: een visueel-afhankelijke obstakel geheugen, en een tactiele-afhankelijke obstakel geheugen taak. Tijdens de basisopleiding en het daaropvolgende testen moeten beide paradigma's worden gebruikt.
-
De belemmering van de visuele geheugen
- Om te beoordelen van de belemmering van het visuele geheugen, verhogen het obstakel op de loopbrug (figuur 2A). Plaats het platform aan de andere kant van het obstakel. Plaats het dier op het gebied van de start van de loopbrug.
- Laat het dier aan de aanpak van het voedsel, intensivering over het obstakel met alleen haar voorpoten om te eten van het platform.
- Als het dier eten blijft, verlagen het obstakel zodat het wordt uitgelijnd met de loopbrug om te voorkomen dat eventuele verdere visuele en tactiele ingangen.
- Na een vertragingsperiode van variabele, verplaatsen het voedsel vooruit opnieuw om het dier te hervatten lopen; deze vertraging kan worden minder dan 1 s tot meer dan 2 min.
- Nog belangrijker is, uit te voeren proeven waar het obstakel ontbreekt om te voorkomen dat gewenning aan de belemmering en de ontwikkeling van een reactie geleerd te vermijden. In deze visuele obstakel-afwezige proeven, ervoor zorgen dat de hindernis is niet aan de orde op de loopbrug alvorens het dier op het gebied van de start van de loopbrug.
- Observeren hindleg intensivering in obstakel-heden en belemmering-afwezige proeven om te controleren of de typische locomotor gedrag en intact visueel obstakel geheugen vóór het koelen. Ervoor zorgen dat het dier het obstakel zonder contact kunt wissen, dat intensivering van alle vier poten is aanzienlijk verhoogd in obstakel-heden proeven.
Opmerking: Kijken naar video's van opleiding proeven kan bijstaan in deze verificatie.
-
Voelbare belemmering geheugen
- Om te beoordelen de voelbare belemmering geheugen, zien erop toe dat de hindernis is niet aan de orde op de loopbrug alvorens het dier op het gebied van de start van de loopbrug (figuur 2B).
- Laat het dier te lopen naar de voedsel-platform geplaatst aan de andere kant van de belemmering sleuf.
- Als het dier eet, verhogen het obstakel op de loopbrug onder de schotel van levensmiddelen, voorkoming van visuele toevoer van het obstakel.
- Als het voedsel naar voren verplaatst wordt, merk op dat het dier moet contact opnemen met het obstakel met hun voorpoten voor intensivering eroverheen.
- Laat het dier te blijven eten, terwijl het grensoverschrijdende het obstakel tussen hun voor- en achterpoten. Gedurende deze tijd, door het obstakel te verlagen, zodat wordt het spoelen met de loopbrug om te voorkomen dat eventuele verdere visuele en tactiele ingangen.
- Na een vertragingsperiode van variabele, verplaatsen het voedsel vooruit nogmaals om het dier te hervatten wandelen.
- Nog belangrijker is, het uitvoeren van proeven waar het obstakel afwezig is en geen voorpoot contact vindt plaats ter voorkoming van gewenning aan de belemmering en de ontwikkeling van een reactie geleerd te vermijden.
- In deze voelbare belemmering-afwezige proeven, hebben de dierlijke aanpak en eten van de levensmiddelen-platform, zoals beschreven in stap 3.2.1. Echter verhogen en verlagen het obstakel (stap 3.2.2) alvorens het voedsel voorwaarts in stap 3.2.3. Ervoor zorgen dat een vergelijkbare vertragingsperiode waar het dier is toegestaan om door te gaan eten (stap 3.2.4) voorafgaat aan de laatste voortzetting van voortbewegen (stap 3.2.5).
- Observeer de intensivering in de hindernis-heden en belemmering-afwezige proeven om te controleren of de normale motorische gedrag en intact visueel obstakel geheugen vóór het koelen hindleg.
