Summary
Kvantitativ vurdering av bakteriell vekst er viktig å forstå mikrobiell fysiologi som systemer nivå fenomen. En protokoll for eksperimentell manipulasjon og en analytisk tilnærming er innført, slik at presis, høy gjennomstrømming analyse av bakterievekst, som en nøkkel gjenstand for interesse systemer biologi.
Abstract
Bakteriell vekst er et sentralt begrep i utviklingen av moderne mikrobiell fysiologi og etterforskning av mobilnettet dynamics på systemnivå. Nyere studier har rapportert sammenhenger mellom bakterievekst og genomet-wide hendelsene genomet reduksjon og transcriptome omorganisering. Riktig analysere bakterievekst er avgjørende for å forstå vekst-avhengige samordning av genet funksjoner og cellulære komponenter. Følgelig kreves nøyaktig kvantitativ vurdering av bakterievekst i en høy gjennomstrømming måte. Nye teknologiske utviklingen tilbyr nye eksperimentelle verktøy som tillater oppdateringer av metodene som brukes for å studere bakterievekst. Protokollen innført her benytter en microplate leseren med en optimalisert eksperimentelle prosedyren for reproduserbare og nøyaktig vurdering av bakterievekst. Denne protokollen ble brukt til å evaluere veksten av flere tidligere beskrevet Escherichia coli stammer. De viktigste trinnene av protokollen er som følger: utarbeidelse av et stort antall celle aksjer i små ampuller for gjentatte tester med reproduserbar resultater, bruk av 96-brønns plater for høy gjennomstrømming vekst evaluering og manuell beregning av store parametere (dvs., maksimal vekst rate og befolkningen tetthet) representerer vekst dynamikken. I forhold til tradisjonelle colony-forming unit (CFU) analysen, som teller cellene som er kultivert i glass rør over tid på agar plater, nåværende metoden er mer effektiv og gir mer detaljert timelige poster vekst endringer, men har en strengere gjenkjenning grense på lav befolkningstetthet. Oppsummert er metoden beskrevet fordelaktig for presis og reproduserbar høy gjennomstrømming analyse av bakterievekst, hvilke kan brukes å konseptuell konklusjoner eller gjøre teoretisk observasjoner.
Introduction
Mikrobiologisk studier starter ofte med kulturen i bakterielle celler og vurdering av bakterievekst kurvene, som representerer et grunnleggende fenomen bakteriell fysiologi1,2,3. Grunnleggende kultur prinsippene er allment tilgjengelig i publisert forskningslitteratur og lærebøker fordi bakteriell kultur er en grunnleggende metode. På benken nivå, betydelig oppmerksomhet har tradisjonelt vært fokusert på optimalisering vekst medier og dyrking forhold, men kontrollere veksten, som trolig ville gi enda større forståelse av mikrobielle fysiologi, har ikke vært grundig studert4. Eksponensielt voksende bakterier, er en viktig parameter av mobilnettet vekstraten, som har blitt rapportert som skal koordineres med genom, transcriptome og proteom5,6,7,8 . Dermed er kvantitativ vurdering av bakteriell vekst avgjørende for å forstå mikrobiell fysiologi.
For å evaluere bakterievekst, eksperimentelle metoder brukes til å beregne biomasse er godt etablert9,10 og er basert på oppdagelsen av biokjemiske, fysiske eller biologiske parametere, for eksempel optisk turbiditet. I tillegg er de analytiske metodene brukes til å fange de dynamiske egenskapene til vekst endringer vanligvis basert på etablerte ikke-lineære modeller11,12,13, for eksempel logistikk ligninger. Vekst dynamics er vanligvis kjøpt av tidsbestemte utvalg av cellevekst i kultur måle optisk turbiditet eller utføre colony-forming unit (CFU) analyser. Begrensning av metodene dyrking og oppdagelsen er at datapunktene ikke er en sann refleksjon av populasjonsdynamikk fordi måling intervallene er ofte i timer og fordi betingelsen kultur (f.eksendringer i temperatur og lufting) er forstyrret ved prøvetaking. Kultur og analyse må oppdateres med den siste utviklingen i teknologi og forståelse. Nylige fremskritt innen microplate lesere at sanntid observasjon av bakterievekst og betydelig redusere arbeidskostnader. Med disse avanserte enheter, rapportert de nyeste studiene på bakterievekst analytiske metoder for høy gjennomstrømming målinger14,15.
