Summary
Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.
Abstract
Bacteriële groei is een centraal concept in de ontwikkeling van moderne microbiële fysiologie, evenals in het onderzoek van cellulaire dynamiek op het niveau van de systemen. Recente studies hebben correlaties tussen bacteriële groei en genoom-brede evenementen, zoals genoom vermindering en transcriptome reorganisatie gemeld. Correct analyseren bacteriële groei is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei-afhankelijke coördinatie van gene functies en cellulaire componenten. Dienovereenkomstig, de precieze kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei in een high-throughput wijze is vereist. Opkomende technologische ontwikkelingen bieden nieuwe experimentele instrumenten waarmee updates van de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van de bacteriële groei. Het protocol hier geïntroduceerd maakt gebruik van een microplate-lezer met een geoptimaliseerde experimentele procedure voor de reproduceerbaar en nauwkeurige evaluatie van bacteriële groei. Dit protocol is gebruikt voor het evalueren van de groei van een aantal eerder beschreven Escherichia coli stammen. De belangrijkste stappen van het protocol zijn als volgt: de voorbereiding van een groot aantal cel voorraden in kleine flesjes voor herhaalde tests met reproduceerbare resultaten, het gebruik van 96-wells-platen voor high-throughput groei evaluatie en de handmatige berekening van twee grote parameters (d.w.z., maximale groei tarief en de bevolkingsdichtheid) vertegenwoordigen de groeidynamiek. In vergelijking met de traditionele kolonievormend eenheid (CFU) test, die het aantal cellen dat na verloop van tijd op agar platen in glazen buizen worden gekweekt tellen, de huidige methode is efficiënter en biedt meer gedetailleerde temporele records van wijzigingen van de groei, maar heeft een strengere aantoonbaarheidsgrens op lage bevolkingsdichtheid. Kortom is de beschreven methode gunstig voor de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de high-throughput van bacteriële groei, die kan worden gebruikt om algemene conclusies te trekken of theoretische opmerkingen te maken.
Introduction
Microbiologisch onderzoek beginnen vaak met de cultuur van bacteriële cellen en de beoordeling van de curven van de bacteriële groei, die een fundamentele fenomeen van bacteriële fysiologie1,2,3te vertegenwoordigen. Cultuur van de fundamentele beginselen zijn verkrijgbaar in de gepubliceerde onderzoeksliteratuur en leerboeken omdat bacteriecultuur een fundamentele methode is. Op het niveau van de Bank, aanzienlijke aandacht traditioneel gericht geweest op het optimaliseren van de groei media en het kweken van voorwaarden, maar niet onder controle heeft de groei, die zou waarschijnlijk nog meer inzicht van microbiële fysiologie, is uitgebreid bestudeerde4. Voor exponentieel groeiende bacteriën, is een belangrijke parameter van de cellulaire staat het groeitempo op jaarbasis, die is gemeld moeten worden gecoördineerd met het genoom, transcriptome en Proteoom5,6,7,8 . Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is dus cruciaal voor het begrip van microbiële fysiologie.
Om te beoordelen bacteriële groei, de experimentele methoden voor het schatten van biomassa zijn gevestigde9,10 en zijn gebaseerd op de detectie van biochemische, fysische of biologische parameters, zoals optische turbiditeit. Bovendien, zijn de analytische methoden gebruikt voor het vastleggen van de dynamische eigenschappen van groei veranderingen vaak gebaseerd op gevestigde niet-lineaire modellen11,12,13, bijvoorbeeld, logistieke vergelijkingen. Groeidynamiek worden over het algemeen verkregen door getimede bemonstering van celgroei in cultuur door het meten van optische troebelheid of kolonievormend eenheid (CFU) testen uitvoeren. De beperking van deze kweken en detectiemethoden worden vermeld is dat de gegevenspunten niet een getrouwe weergave van de populatiedynamiek zijn omdat de meting intervallen vaak in uren zijn en de cultuur-voorwaarde (bijvoorbeeldveranderingen in temperatuur en beluchting) wordt verstoord ten tijde van de bemonstering. Cultuur- en analysetechnieken moeten worden bijgewerkt met behulp van de recente ontwikkelingen in technologie en begrip. Recente vooruitgang in microplate lezers toestaan het real-time opvolgen van bacteriële groei en leiden tot aanzienlijke afname van de kosten van arbeid. Met behulp van deze geavanceerde apparaten, hebben de meest recente studies op bacteriële groei gemeld analysemethoden voor high-throughput metingen14,15.
