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Biology

बैक्टीरियल विकास के सटीक, उच्च प्रवाह विश्लेषण

Published: September 19, 2017 doi: 10.3791/56197
Automatic Translation
1, 1,2
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Institute of Biology and Information Science, East China Normal University

Summary

बैक्टीरियल विकास के मात्रात्मक मूल्यांकन एक सिस्टम स्तर घटना के रूप में माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक है । प्रयोगात्मक हेरफेर और एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश कर रहे हैं, सटीक, उच्च बैक्टीरियल विकास का प्रवाह विश्लेषण, जो सिस्टम जीव विज्ञान में ब्याज की एक प्रमुख विषय है के लिए अनुमति दी ।

Abstract

बैक्टीरियल विकास आधुनिक माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के विकास में एक केंद्रीय अवधारणा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रणालियों के स्तर पर सेलुलर गतिशीलता की जांच में । हाल के अध्ययनों से बैक्टीरियल वृद्धि और जीनोम के बीच संबंध की सूचना है व्यापक घटनाओं, जीनोम में कमी और transcriptome पुनर्गठन के रूप में । सही ढंग से विश्लेषण बैक्टीरियल विकास जीन कार्यों और सेलुलर घटकों के विकास पर निर्भर समंवय को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । तदनुसार, एक उच्च प्रवाह तरीके से बैक्टीरियल विकास की सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता है । उभरते तकनीकी विकास नए प्रयोगात्मक उपकरण है कि बैक्टीरियल विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अद्यतन की अनुमति प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल यहां शुरू की प्रतिलिपि और बैक्टीरियल विकास के सटीक मूल्यांकन के लिए एक उच्च अनुकूलित प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ एक microplate पाठक कार्यरत हैं । इस प्रोटोकॉल के विकास के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था कई पहले से वर्णित ई कोलाई उपभेदों । प्रोटोकॉल के मुख्य कदम इस प्रकार हैं: प्रतिलिपि परिणामों के साथ दोहराया परीक्षणों के लिए छोटी शीशियों में सेल शेयरों की एक बड़ी संख्या की तैयारी, ९६ के उपयोग के लिए अच्छी तरह से उच्च प्रवाह विकास मूल्यांकन के लिए प्लेटें, और दो प्रमुख के मैनुअल गणना मापदंडों (यानी, अधिक से अधिक वृद्धि दर और जनसंख्या घनत्व) वृद्धि की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व । पारंपरिक कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख है, जो कोशिकाओं है कि ग्लास ट्यूबों में समय पर आगर प्लेटों पर संस्कृति के मायने रखता है की तुलना में, वर्तमान विधि और अधिक कुशल है और विकास के परिवर्तन के अधिक विस्तृत लौकिक रिकॉर्ड प्रदान करता है, लेकिन एक सख्त है कम जनसंख्या घनत्व पर पता लगाने की सीमा । संक्षेप में, वर्णित विधि बैक्टीरियल विकास के सटीक और प्रतिलिपि उच्च प्रवाह विश्लेषण, जो वैचारिक निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए या सैद्धांतिक टिप्पणियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए लाभप्रद है ।

Introduction

सूक्ष्मजीवविज्ञानी अध्ययन अक्सर बैक्टीरियल कोशिकाओं और बैक्टीरियल विकास घटता है, जो बैक्टीरियल फिजियोलॉजी1,2,3की एक बुनियादी घटना का आकलन की संस्कृति के साथ शुरू करते हैं । आधारभूत संस्कृति के सिद्धांत प्रकाशित शोध साहित्य और पाठ्यपुस्तकों में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं क्योंकि जीवाणु संस्कृति एक मूलभूत पद्धति है. बेंच के स्तर पर, पर्याप्त ध्यान परंपरागत रूप से विकास मीडिया और संवर्धन शर्तों के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन विकास दर है, जो संभावना माइक्रोबियल फिजियोलॉजी के भी अधिक से अधिक समझ प्रदान करेगा नियंत्रण, नहीं किया गया है बड़े पैमाने पर4अध्ययन किया । तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए, सेलुलर राज्य के एक प्रमुख पैरामीटर वृद्धि दर है, जो जीनोम, transcriptome, और proteome5,6,7,8 के साथ समंवित होने की सूचना दी गई है . इस प्रकार, बैक्टीरियल विकास के मात्रात्मक मूल्यांकन माइक्रोबियल फिजियोलॉजी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।

बैक्टीरियल विकास का मूल्यांकन करने के लिए, प्रयोगात्मक बायोमास अनुमान के लिए इस्तेमाल किया अच्छी तरह से9,10 की स्थापना की और जैव रासायनिक, भौतिक, या ऑप्टिकल मैलापन के रूप में जैविक मानकों, का पता लगाने पर आधारित हैं । इसके अलावा, विश्लेषणात्मक विकास परिवर्तन के गतिशील गुणों को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए गए तरीकों सामांयतः स्थापित रेखीय मॉडल11,12,13, उदाहरण के लिए, रसद समीकरणों पर आधारित हैं । विकास गतिशीलता आम तौर पर या तो ऑप्टिकल मैलापन को मापने या कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख प्रदर्शन द्वारा संस्कृति में सेल विकास के समय पर नमूना प्राप्त कर रहे हैं । इन संवर्धन और पता लगाने के तरीकों की सीमा है कि डेटा बिंदुओं जनसंख्या गतिशीलता का एक सही प्रतिबिंब नहीं है क्योंकि माप अंतराल अक्सर घंटे में कर रहे है और क्योंकि संस्कृति की स्थिति (उदा, तापमान में परिवर्तन और वातन) की सैंपलिंग के समय गड़बड़ी की जाती है । संस्कृति और विश्लेषण तकनीक प्रौद्योगिकी और समझ में हाल की घटनाओं का उपयोग कर अद्यतन किया जाना चाहिए । microplate पाठकों में हाल के अग्रिमों बैक्टीरियल विकास की वास्तविक समय अवलोकन और काफी श्रम लागत में कमी की अनुमति देते हैं । इन उंनत उपकरणों का प्रयोग, बैक्टीरियल विकास पर नवीनतम अध्ययन उच्च प्रवाह माप14,15के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों की सूचना दी है ।

