Summary
Komplexe Fortbewegung in naturalistischen Umgebungen erfordern sorgfältige Koordination der Gliedmaßen beinhaltet Regionen des parietalen Kortex. Das folgende Protokoll beschreibt den Einsatz der reversiblen Kühlung-induzierte Deaktivierung die Rolle des parietalen Bereich 5 in Speicher-geführte Hindernis-Vermeidung in der zu Fuß Katze zu demonstrieren.
Abstract
Sensorischer Informationen über ökologische Hindernis ist auf komplexe, naturalistische Terrain lässt sich rasch lokomotorische Bewegungen zur Vermeidung anpassen. Beispielsweise kann bei der Katze, visueller Informationen über bevorstehende Hindernis modulieren stepping für Vermeidung. Bewegungsapparates Anpassung kann auch unabhängig von der Vision, auftreten, wie plötzliche taktile Eingaben an das Bein von einem erwarteten Hindernis zur Vertiefung aller vier Beine für Vermeidung ändern können. Solche komplexen Bewegungsapparat umfasst supraspinalen Strukturen, z. B. der parietalen Kortex. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz der reversibel, Kühlung-induzierte kortikalen Deaktivierung parietalen Kortex Beiträge zur Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung bei der Katze zu beurteilen. Kleine Abkühlung Schleifen, bekannt als Cryoloops, sind speziell geformt, um diskrete Regionen von Interesse für ihre Beiträge zu einem offenkundigen Verhalten beurteilen zu deaktivieren. Solche Methoden wurden verwendet, um die Rolle der parietalen Bereich 5 in Speicher-geführte Hindernis Vermeidung bei der Katze zu erhellen.
Introduction
Auf naturalistische, unebenen Gelände kann sensorischer Informationen über ein Hindernis, die Vision per Touch erworben werden können, schnell Fortbewegung zur Vermeidung ändern. Diese sorgfältige Abstimmung der Schrittmotor Bewegungen beinhaltet mehrere kortikalen Regionen1,2. Zum Beispiel haben Bereiche des motorischen Kortex3,4 und parietalen Kortex5,6,7 bei komplexen motorischen Aufgaben wie Hindernis Vermeidung verwickelt. Bei vierbeinigen Tieren müssen Schritt Modulationen erforderlich zur Vermeidung von Hindernis auf den Vorderbeinen und Hinterbeinen erstrecken. Wenn vorwärts Fortbewegung zwischen den Vorderlauf und Hinterläufen Hindernisfreiheit verzögert wird (die auftreten können, wie ein Tier sorgfältig durch eine komplexe, naturalistische Umwelt stalking Beute tritt), dient Informationen über das Hindernis im Speicher beibehalten führen das Hinterbein verstärkt über das Hindernis einmal zu Fuß fortgesetzt wird.
Experimentelle Techniken zur diskreten kortikalen Bereiche deaktivieren können verwendet werden, kortikale Beiträge zur Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung zu studieren. Kühlung-induzierte kortikalen Deaktivierung bietet eine Reversible, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Bewertung von kortikalen Beiträge zu einer offenkundigen Verhalten8. Cryoloops aus Edelstahlrohren gefertigt sind spezifisch für die kortikalen Bereich von Interesse, geformt sehr selektiv und diskrete Deaktivierung der Loci zu gewährleisten. Einmal implantiert, gekühlte Methanol durch das Lumen der ein Cryoloop gepumpt, kühlt die Region der Hirnrinde direkt unterhalb der Schleife zu < 20 ° C. Unterhalb dieser kritischen Temperatur ist in der Region der Hirnrinde direkt unterhalb der Schleife synaptische Übertragung gehemmt. Diese Deaktivierung kann umgekehrt werden, indem Sie einfach aufhören den Fluss von Methanol. Diese Methode wurde zur kortikalen Beiträge zur sensorischen Verarbeitung und Verhaltensweisen9,10,11,12,13,14,15 studieren , 16 , 17, sowie die Motorsteuerung saccadischen Auge Bewegungen18 und Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung19.
Dieses Protokoll soll reversible Kühlung-induzierte Deaktivierungen verwenden, um die Beteiligung der parietalen kortikalen Bereiche der motorischen Koordination bei der Katze zu beurteilen. Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung war speziell, mit oder ohne aktive parietalen Kortex untersucht. Mit diesen Methoden haben erfolgreich die Rolle des parietalen Bereich 5 in Speicher-geführte Hindernis Vermeidung zu Fuß Katze19nachzuweisen.
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Protocol
Alle Verfahren wurden durchgeführt in Einklang mit den nationalen Forschungsrat Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (achte Auflage, 2011) und des Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (1993), und waren von der University of Western Ontario tierischen Einsatz Unterausschuss des Universitätsrats auf Animal Care genehmigt.
Das folgende Verfahren kann auf Experimente studieren kortikalen Beiträge zur lokomotorischen Kontrolle in der zu Fuß Katze angewendet werden.
