Summary
Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er nødvendigt for at forstå mikrobiel fysiologi som en systemniveau fænomen. En protokol til eksperimentelle manipulation og en analytisk tilgang introduceres, giver mulighed for præcis, høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som er et centralt emne af interesse i systembiologi.
Abstract
Bakterievækst er et centralt begreb i udviklingen af moderne mikrobiel fysiologi samt i undersøgelsen af cellulære dynamics på systemer plan. Nylige undersøgelser har rapporteret korrelationer mellem bakterievækst og genome-wide begivenheder, såsom genom reduktion og transkriptom reorganisering. Korrekt analysere bakterievækst er afgørende for at forstå den vækst-afhængige koordinering af genet funktioner og cellulære komponenter. Det er derfor nødvendigt præcis kvantitativ evaluering af bakteriel vækst på en måde, høj overførselshastighed. Nye teknologiske udvikling tilbyder nye eksperimentelle værktøjer, der tillader opdateringer af de benyttede metoder til at studere bakterievækst. I protokollen indføres her beskæftiger en mikrotiterplade læseren med en stærkt optimeret eksperimentel procedure for den reproducerbare og præcis vurdering af bakterievækst. Denne protokol blev brugt til at evaluere vækst af flere tidligere beskrevet Escherichia coli stammer. De vigtigste trin i protokollen er som følger: udarbejdelse af et stort antal celle bestande i små hætteglas for gentagne forsøg med reproducerbare resultater, brug af 96-brønd plader for høj overførselshastighed vækst evaluering og manuel beregning af to store parametre (dvs., maksimal vækst sats og befolkningen tæthed) repræsenterer vækst dynamics. I forhold til den traditionelle kolonidannende enhed (CFU) analyse, som tæller de celler, der er kulturperler i glasrør over tid på agar plader, den nuværende metode er mere effektiv og giver mere nøjagtige tidsmæssige optegnelser over vækst ændringer, men har en strengere detektionsgrænsen på lav befolkningstæthed. I Resumé er den beskrevne metode fordelagtig for den nøjagtige og reproducerbare høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som kan bruges til konceptuelle konklusioner eller at gøre teoretiske betragtninger.
Introduction
Mikrobiologiske undersøgelser starte ofte med kulturen i bakterieceller og vurderingen af bakterievækst kurver, som repræsenterer et grundlæggende fænomen for bakteriel fysiologi1,2,3. Grundlæggende kultur principper er bredt tilgængelige i offentliggjort forskningslitteratur og lærebøger, fordi bakteriekulturen er en grundlæggende metode. På niveauet bænk betydelig opmærksomhed har traditionelt været fokuseret på optimering vækst medier og dyrkning betingelser, men kontrollerer vækstraten, der vil sandsynligvis give endnu større forståelse af mikrobiel fysiologi, har ikke været grundigt undersøgte4. For eksponentielt voksende bakterier, er en vigtigste parameter i den cellulære stat den vækstrate, der er blevet rapporteret at være samordnet med den genom og transkriptom, proteom5,6,7,8 . Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er således afgørende for forståelsen af mikrobiel fysiologi.
For at evaluere bakterievækst, eksperimentelle metoder til at anslå biomasse er veletableret9,10 og er baseret på påvisning af biokemiske, fysiske eller biologiske parametre, såsom optiske turbiditet. Derudover er de analysemetoder, der anvendes til at fange de dynamiske egenskaber af væksten ændringer almindeligt baseret på etablerede ikke-lineære modeller11,12,13, eksempelvis logistic ligninger. Vækst dynamics er generelt erhvervet timet stikprøveanalyse af cellevækst i kultur af enten måling optisk turbiditet eller udfører kolonidannende enhed (CFU) assays. Begrænsning af disse dyrkning og påvisning metoder er at datapunkterne ikke er et sandt billede af populationsdynamikken, fordi måling intervaller er ofte i timer og kultur betingelse (f.eks.ændringer i temperatur og beluftning) er forstyrret på tidspunktet for prøveudtagningen. Kultur og analyse teknikker skal opdateres ved hjælp af den seneste udvikling i teknologi og forståelse. De seneste fremskridt i mikrotiterplade læsere giver mulighed for real-time observation af bakterievækst og betydeligt reducere omkostninger til arbejdsløn. Brug disse avancerede enheder, har de seneste undersøgelser på bakteriel vækst rapporteret analysemetoder til høj overførselshastighed målinger14,15.