Formålet med denne protokollen er å evaluere presis vekst dynamikken i en høy gjennomstrømming måte, som vil være verdifulle for kvantitative studier som til slutt ta opp spørsmål hvor veksten bestemmes og hvilke faktorer som påvirker vekstraten. Protokollen løser alle faktorer som bør tas i betraktning for repeterbare og presis kvantifisering av bakterievekst. Eksperimentell metode og analyse er beskrevet i detalj i hovedteksten. Denne metoden tillater presis og reproduserbar analyse av bakterievekst i en høy gjennomstrømming måte. Microbiologists kan bruke denne protokollen utlede flere kvantitative resultater fra deres eksperimentelle bevis. Denne protokollen kan også brukes for studier i systems biology som forsøker å konseptuell konklusjoner eller å oppnå en teoretisk oversikt over vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør vekstmediet
Merk: den kjemiske sammensetningen av minimal middels M63 er som følger: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4: 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM Thiamin-HCl, 0.2 mM MgSO 4 og 22 mM glukose. M63 er laget ved å blande tre lager løsninger: fem X løsning, 20% glukose og MgSO 4 Thiamin løsning. Lagre alle løsninger på 4 ° C.
- Forbereder fem X løsningen
- å forberede FeSO 4 løsning, bruker en elektrisk pipette og en engangs serologisk pipette til ddH 2 O slik 50 mL sentrifuge. Bruker en P-200 til 0,06 mL HCl å få 0,01 M HCl. Legg 36 mg FeSO 4-7 H 2 O og bland godt.
- 160 mL ddH 2 O i en måling sylinder og legge den til en 500-mL kanne. Legg til følgende i denne rekkefølgen: 10.72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 og 0,5 mL FeSO 4 løsning (forberedt i trinn 1.1.1).
- Med en presisjon pH-meter, justere pH 7.0 ved å legge til 2 M KOH. Hell løsningen i en måling sylinder og legge ddH 2 O til et totalt volum på 200 mL. Sterilisere løsningen med en 250-mL filtrering enhet (PVDF, 0.22 µM).
- Forbereder 20% glukose løsningen
- 200 mL ddH 2 O i en måling sylinder og hell den å en 500-mL kanne. Men med en magnetisk rørestang, legger du til 50 g av glukose. Fortynne løsningen i en måling sylinder til et totalt volum på 250 mL. Sterilisere løsningen som beskrevet i trinn 1.1.3.
- Forbereder MgSO 4 Thiamin løsningen
- legge til 150 mL ddH 2 O en 500-mL kanne. Mens blander med en magnetisk rørestang, legge til 1,0 g av Thiamin-HCl og 10 g MgSO 4-7 H 2 O. Dilute løsningen i en måling sylinder et totalt volum på 200 mL. Sterilisere løsningen som beskrevet i trinn 1.1.3.
- Forbereder minimal middels M63
- plassere fem X løsningen, 20% glukose løsningen, MgSO 4 Thiamin løsningen, en elektronisk pipette, en P-200 pipette og 200-µL pipette-spisser på en ren benk.
- 155.8 mL ddH 2 O i en måling sylinder og hell den i et 500 mL beaker.
- Elektronisk pipette og disponibel serologisk pipette, legger 40 mL av fem X løsning og 4 mL 20% glukose løsning til målte ddH 2 O. Legg deretter til 0,2 mL MgSO 4 Thiamin løsning med P-200. Sterilisere løsningen som beskrevet i trinn 1.1.3.