(1) Apparat
- Konstruieren Sie die Vorrichtung verwendet, um Hindernis Speicher zu bewerten.
Hinweis: Das Gerät besteht aus einem 2,43 m lang, 29 cm breite Gehweg umgeben von 18 cm hohen klaren Acryl Mauern (Abbildung 1). Ein schmaler Schlitz auf halber Strecke der Apparat ermöglicht ein 25,8 cm breit X 3 mm dicken Hindernis angehoben auf oder entfernt von der Promenade mit einem Hebel unter der Lauffläche angebracht werden. - Um sicherzustellen, dass die Aufmerksamkeit des Tieres auf das Essen gewartet ist, verwenden Sie die Hand heben oder senken das Hindernis. Stattdessen das Hindernis kann angehoben werden oder gesenkt, mit der Experimentator Bein bewegen der Hebel unterhalb der Gehweg, so dass des Experimentators weiterhin das Tier füttern.
- Pflegen Sie richtig die Hebel-System, um sicherzustellen, dass das Hindernis kann angehoben oder werden lautlos abgesenkt.
- Verwenden eine kleinen erhöhte Plattform (23 cm lang x 23 cm Breite X 16 cm hoch) auf welche weiche Nahrung platziert wird, um Bewegungen des Tieres führen.
- Notieren Sie alle Prüfungen mit einem Ethernet-Kamera (54 Bilder/s), montiert auf einem Stativ 1,85 m Weg von der Mittellinie des Gehweges.
(2) Trainingsverfahren
Hinweis: Für erfolgreiche Data Acquisition, sorgt für ein Zeitraum der Ausbildung vor Verhaltens testen, dass jedes Tier die Prüfung Raum und Apparat richtig gewöhnt ist. Wiederholter Exposition zu einer neuartigen Umwelt hilft bei der Reduzierung der überraschender oder anderen belastender Verhaltensweisen. Akklimatisierung variieren zwischen Tieren und 1-2 Monate der Ausbildung erfordern. Anfängliche Akklimatisierung Sitzungen können bis zu 5 min Länge abhängig von der Konzentration und Motivation des Tieres zu essen sein. Nachfolgende Sitzungen soll die Dauer der Zeit zu erhöhen, die das Tier (in der Regel etwa 20-25 min) arbeiten motiviert ist.
- Reife zu erwerben (> 6 Monate alt) inländischen kurze Haare Katzen von einem kommerziellen Labor Züchter von Gewicht oder Geschlecht.
Hinweis: Motivation, für Essen und eine kooperative Disposition Arbeiten umfassen die Auswahlkriterien wenn man bedenkt, welche Tiere in die Studie aufgenommen werden sollen. - Jedes Tier trägt ein Geschirr, an dem eine 1 m lange Leine, zu gewöhnen. Verankern Sie die Leine auf einem Regal über dem Gehweg über dem Mittelpunkt des Gehweges.
Hinweis: Dies ermöglicht das Tier zu Fuß entlang der zentrale Teil des Apparates ohne jede Spannung, fördert so das Tier innerhalb dieses Teils des Apparates zu bleiben. Solche Grenzen ist hilfreich für die Arbeit mit einem sich bewegenden Motiv Test. - Legen Sie das Tier auf den Gehweg, ermöglicht es, von der Plattform zu Essen auf dem weichen Lebensmittel gelangen.
Hinweis: Ein Ziel dieses ersten Trainings besteht darin, dass das Tier ohne weiteres die Lebensmittel-Plattform beim nach vorne verschoben folgt und kann bequem Fuß, mit Geschirr und Leine. Die Verwendung von weiche Nahrung als positive Verstärkung fördert das Tier während jeder Sitzung Ausbildung oder Prüfung konzentriert bleiben, und ein komfortables Arbeitsumfeld. - Stellen Sie sicher, dass das Tier fühlt sich wohl bei Handhabung, einschließlich der Fälle, wo das Tier in den Startbereich des Gehweges verschoben werden muss.
(3) Verhaltens-Training und Testprotokoll
Hinweis: Das Hindernis Gedächtnis bemisst sich in zwei Paradigmen: ein visuell-abhängige Hindernis Speicher Aufgabe und eine taktile-abhängige Hindernis-Speicher-Aufgabe. Beide Paradigmen sollte während der Erstausbildung und der anschließenden Tests verwendet werden.
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Visuelle Hindernis Speicher
- Zur Beurteilung des visuellen Hindernis Speichers erhöhen Sie das Hindernis auf dem Gehweg (Abbildung 2A). Legen Sie die Plattform, auf der anderen Seite des Hindernisses. Legen Sie das Tier im Startbereich des Gehweges.
- Lassen Sie das Tier zu essen, verstärkt über das Hindernis mit nur seine Vorderbeine um Essen von der Plattform zu nähern.
- Da das Tier weiter zu essen, das Hindernis zu senken, so dass es bündig mit dem Gehweg, eine weitere visuellen oder taktilen Eingaben zu verhindern wird.