Het doel van dit protocol is ter beoordeling van de precieze groeidynamiek in een high-throughput wijze, die zullen waardevol voor kwantitatieve studies die uiteindelijk betrekking hebben op de vragen van hoe de groei wordt bepaald en welke factoren beïnvloeden de groei. Het protocol adressen alle factoren die worden in aanmerking voor de herhaalbare en nauwkeurige kwantificatie van bacteriële groei genomen moeten. De experimentele methode en analyse worden in detail in de hoofdtekst beschreven. Deze methode kunnen de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van bacteriegroei in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Microbiologen kunnen dit protocol gebruiken om extra kwantitatieve resultaten ontlenen hun experimenteel bewijs. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor studies in systeembiologie die proberen om algemene conclusies te trekken of om een theoretische overzicht van groei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden van het groeimedium
Opmerking: de chemische samenstelling van minimaal middellange M63 is als volgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1.8 µM FeSO 4 15 µM thiamine-HCl, 0,2 mM MgSO 4 en 22 mM glucose. M63 wordt gemaakt door het mengen van drie voorraadoplossingen: vijf X oplossing, 20% glucose en MgSO 4 thiamine oplossing. Alle oplossingen bewaren bij 4 ° C.
- Voorbereiding van de vijf X oplossing
- te bereiden FeSO 4 oplossing, gebruik een elektrische pipet en een wegwerp serologische pipet ddH 2 O toevoegen aan een centrifugebuis van 50 mL. Gebruik een P-200 om toe te voegen 0.06 mL HCl verkrijgen van 0,01 M HCl. Voeg 36 mg FeSO 4-7 H 2 O en meng goed.
- Meet 160 mL ddH 2 O in een maatcylinder en toe te voegen aan een bekerglas van 500 mL. Voeg de volgende in deze volgorde: 10.72 g K 2 HPO 4, 5.24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 en 0,5 mL FeSO 4 oplossing (bereid in stap 1.1.1).
- Met behulp van een pH-meter precisie op pH 7.0 door toevoeging van 2 M KOH. Giet de oplossing in een maatcylinder en ddH 2 O toevoegen aan een totaal volume van 200 mL. Steriliseren van de oplossing met behulp van een 250 mL filtratie eenheid (PVDF, 0,22 µM).
- Voorbereiden van de 20% glucose oplossing
- maatregel 200 mL ddH 2 O in een maatcylinder en giet het in een bekerglas van 500 mL. Voeg tijdens het mixen met een magneetroerder, 50 g glucose. Verdun de oplossing in een maatcylinder tot een totaal volume van 250 mL. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.
- De MgSO 4 thiamine oplossing voorbereiden
- 150 mL ddH 2 O toevoegen aan een bekerglas van 500 mL. Voeg tijdens het mixen met een magneetroerder, 1.0 g van thiamine HCl en 10 g van MgSO 4-7 H 2 O. Dilute de oplossing in een maatcylinder tot een totaal volume van 200 mL. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.
- Voorbereiding van minimaal middellange M63
- plaats van de vijf X-oplossing, de 20% glucose-oplossing, de oplossing van MgSO 4 thiamine, een elektronische Pipetteer, een P-200 Pipetteer en 200-µL Pipetteer tips op een schone bankje.
- Meten 155.8 mL ddH 2 O in een maatcylinder en giet het in een bekerglas van 500 mL.
- Met behulp van de elektronische pipet en wegwerp serologische Pipetteer 40 mL van de oplossing van de vijf X en 4 mL 20% glucose oplossing aan de gemeten ddH 2 O. toevoegen Voeg vervolgens, 0.2 mL MgSO 4 thiamine oplossing met de P-200. Steriliseren van de oplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.
2. Voorbereiding van de voorraad Glycerol
- cel cultuur
Opmerking: de bacteriestammen (b.v., W3110 en de verminderde genomes) zijn verkrijgbaar bij stam bank organisaties. De stammen worden meestal verkregen in de vorm van kolonies op agar platen.- Plaats vijf gesteriliseerde glazen buizen met silicone rubber stoppen, een elektronische Pipet, P-1,000, 1.000-µL Pipetteer tips, P-200, 200-µL Pipetteer tips en de doel-stammen (kolonies op platen) op een schone bankje.