2. Forbereder glyserol aksjen
- celle kultur
Merk: på bakteriell stammer (f.eks, W3110 og dens redusert genomer) er tilgjengelig fra belastning bank organisasjoner. Stammene hentes vanligvis i form av kolonier på agar plater.- Plassere fem steriliserte glass rør med silikon gummi propper, en elektronisk pipette, P-1,000, 1000-µL pipette-spisser, P-200, 200-µL pipette-spisser og målet stammer (kolonier på plater) på en ren benk.
- Avsløre munningen av glasset røret til en Bunsen brenner før du åpner gummi silikonpluggen. Utsette gummi silikonpluggen til flammen etter røret er åpnet, og lett plasser lokket tilbake på glassrør.
- Bruker den elektroniske pipette og disponibel serologisk Pipetter til 5 mL M63 til BILLEDRØR og 4,5 mL M63 til andre fire rør.
- Bruker P-200 spissen å plukke en koloni og vaksinere det i glass røret som inneholder 5 mL M63.
- Vortex tube gjøre en suspensjon. Deretter fortynne løsningen 10-fold ved å overføre 0,5 mL løsningen til en av de fire rørene som inneholder 4,5 mL M63.
- Gjenta prosessen beskrevet i trinn 2.1.5 for gjenværende rørene. En fortynning serie med fem ulike konsentrasjoner (fortynninger av 1, 10, 100, 1000 og 10000) er nå klar.
- Sterilisere munn glass-rør og silikon gummi stoppers som beskrevet i trinn 2.1.2. Cap rør med stoppers. Unngå forurensning av rynker ikke silikon gummi stoppere.
- Plasserer fem rør i en forvarmes risting inkubator på 37 ° C og riste på 200 rpm. Inkuber kultur over natten eller i 10 til 30 h.
- Utvalg av kultur for glyserol aksjen
- Plasser forvarmes romtemperatur M63 medium, P-1,000, 1000-µL pipette-spisser og disponibel søppel på en ren benk.
- Legge til 1000 µL M63 til disponibel søppel med en P-1, 000. Plasser den disponible cuvette i et spektrofotometer, start programmet på en bestemt bølgelengde på 600 nm, og måle tomt.
- Flytte de fem BILLEDRØR settefiskanlegg risting til ren benken.
- Forkaste M63 fra den disponible cuvette og legge 1000 µL kultur til den samme disponibel cuvette med en P-1, 000. Måle den optiske turbiditet med cellekulturer (OD 600) som beskrevet i trinn 2.2.2.
Merk: Unngå enhver kontaminering og oppnå nøyaktig måling, utsette glass-rør og stoppers flamme som beskrevet og vortex kulturen før prøvetaking. For å sikre pålitelige resultater, gjentatte målinger er anbefalt, særlig når cellen tetthet er lave. - Av de fem celle kulturer, Velg en som er i den tidlige fasen eksponentiell vekst (OD 600 = 0.01 - 0,05) leter glyserol.
Merk: Hvis flere kulturer har tettheter i det optimale området, nærmest 0,05 vanligvis velges.
- Gjøre glyserol aksjer for gjentatte tester.
Merk: Dette er beskrevet for å forberede ti aksjer. Større eller mindre mengder kan gjøres i henhold til eksperimentelle kravene.- Setter steriliserte 60% glyserol løsningen, ti sterilisert 1.5-mL microtubes, P-1,000 og P-200, 1000 - og 200-µL pipette-spisser og en microtube stå på en ren benk.
- Legge til 250 µL sterilisert 60% glyserol løsning og 750 µL av merket cellekultur til 1.5-mL microtube og blanding av pipettering.
Merk: Lager volumet er variabel, men alltid opprettholde 1:3 forholdet mellom 60% glyserol til cellekultur; Dette resulterer i en siste konsentrasjon av 15% glyserol. - Plasser de resterende ni microtubes i microtube stå og dispensere 100 µL av blandingen i trinn 2.3.2 til hver tube. Det er nå ti identiske glyserol aksjer for fremtidig bruk.