- Im Anschluss an eine Variable Verzögerungszeit bewegen Sie das Essen nach vorne wieder zu ermutigen, das Tier wieder zu Fuß; Diese Verzögerung kann weniger als 1 s, bis zu 2 min.
- Führen Sie wichtig ist, Studien wo fehlt das Hindernis um Gewöhnung an das Hindernis und die Entwicklung einer Gelehrten Vermeidung Antwort zu vermeiden. Solche visuelle Hindernis-abwesend-Prüfungen sicherstellen Sie, dass das Hindernis auf dem Gehweg nicht ausgelöst wird, bevor Sie das Tier im Startbereich des Gehweges platzieren.
- Beobachten Sie Hinterbein treten in Hindernis-Gegenwart und Hindernis-fehlen Studien typischen Bewegungsorgane Verhaltensweisen und intakte visuelle Hindernis Speicher vor der Kühlung zu überprüfen. Sicherstellen Sie, dass das Tier kann das Hindernis ohne Kontakt, und dieser Verstärkung aller vier Beine in Hindernis-heute Studien deutlich erhöht ist.
Hinweis: Ansehen von Videos von Training Studien kann in diese Überprüfung unterstützen.
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Taktile Hindernis Speicher
- Um die taktile Hindernis Erinnerung zu beurteilen, sicherzustellen Sie, dass das Hindernis auf dem Gehweg nicht ausgelöst wird, bevor Sie das Tier im Startbereich des Gehweges (Abbildung 2 b) platzieren.
- Lassen Sie das Tier zu Fuß in Richtung der Lebensmittel-Plattform platziert auf der anderen Seite des Schlitzes Hindernis.
- Da das Tier frisst, heben Sie das Hindernis auf dem Gehweg unter der Futternapf visuelle Eingaben des Hindernisses zu verhindern.
- Als das Essen nach vorne verschoben wird, beachten Sie, dass das Tier das Hindernis mit den Vorderbeinen kontaktieren sollten, vor dem Betreten drüber.
- Lassen Sie das Tier weiterhin essen während gebietsübergreifenden das Hindernis zwischen ihrer Vorder- und Hinterbeine. Während dieser Zeit senken Sie das Hindernis, so dass es bündig mit dem Gehweg, eine weitere visuellen oder taktilen Eingaben zu verhindern wird.
- Im Anschluss an eine Variable Verzögerungszeit bewegen Sie das Essen nach vorne wieder zu ermutigen, das Tier zu Fuß fortsetzen.
- Wichtig ist, führen Studien wo fehlt das Hindernis und Schließer Vorderbeins tritt zur Vermeidung von Gewöhnung zum Hindernis und zur Entwicklung einer Gelehrten Vermeidung Antwort.
- In diesen taktilen Hindernis-abwesend-Studien haben den tierischen Ansatz und Essen aus der Lebensmittel-Plattform, wie unter Punkt 3.2.1 beschrieben. Jedoch heben Sie und senken Sie das Hindernis (Schritt 3.2.2) vor dem Einzug der Nahrung nach vorn Schritt 3.2.3. Stellen Sie sicher, dass eine ähnliche Verzögerungszeit, wo das Tier Essen (Schritt 3.2.4) weiterhin erlaubt ist, die letzte Fortsetzung der Fortbewegung (Schritt 3.2.5) vorausgeht.
- Beobachten Sie den Hinterläufen verstärkt in der Hindernis-Gegenwart und Hindernis-fehlen Studien normale Bewegungsorgane Verhaltensweisen und intakte visuelle Hindernis Speicher vor der Kühlung zu überprüfen.
4. Videoanalysen
Hinweis: Um Hindernis Speicher zu beurteilen, beinhalten Analysen während der Erstausbildung und der anschließenden Tests nach dem Abkühlen Schleife Implantation Quantifizierung der Peakhöhe Schritt, Schritt Abstand und der horizontale Abstand zwischen den Zehen und Hindernis auf dem Höhepunkt der einzelnen Schritte für visuelle und taktile Paradigmen (Abbildung 2).
- Analysieren Sie die Videos mit benutzerdefinierten geschriebene Skripte.
- Verfolgen Sie für jede Prüfung jeden Fuß durch die Markierung der Position der Zehe am nächsten an der Kamera in jedem Schritt.
- Messen Sie die Peakhöhe Schritt als der senkrechte Abstand zwischen der Zehe und der Oberfläche des Gehweges auf dem höchsten Punkt in jedem Schritt Flugbahn (Abbildung 2).
- Messen Sie in den Hindernis-heute war der Schritt Abstand als die Schritt Höhe direkt über dem Hindernis-Steckplatz subtrahiert von der Höhe des Hindernisses.
- Darüber hinaus messen Sie den horizontalen Abstand zwischen den Zehen und das Hindernis auf dem Höhepunkt der einzelnen Schritte in der Hindernis-Gegenwart-Studien.