- Bloot de monding van de glazen buis naar een bunsenbrander alvorens de siliconen rubberstop te openen. Bloot de siliconen rubberstop aan de vlam nadat de buis is geopend, en plaats dan licht het GLB terug op de glazen buis.
- Gebruik van de elektronische pipet en wegwerp serologische Pipetteer 5 mL M63 toevoegen aan een van de glazen buizen en 4.5 mL M63 tot de andere vier buizen.
- De P-200 tip gebruiken om te kiezen een kolonie en het in de glazen buis met 5 mL M63 beënten.
- Vortex de buis te maken van een schorsing. Dan Verdun de oplossing 10-fold door 0,5 mL van deze oplossing te brengen naar één van de vier buizen met 4.5 mL M63.
- Herhaalt u de procedure die wordt beschreven in stap 2.1.5 voor de overige buizen. Een verdunningsreeks met vijf verschillende concentraties (verdunningen van 1, 10, 100, 1000 en 10.000) is nu klaar.
- Steriliseren de monden van de glazen buizen en de siliconen rubber stoppen zoals beschreven in stap 2.1.2. De buisjes met het stoppen van het GLB. Verontreiniging voorkomen door niet kreuken de silicone rubber stoppen.
- Plaats van de vijf buizen in een voorverwarmde schudden incubator bij 37 ° C staan en schud nu bij 200 omwentelingen per minuut. Incubeer de cultuur, 's nachts of voor 10 tot 30 h.
- Selectie van de cultuur voor de voorraad glycerol
- plaats van het voorverwarmde kamertemperatuur M63 medium, P-1,000, 1.000-µL Pipetteer tips en een wegwerp cuvette op een schone bankje.
- Toevoegen 1000 µL M63 aan een wegwerp Cuvet met een P-1, 000. Plaats de wegwerp cuvette in een spectrofotometer, start het programma met een vaste golflengte van 600 nm, en maatregel de blanco.
- De vijf glazen buizen van de schudden incubator naar de schone Bank verplaatsen.
- M63 negeren van de wegwerp cuvette en 1.000 µL cultuur toe te voegen aan de dezelfde wegwerp Cuvet met een P-1, 000. Meten van de optische troebelheid van de cultuur van de cel (OD 600) zoals beschreven in stap 2.2.2.
Opmerking: Om elke besmetting te voorkomen en om een nauwkeurige meting, bloot de glazen buizen en de stoppers naar de vlam zoals beschreven en vortex de cultuur vóór de bemonstering. Om betrouwbare resultaten, herhaalde metingen worden aanbevolen, met name wanneer de celdichtheid slinkt. - Van de vijf cel culturen, kies een die is in de vroege fase van de exponentiële groei (OD 600 = 0,01 - 0.05) voor de voorraad glycerol.
Opmerking: Als meerdere culturen dichtheden binnen het optimale bereik hebben, het dichtst bij 0.05 gewoonlijk geselecteerd.
- Maken de glycerol voorraden voor herhaalde tests.
Opmerking: Dit is beschreven voor het voorbereiden van tien voorraden. Bedragen groter of kleiner kunnen worden gemaakt volgens de experimentele eisen.- Plaats de gesteriliseerde oplossing van 60% glycerol, tien gesteriliseerd 1.5-mL slangen, P-1,000 en P-200, 1000 - en 200-µL Pipetteer tips en een microtube staan op een schone bankje.
- Voeg toe 250 µL gesteriliseerd 60% glycerol oplossing en 750 µL van de cultuur van de geselecteerde cel naar de 1.5-mL microtube en meng door pipetteren.
Opmerking: Het voorraad volume is variabel, maar altijd een 1:3-breedteverhouding 60% glycerol aan de cultuur van de cel; Dit resulteert in een eindconcentratie van 15% glycerol. - Plaats van de resterende negen slangen in de microtube stand en afzien van 100 µL van het mengsel bereid in stap 2.3.2 aan elke buis. Er zijn nu tien identieke glycerol voorraden voor toekomstig gebruik.
- Opslaan van de bestanden in een diepvriezer op -80 ° C.
3. Het verwerven van de groeikrommes
- het opzetten van de lezer microplate.
Opmerking: De voorwaarden weergegeven in aanhalingstekens Toon de specifieke formulering gebruikt op de plaat lezer hier gebruikt (Zie de tabel van materialen).- Open de software. Open " protocollen " in " Task Manager " en kies " nieuw ". Kies " standaardprotocol ".