Formålet med denne protokol er at vurdere den præcise vækst dynamik i en høj overførselshastighed måde, som vil være værdifuld for kvantitative undersøgelser, der i sidste ende løse spørgsmålene om hvordan væksten bestemmes og hvilke faktorer påvirker vækstraten. Protokollen adresser alle faktorer, der bør tages hensyn til den gentagelig og præcis kvantificering af bakterievækst. Den eksperimentelle metode og analyse er beskrevet i detaljer i hovedteksten. Denne metode tillader den nøjagtige og reproducerbare analyse af bakterievækst i en høj overførselshastighed måde. Mikrobiologer kan bruge denne protokol til at udlede yderligere kvantitative resultater fra deres eksperimentelle bevismateriale. Denne protokol kan også bruges til studier i systembiologi, der forsøger at drage grundlæggende konklusioner eller at opnå en teoretisk overblik over vækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede vækstmediet
NOTE: den kemiske sammensætning af minimal medium M63 er som følger: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 og 22 mM glukose. M63 er lavet ved at blande tre stamopløsninger: fem X løsning, 20% glucose og MgSO 4 thiamin løsning. Opbevar alle løsninger ved 4 ° C.
- Forbereder fem X løsning
- at forberede FeSO 4 løsning, bruge en elektrisk pipette og en engangs serologisk pipette tilføjes ddH 2 O til en 50 mL-centrifugerør. Brug en P-200 til at tilføje 0,06 mL HCl at opnå 0,01 M HCl. tilføje 36 mg FeSO 4-7 H 2 O og bland godt.
- Måler 160 mL ddH 2 O i et måleglas og føje den til et 500 mL bægerglas. Tilføj følgende i denne rækkefølge: 10.72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2,0 g (NH 4) 2 SO 4 og 0,5 mL FeSO 4 løsning (udarbejdet i trin 1.1.1).
- Ved hjælp af en præcision pH-meter, justeres til pH 7,0 ved at tilføje 2 M KOH. Hæld opløsningen i et måleglas og tilføje ddH 2 O til en samlet maengde paa 200 mL. Sterilisere den løsning ved hjælp af en 250 mL filtrering enhed (PVDF, 0,22 µM).
- Forbereder den 20% glukose løsning
- måler 200 mL ddH 2 O i et måleglas og hæld det til et 500 mL bægerglas. Mens blanding med en magnetomrører, tilsættes 50 g af glukose. Fortynd løsningen i et måleglas til en samlet maengde paa 250 mL. Sterilisere løsningen, som beskrevet i trin 1.1.3.
- Forbereder MgSO 4 thiamin løsning
- tilføje 150 mL ddH 2 O til et 500 mL bægerglas. Mens blanding med en magnetomrører, tilføje 1,0 g thiamin-HCl og 10 g af MgSO 4-7 H 2 O. Dilute løsningen i et måleglas til en samlet maengde paa 200 mL. Sterilisere løsningen, som beskrevet i trin 1.1.3.
- Forbereder minimal medium M63
- sted fem X løsning, 20% glukose løsning, MgSO 4 thiamin løsning, en elektronisk pipette, en P-200 pipette og 200 µL pipette tips på en ren bænk.
- Måler 155.8 mL ddH 2 O i et måleglas og hæld det i et 500 mL bægerglas.
- Ved hjælp af elektroniske pipette og engangs serologisk pipette, tilsættes 40 mL fem X løsning og 4 mL 20% glukose løsning til målte ddH 2 O. Derefter tilføje 0,2 mL MgSO 4 thiamin løsning med P-200. Sterilisere løsningen, som beskrevet i trin 1.1.3.