4. video Analyses
Opmerking: Om te beoordelen obstakel geheugen, analyses tijdens het initiële opleiding en de daaropvolgende testen na afkoeling lus implantatie betrekken kwantificeren van de piekhoogte stap, stap mijnen, en de horizontale afstand tussen de teen en obstakel op het hoogtepunt van elke stap voor zowel visuele en tactiele paradigma's (figuur 2C).
- De video's met behulp van aangepaste geschreven scripts te analyseren.
- Voor elke proef, track elke voet door de positie van de teen dichtst bij de camera gedurende elke stap te markeren.
- Meet de hoogte van de trede van de piek als de loodrechte afstand tussen de teen en het oppervlak van de loopbrug op het hoogste punt in elke stap traject (figuur 2C).
- In de proeven van de belemmering-heden, de goedkeuring van de stap als de Staphoogte direct boven de sleuf van de belemmering afgetrokken door de hoogte van de belemmering te meten.
- Bovendien meet de horizontale afstand tussen de teen en het obstakel op het hoogtepunt van elke stap in het belemmering-heden proeven.
- Bevestigen dat de belemmering geheugen capaciteiten intact vóór de lus koeling zijn door te verifiëren dat de piekhoogte stap is verheven in de hindernis-heden proeven in vergelijking met de intensivering in de proeven obstakel-afwezig.
5. cooling implantatie van de lus (Cryoloop)
- Implant cryoloops bilateraal over gebieden 5 en 7 volgens de eerder gemelde chirurgische ingrepen8 (Figuur 3).
- Kortom, voor elk halfrond, uitvoeren een craniotomy en de durotomy van Horsley-Clarke coördinaten20 A15 naar A25 bloot van het moment van de ansate en laterale Sulcus (hersenanatomie).
- Positie individuele koeling lussen vormige van 23-roestvrij staal hypodermic buizen met de lus in direct contact met de corticale oppervlak van pariëtale gebied 5 of 7.
- Veilig de basis van elke cryoloop op de schedel met tandheelkundige acryl verankerd aan de RVS-schroeven.
- Sluit de craniotomies met extra tandheelkundige acryl; opstellen van de marges van de huid tot de acryl randen en hechtdraad samen.
6. corticale koeling Protocol
-
Experimentele opstelling
Opmerking: Voordat het dier te brengen in de test kamer, het koel circuit is voorbereid en getest. Het koel circuit bestaat uit een reservoir van de methanol met een inleidbuis (3.2 mm od, 1,6 mm ID), een zuigercompressor zuigerpomp en droog ijsbad aangesloten via polytetrafluorethyleen buizen (1.6 mm od, 0.5 mm I.D.; Figuur 4). Bovendien is een digitale thermometer is vereist.- 500 cc droogijs aan 200 mL methanol in het ijsbad toevoegen. Fit buis eindigt zonder speling over de inlaat en de uitlaat van een dummy cryoloop om te voltooien van het koel circuit.
- Sluit de stekker van de thermokoppel aan een digitale thermometer voor voortdurende Temperatuurbewaking met behulp van een kabel die bestaat uit twee mannelijke Thermokoppel connectoren en een Thermokoppeldraad. Zorg ervoor dat de lengte van deze kabel voldoende is om het bereiken van het hoofd van het dier wanneer één eind is aangesloten op de thermometer.
- Zet de zuigerpomp met behulp van de schakeloptie.