- Open " Procedure ", en de instellingen aanpassen. Open " instellen temperatuur ", en selecteer " Incubator op ". Instellen " temperatuur " tot 37 ° C en " verlopende " op 0 ° C. Check " Preheat " voordat u verdergaat met de volgende stap. Open " Start Kinetic ", set " runtime " voor 24:00:00 of 48:00:00, en " Interval " voor 00:30:00 of 01:00:00.
Opmerking: Het duurt ongeveer 1 minuut om te lezen een hele 96 goed plaat. - Open " schudden " en stel " schudden modus " als " lineair ". Controleer " CoInstituut Shake " en stel " frequentie " op 567 cpm. Open " lezen ", controleren " absorptie ", " eindpunt/kinetische ", en " Monochromators. " Set " golflengte " tot 600.
- Klik " valideren " om te bevestigen dat de procedure correct is. Klik op " opslaan " opslaan als een nieuw programma voor toekomstig gebruik.
- Real-time opname van groei
- tekenen van een 96-wells-plaat-pictogram (8 × 12 tabel) om aan te geven van de standpunten van de geënte cultuur monsters op de 96-wells-plaat. Uitprinten van de tabel en gebruik het als een referentie voor het experiment.
Opmerking: Moeten de putten, gelegen aan de randen van de microplate alleen blanco medium bevatten vanwege verdamping. - Plaats een gesteriliseerde 96-Wells-vlakke onderkant microplate met deksel, P-1000, 1000-µL Pipetteer tips, P-200, 200-µL Pipetteer tips, verschillende 1.5-mL slangen, een 8-meerkanaals-Pipet, een gesteriliseerde reagens reservoir, kamertemperatuur M63 en de glycerol voorraden (bereid in stap 2.3) op een schone bankje.
- Voeg ongeveer 25 mL M63 naar het reservoir reagens. Dit reservoir voorraad voor alle volgende stappen gebruiken.
- Toevoegen 900 µL M63 naar de slangen in voorbereiding voor het maken van de seriële verdunningen.
- Ontdooi de glycerol voorraad bij kamertemperatuur. Voeg 900 µL M63 de ontdooide glycerol materieel en vortex. Dit resulteert in een 10-fold verdunning van de oorspronkelijke glycerol voorraad.
- Breng 100 µL van de 10-fold verdunning naar een ander microtube met 900 µL van M63 en vortex. Dit resulteert in een 100-fold verdunning.
- Herhaal stap 3.2.6 totdat het gewenste aantal verdunningen worden verkregen.
- Vullen de putten aan de rand van de microplate met 200 µL M63 met behulp van een pipet 8-kanaals (P-200).
Opmerking: Deze putten kunnen worden gebruikt als de blanco. - Load 200 µL van elk verdunde monster bereid in stappen 3.2.4 - 3.2.7 de putjes microplate volgens de referentietabel (stap 3.2.1). Vortex verdunde monsters voorafgaande aan laden en belasting hetzelfde monster in meerdere putten op uiteenlopende locaties op de plaat.
- Plaats van de 96-Wells-microplate op de afleesapparaat.
- Open " lezen nu " in " Task Manager " en kies het programma (punt 3.1). Klik op " OK " te meten. De opname op te slaan als een nieuwe experimentele bestand voor data-analyse (punt 4).
- tekenen van een 96-wells-plaat-pictogram (8 × 12 tabel) om aan te geven van de standpunten van de geënte cultuur monsters op de 96-wells-plaat. Uitprinten van de tabel en gebruik het als een referentie voor het experiment.
4. Data-analyse
- Export de resultaten van de real-time groei-gegevens (punt 3.2) naar een USB-geheugen houden als een tekstbestand.
Opmerking: Een 96-Wells opgemaakte resultaten (curven) wordt weergegeven op de lezer van de plaat in real time. Het uurtarief records (OD-waarden) kunnen worden geëxporteerd als een tabel; de goed nummers (bijvoorbeeld A1, B1) en de meten tijd (bijvoorbeeld 00:00:59) van de rijen en kolommen vertegenwoordigen respectievelijk. - Het tekstbestand opent met een spreadsheetprogramma.
- De uurlijkse OD 600 leest van de 96-Wells-microplate kopiëren naar een nieuw werkblad voor verdere analyse.
- Aftrekken bij wordt gelezen en de achtergrond tijd nul van de uurlijkse leest van elk monster goed.