2. Forberede Glycerol bestanden
- celle kultur
Bemærk: bakteriestammer (fx, W3110 og dens reducerede genomer) er tilgængelige fra stamme bank organisationer. Stammer fås som regel i form af kolonier på agar plader.- Sted fem steriliseret glasrør med silikone gummipropper, en elektronisk pipette, P-1,000, 1.000-µL pipette tips, P-200, 200-µL pipette tips og målet stammer (kolonier på plader) på en ren bænk.
- Afsløre mundingen af glasrør til en bunsenbrænder før åbning silikone gummiprop. Udsætte silikone gummiprop til flammen når røret er åben, og Placer derefter let fælles landbrugspolitik tilbage på glasrør.
- Bruge elektroniske pipette og engangs serologisk pipette tilføjes 5 mL M63 til en af glasrør og 4,5 mL M63 til andre fire rør.
- Bruger P-200 tip til at vælge en koloni og podes det i glasrør, der indeholder 5 mL M63.
- Vortex røret til at gøre en suspension. Derefter fortyndes løsningen 10-fold ved at overføre 0,5 mL af denne opløsning til en af de fire rør indeholdende 4,5 mL M63.
- Gentag processen beskrevet taktfast 2.1.5 for de resterende rør. En fortyndingsrække med fem forskellige koncentrationer (fortyndinger på 1, 10, 100, 1000 og 10,000) er nu klar.
- Sterilisere munden af glasrør og silikone gummipropper som beskrevet i trin 2.1.2. Cap rør med propperne. Undgå forurening af ikke rynker silikone gummipropper.
- Placer de fem rør i en pre varmede ryster inkubator ved 37 ° C og ryste på 200 rpm. Inkuber kulturen natten over eller for 10 til 30 h.
- Udvalg af kultur for glycerol bestanden
- placere pre varmet rumtemperaturen M63 medium, P-1,000, 1.000-µL pipette tips, og en engangs kuvette på en ren bænk.
- Tilføje 1000 µL M63 til en engangs kuvette med en P-1, 000. Placer den disponible kuvette i et spektrofotometer, starte programmet med en fast bølgelængde på 600 nm, og foranstaltningen blindprøven.
- Flytte fem glasrør fra ryster rugemaskine til ren bænken.
- Kassere M63 fra den disponible kuvette og tilføje 1.000 µL kultur til den samme engangs kuvette med en P-1, 000. Måle den optiske turbiditet i cellekultur (OD 600) som beskrevet i trin 2.2.2.
Bemærk: Undgå kontaminering og opnå en præcis måling, udsætte glasrør og propper til at flamme som beskrevet og vortex kultur før prøvetagning. For at sikre pålidelige resultater, gentagne målinger anbefales, især når den celle tæthed er lav. - Af de fem celle kulturer, skal du vælge en, der er i den tidlige eksponentielle vækstfase (OD 600 = 0,01 - 0,05) til glycerol stock.
Bemærk: Hvis flere kulturer har tætheder inden for den optimale sortiment, de, der er tættest på 0,05 er almindeligt valgt.
- Glycerol lagre for gentagne tests.
Bemærk: Dette er beskrevet for at forberede ti bestande. Større eller mindre mængder kan være fremstillet efter de eksperimentelle krav.- Placere steriliseret 60% glycerol løsning, ti steriliseret 1,5 mL microtubes, P-1,000 og P-200, 1.000 og 200 µL pipette tips og en microtube stå på en ren bænk.
- Tilføje 250 µL steriliseret 60% glycerol løsning og 750 µL af den markerede cellekultur til 1,5 mL microtube og blanding af pipettering.
Bemærk: Lager volumen er variabel, men altid opretholde en 1:3 ratio af 60% glycerol til cellekultur; Dette resulterer i en endelig koncentration på 15% glycerol. - Placer de resterende ni microtubes i microtube stand og afpipetteres 100 µL af blandingen forberedt i trin 2.3.2 til hver tube. Der er nu ti identiske glycerol bestande til fremtidig brug.
- Gemme lagre i en dybfryser på-80 ° C.
3. Erhverve den vækstkurver
- Opsætning af mikrotiterplade læseren.