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए एक उच्च प्रवाह तरीके से सटीक विकास गतिशीलता का मूल्यांकन है, जो मात्रात्मक अध्ययन के लिए मूल्यवान होगा कि अंततः कैसे विकास दर निर्धारित है और क्या कारकों की वृद्धि दर को प्रभावित करने के सवालों का पता है । प्रोटोकॉल सभी कारकों है कि जीवाणु विकास के दोहराया और सटीक quantitation के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए पते । प्रायोगिक विधि और विश्लेषण मुख्य पाठ में विस्तार से वर्णित हैं । इस विधि एक उच्च प्रवाह तरीके से बैक्टीरियल विकास के सटीक और प्रतिलिपि विश्लेषण परमिट । विज्ञानियों अपने प्रायोगिक सबूत से अतिरिक्त मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल भी प्रणाली जीवविज्ञान में अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वैचारिक निष्कर्ष आकर्षित या विकास का एक सैद्धांतिक सिंहावलोकन प्राप्त करने का प्रयास ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. विकास माध्यम की तैयारी करना

< p class = "jove_content" > नोट: मिनिमल मीडियम M63 की रासायनिक संरचना इस प्रकार है: ६२ मिमी K 2 HPO 4 , ३९ मिमी KH 2 पो 4 , 15 मिमी (NH 4 ) 2 सू 4 , १.८ & #181; m FeSO 4 , 15 & #181; एम thiamine-एचसीएल, ०.२ एमएम MgSO 4 , और 22 एमएम ग्लूकोज । M63 को मिलाकर बनाया जाता है तीन शेयर सॉल्यूशन: फाइव एक्स सॉल्यूशन, 20% ग्लूकोज और MgSO 4 thiamine सॉल्यूशन । 4 & #176 पर सभी समाधानों को संग्रहीत करना; C.

  1. तैयार करने के पांच X हल
    1. FeSO 4 हल करने के लिए, एक विद्युत पिपेट का उपयोग करें और एक डिस्पोजेबल सीरम पिपेट जोड़ने के लिए ddH 2 ओ को एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । ०.०१ M hcl प्राप्त करने के लिए ०.०६ mL hcl जोड़ने के लिए P-२०० का उपयोग करें । जोड़ें ३६ मिलीग्राम FeSO 4 -7H 2 हे और मिश्रण अच्छी तरह से.
    2. नाप १६० एमएल ddH 2 हे एक मापने वाले सिलिंडर में डालें और इसे ५००-एमएल वाला यूरिन में डालिए । इस क्रम में निंन जोड़ें: १०.७२ छ K 2 HPO 4 , ५.२४ g KH 2 पो 4 , २.० g (NH 4 ) 2 सू 4 , व ०.५ मिलि FeSO 4 समाधान (1.1.1 चरण में तैयार).
    3. एक सटीक पीएच मीटर का उपयोग कर, 2 एम KOH जोड़ने के द्वारा ७.० को पीएच समायोजित करें । एक को मापने के सिलेंडर में घोल डालो और ddH 2 O २०० मिलीलीटर की कुल मात्रा में जोड़ें । २५०-मिलीलीटर निस्पंदन इकाई (PVDF, ०.२२ & #181; M) का उपयोग कर समाधान को निष्फल करें ।
  2. तैयार कर रहा है 20% ग्लूकोज सॉल्यूशन
    1. उपाय २०० एमएल ddH 2 हे एक मापने वाले सिलिंडर में डालें और इसे ५००-एमएल चोंच में डाल दें । एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करते हुए मिश्रण, ग्लूकोज की ५० ग्राम जोड़ें. एक मापने सिलेंडर में समाधान २५० मिलीलीटर की कुल मात्रा को पतला । चरण 1.1.3.
      2. में वर्णित के रूप में समाधान निष्फल
  3. की तैयारी कर रहे MgSO 4 thiamine हल
    1. Add १५० मब ddH 2 हे को एक ५०० एमएल वाला यूरिन. एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ मिश्रण है, जबकि thiamine-एचसीएल के १.० ग्राम जोड़ें और MgSO के 10 जी 4 -7H 2 O. समाधान एक मापने सिलेंडर में २०० मिलीलीटर की कुल मात्रा को पतला । चरण 1.1.3.
      2. में वर्णित के रूप में समाधान निष्फल
  4. की तैयारी मिनिमल मीडियम M63
    1. प्लेस द फाइव एक्स सॉल्यूशन, द 20% ग्लूकोज सॉल्यूशन, द MgSO 4 thiamine सॉल्यूशन, एक इलेक् पिपेट, ए पी-२०० पिपेट, और २००-& #181; एल पिपेट टिप्स क्लीन बेंच पर ।
    2. उपाय १५५.८ एमएल ddH 2 हे एक मापने वाले सिलिंडर में डालें और इसे ५००-mL चोंच में डाल दें ।
    3. इलेक्ट्रॉनिक पिपेट और डिस्पोजेबल सीरम पिपेट का उपयोग करते हुए, मापा ddH 2 ओ के लिए पांच एक्स समाधान और 4 मिलीलीटर 20% ग्लूकोज समाधान की ४० मिलीलीटर जोड़ें । फिर, पी-२०० के साथ ०.२ मिलीलीटर MgSO 4 thiamine समाधान जोड़ें । चरण 1.1.3.
      4. में वर्णित के रूप में समाधान निष्फल
< p class = "jove_title" > 2. ग्लिसरॉल शेयर की तैयारी