- Lagre aksjer i en fryser på-80 ° C.
3. Anskaffe vekst kurvene
- sette opp microplate leseren.
Merk: Betingelsene vises i anførselstegn Vis bestemt frasering brukes på plate leseren brukes her (se tabell for materiale).- Åpne programvaren. Åpne " protokoller " i " oppgave bestyrer " og velge " ny ". Velg " Standard protokoll ".
- Åpen " prosedyren ", og justere innstillingene. Åpne " angi temperatur ", og velg " inkubator på ". Angi " temperatur " 37 ° c og " Gradient " til 0 ° C. Sjekk " Forvarm " før du fortsetter med neste trinn. Åpne " starte Kinetic ", sette " kjøretid " for 24:00:00 eller 48:00:00, og " intervall " 00:30:00 eller 01:00:00.
Merk: Det tar ca 1 min å lese en hel 96 godt plate. - Åpen " riste " og sette " Shake modus " som " lineær ". Sjekk " Constitution Shake " og " ofte " på 567 cpm. Åpne " Les ", sjekk " absorbans ", " endepunkt/kinetisk ", og " Monochromators. " satt " bølgelengde " 600.
- Klikk " Valider " å bekrefte at prosedyren er riktig. Klikk " lagre " lagre det som et nytt program for fremtidig bruk.
- Sanntid opptak av vekst
- trekke en 96-brønns plate piktogram (8 × 12 tabell) for å angi plasseringen av inokulerte kultur prøvene på 96-brønns tallerkenen. Skrive ut tabellen og bruke den som referanse for eksperimentet.
Merk: Brønnene ligger på kanten av microplate bør bare inneholde tomme medium på grunn av fordamping. - Sted en sterilisert 96-brønns flat bunn microplate med lokk, P-1000, 1000-µL pipette-spisser, P-200, 200-µL pipette-spisser, flere 1.5-mL microtubes, en 8-kanals pipette, en sterilisert reagens-reservoaret, romtemperatur M63 og glyserol aksjer (forberedt i trinn 2.3) på en ren benk.
- Legge til ca 25 mL M63 reagens reservoaret. Bruk dette reservoaret lager for alle følgende trinn.
- Legge til 900 µL M63 til microtubes i forberedelse for å gjøre føljetong fortynninger.
- Tine glyserol aksjen ved romtemperatur. Legge til 900 µL M63 tinte glyserol lager og vortex. Dette resulterer i en 10 ganger fortynning av den opprinnelige glyserol lager.
- Overføre 100 µL av 10 ganger fortynning til en annen microtube som inneholder 900 µL M63 og vortex. Dette resulterer i en 100-fold fortynning.
- Gjenta trinn 3.2.6 til ønsket antall fortynninger er oppnådd.
- Fylle brønnene på kanten av microplate med 200 µL M63 benytter en 8-kanals Pipetter (P-200).
Merk: Disse brønnene kan brukes som tomt. - Last 200 µL av hver utvannet eksempel i trinnene 3.2.4 - 3.2.7 microplate fordelt etter referansetabellen (trinn 3.2.1). Virvelen av fortynnede prøver før lasting og Last det samme prøve i flere brønner på varierte steder på tallerkenen.
- Sted i 96-brønnen microplate på platen leseren.
- Åpen " lese nå " i " oppgave bestyrer " og Velg programmet (inndelingen 3.1). Klikk " OK " å begynne å måle. Lagre innspillingen som en ny eksperimentell fil for dataanalyse (del 4).
- trekke en 96-brønns plate piktogram (8 × 12 tabell) for å angi plasseringen av inokulerte kultur prøvene på 96-brønns tallerkenen. Skrive ut tabellen og bruke den som referanse for eksperimentet.