Bemærk: Vilkårene vist i anførelsestegn showet den særlige frasering anvendes på i pladelæseren bruges her (se tabel materialer).- Open software. Åben " protokoller " i " hverv bestyrer " og vælge " Opret ny ". Vælg " standardprotokol ".
- Åben " Procedure ", og justere indstillingerne. Åben " indstillet temperatur ", og vælg " inkubator på ". Indstille " temperatur " til 37 ° C og " Gradient " til 0 ° C. Check " Forvarm " før du fortsætter til næste trin. Åben " starte Kinetic ", Indstil " køre tid " til 24:00:00 eller 48:00:00, og " Interval " 00:30:00 eller 01:00:00.
Bemærk: Det tager ca. 1 min. til at læse en hel 96 godt plade. - Åben " ryste " og indstille " ryste Mode " som " lineære ". Check " Constitution Ryst ", og " hyppighed " på 567 cpm. Åben " Læs ", tjek " absorbans ", " slutpunkt/kinetiske ", og " Monochromators. " angivet " bølgelængde " til 600.
- Klik " Valider " at bekræfte, at proceduren er korrekt. Klik på " Spar " at gemme det som et nyt program til fremtidig brug.
- Realtid indspilning af vækst
- tegne en 96-brønd plade piktogram (8 × 12 tabel) for at angive positioner af podede kultur prøver på den 96-brønd plade. Udskrive bordet og bruge det som en reference til eksperimentet.
Bemærk: Brøndene beliggende på kanten af mikrotiterplade bør kun indeholde tomme medium på grund af fordampning. - Sted en steriliseret 96-godt flad bund mikrotiterplade med låg, P-1000, 1000-µL pipette tips, P-200, 200-µL pipette tips, flere 1,5 mL microtubes, en 8-multikanal-pipette, en steriliseret reagens reservoir, stuetemperatur M63 og glycerol lagre (udarbejdet i trin 2.3) på en ren bænk.
- Tilsættes ca 25 mL M63 til reagens reservoir. Brug dette reservoir lager for alle de følgende trin.
- Tilføje 900 µL M63 til microtubes i forberedelse for at gøre serielle fortyndinger.
- Tø glycerol bestanden ved stuetemperatur. Tilføje 900 µL M63 optøede glycerol lager og vortex. Dette resulterer i en 10-fold fortynding af det oprindelige glycerol materiel.
- Overføres 100 µL af den 10-fold fortynding til en anden microtube med 900 µL af M63 og vortex. Dette resulterer i en 100-fold fortynding.
- Gentag trin 3.2.6 indtil det ønskede antal fortyndinger er opnået.
- Fylde brøndene på kanten af mikrotiterplade med 200 µL M63 bruger en 8-kanal pipette (P-200).
Bemærk: Disse brønde kan bruges som tomt. - Belastning 200 µL af hver fortyndet prøve, der tilberedes i trin 3.2.4 - 3.2.7 mikrotiterplade brønde ifølge referencetabellen (trin 3.2.1). Vortex fortyndede prøver forud for lastning og belastning den samme prøve i flere brønde på forskellige steder på pladen.
- Anbring 96-brønds mikrotiterplade på i pladelæseren.
- Åben " Læs nu " i " hverv bestyrer " og vælge program (afsnit 3.1). Klik på " OK " du kan måle. Gemme optagelsen som en ny eksperimenterende fil til dataanalyse (afsnit 4).
- tegne en 96-brønd plade piktogram (8 × 12 tabel) for at angive positioner af podede kultur prøver på den 96-brønd plade. Udskrive bordet og bruge det som en reference til eksperimentet.
4. Dataanalyse
- eksport resultaterne af real-time vækstrate data (punkt 3.2) til en USB-memory stick som en tekstfil.
Bemærk: En 96-brønd formaterede resultater (kurver) vises på i pladelæseren i realtid. De timeløn poster (OD-værdierne) kan eksporteres som en tabel. rækkerne og kolonnerne repræsenterer den godt tal (fx A1, B1) og måle tiden (f.eks. 00:00:59), hhv. - Åbne tekstfilen med et regneark software.