Opmerking: De Methanol moet worden opgesteld van het reservoir, doorgegeven door de pomp aan het bad droogijs waar de vloeiende methanol in de slang zal worden afgekoeld tot-75 ° C. De gekoelde methanol zal vervolgens sluit het ijsbad en lopen door de bijgevoegde cryoloop voordat hij terugkeerde naar het reservoir van de methanol. - Zorgen dat de pomp instelling, lengte van de buis binnen het ijsbad en lengte van de slang uit het ijsbad aan de dummy lussen optimaal zijn zodat de dummy cryoloop temperatuur een steady-state rond de-5.0 ° C. bereiken kunt
Opmerking: Dergelijke temperaturen bereikt tijdens deze basisinstellingen zijn vaak voldoende voor het bereiken van de beproevingstemperatuur van 3,0 ± 1,0 ° C wanneer hetzelfde systeem wordt gebruikt om te koelen een geïmplanteerde cryoloop. Moeilijkheden bij het bereiken van voldoende koeling kan worden opgelost door het aanpassen van de snelheid van de pomp, verhoging van de lengte van de buizen onder water binnen het ijsbad, en/of het minimaliseren van de lengte van de slang uit het ijsbad aan de cryoloop. - Indien nodig, het verlengen van een gedeelte van de buis door het uiteinde van de buis door een buis eindfitting threading en flens van het uiteinde van de buis met een flanging gereedschap. Bevestig buis van een gewenste lengte met een evenzo flens einde met behulp van een verbindingslijn.
- Controleer of alle aansluitingen zijn knus en geen lekken zijn aanwezig. Zodra de tevredengesteld met de initiële installatie, de pomp uit te schakelen en verwijder de dummy cryoloop; het circuit is nu voorbereid op een proefdier.
-
Testen van de gedragsmatige
- Plaats het dier op het testen apparaat. Schuif het harnas over het hoofd en de riem snuggly rond het dier veilig. Bevestig de leiband.
- Verwijder de beschermende dop van de geïmplanteerde cryoloop bloot van de inlaat en uitlaat buizen. Fit buis eindigt zonder speling over de inlaat en uitlaat buizen van de cryoloop. Hiermee sluit u de thermokoppel aan op de digitale thermometer.
- Beginnen de test sessie met een visuele (stap 3.1) of tactiele (stap 3.2) belemmering geheugen proces. Volgen met bijkomende proeven van alle vier typen (visuele obstakel-heden, visuele obstakel-afwezig, voelbare belemmering-heden, tactiele hindernis-afwezig) op een willekeurige manier.
Opmerking: Een typische testen sessie bestaat uit een 'warme' blok van proeven, waar geheugen-geleide obstakel te vermijden wordt waargenomen in de afwezigheid van een koelventilators om vast te stellen maatregelen van de basislijn. - Zet de zuigerpomp, en wachten op de cryoloop te bereiken een temperatuur van 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Vervolgens voert u een 'cool' blok van proeven nadat de zuigerpomp heeft aangezet. Tijdens dit blok van proeven, beoordelen indien nodig, bijdragen van de gekoelde ruimte geheugen-leiden. Zorgen dat de temperatuur van de cryoloop bij 3,0 ± 1,0 ° C gedurende het hele blok.
Opmerking: Alle vier proef typen moeten willekeurig worden afgewisseld in het blok. - Een definitieve 'rewarm' blok van proeven worden uitgevoerd nadat de zuigerpomp is uitgeschakeld, en de cryoloop is teruggekeerd naar de oorspronkelijke temperatuur.
Opmerking: Basislijn stepping gedrag is hersteld tijdens dit blok. Opnieuw, moeten alle vier proef typen willekeurig afgewisseld worden in het blok.
-
Opruimen
- Wanneer het gedrags testen is gesloten, de slang uit de inlaat en uitlaat buizen verwijderen. Worden bewuste residuele methanol die kan druppelen van de uiteinden van de buis en het dier kunnen irriteren.
- Ervoor zorgen dat het beschermkapje is vervangen. Verwijder de leiband en harnas alvorens het dier terug te keren naar de kolonie. Trim de buis uiteinden (3-4 mm) met behulp van een cutter buis om te voorkomen dat lekkende verbindingen op de volgende tests dag.
7. controle van de mate van koeling
- Aan het eind van het testen van de gedragsmatige, bevestigen dat de omvang van de deactivering is beperkt tot de regio van cortex direct onder elke cryoloop met behulp van de eerder gemelde technieken8.