Opmerking: Voor het gemak, de gemiddelde waarde van de blanco wells met M63 (stap 3.2.8) kan worden gebruikt als de waarde van de achtergrond. - Berekent het gemiddelde van de vijf opeenvolgende OD 600 leest te schatten van de maximale bevolkingsdichtheid.
Opmerking: De grootste gemiddelde waarde van de vijf opeenvolgende OD 600 leest wordt gedefinieerd als de maximale OD 600 van de overeenkomstige groeikromme. - Berekenen het groeitempo op jaarbasis, µ (h -1), door toepassing van de volgende vergelijking voor alle paren van opeenvolgende waarden van OD 600:
Opmerking: In deze vergelijking, C i en C i + 1 vertegenwoordigen de OD 600-waarden van twee achtereenvolgende keer punten (t ik en t i + 1, respectievelijk). LN geeft aan natuurlijke logaritme. - Berekenen de veranderingen in het groeitempo op jaarbasis na verloop van tijd op basis van het uurtarief OD 600 leest volgens stap 4.6. Berekenen van het gemiddelde en de standaardafwijking van de vijf opeenvolgende groeicijfers te schatten van de maximale groei.
Opmerking: Het grootste gemiddelde met de kleinste standaarddeviatie wordt gedefinieerd als de maximale groei van de overeenkomstige groeikromme.
5. Bevestiging van de mondiale Bias van de 96-Wells luidt (optioneel)
Opmerking: zowel de plaat reader en de verbruikbare 96-wells-plaat vooringenomen metingen kunnen veroorzaken. Zeer nauwkeurige en reproduceerbare kwantitatieve om resultaten te bereiken, bevestigen de wereldwijde bias van de 96-wells-plaat wordt ten zeerste aanbevolen.
- Voorbereiden van de 96-wells-plaat en de plaat-lezer op de bias test zoals beschreven in paragraaf 3.2.2.
- Voeg toe 20 mL M63 tot een gesteriliseerde 50 mL centrifugebuis. Voeg de glycerol voorraad aan de dezelfde centrifugebuis en vortex. Breng de geschorste oplossing over in een gesteriliseerde reagens reservoir.
- Gebruik van een 8-kanaals Pipetteer 200 µL van de geschorste oplossing overbrengen naar de 96-wells-plaat.
- Plaats van de 96-wells-plaat op de afleesapparaat en start de meting.
- Record het uurtarief OD 600 leest en analyseren zoals beschreven in sectie 4. Vergelijk de berekende maximale groei tarief en de bevolkingsdichtheid van elk putje te bepalen locatiespecifieke bias van de 96-Wells-leest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven methode biedt een middel om het vangen van dynamische groei van de bacteriën in een continue, hoge-doorvoer wijze met behulp van een 96-Wells formaat reader waarmee meerdere extinctie metingen op verschillende tijdstippen (van minuten tot uren tot dagen). De groeikrommes van een assortiment van E. coli stammen uiting van verschillende genoom kunnen precies worden verkregen in een enkele experiment (figuur 1A). In vergelijking met de beschreven methode, de traditionele methode (de CFU-assay) in het algemeen vereist langere bemonstering tijdsintervallen (figuur 1B) en arbeidsintensief is, als meerdere cultuur vereist is. Bovendien, vereist elke cultuur bemonsteringstijdstip voor de CFU assay het gebruik van een klein volume van de cultuur van de cel die niet kan worden gebruikt voor herhaalde metingen. Bovendien kunnen beperkt aantal tijdstippen voor detectie missen de bemonsteringspunten die nodig zijn voor de juiste berekening van de groei en de maximale OD600. De CFU bepaling heeft echter een ondergrens van detectie, 10,3 - 104 cellen/mL, waardoor het ten minste twee ordes van grootte gevoeliger dan de optische troebelheid assay (OD600= 0,001, die een detectiegrens van ongeveer 10 heeft5 -106 cellen/mL). De beschreven methode biedt een praktische en efficiënte experimentele instrument voor systemen-niveau studies over groeidynamiek.
Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat het herhaalde metingen uit een gemeenschappelijk glycerol voorraad neemt. Na meerdere celculturen tegen verschillende tarieven van de verdunning in de vroege fase van de exponentiële groei is zeer nuttig, omdat het toestaat van onderzoekers om te bepalen van het tijdstip van een tijdschaal met cultuur en vermijdt culturen als gevolg van onvoorspelbare gebeurtenissen die verzadigd. Herhaalde kweken en metingen van de gewone aandelen, die bereid waren van één van de vijf culturen gestart met behulp van verschillende verdunning tarieven zoals beschreven in het Protocol sectie 2.2 (figuur 2A), zeer vergelijkbare resultaten voor de groei gepresenteerd analyse van de dynamiek. Meerdere groeikrommes van herhaald en onafhankelijke metingen (N = 6) goed overlapt (figuur 2Bbovenste paneel), met weinig variantie (figuur 2Bonderste paneel), met name tijdens de exponentiële fase ( Figuur 2B, schaduw gebied). Deze resultaten suggereren dat de beschreven methode zeer reproduceerbare resultaten levert.
Schatten van de wereldwijde bias van de 96-Wells-leest wordt sterk aanbevolen. In de huidige methode, de wereldwijde bias is geschat door het toezicht op de groei van de wild-type E. coli stam van W3110 zoals beschreven in sectie 5 Protocol. Bijvoorbeeld, de groeicijfers berekend vanaf de groeikrommes toonde significante variatie tussen de 96-wells (figuur 3A), vertegenwoordigt de globale schommeling afgeleid van zowel de gegevensmanipulatie en de fouten van het apparaat. Deze fouten kunnen worden gemaskeerd door hetzelfde monster in meerdere putten op afwisselende locaties op de plaat geladen. Daarentegen, de maximale OD600 toonde een duidelijke locatie-afhankelijke bias voor de resultaten, zoals geleidelijke veranderingen werden waargenomen in de verticale richting, dat wil zeggen de maximale OD600 geleidelijk verhoogd van de putten van kolom 2 naar die van kolom 11 op de 96-wells-plaat (figuur 3B). Om te voorkomen dat de vooringenomen resultaten, wordt hetzelfde monster aanbevolen om in de putten, gelegen aan de beide zijden van de 96-wells-plaat voor herhaalde metingen worden geladen. De locatiespecifieke bias in maximale OD600 waarden wordt aangenomen dat het gevolg zijn van de variatie in de verdampingssnelheden, die worden bepaald door zowel verwarming en afdichten van efficiëntie. Vergeleken met de putten in het midden van de 96-Wells-microplate, neiging de putten, gelegen aan de randen om relatief hogere waarden, als gevolg van de gevarieerde verdampingssnelheden die voortvloeien uit de afdichtende werking van de microplate weergeven. Bovendien, aangezien andere 96-Wells-microplates onderworpen aan dezelfde bias test soortgelijke directionele wijzigingen die zijn gebaseerd toonde op waar de put bevond op de plaat, kan de omvang van de bias afhankelijk van de afleesapparaat. Het is dus belangrijk om te evalueren van de wereldwijde bias van de 96-Wells luidt in studies die maximale bevolkingsdichtheid bepalen. Verkrijgbare plaat lezers hebben allemaal hun specifieke global bias veroorzaakt door de verwarming en schudden van de efficiëntie en de 96-Wells-microplates grotendeels onderscheiden zich door het afdichten van efficiëntie.
Deze methode is bedoeld voor een systematische analyse van de groei van bacteriën, en het kan worden gebruikt voor het analyseren van twee belangrijke parameters, d.w.z., groei, rente en cel dichtheid, die vaak worden toegepast in een breed scala van gebieden, zoals de systeembiologie, evolutie, en ecologie16,17. De handmatige berekening met behulp van werkblad is ingevoerd om aan te tonen van de verwerking van de ruwe luidt voor de productie van de geëvalueerde parameters groei tarief en cel-dichtheid. De uurtarieven van de groei worden eerst berekend vanaf de ruwe leest van de groeikromme (figuur 4A) volgens Protocol sectie 4.6 als een gegevensset van opeenvolgende wijzigingen in groeicijfers (figuur 4B). De gemiddelde en standaardafwijking van elke vijf opeenvolgende groeicijfers sequentieel worden verworven (figuur 4C-D), en de grootste gemiddelde groeisnelheid met de kleinste standaarddeviatie is gedefinieerd als de maximale groei van de groei Curve (figuur 4C-D, gemarkeerd). De maximale celdichtheid (OD600) is ook geanalyseerd (figuur 4E-F). De berekende groei tarief en cel dichtheid worden vervolgens onderworpen aan verdere analyse. Merk op dat de beschreven berekeningen kunnen worden automatisch uitgevoerd met behulp van computationele platforms (programmeertalen), bijvoorbeeld, R en Python.