- Kopiere de timeløn OD 600 læser i 96-brønd mikrotiterplade til et nyt regneark for yderligere analyse.
- Subtraher baggrunden lyder på tid nul fra de timeløn læser i hver prøve godt.
Bemærk: For bekvemmelighed, den gennemsnitlige værdi af Tom brønde indeholdende M63 (trin 3.2.8) kan bruges som værdien baggrunden. - Beregne middelværdien af fem på hinanden følgende OD 600 læser til at anslå maksimal befolkningstætheden.
Bemærk: Den største gennemsnitsværdien af de fem på hinanden følgende OD 600 læser er defineret som den maksimale OD 600 af de tilsvarende vækstkurven. - Beregne vækstrate, µ (h -1), ved anvendelse af følgende ligning for alle par af på hinanden følgende værdier af OD 600:
NOTE: I denne ligning, K, jeg og C + 1 repræsenterer OD 600 værdier af to på hinanden følgende tid point (t jeg og t + 1, henholdsvis). LN angiver naturlige logaritme. - Beregn ændringer i vækst over tid baseret på timeomkostninger OD 600 læser ifølge trin 4.6. Beregne middelværdien og standardafvigelsen af fem på hinanden følgende vækstrater til at anslå maksimal væksten.
Bemærk: Den største gennemsnitlige med den mindste standardafvigelsen er defineret som maksimal væksten i den tilsvarende vækstkurven.
5. Bekræfter den globale Bias af 96-brønd læser (valgfrit)
Bemærk: begge pladen læser og forbrugsmaterialer 96-brønd pladen kan forårsage forudindtaget målinger. For at opnå meget præcise og reproducerbare kvantitative resultater, bekræfter den globale bias i 96-brønd-pladen er stærkt anbefales.
- Forberede bias testen 96-brønd plade og i pladelæseren, som beskrevet i afsnit 3.2.2.
- Tilføje 20 mL M63 til en steriliseret 50 mL-centrifugerør. Tilføj glycerol lager til samme centrifugeglas og vortex. Den suspenderede opløsning overføres til en steriliseret reagens reservoir.
- Bruge en 8-kanal pipette til at overføre 200 µL af den suspenderede løsning til 96-brønd plade.
- 96 brønde pladen anbringes på i pladelæseren og start måling.
- Record time OD 600 læser og analysere som beskrevet i afsnit 4. Sammenligne beregnet maksimal vækst sats og befolkningen tæthed af hver brønd bestemmer stedsbestemte bias af 96-brønd læser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metode giver mulighed for at fange dynamisk bakterievækst i en kontinuerlig, høj overførselshastighed måde ved at udnytte en 96-brønds format læser, der tager flere ekstinktionen målinger ved forskellige tidsintervaller (fra minutter til timer til dage). Vækstkurver af et sortiment af E. coli stammer udtrykker forskellige genomer kan netop erhvervet i et enkelt eksperiment (figur 1A). I forhold til den beskrevne metode, den traditionelle metode (CFU analysen) generelt kræver længere tid af dataindsamlingsintervaller (figur 1B) og er arbejdsintensive, hvis flere kultur er påkrævet. Derudover kræver hver kultur Prøvetagningstiden for CFU analysen brug af en lille mængde af cellekultur, der ikke kan bruges til gentagne målinger. Derudover begrænset antal tidspunkter for registrering kan gå glip af prøveudtagningssteder, der er nødvendige for korrekt beregning af væksten og de maksimale OD600. CFU analysen har dog en lavere detektionsgrænse, 103 - 104 celler/mL, hvilket gør det mindst to størrelsesordener mere følsomme end optisk turbiditet assay (OD600= 0,001, som har en detektionsgrænse på ca 105 -106 celler/mL). Metoden beskrevet giver en praktisk og effektiv eksperimentelle værktøj for systemer-niveau undersøgelser på vækst dynamics.