Opmerking: Dit kan worden gecontroleerd met thermocline toewijzing12 of met een thermische beeldvorming camera13,14,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is met succes gebruikt om het onderzoeken van de pariëtale cortex bijdragen aan belemmering geheugen in de wandelende kat19. In deze studie werden cryoloops geïmplanteerd bilateraal over pariëtale gebieden 5 en 7 op de drie volwassenen (> 6 maanden oud) vrouwelijke katten (figuur 5A). Dieren werden beoordeeld in het paradigma geheugen voelbare belemmering in de afwezigheid van koeling (warm, controle voorwaarde), of het gebied met 5 of 7 toen bilateraal gedeactiveerd.
De representatieve resultaten van dat onderzoek tonen aan dat wanneer gebied 5 werd bilateraal gekoeld, hindleg intensivering was aanzienlijk verzwakt in de hindernis-heden proeven (figuur 5D, blauw). In de warme voorwaarde was de gemiddelde piekhoogte voor stap voor begin en einde van de achterpoten 9.5 ±2.2 cm en 8.0 ±2.1 cm, respectievelijk. Een one-way multivariate ANOVA geopenbaard dat als gebied 5 werd gekoeld, de piekhoogte stap voor begin en einde van de achterpoten aanzienlijk werd verlaagd tot 4.3 ±2.2 cm (p < 0.0001) en 3.4 ±1.4 cm (p < 0.0001), respectievelijk. De piekhoogte stap van de voorpoten in de hindernis-heden proeven of van een been in de proeven obstakel-afwezig was niet beïnvloed door gebied 5 deactivering. De piekhoogte stap voor elke etappe in obstakel-heden of belemmering-afwezige proeven ook niet afwijken van de warme voorwaarde wanneer gebied 7 werd gedeactiveerd.
Bovendien werd de hindleg stap goedkeuring ook beïnvloed wanneer gebied 5 werd gedeactiveerd. In vergelijking met zowel warm als gebied 7 gekoeld voorwaarden, stap goedkeuring werd gereduceerd tot 4,7 cm van de ±2.2 in de leidende hindleg stap (p < 0,0001; Figuur 5 g) en −5.6 ±1.4 cm in de afsluitende hindleg stap (p < 0.0001). Stap traject van de afsluitende hindleg werd bovendien beïnvloed door gebied 5 deactivering, zoals de piek is opgetreden voordat het obstakel, in tegenstelling tot de intensivering in zowel warm als gebied 7 gekoelde voorwaarden (Figuur 5 g).
Over het geheel genomen dergelijke wijzigingen in de piekhoogte stap, stap goedkeuring en stap traject aangegeven diepe obstakel geheugen tekorten wanneer gebied 5 werd gedeactiveerd. Nog belangrijker is, zoals het gebied 5 deactivering alleen veranderd van de kenmerken van hindleg intensivering in obstakel-heden proeven en deed geen afbreuk aan de mogelijkheid om stepping bewegingen, weerspiegelen deze waargenomen veranderingen in de motoriek geheugen, niet motorische tekorten. Bovendien bevestigd thermografie uitgevoerd aan het einde van het testen van de gedragsmatige dat koeling beperkt tot gebied 5 of 7 was toen elke lus werd individueel gekoeld voor elk halfrond (Figuur 6). Dus over het geheel genomen, deze resultaten tonen aan de bijdragen van de pariëtale gebied 5 geheugen-geleide obstakel motoriek bij de kat.