- Bestätigen Sie, dass die Hindernis-Speicher-Funktionen sind intakt vor der abkühlenden Schleife Implantation durch überprüfen, ob die Peakhöhe Schritt in der Hindernis-heute Studien im Vergleich zu treten in der Hindernis-abwesend-Studien erhoben wird.
(5) Kühlung Implantation von Loop (Cryoloop)
- Implantat-Cryoloops bilateral über Bereiche 5 und 7 nach zuvor gemeldeten Operationsverfahren8 (Abbildung 3).
- Kurz gesagt, für jede Hemisphäre führen Sie eine Kraniotomie und Durotomy von Horsley-Clarke Koordinaten20 A15 nach A25, die Stelle des ansate und seitlichen Furchen verfügbar zu machen.
- Lage individuelle Kühlung Schleifen geformt aus 23-Gauge subkutane Edelstahlrohren mit der Schleife in direktem Kontakt mit der kortikalen Oberfläche des parietalen Bereich 5 oder 7.
- Sichern Sie die Basis jedes Cryoloop an den Schädel mit dental Acryl mit Edelstahl-Schrauben verankert.
- Schließen Sie die Kraniotomien mit zusätzlichen zahnärztliche Acryl; erstellt am Rande der Haut bis hin zu Acryl Kanten und Naht zusammen.
(6) kortikale Kühlung Protokoll
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Versuchsaufbau
Hinweis: Bevor Sie das Tier in den Prüfraum zu bringen, ist der Kühlkreislauf vorbereitet und getestet. Der Kühlkreislauf besteht aus einem Methanol-Stausee mit einem Ansaugrohr (3,2 mm O.D, 1,6 mm I.D.), ein hin-und hergehenden Kolben-Pumpe und Trockeneis Bad verbunden über Polytetrafluorethylen Rohr (1,6 mm O.D, 0,5 mm I.D.; ( Abbildung 4). Darüber hinaus ist ein digitales Thermometer erforderlich.- 200 mL Methanol in das Eisbad 500 cc Trockeneis hinzufügen. Fit Schlauch endet gemütlich über den Einlass und Auslass ein Dummy-Cryoloop um den Kühlkreislauf zu vervollständigen.
- Befestigen Sie Thermoelement Stecker an ein digitales Thermometer für kontinuierliche Temperaturüberwachung mit einem Kabel bestehend aus zwei männlichen Thermoelement Steckverbinder und ein Thermoelement Draht. Stellen Sie sicher, dass die Länge dieses Kabels ist ausreichend, um den Kopf des Tieres zu erreichen, wenn das Thermometer ein Ende eingesteckt ist.
- Die Kolbenpumpe mit dem Schalter einschalten.
Hinweis: Methanol ist aufzustellen, aus dem Reservoir, ging durch die Pumpe zum Trockeneis Bad wo wird das fließende Methanol in der Verrohrung bis-75 ° c gekühlt werden Das gekühlte Methanol wird dann beenden das Eisbad und führen durch die beigefügten Cryoloop vor der Rückkehr in die Methanol-Reservoir. - Sicherzustellen Sie, dass die Pumpe, Rohre in das Eisbad und Rohre aus dem Eisbad auf die Dummy-Loops optimal sind, so dass die Dummy-Cryoloop-Temperatur erreichen einen Steady-State-5,00 ° C.
Hinweis: Diese Temperaturen erreicht während dieser ersten Installation sind oft ausreichend für Prüftemperaturen von 3,0 ± 1,0 ° C zu erreichen, wenn das gleiche System verwendet wird, um einen implantierten Cryoloop zu kühlen. Schwierigkeiten bei der Erreichung ausreichende Kühlung kann gelöst werden, durch Anpassen der Drehzahl der Pumpe, Erhöhung der Länge der Rohre unter Wasser in das Eisbad und/oder die Länge der Schläuche aus dem Eisbad, die Cryoloop zu minimieren. - Bei Bedarf verlängern Sie einen Teil der Schläuche durch Gewinde am Ende des Rohres durch ein Rohr-Endstück und Flansch am Ende des Rohres mit einem Flanger-Tool. Bringen Sie Schlauch mit einer gewünschten Länge mit einer ähnlich geflanschten Ende mit einem Connector an.
- Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungen gemütlich sind und keine Lecks vorhanden sind. Sobald mit der Ersteinrichtung zufrieden sind, schalten Sie die Pumpe aus, und entfernen Sie die Dummy-Cryoloop; die Schaltung ist nun gerüstet für ein Versuchstier.
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Verhaltens zu testen
- Legen Sie das Tier auf den Test Apparat. Schieben Sie den Gurt über den Kopf und sichern Sie das Armband Snuggly rund um das Tier zu. Befestigen Sie die Leine.
- Entfernen Sie die Schutzkappe von der implantierten Cryoloop, die Einlass und Auslass Röhren verfügbar zu machen. Fit Schlauch endet gemütlich über den Einlass und Auslass Röhren von der Cryoloop. Das Thermoelement-Stecker in das digitale Thermometer.