En afgørende fordel i denne protokol er at det tager gentagne målinger fra en fælles glycerol bestand. At have flere cellekulturer på forskellige fortynding satser i tidlig eksponentielle vækstfase er meget nyttigt, fordi det gør det muligt for forskerne at finde frem til den kultur på en eventuel tidsfrist, og undgår at have mættet kulturer på grund af uforudsigelige begivenheder. Gentage dyrkning og målinger af fælles bestande, som var beredt fra en af de fem kulturer indledt ved hjælp af forskellige fortynding satser som beskrevet i protokollen afsnit 2.2 (figur 2A), fremlagt meget lignende resultater af væksten Dynamics analyse. Flere vækstkurver af gentagne og uafhængige målinger (N = 6) overlappede godt (figur 2Btop panel), med lidt afvigelse (figur 2Bnederste panel), især i den eksponentielle fase ( Figur 2B, skygget område). Disse resultater tyder på, at den beskrevne metode leverer meget reproducerbare resultater.
Estimering den globale bias af 96-brønd læser er stærkt anbefales. I den aktuelle metode, anslås de globale bias ved overvågning af væksten i wild-type E. coli stamme W3110 som beskrevet i afsnit 5-protokollen. For eksempel, vækstraterne beregnet fra vækstkurver viste betydelig variation blandt de 96 brønde (figur 3A), der repræsenterer den globale udsving stammer fra både datamanipulation og enhed fejl. Disse fejl kan maskeres ved at indlæse de samme prøve i flere brønde på forskellige steder på pladen. Derimod den maksimale OD600 viste en klar placering-afhængig bias for resultaterne, som gradvise ændringer blev observeret langs den lodrette retning, dvs den maksimale OD600 gradvist steget fra brønde i kolonne 2 til dem af kolonne 11 på 96-brønd plade (figur 3B). For at undgå partiske resultaterne, anbefales den samme prøve skal indlæses i de brønd beliggende på begge sider af den 96-brønd plade for gentagne målinger. Den placeringsmæssige skævhed i maksimal OD600 værdier antages for at skyldes variationen i fordampning priser, som fastsættes af både varme og forsegling effektivitetsgevinster. Sammenlignet med wells midt i 96-brønd mikrotiterplade, tendens brønde placeret i kanterne til at Vis forholdsvis højere værdier, som afspejler de varierede fordampning priser som følge af den forsegling effekten af mikrotiterplade. Desuden, da andre 96-brønd mikroplader underkastes den samme bias test viste lignende retningsbestemt ændringer baseret på hvor brønden var placeret på pladen, kan omfanget af bias afhænge i pladelæseren. Det er således vigtigt at vurdere de globale bias af 96-brønd læser i undersøgelser, der bestemmer maksimal befolkningstæthed. Kommercielt tilgængelige plade læsere har alle deres særlige globale bias forårsaget af opvarmning og ryste effektivitetsgevinster og 96-brønd mikroplader er i høj grad differentieret ved forsegling effektivitet.
Denne metode er designet til systematisk analyse af bakterievækst, og det kan bruges til at analysere to vigtige parametre, dvs., vækst sats og celle tæthed, der er almindeligt anvendt i en lang række områder, såsom systembiologi, evolution, og økologi16,17. Manuel beregning ved hjælp af regneark er indført for at vise behandling af de rå læsninger til at producere de evaluerede parametre af vækst sats og celle tæthed. Vækst timepriser der først beregnes fra de rå læsninger af vækstkurven (figur 4A) Ifølge protokollen afsnit 4.6 som et datasæt af sekventielle ændringer i vækstrater (figur 4B). De midler og standardafvigelser af hver fem på hinanden følgende vækstrater er erhvervet sekventielt (figur 4 c-D), og den største gennemsnitlige vækstrate med den mindste standardafvigelsen er defineret som maksimal væksten i vækst kurve (figur 4 c-D, fremhævet). Maksimal celle densitet (OD600) analyseres på samme måde (figur 4E-F). Den beregnede vækst sats og celle tæthed er efterfølgende underkastes yderligere analyse. Bemærk, at de beskrevne beregninger kan automatisk udføres ved hjælp af computational platforme (programmeringssprog), f.eks., R og Python.