Figuur 1 groeikrommes overgenomen met de uiteenlopende methoden. (A) meerdere overnames voor groei curves. Groeicurven van vier verschillende stammen van E. coli uiting van verschillende genomen werden verkregen in een high-throughput wijze. De cellen van E. coli in minimaal middellange M63 zijn geteeld, en de wijzigingen in OD600 leest werden geregistreerd door een microplate-lezer om 1 uur. De stammen van links naar rechts zijn het wild type E. coli W3110 (nummer 0) en de verlaagde genoom nummers 1, 10 en 18 beschreven (eerder5), respectievelijk. (B) groeicurve verkregen met behulp van de CFU-bepaling. Het wild-type E. coli cellen (nummer 0) werden gekweekt en werden bemonsterd op de aangegeven tijd punten over enkele uren. De groei wijzigingen werden geschat aan de hand van de CFU-bepaling. Open cirkels wijzen op de opname of de monsternemingspunten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Reproduceerbare metingen herhaald. (A) Overnight culturen van gevarieerde verdunningsluchts. de cellen van E. coli waren geënt in buizen op meerdere verdunning tarieven, die van 1-tot 10.000 varieerde, zoals aangegeven. De cellen werden gekweekt bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut gedurende ongeveer 12 uur. De resultaatwaarden van de600 OD van de vijf celculturen (van links naar rechts) waren 1.51, 0,74, 0,05, 0,008 en 0.001, respectievelijk. De cultuur met OD600 van 0,05 werd gebruikt voor de gemeenschappelijke glycerol voorraad. (B) zeer reproduceerbare metingen. Zes onafhankelijke groeikrommes (top, grijze lijnen) van dezelfde stam E. coli werden verworven en berekend op basis van zes posities op de microplate en twee flesjes van de gemeenschappelijke glycerol voorraad. De zwarte lijn geeft het gemiddelde van de zes groeikrommes. De coëfficiënten van variatie (CV) van de zes herhaalde metingen waren berekend (onder), en de constante lage punten zijn schaduw in roze. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 Global Bias van de 96-Wells formaat. (A) warmte kaart van groeicijfers. De E. coli cel voorraad was opgeschort in minimaal middellange M63 en even in de 96 putjes van de microplate (weergegeven als een tabel 12 × 8) geladen. De veranderingen in OD600 werden verkregen met behulp van de lezer microplate, zoals beschreven in sectie 5 van het protocol. De gradatie van wit naar rood geeft aan dat de prijzen van de groei van 0,7 tot 0.9 h-1. (B) de kaart van de warmte van de maximale OD600. De gradatie van wit naar rood geeft de maximale OD600 waarden van 0,9 tot 1.2. De berekeningen voor de groei en de maximale OD600 zijn zoals beschreven in Figuur 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 analyse van de groeikrommes. (A) ruwe gegevens voor groei curves. Het uurtarief OD600 luidt worden uitgezet tegen de tijd van de cultuur. Open cirkels geven de bemonsteringstijdstippen. (B) temporale verandert in groeicijfers. Uurtarieven groei tussen twee opeenvolgende OD600 leest worden berekend volgens de vergelijking in 4.6 beschreven. (C) betekent groeicijfers. Het gemiddelde van de vijf opeenvolgende groeicijfers worden berekend geven goede groeicijfers. (D) de standaarddeviaties van de gemiddelde groeicijfers. De standaarddeviatie van de dezelfde vijf opeenvolgende groeicijfers wordt berekend. De maximale groei met de kleinste standaarddeviatie is rood gemarkeerd. (E) betekent OD600. Het gemiddelde van vijf opeenvolgende OD600 waarden wordt berekend om de soepele OD600. (F) de standaarddeviaties van gemiddelde OD600 waarden. Standaarddeviatie van dezelfde vijf opeenvolgende OD600 waarden wordt berekend. De maximale OD600 met de kleinste standaarddeviatie is rood gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol zijn de voorbereiding van een gewone aandelen van exponentieel groeiende cellen en de replicatie van de dezelfde monsters in meerdere putten op verschillende posities op de microplate. Eerder, microbiologen begonnen de cultuur van een overnachting pre cultuur. Hoewel deze methode de vertragingstijd van bacteriële groei verminderen kan, is het moeilijk om reproduceerbare groeikrommes. Zoals blijkt uit Figuur 2, resulteerde de onafhankelijke metingen met behulp van de gemeenschappelijke glycerol voorraden in bijna identieke groeikrommes, waarmee reproduceerbare en nauwkeurige resultaten. Zoals blijkt uit Figuur 3, geven putten op diverse locaties iets anders leest, die wordt beschouwd als de algemene achtergrond van de metingen. Voor de kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei, moet deze achtergrond worden beschouwd. Inoculatie van monsters aan meerdere putjes op gevarieerde plaat locaties voor experimentele replicatie wordt sterk aanbevolen voor globale bias.