Figuur 1: Diagram van de beeltenis van de camera, koelinstallatie en apparatuur die wordt gebruikt om te beoordelen obstakel geheugen in de cat. wandelen Een 2.43 meter lang, 29 cm breed wandelpad is omsloten door 18 cm hoge helder Plexiglas muren. Halverwege langs het wandelpad, een 25,8 cm breed 3 mm dik obstakel kan worden verhoogd op de loopbrug door een smalle groef met behulp van een hendel onder de loopbrug gemonteerd. Voor elk afzonderlijk experiment, is het dier een paar stappen van het obstakel in de startende gebied van de loopbrug geplaatst. Voedsel is geplaatst op een kleine verhoogde platform (23 cm lang x 23 cm breed x 16 cm hoog) aan de andere kant van de sleuf van de hindernis tegenover het start gebied. Alle proeven worden geregistreerd via een Ethernet-camera gemonteerd op de top van een statief en opgeslagen op een laptop. Dit cijfer is gewijzigd van Wong et al. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Diagram waarin u ziet zowel visuele en tactiele obstakel geheugen taken en de stap metingen gebruikt voor de beoordeling van de belemmering geheugen in de wandelende cat. (A) te beoordelen van de belemmering van de visuele geheugen, het obstakel wordt opgeworpen op de loopbrug als het dier de voedsel-platform nadert. Na de intensivering over het obstakel met alleen haar voorpoten, is het dier toegestaan om te eten van het platform, zoals het obstakel is verlaagd heimelijk steeds spoelen met het oppervlak van de loopbrug. Na een vertragingsperiode van de variabele, wordt het voedsel vooruit verplaatst ter bevordering van het dier te hervatten wandelen. (B) te beoordelen van voelbare belemmering geheugen, de hindernis is niet aan de orde op de loopbrug als het dier de voedsel-platform nadert. Als het dier eet, wordt het obstakel opgeworpen stil op de loopbrug direct onder het platform van voedsel. Het voedsel wordt verplaatst vooruit waardoor de voorbenen van het dier te contacteren het obstakel voor intensivering eroverheen. Het dier mag blijven eten van het voedsel-platform, terwijl grensoverschrijdende het obstakel tussen zijn voorpoten en de achterpoten. Gedurende deze tijd, is het obstakel heimelijk verlaagd van de looppaden. Het voedsel voorwaarts verplaatst nogmaals om het dier te hervatten wandelen. Hindleg stappen worden gemeten om te beoordelen obstakel geheugen. (C) Stepping wordt beoordeeld in zowel visuele en tactiele obstakel geheugen paradigma's door het meten van de piekhoogte stap, stap mijnen, en de horizontale afstand tussen het hoogtepunt van elke stap en het obstakel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische van de cryoloop. De cryoloop bestaat uit een beschermkap, die over de inlaat en uitlaat buizen past. Deze buizen lopen door een thread post en vormt de lus die in direct contact met de corticale oppervlakte over de regio van belang zit. Een microthermocouple zit soldeerder bij de Unie van de lus om de temperatuur van de cryoloop te meten. De draden terug aanloop via de heat-shrink tubing (die ook loopt de RVS-buis) en aan een verbindingslijn zijn gekoppeld. De hele vergadering wordt aan de schedel met tandheelkundige acryl vastgezet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: het koel circuit. Het koel circuit bestaat uit de methanol reservoir, zuigercompressor zuigerpomp ijsbad, thermometer en cryoloop. Om te koelen, opstelt de pomp methanol uit het reservoir via de inleidbuis (1.6 mm ID). De methanol sluit u de pomp door de buis van polytetrafluorethyleen (0.5 mm ID) en door wordt gepompt naar de droog ijsbad, waar de vloeiende methanol in de buis wordt gekoeld tot-75 ° C. De gekoelde methanol vervolgens sluit u het ijsbad en loopt door