  1. सेल संस्कृति
    नोट: बैक्टीरियल उपभेदों ( जैसे , W3110 और उसके कम जीनोम) तनाव बैंक संगठनों से उपलब्ध हैं । उपभेदों आमतौर पर प्लेटों आगर पर कालोनियों के रूप में प्राप्त कर रहे हैं ।
    1. जगह पांच निष्फल ग्लास ट्यूबों सिलिकॉन रबर डाट के साथ, एक इलेक्ट्रॉनिक पिपेट, पी-१,०००, १,०००-& #181; l पिपेट tips, p-२००, २००-& #181; l पिपेट टिप्स, और लक्ष्य उपभेदों (प्लेटों पर कालोनियों) एक स्वच्छ बेंच पर.
    2. सिलिकॉन रबर डाट खोलने से पहले एक Bunsen बर्नर के लिए ग्लास ट्यूब के मुंह बेनकाब । ट्यूब खोलने के बाद लौ को सिलिकॉन रबर डाट बेनकाब, और फिर हल्के कांच ट्यूब पर टोपी वापस जगह है ।
    3. का उपयोग इलेक्ट्रॉनिक पिपेट और डिस्पोजेबल सीरम पिपेट एक ग्लास ट्यूबों और ४.५ मिलीलीटर M63 को अंय चार ट्यूबों के लिए 5 मिलीलीटर M63 जोड़ने के लिए ।
    4. का उपयोग पी-२०० टिप एक कॉलोनी लेने के लिए और यह ग्लास ट्यूब में 5 मिलीलीटर M63 युक्त लगाना ।
    5. भंवर ट्यूब सस्पेंशन करने के लिए । फिर, इस समाधान का एक चार ट्यूबों ४.५ मिलीलीटर M63.
      6. युक्त के लिए ०.५ मिलीलीटर स्थानांतरित द्वारा समाधान 10 गुना पतला
    6. शेष ट्यूबों के लिए चरण 2.1.5 में वर्णित प्रक्रिया को दोहराएँ । पांच अलग सांद्रता के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला (1, 10, १००, १०००, और १०,००० के कमजोर पड़ने) अब तैयार है ।
    7. ग्लास ट्यूबों के मुंह और सिलिकॉन रबर डाट के रूप में कदम 2.1.2 में वर्णित निष्फल । डाट के साथ ट्यूब कैप । सिलिकॉन रबर डाट wrinkling नहीं करके संदूषण से बचें ।
    8. जगह में पांच ट्यूबों एक पूर्व में मिलाते हुए ३७ & #176 पर हिलती मशीन, सी और शेक पर २०० rpm । संस्कृति रात भर या 10 से 30 घंटे के लिए
  2. के लिए संस्कृति का चयन ग्लिसरॉल स्टॉक
    1. जगह पूर्व गर्म कमरे के तापमान M63 मध्यम, पी-१,०००, १,०००-& #181; एल पिपेट टिप्स, और एक स्वच्छ बेंच पर एक डिस्पोजेबल cuvette.
    2. Add १००० & #181; L M63 एक डिस्पोजेबल cuvette के साथ पी-१,०००. एक spectrophotometer में डिस्पोजेबल cuvette प्लेस, ६०० एनएम के एक निश्चित तरंग दैर्ध्य पर कार्यक्रम शुरू, और खाली उपाय ।
    3. हिलाना मशीन से स्वच्छ बेंच के लिए पांच ग्लास ट्यूबों ले जाएं ।
    4. को डिस्पोजेबल cuvette से M63 छोड़ना और १,००० & #181; L कल्चर को पी-१,००० के साथ ही डिस्पोजेबल cuvette से जोड़ना. कक्ष culture (OD ६०० ) के ऑप्टिकल मैलापन चरण -8. में वर्णित के रूप में मापने
      नोट: किसी भी संदूषण से बचने के लिए और एक सटीक माप प्राप्त करने के लिए, कांच ट्यूबों का पर्दाफाश और लपटों के लिए डाट के रूप में वर्णित है और नमूने से पहले संस्कृति भंवर । विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, दोहराया माप सिफारिश कर रहे हैं, विशेष रूप से जब सेल घनत्व कम है.
    5. पांच सेल संस्कृतियों में से एक है कि जल्दी घातीय विकास चरण में है चुनें (आयुध डिपो ६०० = ०.०१-०.०५) ग्लिसरॉल स्टॉक के लिए ।
      नोट: यदि एकाधिक संस्कृतियों इष्टतम रेंज के भीतर घनत्व है, एक निकटतम ०.०५ के लिए सामांयतः चुना है ।
  3. दोहराया परीक्षणों के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक्स बनाओ ।
    नोट: यह दस स्टॉक्स तैयार करने के लिए वर्णित है । बड़ी या छोटी मात्रा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार किया जा सकता है ।
    1. जगह निष्फल ६०% ग्लिसरॉल हल, दस निष्फल १.५-एमएल microtubes, पी-१,००० और पी-२००, १,०००-और २००-& #181; एल पिपेट टिप्स, और एक microtube एक साफ बेंच पर खड़े हो जाओ ।
    2. Add २५० & #181; l एकमेकांना ६०% ग्लिसरॉल हल व ७५० & #181; l चयनित सेल कल्चर को १.५-एमएल microtube और मिक्स करके pipetting.
      नोट: स्टॉक मात्रा चर है, लेकिन हमेशा ६०% ग्लिसरॉल के एक 1:3 अनुपात सेल संस्कृति के लिए बनाए रखने; यह 15% ग्लिसरॉल.
      3. के एक अंतिम एकाग्रता में परिणाम
    3. जगह बचे नौ microtubes को microtube स्टैंड में और तिरस्कृत १०० & #181; प्रत्येक ट्यूब के लिए कदम 2.3.2 में तैयार मिश्रण के एल. भविष्य के उपयोग के लिए अब दस समान ग्लिसरॉल स्टॉक्स हैं ।
    4. स्टोर पर एक डीप फ्रीजर में स्टॉक्स-८० & #176; C.
< p class = "jove_title" > 3. विकास curves प्राप्त करना