- Beginnen Sie den Test-Session mit einem visuellen (Schritt 3.1) oder taktile (Schritt 3.2) Hindernis Speicher Test. Folgen Sie mit zusätzlichen Prüfungen aller vier Arten (visuelle Hindernis-Gegenwart, visuelle Hindernis-abwesend, taktile Hindernis-Present, taktile Hindernis-abwesend) in einer zufälligen.
Hinweis: Eine typische Test-Session besteht aus einem "warm" Block von Studien, wo Speicher-geführte Hindernis Vermeidung bei fehlender Kühlung zur Grundlinie Maßnahmen beobachtet wird. - Kolbenpumpe schalten Sie ein und warten Sie, bis die Cryoloop eine Temperatur von 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min) zu erreichen. Führen Sie dann einen "coolen" Block von Studien, nachdem der Kolben-Pumpe eingeschaltet wurde. Während dieser Block von Studien bei Bedarf bewerten Sie Beiträge von gekühlten Bereich Speicher leiten. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Cryoloop, bei 3,0 ± 1,0 ° C über den gesamten Block gehalten wird.
Hinweis: Alle vier Test-Typen sollten nach dem Zufallsprinzip in den Block durchsetzt sein. - Einen letzte "abgekühlter" Block von Studien nach der Kolbenpumpe ausgeschaltet wurde, und die Cryoloop hat wieder seine ursprüngliche Temperatur ausgeführt.
Hinweis: Baseline stepping Verhalten ist während dieser Block wieder hergestellt. Alle vier Test-Typen sollte wiederum nach dem Zufallsprinzip in den Block durchsetzt sein.
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Aufräumarbeiten
- Als Verhaltensstörungen Tests abgeschlossen ist, entfernen Sie den Schlauch aus Einlass und Auslass Röhren. Restliche Methanol, das kann von den Enden der Schläuche Tropfen und kann das Tier reizen bewusst sein.
- Stellen Sie sicher, dass die Schutzkappe ersetzt wird. Entfernen Sie die Leine und Geschirr vor der Rückkehr des Tieres in der Kolonie. Schneiden Sie die Schlauch-Enden (3-4 mm) mit einem Schlauch Cutter um undichte Anschlüsse am Folgetag Tests zu verhindern.
7. überprüfen das Ausmaß der Kühlung
- Am Ende des Verhaltens Tests bestätigen Sie, dass das Ausmaß der Deaktivierung auf die Region des Kortex direkt unterhalb jedes Cryoloop mit bereits berichtet Techniken8beschränkt ist.
Hinweis: Dies kann mit Thermokline Zuordnung12 oder mit einem thermal imaging Kamera13,14,19überprüft werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur parietalen Kortex Beiträge zum Hindernis Speicher zu Fuß Katze19zu untersuchen. In dieser Studie wurden Cryoloops über parietal Bereichen 5 und 7 in drei Erwachsenen bilateral implantiert (> 6 Monate alt) Katzen (Abb. 5A). Tiere wurden bewertet, im taktilen Hindernis Speicher Paradigma bei fehlender Kühlung (Warm, Kontrollbedingung) oder als Bereich 5 oder 7 bilateral deaktiviert war.
Die repräsentativen Ergebnisse aus dieser Studie zeigen, dass beim Bereich 5 bilateral abgekühlt war, Hinterbein treten in der Hindernis-Gegenwart-Studien (Abbildung 5, blau) deutlich abgeschwächt wurde. Im warmen Zustand war die mittlere Peakhöhe Schritt für führende und nachfolgende Hinterläufen 9,5 ±2.2 bis 8,0 ±2.1 cm. Eine einfache multivariate ANOVA ergab, dass wenn Bereich 5 abgekühlt war, Schritt Peakhöhe für führende und nachfolgende Hinterläufen deutlich um 4,3 ±2.2 cm reduziert werden konnte (p < 0,0001) und 3,4 ±1.4 cm (p < 0,0001), beziehungsweise. Die Peakhöhe Schritt die Vorderbeine in der Hindernis-Gegenwart-Studien oder jedes Bein in der Hindernis-abwesend-Studien wurde von Bereich 5 Deaktivierung nicht betroffen. Ebenso unterscheiden die Peakhöhe Schritt für jedes Bein in Hindernis-Geschenk oder Hindernis-fehlende Studien nicht von der warmen Zustand wenn Gebiet 7 deaktiviert wurde.
Darüber hinaus wurde der Hinterläufen Schritt Abstand in ähnlicher Weise betroffen, wenn Bereich 5 deaktiviert wurde. Im Vergleich zu Warm und Gebiet 7 gekühlt Bedingungen Schritt Abstand verringerte sich auf 4,7 ±2.2 cm im führenden Hinterläufen Schritt (p < 0,0001; Abbildung 5) und −5.6 ±1.4 cm im abschließenden Schritt Hinterbein (p < 0,0001). Darüber hinaus war Schritt Flugbahn des nachgestellten Hinterbein Bereich 5 Deaktivierung betroffen, wie der Gipfel vor dem Hindernis, im Gegensatz zur Vertiefung in warmen und Bereich 7 gekühlten Bedingungen (Abbildung 5).