Figur 1 vækstkurver erhvervet med forskellige metoder. (A) masseanskaffelser af vækstkurver. Vækstkurver af fire forskellige E. coli stammer udtrykker forskellige genomer blev fremstillet på en måde, høj overførselshastighed. E. coli -celler blev dyrket i minimal medium M63, og ændringer i OD600 læser blev optaget af en mikrotiterplade læser på 1-h intervaller. Stammer fra venstre til højre er vildtype E. coli W3110 (nummer 0) og dens reducerede genomer nummer 1, 10 og 18 beskrevet (tidligere5), henholdsvis. (B) vækstkurve fremstillet ved hjælp af CFU assay. Wild-type E. coli celler (nummer 0) var kulturperler og var stikprøven på de angivne tidspunkter over flere timer. Væksten ændringer blev anslået ved hjælp af CFU assay. Åbne cirkler angive optagelse eller prøvetagningspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Reproducerbare gentagne målinger. (A) Overnight kulturer af varieret fortyndingslufts. E. coli cellerne blev podet i rør på flere fortynding satser, som varierede fra 1-til 10,000-fold, som angivet. Cellerne var kulturperler ved 37 ° C under omrystning på 200 rpm i ca 12 timer. De endelige OD600 værdier af fem cellekulturer (fra venstre til højre) var 1,51, 0,74, 0,05, 0,008 og 0,001, henholdsvis. Kultur med OD600 på 0,05 blev brugt til det fælles glycerol materiel. (B) højt reproducerbare maalinger. Seks uafhængige vækstkurver (top, grå linjer) fra den samme E. coli -stamme var erhvervet og beregnes ud fra seks positioner på mikrotiterplade og to hætteglas med fælles glycerol bestanden. Den sorte linie repræsenterer gennemsnittet af seks vækstkurver. Koefficienter af variation (CV) af de seks gentagne målinger blev beregnet (nederst), og de konstant lave punkter er skygget i pink. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 globale Bias af 96-brønds Format. (A) Heat map vækstrater. E. coli celle bestand blev suspenderet i minimal medium M63 og indlæst ligeligt i de 96 brønde af mikrotiterplade (repræsenteret som en 12 × 8 tabel). Ændringer i OD600 blev opnået ved hjælp af mikrotiterplade læseren, som beskrevet i afsnit 5 i protokollen. Farveovergang fra hvid til rød angiver vækstrater fra 0,7 til 0,9 h-1. (B) zonekort den maksimal OD600. Farveovergang fra hvid til rød angiver de maksimal OD600 værdier fra 0,9 til 1,2. Beregningerne for vækstrate og maksimal OD600 er som beskrevet i figur 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 analyse af vækstkurver. (A) rå data af vækstkurver. Timebasis OD600 læser plottes mod kultur-tiden. Åbne cirkler angiver prøvetidspunkter. (B) tidsmæssige ændringer i vækstrater. Vækst timepriser mellem to på hinanden følgende OD600 læser beregnes efter ligningen beskrevet i 4.6. (C) betyde vækstrater. Middelværdien af fem på hinanden følgende vækstrater er beregnet for at give glat vækstrater. (D) standardafvigelser gennemsnitlige vækstrater. Standardafvigelsen af de samme fem på hinanden følgende vækst priser beregnes. Maksimal væksten med den mindste standardafvigelse er fremhævet med rødt. (E) mener OD600. Gennemsnittet af fem på hinanden følgende OD600 værdier er beregnet til at bestemme den glatte OD600. (F) standardafvigelser af betyde OD600 værdier. Standardafvigelsen af de samme fem på hinanden følgende OD600 værdier beregnes. Den maksimale OD600 med den mindste standardafvigelse er fremhævet med rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen omfatter udarbejdelse af en fælles bestand af eksponentielt voksende celler og replikering af de samme prøver i flere brønde på forskellige positioner på en mikrotiterplade. Tidligere, mikrobiologer startede kulturen fra en overnatning før kultur. Denne metode kan reducere tidsforsinkelsen for bakteriel vækst, men det er vanskeligt at opnå reproducerbare vækstkurver. Som vist i figur 2, resulterede de uafhængige målinger ved hjælp af de fælles glycerol bestande i næsten identiske vækstkurver, som giver reproducerbare og præcise resultater. Som vist i figur 3, give brønde på forskellige steder lidt forskellige læsninger, der betragtes som den globale baggrund af målingerne. Den kvantitative evaluering af bakterievækst betragtes denne baggrund. Podning af prøver til flere brønde på varieret plade steder for eksperimenterende replikering anbefales stærkt at tage højde for globale bias.