  1. microplate पाठक की स्थापना ।
    नोट: उद्धरण चिह्नों में दिखाए गए शब्द विशिष्ट phrasing प्लेट रीडर पर यहां उपयोग किया गया दिखाने (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. खुला लागेको हो । Open & #34;P rotocols & #34; म & #34; कार्य प्रबंधक & #34; व चुन & #34; नया & #34 बनाएं; । चुन & #34; मानक प्रोटोकॉल & #34;.
    2. Open & #34;P rocedure & #34;, और सेटिंग्स समायोजित करें । Open & #34; सेट तापमान & #34;, और & #34 का चयन करें; मशीनर ऑन & #34;. सेट & #34; तापमान & #34; को ३७ & #176; ग र & #34; ग्रैडिएंट & #34; को 0 & #176; ग. चेक & #34;P reheat & #34; अगले चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले । Open & #34; प्रारंभ काइनेटिक & #34;, सेट & #34; रन समय & #34; के लिए 24:00:00 या 48:00:00, और & #34; अंतराल & #34; के लिए 00:30:00 या 01:00:00.
      नोट: यह लगभग 1 मिनट लगते है एक पूरे ९६ अच्छी तरह से थाली पढ़ें ।
    3. Open & #34; घे & #34; व सेट & #34; हिला मोड & #34; यथा & #34; रेखीय & #34;. चेक & #34; कंnstitution घे & #34; व सेट & #34; कव & #34; पर ५६७ cpm. Open & #34; पढ & #34;, चेक & #34; िारी & #34;, & #34; समापन बिंदु/काइनेटिक & #34;, और & #34; Monochromators. & #34; सेट & #34; तरंग दैर्ध्य & #34; को ६००.
    4. Click & #34; बिछाना & #34; यह पुष्टि करने के लिए कि कार्यविधि सही है । क्लिक करें & #34; save & #34; इसे भविष्य में उपयोग के लिए एक नए प्रोग्राम के रूप में सहेजने के लिए ।
  2. ग्रोथ की रीयल-टाइम रिकॉर्डिंग
    1. ड्रा एक ९६-well प्लेट pictogram (8 & #215; 12 टेबल) ९६-वेल प्लेट पर inoculated कल्चरल नमूनों की स्थितियां दर्शाने के लिए । तालिका को मुद्रित करें और इसे प्रयोग के लिए एक संदर्भ के रूप में उपयोग.
      नोट: microplate के किनारों पर स्थित कुओं में वाष्पीकरण की वजह से ही खाली माध्यम शामिल होना चाहिए.
    2. जगह एक निष्फल ९६-ढक्कन के साथ अच्छी तरह से फ्लैट नीचे microplate, p-१०००, १०००-& #181; l पिपेट tips, p-२००, २००-& #181; l पिपेट टिप्स, कई १.५-एमएल microtubes, एक 8-मल्टीचैनल पिपेट, एक निष्फल रिएजेंट जलाशय, कक्ष तापमान M63, और ग्लिसरॉल स्टॉक्स (चरण २.३ में तैयार) एक स्वच्छ बेंच पर ।
    3. लगभग २५ मिलीलीटर M63 को रिएजेंट जलाशय में जोड़ते हैं. सभी निम्न चरणों के लिए इस जलाशय स्टॉक का उपयोग करें ।
    4. Add ९०० & #181; धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए तैयारी में microtubes के लिए एल M63.
    5. गल ग्लिसरॉल स्टॉक को कमरे के तापमान पर । जोड़ ९०० & #181; L M63 गल ग्लिसरॉल शेयर और भंवरा. यह मूल ग्लिसरॉल स्टॉक के एक 10 गुना कमजोर पड़ने में परिणाम.
    6. Transfer १०० & #181; एल के 10 गुना कमजोर पड़ने वाले एक और microtube को ९०० & #181; M63 और भंवर के एल. एक १००-गुना कमजोर पड़ने में यह परिणाम है ।
    7. दोहराने कदम 3.2.6 जब तक वांछित कमजोर पड़ने की संख्या हासिल कर रहे हैं ।
    8. microplate के किनारे पर कुओं को भरने के साथ २०० & #181; L M63 का उपयोग कर एक 8-चैनल पिपेट (P-२००).
      नोट: इन कुओं का उपयोग कोरा के रूप में किया जा सकता है ।
    9. लोड २०० & #181; प्रत्येक पतला नमूना चरणों में तैयार की 3.2.4-3.2.7 संदर्भ तालिका (चरण 3.2.1) के अनुसार microplate कुओं के लिए । भंवर पतला नमूनों को लोड करने से पहले और प्लेट पर विभिंन स्थानों पर कई कुओं में एक ही नमूना लोड ।
    10. प्लेस ९६-प्लेट रीडर पर अच्छी तरह से microplate.
    11. Open & #34; अब पढ & #34; म & #34; कार्य प्रबंधक & #34; और कार्यक्रम (धारा ३.१) का चयन करें । & #34; ओके & #34; को मापने का प्रारंभ करें । डेटा विश्लेषण (अनुभाग 4) के लिए एक नई प्रायोगिक फ़ाइल के रूप में रिकॉर्डिंग सहेजें.
< p class = "jove_title" > 4. डेटा विश्लेषण

  1. एक पाठ फ़ाइल के रूप में एक यूएसबी मेमोरी स्टिक के लिए वास्तविक समय विकास दर डेटा (धारा ३.२) के परिणाम निर्यात ।
    नोट: एक ९६-अच्छी तरह से स्वरूपित परिणाम (घटता) वास्तविक समय में प्लेट रीडर पर प्रदर्शित करेगा । प्रति घंटा रिकॉर्ड्स (ओडी मान) को तालिका के रूप में निर्यात किया जा सकता है; पंक्तियों और स्तंभों को अच्छी तरह से संख्या ( उदा , A1, B1) और मापने का समय ( जैसे , 00:00:59), क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं ।
  2. एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ पाठ फ़ाइल खोलें ।
  3. प्रति घंटा आयुध डिपो ६०० की पुस्तकें ९६-अच्छी तरह से microplate आगे विश्लेषण के लिए एक नया वर्कशीट के लिए ।
  4. घटाना प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से प्रति घंटा पढ़ता से समय शून्य पर पृष्ठभूमि पढ़ता है ।
    नोट: सुविधा के लिए, M63 युक्त खाली कुओं का मतलब मूल्य (चरण 3.2.8) पृष्ठभूमि मूल्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. लगातार पांच आयुध डिपो ६०० के माध्य की गणना करने के लिए अधिक से अधिक जनसंख्या घनत्व का अनुमान पढ़ता है ।
    नोट: पांच लगातार आयुध डिपो ६०० पढ़ता का सबसे बड़ा मतलब मूल्य संगत वृद्धि वक्र के अधिक से अधिक आयुध डिपो ६०० के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  6. विकास दर की गणना, & #181; (h -1 ), आयुध डिपो के लगातार मानों के सभी जोड़ों के लिए निम्नलिखित समीकरण लागू करके ६०० : < img alt = "समीकरण" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg"/>
    नोट: इस समीकरण में, c i और c i + 1 का प्रतिनिधित्व करता है जो आयुध ६०० मानों का लगातार दो बार अंक (t i और t i + 1 , क्रमशः). LN प्राकृतिक लघुगणक को इंगित करता है.
  7. समय पर वृद्धि दर में परिवर्तन की गणना प्रति घंटा आयुध डिपो ६०० के आधार पर पढ़ता है कदम ४.६ के अनुसार । माध्य और अधिकतम वृद्धि दर का अनुमान लगाने के लिए लगातार पांच विकास दर के मानक विचलन की गणना करें ।
    नोट: छोटे मानक विचलन के साथ सबसे बड़ा मतलब इसी वृद्धि वक्र की अधिकतम वृद्धि दर के रूप में परिभाषित किया गया है ।
< p class = "jove_title" > 5. ९६ के वैश्विक पूर्वाग्रह की पुष्टि-अच्छी तरह से पढ़ता है (वैकल्पिक)