de bijgevoegde cryoloop voordat hij terugkeerde naar de methanol-reservoir. Deze cryoloop kan een dummy lus (niet geïmplanteerd) gebruikt tijdens de oorspronkelijke setup, of kan een geïmplanteerde cryoloop in een proefdier. De cryoloop is ook verbonden met een digitale thermometer lus temperatuur die overal in het testen van de gedragsmatige opnemen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: omkeerbare, koeling-geïnduceerde deactivering van de pariëtale gebied 5 resultaten obstakel geheugen tekorten. (A) zijdelingse weergave van de rechter hersenhelft van de hersenen van de kat cryoloops geïmplanteerd direct boven de pariëtale gebieden 5 (blauw) en 7 (groen) onderzocht in Wong et al. toont 19 D: dorsale, A: anterior. (B--E) Bar percelen beeltenis bedoel stap hoogte ± SD voor belemmering-deze (B, D) en belemmering-afwezige proeven (C, E) voor de voorpoten (B, C) en achterpoten (D, E) voor warme (rode), gebied 5 gekoeld (blauw), en gebied 7 gekoelde voorwaarden ( groen). Staphoogte werd aanzienlijk teruggebracht in zowel de voorloop- en volgspaties achterpoten in de hindernis-heden proeven wanneer gebied 5 werd gedeactiveerd. (F) Bar perceel beeltenis van gemiddelde hindleg stap klaring ± SD voor elke koeling voorwaarde. Gebied 5 deactivering resulteerde in beperkte goedkeuring voor zowel begin en einde van de hindleg stappen. (G) Bar perceel beeltenis van de gemiddelde horizontale afstand tussen het hoogtepunt van elke stap en het obstakel voor elke koeling voorwaarde. Wanneer gebied 5 werd gekoeld, stap trajecten werden meer variabele en verschilde aanzienlijk van warm en gebied 7 gekoelde voorwaarden. p < 0.005, **p < 0.0001, n.s.: niet significant. Dit cijfer is gewijzigd van Wong et al. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: thermografie gebruikt om te bevestigen beperkt deactivering van ruimte met 5 of 7 tijdens het koelen. (A) foto afgebeeld cryoloops contact pariëtale gebieden 5 en 7 van de rechter hersenhelft. Boven is dorsale, rechts is anterior. Onderbroken lijn geeft de grens tussen de pariëtale gebieden 5 en 7. (B-C) Thermische beelden van de pariëtale corticale oppervlak gefotografeerd wanneer het gedeelte van het cryoloop over gebied 5 (B) of 7 (C) was afgekoeld tot 3 ° C. Dit cijfer is gewijzigd van Wong et al. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven paradigma werkzaam koeling-geïnduceerde deactiveringen van discrete corticale gebieden met behulp van de cryoloop te bestuderen van de geheugen-geleide obstakel motoriek bij de kat. De belemmering van de visuele en tactiele geheugen paradigma's zijn vrij eenvoudig voor dieren uit te voeren zoals zij naturalistische motorische problemen met een minimale inspanning exploiteren bij een dier is gemotiveerd om te volgen een bewegende voedselbron. Dus, de meerderheid van de stage is gewijd aan het wennen van het dier, het testen van de kamer en koelinstallatie. De meeste dieren vereisen herhaalde blootstelling aan het dragen van de kabelboom en worden aangebonden via de leiband voordat comfortabel en natuurlijk vier wijd op het apparaat. Bovendien, tijdens de test, kan het geluid van de zuigerpomp afleiden of schrikken van het dier. Voltooiing van de koeling circuit met de dummy cryoloop en uitvoeren van de pomp tijdens de initiële opleiding kunnen het dier om te acclimatiseren aan het geluid van de pomp. Ondanks voldoende opleiding voorafgaand aan testen, zal er wellicht een beperkte tijd voor het testen voordat het dier onrustig wordt. Daarom voldoende tijd wordt besteed om de juiste instelling en oplossen van voorafgaand aan het dier te brengen door de test kamer zal optimaliseren van latere gegevensverzameling.