4. Dataanalyse
- eksportere resultatene av sanntids vekstrate data (kapittel 3.2) til en USB-minne pinne som en tekstfil.
Merk: En 96-brønns formaterte resultatene (kurver) vises på plate leseren i sanntid. Timebasert postene (OD verdier) kan eksporteres som en tabell. radene og kolonnene representerer godt tallene (f.eks A1, B1) og måle tid (f.eks 00:00:59), henholdsvis. - Åpne tekstfilen med et regnearkprogram.
- Kopi av hourly OD 600 leser av 96-brønnen microplate i et nytt regneark for ytterligere analyse.
- Trekk fra bakgrunnen leser ved tid null fra de timebaserte visninger av hvert utvalg godt.
Merk: For bekvemmelighet middelverdien av tomt brønner som inneholder M63 (trinn 3.2.8) kan brukes som bakgrunn verdien. - Beregner gjennomsnittet av fem påfølgende OD 600 leser til å beregne maksimalt befolkningstettheten.
Merk: Største middelverdien i fem påfølgende OD 600 lyder defineres som maksimal OD 600 av tilsvarende vekstkurven. - Beregner veksten, µ (h -1), ved å bruke følgende ligning for alle verdipar påfølgende OD 600:
Merk: I denne ligningen, C jeg og C jeg + 1 representerer OD 600 verdiene i to ganger punkter (t jeg og t jeg + 1, henholdsvis). LN angir naturlige logaritmen. - Beregner endringene i veksten over tid basert på hourly OD 600 leser etter trinn 4.6. Beregne gjennomsnittet og standardavviket for fem sammenhengende vekst priser for å anslå maksimal vekst.
Merk: Det største gjennomsnittet med minste standardavviket defineres som maksimal veksten av tilsvarende vekstkurven.
5. Bekrefter den globale skjevhet i 96-brønnen lyder (valgfritt)
Merk: begge platen leseren og forbrukes 96-brønns plate kan forårsake partisk målinger. For å oppnå svært presis og reproduserbar kvantitative resultater, bekrefter den globale skjevheten av 96-brønns platen anbefales.
- Forberede 96-brønns platen og plate leseren bias testen som beskrevet i delen 3.2.2.
- Legge til 20 mL M63 slik sterilisert 50 mL sentrifuge. Legg glyserol lager til samme sentrifuge rør og vortex. Overføre suspendert løsningen til et sterilisert reagens reservoar.
- Bruker en 8-kanals pipette overføre 200 µL av suspendert løsningen til 96-brønns plate.
- Plasser 96-brønns platen på plate leseren og starte målingen.
- Post hourly OD 600 leser og analysere som beskrevet i Seksjon 4. Sammenligner beregnede maksimal vekst rate og befolkningen tettheten av hver brønn for å bestemme beliggenhet skjevhet i 96-brønnen lyder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet gir et middel til å fange dynamisk bakterievekst i en kontinuerlig, høy gjennomstrømming måte ved å benytte en 96-brønns format leser som tar flere optisk densitet målinger med ulike tidsintervaller (fra minutter til timer til dager). Vekst kurvene i et utvalg av E. coli stammer uttrykke ulike genomer kan være nettopp kjøpt i et enkelt eksperiment (figur 1A). I forhold til metoden beskrevet den tradisjonelle metoden (CFU analysen) vanligvis krever lengre prøvetaking tidsintervaller (figur 1B) og er arbeidsintensiv hvis flere kultur. I tillegg krever hver kultur prøvetidspunkt for CFU analysen bruk av en liten mengde cellekultur som ikke kan brukes for gjentatte målinger. I tillegg overser begrenset antall tidspunkt for gjenkjenning prøvepunkter som trengs for riktig beregningen av veksten og maksimal OD600. Men CFU analysen har en nedre grense for gjenkjenning, 103 - 104 celler/mL, slik at det er minst to størrelsesordener mer følsom enn optisk turbiditet analysen (OD600= 0,001, som har en grense for ca 10 påvisning5 -106 celler/mL). Metoden beskrevet gir en praktisk og effektiv eksperimentelle verktøy for systemer nivå studier på vekst dynamics.