< p class = "jove_content" > नोट: दोनों प्लेट रीडर और उपभोज्य ९६-अच्छी तरह से थाली पक्षपाती माप पैदा कर सकता है । के लिए अत्यधिक सटीक और प्रतिलिपि मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने, ९६ के वैश्विक पूर्वाग्रह की पुष्टि-अच्छी तरह से थाली अत्यधिक की सिफारिश की है ।

  1. ९६-well प्लेट तैयार करें और खंड 3.2.2.
    2. में वर्णित के रूप में पूर्वाग्रह परीक्षण के लिए प्लेट रीडर
  2. एक निष्फल ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए 20 मिलीलीटर M63 जोड़ें । एक ही केंद्रापसारक ट्यूब और भंवर को ग्लिसरॉल शेयर जोड़ें । एक निष्फल एजेंट जलाशय के लिए निलंबित समाधान स्थानांतरण ।
  3. एक 8-चैनल पिपेट का उपयोग २०० & #181; ९६-वेल प्लेट के निलंबित समाधान के एल.
  4. प्लेस ९६ प्लेट रीडर पर अच्छी तरह से थाली और माप शुरू करते हैं ।
  5. रिकॉर्ड प्रति घंटा आयुध डिपो ६०० पढ़ता है और विश्लेषण के रूप में खंड 4 में वर्णित है । गणना अधिकतम वृद्धि दर और एक अच्छी तरह से ९६ के स्थान पूर्वाग्रह निर्धारित करने के लिए जनसंख्या घनत्व की तुलना-अच्छी तरह से पढ़ता है ।

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Representative Results

वर्णित विधि एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप पाठक है कि विभिंन समय अंतराल पर कई ऑप्टिकल घनत्व माप लेता है का उपयोग करके एक सतत, उच्च प्रवाह तरीके में गतिशील बैक्टीरियल विकास को पकड़ने के लिए एक साधन प्रदान करता है (मिनट से दिन के लिए घंटे के लिए) । विभिंन जीनोम व्यक्त ई. कोलाई उपभेदों के एक वर्गीकरण के विकास curves ठीक एक एकल प्रयोग में प्राप्त किया जा सकता है (चित्र 1a) । वर्णित विधि की तुलना में, पारंपरिक विधि (CFU परख) आम तौर पर अब समय अंतराल नमूना (आंकड़ा 1b) की आवश्यकता है और श्रम गहन अगर कई संस्कृति की आवश्यकता है । इसके अलावा, प्रत्येक संस्कृति CFU परख के लिए समय नमूना सेल संस्कृति की एक छोटी मात्रा है कि दोहराया माप के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता का उपयोग की आवश्यकता है । साथ ही, खोज के लिए समय बिंदुओं की सीमित संख्या में वृद्धि दर और अधिक से अधिक आयुध डिपो६००की सही गणना के लिए आवश्यक नमूना बिंदु याद कर सकते हैं । हालांकि, CFU परख एक कम का पता लगाने की सीमा है, 103 -104 कोशिकाओं/एमएल, यह अधिक से अधिक संवेदनशील परिमाण के दो आदेश ऑप्टिकल मैलापन परख (आयुध डिपो६००= ०.००१ है, जो लगभग 105 का पता लगाने की सीमा है बनाने -106 कोशिकाओं/ वर्णित विधि प्रणाली के लिए एक व्यावहारिक और कुशल प्रयोगात्मक उपकरण विकास की गतिशीलता पर स्तर के अध्ययन प्रदान करता है ।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह एक आम ग्लिसरॉल स्टॉक से दोहराया माप लेता है । जल्दी घातीय विकास चरण में विभिंन कमजोर पड़ने दर पर कई सेल संस्कृतियों होने अत्यधिक उपयोगी है क्योंकि यह शोधकर्ताओं की अनुमति देता है किसी भी टाइमस्केल में संस्कृति समय निर्धारित करने के लिए और अप्रत्याशित घटनाओं के कारण संतृप्त संस्कृतियों होने से बचा जाता है । दोहराया संवर्धन और आम स्टॉक है, जो पांच संस्कृतियों में से एक से तैयार किए गए विभिंन कमजोर पड़ने की दर का उपयोग शुरू के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग २.२ (चित्रा 2a) में वर्णित की माप, विकास के अत्यधिक समान परिणाम प्रस्तुत गतिशीलता विश्लेषण । दोहराया और स्वतंत्र माप के एकाधिक वृद्धि curves (N = 6) अच्छी तरह से छा (चित्रा 2 बी, शीर्ष पैनल), थोड़ा विचरण (चित्रा 2 बी, नीचे पैनल) के साथ, विशेष रूप से घातीय चरण के दौरान ( चित्र b, छायांकित क्षेत्र) । ये परिणाम सुझाएं कि वर्णित विधि अत्यधिक प्रतिलिपि परिणाम देता है ।