Naast het afhandelen van fouten, moeten de wijziging en probleemoplossing afgeleid van de experimentele apparaten en leveringen worden beschouwd. Verscheidene geavanceerde microplate lezers zijn commercieel verkrijgbaar. Zij tonen een grote variatie in kenmerken, zoals de methode van de aanpassing van de golflengte van het licht, de wijze van verwarming of koeling, en de wijze en frequentie van schudden. Gebaseerd op onze ervaring, moet verdamping worden aangepakt in high-throughput onderzoek omdat veranderingen in vloeibare volume sterk OD600 leest beïnvloeden. Verdamping wordt veroorzaakt door de methode van verwarming gebruikt door de microplate-lezers en de architectuur van de microplates. De twee modi van verwarming meestal uitgevoerd in commerciële microplate lezers zijn verwarming door warme lucht en verwarming met een warmhoudplaat. De microplate-lezer gebruikt in dit protocol gebruikt de hete plaat als een methode van verwarming te verlagen van verdamping omdat het medium in de microplate snel in de waait warme lucht opdrogen zou. De microplates moet ook zorgvuldig worden geselecteerd. Verschillende 96-Wells microplates (met deksels) leiden tot verschillende niveaus van verdamping. De beschreven methode maakt gebruik van de indeling van de plaat met een diepe overdekte deksel, dat vermindert de verdamping.
Bovendien, als de studie stationaire fase analyse van de groeikromme vereist, vervolgens de wijze en frequentie van schudden in de microplate-lezer moeten rekening worden gehouden. Schudden tijdens cultuur zorgt ervoor dat de groeiende cellen gelijkmatig zijn opgehangen in de media. Onjuiste schudden of lage frequentie kan de cellen om te stapelen op de rand van het goed of in het midden op een hoge dichtheid, wat resulteert in ONWAAR leest die lager of hoger is dan de werkelijke leest. De beschreven methode gebruikt lineaire, bidirectionele schudden. Terwijl de 8-vormige schudden modus waarschijnlijk voldoende is, niet aangeraden de circulaire mode schudden.
De belangrijkste beperking van deze methode is de verdamping van de voedingsbodem van de cel. Aangezien de maximale cultuur volume klein is, veroorzaakt dat wil zeggen, 200 µL, incubatie bij 37 ° C aanzienlijke verdamping. Dus, deze methode is niet geschikt voor het kweken van meer dan 48 h. Bovendien, celculturen van lage dichtheid moeten worden vermeden omdat optische detectie (OD600) is beperkt in deze dichtheden. Als gezamenlijk onderzocht, zijn zeer traag groeiende cellen/stammen of zeer lage beginconcentratie culturen geen voorkeur, als ze langere tijd nodig hebben en onder de detectiegrens van OD600 zijn.
Deze methode levert nauwkeurige, high-throughput metingen, die zeer gunstig voor systematische enquêtes. Als een representatief resultaat, met deze methode kunt om te evalueren van een assortiment van E. coli stammen met verschillende genomic opeenvolgingen en/of medium gemakkelijk en reproducibly5. In vergelijking met traditionele methoden van kweken in buizen en handmatig monsters op verschillende tijdstippen te meten, is de beschreven methode minder arbeid en tijd intensief. Toekomstige toepassingen en ontwikkeling van de methode wordt verondersteld dat de automatisering van experimentele manipulatie en computationele analyse te betrekken. Automatische meting en robotica toepassing zal leiden tot een zeer efficiënte en betrouwbare methode van evaluatie van de celgroei en verrichten van overleving proeven cuvetten van bacteriële en zoogdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij danken Kohei Tsuchiya voor het verstrekken van het CFU assay voorbeeld. Dit werk werd gedeeltelijk financieel ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (C) nr. 26506003 (voor BWY) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