En viktig fordel med denne protokollen er at det tar gjentatte målinger fra en felles glyserol lager. Å ha flere cellekulturer på ulike fortynning priser i tidlig eksponentiell vekstfase er svært nyttig fordi det tillater forskere å bestemme kultur samtidig alle tidsskalaen og unngår har mettet kulturer på grunn av uforutsette hendelser. Gjentatt dyrking og målinger av felles bestander, som ble utarbeidet fra en av de fem kulturene startet med ulike fortynning priser som beskrevet i protokollen delen 2.2 (figur 2A), presenterte svært lignende resultater vekst Dynamics analyse. Flere vekst kurver av gjentatte og uavhengige målinger (N = 6) overlappes godt (figur 2Btopp panel), med lite avvik (figur 2Bnedre panelet), spesielt i eksponentiell fasen ( Finne 2B, skygget område). Disse resultatene tyder på at metoden beskrevet gir svært reproduserbar resultater.
Beregne globale skjevhet i 96-brønnen lyder anbefales. I metoden nåværende globale bias anslås ved å overvåke veksten av vill-type E. coli sil W3110 som beskrevet i seksjon 5-protokollen. For eksempel veksten beregnet fra vekst kurvene viste signifikant variasjon blant 96 brønnene (figur 3A), som representerer global svingninger både datamanipulasjon og feilene. Disse feilene kan bli maskert av legge samme prøven i flere brønner på ulike steder på tallerkenen. Derimot maksimal OD600 viste en fjern plassering-avhengige bias for resultat som gradvis endringer ble observert langs den vertikal retningen, dvs maksimal OD600 gradvis økt fra brønnene på kolonne 2 til de kolonnen 11 96-brønns platen (figur 3B). For å unngå partisk resultatene, anbefales den samme prøven lastes inn brønnene ligger på begge sider av 96-brønns plate for gjentatte målinger. Beliggenhet skjevhet i maksimal OD600 verdier antas for å skyldes variasjonen i fordampning priser, som bestemmes av både varme og tetting effektivitet. Sammenlignet med brønnene i 96-brønnen microplate, tendens brønnene på kantene til å vise relativt høyere verdier, reflekterer den varierte fordampning prisen fra forsegling effekten av microplate. I tillegg siden andre 96-brønnen microplates utsatt for samme bias testen viste lignende Retningsendringer basert på hvor brønnen var plassert på tallerkenen, kan omfanget av skjevhet avhenge plate leseren. Derfor er det viktig å vurdere globale skjevhet i 96-brønnen lyder i studier som bestemmer maksimal befolkningstetthet. Kommersielt tilgjengelige plate lesere har sine bestemte global bias skyldes oppvarming og risting effektivitet og 96-brønnen microplates er hovedsakelig differensiert forsegle effektivitet.
Denne metoden er utformet for systematisk analyse av bakteriell vekst, og den kan brukes å analysere to store parametere, dvs, vekst rate og celle tetthet, som er brukt i en rekke felt, for eksempel systemer biologi, evolusjon, og økologi16,17. Manuell beregning ved hjelp av regneark er introdusert for å vise behandlingen av den rå lest å produsere evaluert parameterne av veksten rate og celle. Timeprisen vekst beregnes først fra den rå lest av vekstkurve (figur 4A) i henhold til protokollen delen 4.6 som et datasett fortløpende endringer i vekstrater (figur 4B). Midler og standardavvik av hver fem sammenhengende vekst er ervervet sekvensielt (figur 4C-D), og største mener veksten med minste standardavviket defineres som maksimal veksten vekst kurven (figur 4CD uthevet). Maksimal celle tetthet (OD600) er analysert tilsvarende (figur 4E-F). Beregnet veksten rate og celle tetthet er deretter utsatt for videre analyse. Merk at beskrevet beregningene automatisk utføres med beregningsorientert plattformer (programmeringsspråk), f.eksR og Python.