९६ के वैश्विक पूर्वाग्रह का अनुमान-अच्छी तरह से पढ़ता है अत्यधिक की सिफारिश की । वर्तमान पद्धति में, वैश्विक पक्षपात का अनुमान है वंय-प्रकार के विकास की निगरानी द्वारा E. कोलाई तनाव W3110 के रूप में प्रोटोकॉल खंड 5 में वर्णित है । उदाहरण के लिए, वृद्धि curves से गणना की वृद्धि दर ९६ कुओं (चित्र 3ए) के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता दिखाई दी, दोनों डेटा हेरफेर और डिवाइस त्रुटियों से व्युत्पंन वैश्विक अस्थिरता का प्रतिनिधित्व. इन त्रुटियों प्लेट पर विभिंन स्थानों पर एक ही नमूना कई कुओं में लोड हो रहा द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है । इसके विपरीत, अधिक से अधिक आयुध डिपो६०० परिणाम के लिए एक स्पष्ट स्थान पर निर्भर पूर्वाग्रह दिखाया, के रूप में क्रमिक परिवर्तन ऊर्ध्वाधर दिशा के साथ मनाया गया, कि है, अधिक से अधिक आयुध डिपो६०० धीरे से उन लोगों के लिए कॉलम 2 के कुओं से वृद्धि हुई ९६-वेल प्लेट (चित्र 3 बी) पर स्तंभ 11. पक्षपातपूर्ण परिणामों से बचने के लिए, एक ही नमूना दोहराया माप के लिए ९६-अच्छी तरह से प्लेट के दोनों किनारों पर स्थित कुओं में लोड करने के लिए सिफारिश की है । अधिक से अधिक आयुध डिपो में स्थानीय पूर्वाग्रह६०० मूल्यों वाष्पीकरण दर, जो दोनों हीटिंग और सील क्षमता द्वारा निर्धारित कर रहे है में भिंनता से परिणाम माना जाता है । ९६ के बीच में कुओं के साथ तुलना में अच्छी तरह से microplate, कुओं के किनारों पर स्थित अपेक्षाकृत उच्च मूल्यों को दिखाने के लिए, विभिंन वाष्पीकरण microplate की सीलिंग प्रभाव से उत्पंन दरों को दर्शाती है । इसके अलावा, के बाद से अंय ९६ अच्छी तरह से एक ही पूर्वाग्रह परीक्षण के अधीन microplates समान दिशात्मक परिवर्तन के आधार पर जहां अच्छी तरह से थाली पर स्थित था दिखाया, पूर्वाग्रह की हद तक प्लेट रीडर पर निर्भर हो सकता है । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि ९६ के वैश्विक पूर्वाग्रह का मूल्यांकन अच्छी तरह से अध्ययन में पढ़ता है कि अधिक से अधिक जनसंख्या घनत्व निर्धारित करते हैं । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थाली पाठकों सभी अपने विशिष्ट वैश्विक हीटिंग और मिलाते हुए क्षमता की वजह से पूर्वाग्रह है, और ९६-अच्छी तरह से microplates काफी हद तक दक्षता सील द्वारा विभेदित कर रहे हैं ।