Moeite om voldoende koeling te bereiken kan worden aangepakt door het aanpassen van het toerental van de pomp. Echter, moet aandacht worden besteed aan de toenemende druk die kan leiden tot met de slang worden gedwongen uit de inlaat of uitlaat buizen van de cryoloop. Als alternatief kan de lengte van de buis ondergedompeld in het ijsbad worden verhoogd zodat er meer tijd om te relaxen van de stroom van methanol binnen de buizen. Bovendien, om ervoor te zorgen dat de lengte van de buis van de plaats van uitgang uit het ijsbad aan de cryoloop zo kort mogelijk zal minimaliseren verlies van koeling. Echter moet deze afstand ook zijn lang genoeg opdat voldoende aanbod van voortbewegen voor een bepaalde gedrags paradigma. Met de flexibele schuim verpakking voor het optimaliseren van de koeling efficiëntie kan worden geïsoleerd. Deze verpakking kan ook voorkomen dat de druppels condens die vormen rond de buis op het dier vallen die kunnen irriteren of schrikken van het dier. Tijdens het testen, ervoor te zorgen een snug passen van de slang over de inlaat en uitlaat buizen van de cryoloop kunnen maken van een verbinding van de cryoloop moeilijk. Het dragen van een nitril of latex handschoen kan bieden een betere grip van de buis. Ervoor te zorgen dat het dier comfortabel is en patiënt terwijl de experimentator de buis hecht essentieel is. Voedsel kan worden gebruikt om het dier stationaire en inhoud.
Cryoloops kan routinematig worden gekoeld opbrengst zeer reproduceerbaar wijzigingen in gedrag wanneer een bepaald gebied wordt gedeactiveerd. Door dezelfde taak in de aanwezigheid en de afwezigheid van corticale deactivering binnen hetzelfde dier te bepalen, mag het totale aantal proefdieren worden verminderd. Bovendien kan de mate van koeling worden gemanipuleerd om verdere corticale bijdragen aan een specifieke gedrag opgeven. Zowel unilaterale en bilaterale deactiveringen kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd in hetzelfde dier mogelijk lateralization effect van een gedrag te onderzoeken. Bovendien kan de mate van koeling te onderzoeken laminaire bijdragen worden gevarieerd. Door afkoeling cryoloops aan de corticale oppervlakte 3.0 ±1.0 ° C, zijn alle zes lagen van cortex direct onder elke lus afgekoeld tot < 20 ° C, remming van de neuronale blancobepalingen activiteit22. U kunt ook kan cryoloops worden afgekoeld tot 8.0 ±1.0 ° C, die selectief koelt alleen de supragranular corticale lagen onder deze kritische temperatuur van 20 ° C. Beoordeling van gedrag met dergelijke oppervlakkige corticale deactivering evenals volledige corticale Deactivering mag translaminar dissociations van corticale functie21.
Ondanks deze veelzijdigheid, moeten de volgende beperkingen tijdens proefopzet worden beschouwd. Terwijl de koeling is een uitstekende aanpak voor alle celtypes in een bepaalde regio van de corticale deactiveren, voorzien niet het middel van deactivering door de cellulaire specificiteit die mag worden bereikt met optogenetic deactivering technieken. Bovendien, koeling vereist een minimum van 45 s voordat cryoloop temperaturen op de kritische temperatuur van 3.0 ±1.0 ° C voor functionele deactivering stabiliseren. Overwegingen voor de tijdsspanne die nodig zijn om functionele deactivering moeten dus worden opgenomen in het experimentele protocol van keuze.
Over het geheel genomen vereist het koelsysteem minimaal onderhoud. Leidingen en aansluitingen van de koeling circuit moeten regelmatig worden gecontroleerd op lekken. De methanol binnen het reservoir worden wekelijks vervangen om ervoor te zorgen dat de methanol vrij van zwevende deeltjes is. Geïmplanteerde cryoloops vereisen ook minimaal onderhoud. De marges zijn op gezette tijden gereinigd met een 3% waterstof peroxide oplossing gevolgd door een chirurgische scrub-oplossing. Met het juiste gebruik en verzorging, kan geïmplanteerde cryoloops routinematig worden gekoeld voor vele jaren. Deze corticale koeling procedures kunnen worden aangepast aan andere gedrags paradigma's10,11,12 of elektrofysiologische opname preparaten13,14 in alternatieve diermodellen 15,17,18,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We mijn dankbaarheid uitspreken aan de steun van de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada (NSERC) en de Stichting van Canada voor innovatie. C.W. werd gesteund door een Alexander Graham Bell Canada Graduate beurs (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