Insgesamt, solche Veränderungen der Peakhöhe Schritt, Schritt Abstand und Schritt Flugbahn Tiefe Hindernis Gedächtnisdefizite bei Bereich 5 deaktiviert wurde angegeben. Wichtig ist, da die Bereich 5 Deaktivierung nur verändert die Eigenschaften des Hinterbein treten in Hindernis-heute Studien und keinen, die Fähigkeit Abbruch tat, stepping Bewegungen machen, reflektieren diese beobachteten Veränderungen der Fortbewegung Speicher, keine motorischen Defizite. Darüber hinaus bestätigte Thermografie durchgeführt am Ende der Verhaltens-testen Kühlung auf 5 oder 7 Wenn each-Schleife für jede Hemisphäre (Abbildung 6) einzeln gekühlt wurde. Diese Ergebnisse beweisen damit insgesamt die Beiträge der parietalen Bereich 5 Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung bei der Katze.
Abbildung 1: Diagramm zeigt die Kamera, Kühlanlagen und walking Apparat zur Beurteilung der Hindernis-Speicher in der Kat. Eine 2,43 m lang, 29 cm breite Gehweg ist mit 18 cm hohen klaren Plexiglas Mauern umschlossen. Auf halbem Weg entlang der Gehweg, kann ein 25,8 cm breit 3 mm dicken Hindernis auf dem Gehweg durch einen schmalen Schlitz über einen Hebel montiert unter dem Gehweg ausgelöst werden. Das Tier wird für jeden Versuch ein paar Schritte vom Hindernis im Startbereich des Gehweges platziert. Essen liegt auf einer kleinen erhöhten Plattform (23 cm lang x 23 cm Breite X 16 cm hoch) auf der anderen Seite des Schlitzes Hindernis gegenüber dem Startbereich. Alle Studien sind über ein Ethernet-Kamera auf ein Stativ montiert und auf einem Laptop gespeichert aufgezeichnet. Diese Zahl wurde von Wong Et Al. modifiziert 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Diagramm Darstellung Optik und Haptik Hindernis Gedächtnisaufgaben und die Schritt-Messungen zur Beurteilung der Hindernis-Speicher in der zu Fuß Kat. (A) zur visuellen Hindernis Speicher, das Hindernis zu beurteilen wird auf dem Gehweg ausgelöst, da das Tier nähert sich die Lebensmittel-Plattform. Nach Schritt über das Hindernis mit nur seine Vorderbeine, darf das Tier von der Plattform zu essen wie das Hindernis verdeckt immer bündig mit der Oberfläche des Gehweges abgesenkt wird. Im Anschluss an eine Variable Verzögerungszeit wird das Essen nach vorne verschoben, zu ermutigen, das Tier wieder zu Fuß. (B), taktile Hindernis Speicher, das Hindernis zu beurteilen ist nicht auf dem Gehweg ausgelöst, wie das Tier nähert sich die Lebensmittel-Plattform. Wie das Tier frisst, wird das Hindernis schweigend auf den Gehweg direkt unterhalb der Plattform Lebensmittel ausgelöst. Das Essen wird an das Hindernis vor dem Betreten darüber bewegt vorwärts die Vorderbeine des Tieres verursacht. Das Tier darf weiterhin Essen aus der Küche-Plattform während gebietsübergreifenden das Hindernis zwischen den Vorderbeinen und Hinterbeinen. Während dieser Zeit wird das Hindernis verdeckt von den Gehwegen abgesenkt. Das Essen ist wieder vorwärts bewegt, zu ermutigen, das Tier zu Fuß fortsetzen. Hinterbein Schritte werden gemessen, um Hindernis Speicher zu beurteilen. (C) Stepping wird in beiden visuellen und taktilen Hindernis Speicher Paradigmen bewertet, durch Messung der Peakhöhe Schritt, Schritt-Clearance und der horizontale Abstand zwischen der Spitze der einzelnen Schritte und das Hindernis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schematische von der Cryoloop. Die Cryoloop besteht aus einer Schutzkappe, die über den Einlass und Auslass Rohre passt. Diese Rohre laufen durch einen Thread Beitrag und bildet die Schleife, die in direktem Kontakt mit der kortikalen Oberfläche über der Region von Interesse sitzt. Eine Microthermocouple ist bei der Union der Schleife zur Messung der Temperatur Cryoloop verlötet. Die Drähte laufen zurück durch die Hitze-Schrumpf-Schläuche (die auch die Edelstahl-Schlauch umschließt) und an einen Connector befestigt sind. Die gesamte Baugruppe ist mit dem Schädel mit dental Acryl gesichert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: der Kühlkreislauf. Der Kühlkreislauf besteht aus Methanol Reservoir, hin-und hergehenden