इस विधि बैक्टीरियल विकास के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए बनाया गया है, और यह दो प्रमुख मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यानी, विकास दर और कोशिका घनत्व, कि सामान्यतः ऐसे सिस्टम जीव विज्ञान, विकास के रूप में खेतों की एक विस्तृत विविधता में लागू कर रहे हैं, और पारिस्थितिकीय16,17. मैनुअल गणना स्प्रेडशीट का उपयोग करने के लिए रॉ की प्रोसेसिंग दिखाने के लिए विकास दर और कोशिका घनत्व के मूल्यांकन मापदंडों का उत्पादन करने के लिए शुरू की है । प्रति घंटा की वृद्धि दर पहले विकास वक्र (चित्रा 4a) के कच्चे पढ़ता से गणना कर रहे है विकास दर में अनुक्रमिक परिवर्तन (चित्रा 4B) के एक डेटा सेट के रूप में ४.६ प्रोटोकॉल अनुभाग के अनुसार । प्रत्येक पांच लगातार वृद्धि दर का अर्थ और मानक विचलन क्रमिक रूप से अधिग्रहीत किए जाते हैं (चित्र 4c-D), और सबसे छोटे मानक विचलन के साथ सर्वाधिक अर्थ वृद्धि दर को वृद्धि की अधिक से अधिक वृद्धि दर के रूप में परिभाषित किया गया है वक्र (चित्र 4c-D, हाइलाइटकिया गया) । अधिक से अधिक सेल घनत्व (आयुध डिपो६००) इसी तरह (चित्रा 4E-एफ) का विश्लेषण किया है । गणना वृद्धि दर और कोशिका घनत्व को बाद में आगे के विश्लेषण के अधीन कर रहे हैं । ध्यान दें कि वर्णित गणना स्वचालित रूप से गणनात्मक प्लेटफार्मों (प्रोग्रामिंग भाषाओं), उदा, R और पायथन का उपयोग किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 विकास घटता विविध तरीकों के साथ अधिग्रहीत किया । (क) वृद्धि curves के कई अधिग्रहण । विभिंन जीनोम व्यक्त चार विभिंन ई. कोलाई उपभेदों के विकास curves एक उच्च प्रवाह तरीके से प्राप्त किया गया । ई. कोलाई कोशिकाओं को ंयूनतम मध्यम M63 में बड़े हो गए थे, और आयुध डिपो में परिवर्तन६०० पढ़ता एक microplate रीडर द्वारा 1-h अंतराल पर दर्ज किए गए थे । बाएं से दाएं उपभेदों जंगली प्रकार ई. कोलाई W3110 (संख्या 0) और उसके कम जीनोम संख्या 1, 10 और 18 (पहले5वर्णित), क्रमशः हैं । (ख) विकास वक्र CFU परख का उपयोग करके प्राप्त की । वंय प्रकार ई. कोलाई कोशिकाओं (संख्या 0) और संस्कृति थे कई घंटे से अधिक संकेत दिया समय अंक में नमूने थे । वृद्धि परिवर्तन CFU परख का उपयोग कर का अनुमान लगाया गया । खुले हलकों रिकॉर्डिंग या नमूने अंक इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. प्रतिलिपि दोहराया माप । (क) विविध कमजोर पड़ने की दर की रातोंरात संस्कृतियोंएस ई. कोलाई कोशिकाओं एकाधिक कमजोर पड़ने की दर है, जो 1 से विविध-१०,०००-गुना में ट्यूबों में inoculated थे, के रूप में संकेत दिया । कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 12 घंटे के लिए २०० rpm में मिलाते के साथ संस्कृति थे । अंतिम आयुध डिपो पांच सेल संस्कृतियों के६०० मूल्यों (बाएं से दाएं) थे १.५१, ०.७४, ०.०५, ०.००८ और ०.००१, क्रमशः । ०.०५ के ओडी६०० के साथ कल्चर का प्रयोग कॉमन ग्लिसरॉल स्टॉक के लिए किया गया । (ख) अति प्रतिलिपि मापन. एक ही ई. कोलाई तनाव के छह स्वतंत्र विकास घटता (ऊपर, ग्रे लाइनों) का अधिग्रहण किया और microplate और आम ग्लिसरॉल शेयर की दो शीशियों पर छह पदों से गणना की गई । ब्लैक लाइन छह विकास curves के औसत का प्रतिनिधित्व करता है । भिन्नता के गुणांक (CV) छह दोहराया माप (नीचे) की गणना की गई, और स्थिर कम अंक गुलाबी में छायांकित हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 ९६ के वैश्विक पूर्वाग्रह-अच्छी तरह से प्रारूप । (क) विकास दर की ऊष्मा का नक्शा. ई. कोलाई सेल स्टॉक ंयूनतम मध्यम M63 में निलंबित कर दिया गया था और microplate के ९६ कुओं में समान रूप से भरी हुई (एक 12 × 8 तालिका के रूप में प्रतिनिधित्व) । आयुध डिपो में परिवर्तन६०० microplate रीडर का उपयोग कर प्राप्त किए गए, के रूप में प्रोटोकॉल के खंड 5 में वर्णित है । सफेद से लाल उंनयन ०.७ से ०.९ h-1के विकास दर को इंगित करता है । (ख) अधिक से अधिक आयुध डिपो६००की हीट नक्शा । लाल करने के लिए सफेद से उंनयन ०.९ से १.२ के लिए अधिक से अधिक आयुध डिपो६०० मान इंगित करता है । वृद्धि दर और अधिक से अधिक आयुध डिपो६०० के लिए गणना चित्रा 4में वर्णित के रूप में कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 विकास घटता का विश्लेषण । (क) विकास घटता का कच्चा आँकड़ा. प्रति घंटा आयुध डिपो६०० पढ़ता संस्कृति समय के खिलाफ साजिश रची है । खुला हलकों नमूना बार संकेत मिलता है । (ख) विकास दर में लौकिक परिवर्तन । दो लगातार आयुध डिपो६०० पढ़ता के बीच प्रति घंटा की वृद्धि दर ४.६ में वर्णित समीकरण के अनुसार परिकलित की जाती हैं । (ग) मतलब वृद्धि दर । निर्बाध विकास दर देने के लिए पांच लगातार वृद्धि दर के माध्य की गणना की जाती है । (घ) मतलब वृद्धि दर के मानक विचलन । समान पांच लगातार वृद्धि दर के मानक विचलन की गणना की जाती है । सबसे छोटे मानक विचलन के साथ अधिक से अधिक वृद्धि दर लाल रंग में हाइलाइट किया गया है । (ङ) माध्य ओडी६००. पांच लगातार आयुध डिपो६०० मूल्यों का मतलब चिकनी आयुध डिपो६००निर्धारित करने के लिए गणना की है । (च) माध्य ओडी६०० मूल्यों का मानक विचलन । समान पांच लगातार ओडी६०० मान के मानक विचलन की गणना की जाती है । सबसे छोटे मानक विचलन के साथ अधिक से अधिक आयुध डिपो६०० लाल रंग में हाइलाइट किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के एक आम शेयर की तैयारी और microplate पर विभिंन पदों पर कई कुओं में एक ही नमूने की प्रतिकृति शामिल हैं । पहले, विज्ञानियों एक रात पूर्व संस्कृति से संस्कृति शुरू कर दिया । हालांकि इस विधि से बैक्टीरियल ग्रोथ के लैग टाइम को कम कर सकते हैं, लेकिन प्रतिलिपि ग्रोथ घटता पाना मुश्किल होता है । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, स्वतंत्र माप आम ग्लिसरॉल शेयरों का उपयोग लगभग समान विकास घटता है, जो प्रतिलिपि और सटीक परिणाम प्रदान के परिणामस्वरूप । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, विभिंन स्थानों पर कुओं थोड़ा अलग दे पढ़ता है, जो माप की वैश्विक पृष्ठभूमि माना जाता है । बैक्टीरियल विकास के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए, इस पृष्ठभूमि पर विचार किया जाना चाहिए । प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए विभिंन प्लेट स्थानों पर कई कुओं के लिए नमूनों की टीका अत्यधिक वैश्विक पूर्वाग्रह के लिए खाते के लिए सिफारिश की है ।

त्रुटियों को संभालने के अलावा, संशोधन और प्रयोगात्मक उपकरणों और आपूर्ति से व्युत्पंन समस्या निवारण पर विचार किया जाना चाहिए । कई उंनत microplate पाठकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । वे विशेषताओं में एक विस्तृत भिन्नता, प्रकाश तरंग दैर्ध्य को समायोजित करने की विधि के रूप में दिखाने, हीटिंग या ठंडा करने की विधा, और तरीके और झटकों की आवृत्ति. हमारे अनुभव के आधार पर, वाष्पीकरण उच्च प्रवाह अध्ययनों में संबोधित किया जाना चाहिए, क्योंकि तरल मात्रा में परिवर्तन बहुत प्रभावित आयुध डिपो६०० पढ़ता है । वाष्पीकरण microplate पाठकों और microplates की वास्तुकला द्वारा इस्तेमाल हीटिंग की विधि के कारण होता है । आमतौर पर वाणिज्यिक microplate पाठकों में कार्यांवित हीटिंग के दो तरीके गर्म हवा और एक गर्म थाली के साथ हीटिंग द्वारा हीटिंग हैं । microplate पाठक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एक हीटिंग विधि के रूप में गर्म थाली का इस्तेमाल किया वाष्पीकरण कम है क्योंकि microplate में मध्यम जल्दी से उड़ाने गर्म हवा में सूख जाएगा । microplates का भी सावधानीपूर्वक चयन करना चाहिए । अलग ९६-अच्छी तरह से microplates (ढक्कन के साथ) वाष्पीकरण के विभिन्न स्तरों के कारण. वर्णित विधि एक गहरी कवर ढक्कन, जो वाष्पीकरण कम कर देता है के साथ प्लेट स्वरूप का उपयोग करता है ।