Figur 1 vekst kurver kjøpt med ulike metoder. (A) masseanskaffelser av vekst kurver. Vekst kurver av fire ulike E. coli stammer uttrykke ulike genomer ble oppnådd i en høy gjennomstrømming måte. E. coli cellene ble dyrket i minimal middels M63, og endringene i OD600 leser ble registrert av en microplate leser på 1-h intervaller. Stammene fra venstre til høyre er vill-type E. coli W3110 (nummer 0) og dens redusert genomer nummer 1, 10 og 18 beskrevet (tidligere5), henholdsvis. (B) vekstkurve hentes ved å bruke CFU analysen. Vill-type E. coli celler (nummer 0) ble kultivert og ble valgt til de angitte tidspunkt over flere timer. Vekst endringene var anslått bruker CFU analysen. Åpne sirklene angi innspilling eller prøvepunkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Reproduserbar gjentatte målinger. (A) overnatting kulturer av variert fortynnings. E. coli cellene ble inokulert i rør til flere fortynning priser, som varierte fra 1-til 10,000-fold, som angitt. Cellene ble kultivert på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm for ca 12 timer. Siste OD600 verdiene av de fem cellekulturer (fra venstre til høyre) var 1,51, 0.74, 0,05, 0.008 og 0,001, henholdsvis. Kulturen med OD600 av 0,05 ble brukt til vanlige glyserol aksjen. (B) svært reproduserbar målinger. Seks uavhengige vekst kurver (topp, grå linjer) av samme E. coli belastningen ble kjøpt og beregnet fra seks stillinger i microplate og to ampuller av felles glyserol aksjen. Den svarte linjen representerer gjennomsnittet av seks vekst kurvene. Koeffisientene variasjon (CV) av seks gjentatte målinger var beregnet (nederst), og jevn lave punktene er skyggelagt i rosa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 globale skjevhet av 96-brønns formatet. (A) varmekartet av vekst. E. coli celle aksjen ble suspendert i minimal middels M63 og lastet like i 96 brønnene av microplate (representert som en 12 × 8 tabell). Endringene i OD600 ble oppnådd med microplate leseren, som beskrevet i seksjon 5 i protokollen. Gradering fra hvit til rød angir vekstrater fra 0,7 til 0.9 h-1. (B) varmekartet av maksimal OD600. Gradering fra hvit til rød Angir maksimal OD600 verdiene fra 0,9 til 1.2. Beregningene for vekst og maksimal OD600 er som beskrevet i Figur 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 analyse av vekst kurver. (A) rådata om vekst kurver. Den hourly OD600 lest tegnes imot kultur. Åpne sirklene indikerer tidspunktene for prøvetaking. (B) Temporal endringer i vekst. Vekst timeprisene mellom to påfølgende OD600 leser beregnes ut ligningen beskrevet i 4.6. (C) at vekst. Gjennomsnittet av fem sammenhengende vekst priser beregnes for å gi jevn vekst. (D) standardavvik av gjennomsnittlig vekst. Standardavviket for samme fem sammenhengende vekst priser beregnes. Maksimal veksten med minste standardavviket er uthevet i rødt. (E) mener OD600. Gjennomsnittet av fem påfølgende OD600 verdiene beregnes for å bestemme glatt OD600. (F) standardavvik av mener OD600 verdier. Standardavviket for de samme fem påfølgende OD600 verdiene beregnes. Maksimal OD600 med minste standardavviket er uthevet i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgjørende skritt i protokollen inkludere utarbeidelsen av en felles lager eksponensielt voksende celler og replikering av samme eksemplene i flere brønner på ulike posisjoner på microplate. Tidligere startet microbiologists kulturen fra en overnatting før kultur. Mens denne metoden kan redusere oppholdstiden av bakteriell vekst, er det vanskelig å oppnå reproduserbar vekst kurver. Som vist i figur 2, førte uavhengige målinger ved hjelp av vanlige glyserol aksjer nesten identisk vekst kurver, som gir reproduserbare og nøyaktige resultater. Som vist i Figur 3, gir brønner på forskjellige steder litt forskjellige lyder, som er ansett som globale bakgrunnen av målinger. For kvantitativ vurdering av bakterievekst anses denne bakgrunn. Vaksinering å flere brønner på varierte plate steder for eksperimentell replikering anbefales å ta hensyn til global bias.