Kolben-Pumpe, Eisbad, Thermometer und Cryoloop. Um zu kühlen, saugt die Pumpe Methanol aus dem Reservoir durch das Ansaugrohr (1,6 mm I.D.). Das Methanol beendet wird die Pumpe durch die Schläuche Polytetrafluorethylen (0,5 mm I.D.) und ist durch das Trockeneis-Bad, wo das fließende Methanol in der Verrohrung bis-75 ° c gekühlt gepumpt Das gekühlte Methanol dann beendet das Eisbad und zieht sich durch die beigefügte Cryoloop vor der Rückkehr in die Methanol-Reservoir. Diese Cryoloop kann eine Dummy-Schleife (nicht implantiert) während der ursprünglichen Installation verwendet werden, oder möglicherweise einen implantierten Cryoloop in einem Versuchstier. Die Cryoloop ist ein digitales Thermometer Schleife Temperatur während der Testphase Verhaltens aufzeichnen auch verbunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: reversibel, Kühlung-induzierte Deaktivierung des parietalen Bereich 5 führt zu Hindernis Gedächtnisdefizite. (A) seitliche Ansicht von der rechten Hemisphäre von der Katze Großhirn zeigen Cryoloops direkt über parietal Bereichen 5 (blau) und 7 (grün) im Wong Et Al. untersuchten implantiert 19 D: dorsal, A: anterior. (B–E) Bar-Grundstücke Darstellung bedeutet Schritt Höhe ± SD für die Hindernis-Gegenwart (B, D) und Hindernis-fehlen Studien (C, E) für die Vorderbeine (B, C) und die Hinterbeine (D, E) für warmen (rot), Bereich 5 gekühlt (blau) und Area 7 gekühlten Bedingungen ( (grün). Stufenhöhe wurde deutlich reduziert, in der führende und nachfolgende Hinterbeine in der Hindernis-Gegenwart-Studien, Bereich 5 deaktiviert wurde. (F) Bar Plot bedeutet Hinterbein Schritt Abstand ± SD für jede Kühlung Bedingung darstellt. Bereich 5 Deaktivierung führte zu reduzierten Clearance für sowohl führende und nachfolgende Schritte Hinterbein. (G) Bar Plot zeigt die mittlere horizontale Entfernung zwischen der Spitze der einzelnen Schritte und das Hindernis für jede Kühlung Bedingung. Wenn Bereich 5 abgekühlt war, Schritt Bahnen waren variabler und Unterschied sich deutlich von Warm und Bereich 7 gekühlten Bedingungen. p < 0,005, **p < 0,0001, n.s.: nicht signifikant. Diese Zahl wurde von Wong Et Al. modifiziert 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Thermografie verwendet, um eingeschränkte Deaktivierung des Bereichs 5 oder 7 während des Abkühlens bestätigen. (A) ein Foto mit Cryoloops in Kontakt mit parietalen Bereichen 5 und 7 der rechten Hemisphäre. Oben ist dorsal, rechts anterior. Gestrichelte Linie stellt die Grenze zwischen parietal Bereichen 5 und 7. (B–C) Wärmebilder der parietalen kortikalen Oberfläche fotografiert, als die Cryoloop Fläche 5 (B) oder den Bereich 7 (C) um gekühlt wurde 3 ° C. Diese Zahl wurde von Wong Et Al. modifiziert 19 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das beschriebene Paradigma beschäftigt Kühlung-induzierte Deaktivierungen von diskreten kortikalen Bereiche, die mit der Cryoloop um Speicher-geführte Hindernis Fortbewegung bei der Katze zu studieren. Die visuelle und taktile Hindernis Speicher Paradigmen sind ziemlich einfach für Tiere ausführen, da sie naturalistische Bewegungsorgane Verhaltensweisen, die mit minimalem Aufwand auftreten beuten, wenn ein Tier motiviert ist, eine beweglichen Nahrungsquelle zu folgen. Somit ist der Großteil der Ausbildungszeit akklimatisieren dem Tier den Testraum und Kühleinrichtungen gewidmet. Die meisten Tiere erfordern wiederholten Exposition trug das Gurtzeug und bevor Sie zu Fuß bequem und natürlich auf das Gerät über die Leine angebunden. Während des Tests kann darüber hinaus der Klang der Kolbenpumpe abzulenken oder das Tier erschrecken. Abschluss den Kühlkreislauf mit dem Dummy-Cryoloop und läuft die Pumpe während der Erstausbildung können das Tier akklimatisieren, um den Klang der Pumpe ermöglichen. Trotz ausreichender Ausbildung vor der Prüfung, werden wahrscheinlich eine begrenzte Zeit zum testen, bevor das Tier unruhig wird. Daher genügend Zeit widmet sich der korrekte Einrichtung sicherzustellen und Fehlerbehebung vor bringen das Tier in den Prüfraum werden nachfolgende Datenerhebung optimieren.