Ud over håndtering af fejl, bør ændring og fejlfinding afledt af eksperimentelle udstyr og forsyninger overvejes. Flere avancerede mikrotiterplade læsere er kommercielt tilgængelige. De viser en bred variation i karakteristika, såsom metoden til justering af lys bølgelængde, tilstand af opvarmning eller køling, og den måde, og hyppigheden af ryster. Baseret på vores erfaringer, bør fordampning behandles i høj overførselshastighed undersøgelser, fordi ændringer i flydende volumen stor indflydelse OD600 læser. Fordampning er forårsaget af metoden til opvarmning anvendes af mikrotiterplade læsere og arkitektur af mikroplader. De to former for varme almindeligt implementeret i kommercielle mikrotiterplade læsere opvarmning af varm luft og varme med en varm tallerken. Mikrotiterplade læseren bruges i denne protokol anvendes varmepladen som en opvarmning metode til at formindske fordampningen, fordi mediet i mikrotiterplade ville hurtigt tørre op i den blæste varm luft. Mikroplader bør også nøje udvalgt. Forskellige 96-brønd mikroplader (med låg) medføre forskellige niveauer af fordampning. Den beskrevne metode benytter formatet plade med en dyb overdækket låg, som reducerer fordampning.
Desuden, hvis undersøgelsen kræver stationær fase analyse af vækstkurven, så den måde og hyppighed af rysten i mikrotiterplade læseren bør tages hensyn. Ryster under kultur sikrer, at de voksende celler er suspenderet ensartet i medierne. Forkert ryster eller lav frekvens kan bevirke, at cellerne at stable rundt i godt kanten eller i center på en høj densitet, hvilket resulterer i false læsninger, der er enten lavere eller højere end faktiske læser. Den beskrevne metode bruger lineære, tovejs ryster. Mens den 8-formet ryster tilstand er formentlig tilstrækkeligt, anbefaler vi ikke den cirkulære tilstand af rysten.
Den store begrænsning af denne metode er fordampning af cellekulturmedium. Da maksimal kultur er små, forårsager dvs., 200 µL, inkubation ved 37 ° C betydelig fordampning. Således, denne metode er uegnede til dyrkning længere end 48 h. Desuden, cellekulturer af lav befolkningstæthed bør undgås, fordi optiske registrering (OD600) er begrænset på disse tætheder. Når betragtes som sammen, foretrækkes meget langsomt voksende celler/stammer eller meget lav begyndelseskoncentration kulturer ikke, da de kræver længere tid og er under detektionsgrænsen for OD600.
Denne metode giver nøjagtige, høj overførselshastighed målinger, som er meget fordelagtige for systematiske undersøgelser. Som en repræsentant resultat, denne metode gør det muligt for at evaluere et sortiment af E. coli stammer med forskellige genomiske sekvenser og/eller medium let og reproducerbar5. Sammenlignet med traditionelle metoder til dyrkning i rør og manuelt måling prøver på forskellige tidspunkter, er den beskrevne metode mindre arbejdskraft og tid intensiv. Fremtidige ansøgninger og udviklingen af metoden antages for at inddrage automatisering af eksperimentelle manipulation og beregningsmæssige analyse. Automatisk måling og robotteknologi anvendelse vil føre til en yderst effektiv og pålidelig metode til evaluering af cellevækst og overlevelse test ved hjælp af bakteriel og mammale celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker Kohei Tsuchiya for at give eksemplet CFU assay. Dette arbejde var delvis økonomisk støttet af en licensbetaling for videnskabelig forskning (C) nr. 26506003 (til BWY) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, Japan.
Acknowledgments
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