I tillegg til feilbehandling, bør endring og feilsøking avledet fra experimental enheter og forsyninger vurderes. Flere avansert microplate lesere er kommersielt tilgjengelig. De viser store variasjoner i egenskaper, for eksempel metoden justere lys bølgelengde, modus for oppvarming og kjøling, og måte og hyppigheten av risting. Basert på vår erfaring, rettes fordampning i høy gjennomstrømming studier fordi endringer i flytende volum stor innflytelse OD600 leser. Fordampning skyldes metoden for oppvarming microplate leserne og arkitektur i microplates. To moduser av oppvarming ofte implementert i kommersielle microplate lesere er oppvarming av varm luft og oppvarming med en kokeplate. Microplate leseren i denne protokollen brukes kokeplate som en oppvarming metode for å redusere fordampning fordi mediet i microplate vil raskt tørke opp i den blåse varm luften. Microplates bør også være nøye valgt. Ulike 96-brønnen microplates (med lokk) forårsake ulike nivåer av fordampning. Metoden beskrevet benytter plate-format med en dyp dekket lokk, noe som reduserer fordamping.
Videre, hvis studien krever stasjonære fase analyse av vekstkurve, deretter måten og hyppigheten av risting i microplate leseren bør tas i betraktning. Riste under kultur sikrer at økende cellene er suspendert jevnt i media. Uriktig risting eller lav frekvens kan forårsake cellene å stable rundt godt kanten eller midt på en høy tetthet, noe som resulterer i USANN leser som er lavere eller høyere enn faktisk leser. Den beskrevet metoden bruker lineær, toveis risting. 8-formet risting modus er tilstrekkelige, anbefaler vi ikke sirkulær modus risting.
Stor begrensning av denne metoden er fordampning av celle kultur medium. Fordi det maksimale kultur er liten, fører dvs200 µL, inkubasjon på 37 ° C til betydelig fordampning. Dermed denne metoden er uegnet for dyrking lenger enn 48 h. i tillegg, cellekulturer av lav tetthet bør unngås fordi optiske gjenkjenning (OD600) er begrenset på disse tettheter. Når regnet sammen, er ikke meget langsom voksende celler/stammer eller svært lav innledende konsentrasjon kulturer foretrukket, som de krever lenger tid og er under gjenkjenning grensen på OD600.
Denne metoden gir presis, høy gjennomstrømming målinger, som er svært fordelaktig for systematisk undersøkelser. Representant dermed denne metoden kan evaluere et utvalg av E. coli stammer med forskjellige genomisk sekvenser og/eller middels lett og reproduserbar5. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for dyrking i rør og manuelt måle eksempler på forskjellige tidspunkt, er metoden beskrevet mindre arbeid og tid intensiv. Framtidige applikasjoner og utvikling av metoden antas for å involvere automatisering av eksperimentelle manipulasjon og beregningsformelen analyser. Automatisk måling og robotikk programmet vil føre til en svært effektiv og pålitelig metode for å vurdere cellevekst og utføre overlevelse tester med bakteriell og pattedyr celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker Kohei Tsuchiya for å gi eksemplet CFU analysen. Dette arbeidet ble delvis økonomisk støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) nr. 26506003 (til BWY) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan.
Acknowledgments
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