Schwierigkeiten erreichen ausreichender Kühlung kann durch Verstellen der Pumpendrehzahl angesprochen werden. Allerdings sollte auf den zunehmenden Druck achten, die mit dem Schlauch gezwungen aus den ein- oder Auslass Rohre der Cryoloop führen kann. Alternativ kann die Länge der Schläuche in das Eisbad getaucht erhöht werden, um mehr Zeit, um den Fluss von Methanol in den Rohren chill zu ermöglichen. Darüber hinaus wird um sicherzustellen, dass die Länge der Rohre unter dem Gesichtspunkt der Ausstieg aus dem Eisbad, die Cryoloop so kurz wie möglich ist Verlust der Kühlung minimieren. Jedoch muss dieser Abstand auch lang genug, um ausreichend Bandbreite der Fortbewegung nach einem bestimmten Verhaltens Paradigma ermöglicht sein. Schlauch kann mit Weichschaum Umbruch zur Optimierung der Kühlleistung isoliert werden. Solche können auch Tropfen Kondenswasser, die bilden um den Schläuche fallen auf das Tier, verhindert die reizen oder das Tier erschrecken. Während des Tests gewährleisten einen gemütlichen über den Einlass der Schläuche passen und Auslaufrohre von den Cryoloop machen können, verbinden die Cryoloop schwierig. Tragen eines Nitril oder Latex-Handschuh bieten einen besseren Halt der Schläuche. Um sicherzustellen, dass das Tier komfortabel ist und Patient während der Experimentator den Schlauch legt unerlässlich ist. Essen kann verwendet werden, um das Tier stationär und Inhalten zu halten.
Cryoloops können routinemäßig Gewinnung hoch reproduzierbare Veränderungen im Verhalten, wenn ein bestimmter Bereich deaktiviert wird gekühlt werden. Bewerten die gleiche Aufgabe in an- und Abwesenheit der kortikalen Deaktivierung innerhalb des gleichen Tieres, kann die Gesamtzahl der verwendeten Tiere reduziert werden. Darüber hinaus kann das Ausmaß der Kühlung kortikalen Beiträge zu einem bestimmten Verhalten dahingehend manipuliert werden. Zum Beispiel können einseitige und zweiseitig Deaktivierungen im gleichen Tier möglich Lateralisierung Auswirkungen eines Verhaltens zu untersuchen durchgeführt werden. Darüber hinaus ist der Grad der Kühlung variierbar, laminar Beiträge untersuchen. Durch Cryoloops an der kortikalen Oberfläche bis 3,0 1,0 ° C abkühlen, alle sechs Schichten des Cortex direkt unter each-Schleife werden gekühlt < 20 ° C, Hemmung der neuronalen spiking Aktivität22. Alternativ können Cryoloops gekühlt werden, die selektiv nur die Supragranular kortikalen Schichten unterhalb dieser kritischen Temperatur von 20 ° c abkühlt bis 8,0 1,0 ° C, Bewertung von Verhaltensweisen mit solchen oberflächlichen kortikalen Deaktivierung sowie volle kortikalen Deaktivierung kann Translaminar Dissoziationen der kortikalen Funktion21zulassen.
Trotz dieser Vielseitigkeit sollten die folgenden Einschränkungen bei experimentelles Design berücksichtigt werden. Während Kühlung einen hervorragenden Ansatz zur Deaktivierung aller Zelltypen in einer bestimmten kortikalen Region ist, kann nicht es ein Mittel zur Deaktivierung die zelluläre Spezifität geben, die mit optogenetische Deaktivierung Techniken erreicht werden kann. Des weiteren Kühlung erfordert ein Minimum von 45 s vor Cryoloop Temperaturen an die kritische Temperatur von 3,0 1,0 ° C für funktionale Deaktivierung zu stabilisieren. Daher sollten Überlegungen für die Zeitspanne benötigt, um funktionelle Deaktivierung zu erreichen in der experimentellen Protokoll der Wahl aufgenommen werden.
Alles in allem, das Kühlsystem erfordert nur minimale Wartung. Schläuche und Anschlüsse des Kühlkreislaufes sollte regelmäßig auf Dichtheit überprüft werden. Das Methanol innerhalb des Reservoirs sollte wöchentlich ausgetauscht werden, um sicherzustellen, dass das Methanol frei von Partikeln ist. Implantierten Cryoloops erfordern auch minimale Wartung. Die Ränder werden mit 3 % Wasserstoffperoxid-Lösung gefolgt von einer chirurgischen Peeling-Lösung in regelmäßigen Abständen gereinigt. Mit ordnungsgemäße Verwendung und Pflege können implantierte Cryoloops seit vielen Jahren routinemäßig gekühlt werden. Diese kortikalen Kühlungen Verfahren an andere Verhaltensstörungen Paradigmen10,11,12 oder elektrophysiologische Aufnahme Vorbereitungen13,14 in alternative Tiermodellen anpassbar 15,17,18,22.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir erkennen dankbar an die Unterstützung der Canadian Institutes of Health Research, Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC) und Canada Foundation for Innovation. C.w. wurde durch ein Alexander Graham Bell Canada Graduate Stipendium (NSERC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
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