इसके अलावा, यदि अध्ययन विकास वक्र के स्थिर चरण विश्लेषण की आवश्यकता है, तो तरीके और microplate रीडर में मिलाते की आवृत्ति ध्यान में रखा जाना चाहिए । संस्कृति के दौरान मिलाते हुए यह सुनिश्चित करता है कि बढ़ती कोशिकाओं मीडिया में समान रूप से निलंबित कर रहे हैं । गलत मिलाते हुए या कम आवृत्ति कोशिकाओं के चारों ओर अच्छी तरह से किनारे या केंद्र में एक उच्च घनत्व पर ढेर करने के लिए कारण हो सकता है, झूठी पढ़ता है कि या तो कम या अधिक वास्तविक पढ़ता में जिसके परिणामस्वरूप. वर्णित विधि रेखीय, द्वि-दिशा मिलाना का उपयोग करता है । जबकि 8 के आकार का मिलाते हुए मोड शायद पर्याप्त है, हम मिलाते के परिपत्र मोड की सिफारिश नहीं है ।

इस विधि की प्रमुख सीमा कोशिका संस्कृति माध्यम का वाष्पीकरण है. के बाद से अधिक से अधिक संस्कृति की मात्रा छोटी है, यानी, २०० µ एल, ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी महत्वपूर्ण वाष्पीकरण का कारण बनता है. इस प्रकार, इस विधि से अधिक संवर्धन के लिए अनुपयुक्त है ४८ h. इसके अतिरिक्त, कम घनत्व के सेल संस्कृतियों से बचना चाहिए क्योंकि ऑप्टिकल डिटेक्शन (आयुध डिपो६००) इन घनत्व पर सीमित है । जब एक साथ माना जाता है, बहुत धीमी गति से बढ़ रही कोशिकाओं/उपभेदों या बहुत कम प्रारंभिक एकाग्रता संस्कृतियों पसंद नहीं कर रहे हैं, के रूप में वे लंबे समय की आवश्यकता है और ओडी६००का पता लगाने की सीमा से नीचे हैं ।

इस विधि सटीक, उच्च प्रवाह माप है, जो व्यवस्थित सर्वेक्षण के लिए अत्यधिक लाभप्रद है पैदावार । एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, इस विधि के विभिंन जीनोमिक दृश्यों और/या मध्यम आसानी से और reproducibly5के साथ ई. कोलाई उपभेदों के एक वर्गीकरण का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है । जब ट्यूबों में संवर्धन के पारंपरिक तरीकों की तुलना में और मैंयुअल रूप से अलग समय बिंदुओं पर नमूनों को मापने, वर्णित विधि कम परिश्रम और गहन समय है । भविष्य के अनुप्रयोगों और विधि के विकास के लिए प्रयोगात्मक हेरफेर और गणना विश्लेषण के स्वचालन शामिल ग्रहण कर रहे हैं । स्वचालित माप और रोबोटिक्स आवेदन सेल विकास के मूल्यांकन और बैक्टीरियल और स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग कर अस्तित्व परीक्षण प्रदर्शन का एक अत्यधिक कुशल और विश्वसनीय विधि के लिए नेतृत्व करेंगे ।

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Disclosures

हम CFU परख उदाहरण प्रदान करने के लिए मेंहै Tsuchiya धंयवाद । यह काम आंशिक रूप से आर्थिक रूप से एक अनुदान के द्वारा समर्थित था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (C) no. २६५०६००३ (BWY) शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से, जापान ।

Acknowledgments

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2HPO4 Wako 164-04295
KH2PO4 Wako 166-04255
(NH4)2SO4 Wako 019-03435
MgSO4-7H2O Wako 138-00415
Thiamine-HCl Wako 201-00852
glucose Wako 049-31165
HCl Wako 080-01066
Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) Wako 094-01082
KOH Wako 168-21815
Glycerol Wako 075-00611
Centrifuge tube (50 mL, sterilized) WATSON 1342-050S
Pipette Tips, 200 µL WATSON 110-705Y
Pipette Tips, 1,000 µL WATSON 110-8040
Microtube (1.5 mL) WATSON 131-715C
8 multichannel-pipette WATSON NT-8200
PASORINA STIRRER AS ONE 2-4990-02
Glass cylinder (200 mL) AS ONE 1-8562-07
Precision pH mater AS ONE AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200 GILSON 1-6855-05
Pipetman P-1000 GILSON 1-6855-06
Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) SANPLATEC SAN27014
Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) SANPLATEC SAN27015
Microtube stand BM Bio 801-02Y
Vortex BM Bio BM-V1
Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) Sigma-Aldrich Corning, 3370
Corning Costar reagent reservoir (50 mL) Sigma-Aldrich Corning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) Merck Millipore SCGVU02RE
Pipet-Aid XP DRUMMOND 4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR) TAITEC 0053778-000
Disposal cell (1.5 mL) Kartell 1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter A23616
EPOCH2 BioTek 2014-EP2-002 / EPOCH2T
Beaker (500 mL) IWAKI 82-0008
BIO clean bench Panasonic MCV-B131F
Glass tubes NICHIDEN RIKA GLASS P-10M~P-30 /101019
Silicone rubber stoppers ShinEtsu Polymer T-19
Bacterial strains Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan

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References

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माइक्रोबायोलॉजी अंक १२७ बैक्टीरियल विकास विकास वक्र विकास दर सेल घनत्व उच्च प्रवाह microplate रीडर ९६-खैर प्लेट ई कोलाई
बैक्टीरियल विकास के सटीक, उच्च प्रवाह विश्लेषण
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Kurokawa, M., Ying, B. W. Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (127), e56197, doi:10.3791/56197 (2017).

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