Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne

Published: September 19, 2017 doi: 10.3791/56197
Automatic Translation
1, 1,2
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Institute of Biology and Information Science, East China Normal University

Summary

Une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est essentielle pour comprendre la physiologie microbienne comme un phénomène de niveau système. Un protocole pour la manipulation expérimentale et une approche analytique sont introduites, permettant une analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne, qui est un sujet clé d’intérêt en biologie des systèmes.

Abstract

La croissance bactérienne est un concept central dans le développement de la physiologie microbienne moderne, ainsi que dans l’investigation de la dynamique cellulaire au niveau des systèmes. Des études récentes ont rapporté des corrélations entre la croissance bactérienne et les événements de génome, comme la réorganisation de la réduction et le transcriptome du génome. Analyser correctement la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la coordination axées sur la croissance des fonctions des gènes et des composants cellulaires. Par conséquent, l’évaluation quantitative précise de la croissance bactérienne de manière haut débit est requise. Nouveaux développements technologiques offrent de nouveaux outils expérimentaux qui permettent des mises à jour des méthodes utilisées pour l’étude de la croissance bactérienne. Le protocole présenté ici utilise un lecteur de microplaques avec une procédure expérimentale hautement optimisé pour l’évaluation précise et reproductible de la croissance bactérienne. Ce protocole a été utilisé pour évaluer la croissance de plusieurs précédemment décrit des souches d’Escherichia coli . Les principales étapes du protocole sont les suivants : la préparation d’un grand nombre de stocks de cellules de petites fioles pour essais répétés avec des résultats reproductibles, l’utilisation des plaques à 96 puits, pour l’évaluation de la croissance du haut débit et le calcul manuel de deux grandes paramètres (p. ex., densité de population et taux de croissance maximal) qui représente la dynamique de croissance. En comparaison avec le test d’unité (CFU) formatrices traditionnels, qui compte les cellules qui sont cultivées dans des tubes de verre au fil du temps sur milieu gélosé, la présente méthode est plus efficace et fournit des notices plus détaillées temporelles des variations de croissance, mais a une plus stricte limite de détection à faible densité de population. En résumé, la méthode décrite est avantageuse pour l’analyse précise et reproductible de haut débit de la croissance bactérienne, qui peut être utilisée pour tirer des conclusions conceptuelles ou de présenter des observations théoriques.

Introduction

Des études microbiologiques commencent souvent avec la culture de cellules bactériennes et l’évaluation des courbes de croissance bactérienne, qui représentent un phénomène fondamental de la physiologie bactérienne1,2,3. Principes de base de la culture sont largement disponibles dans la littérature de recherche publiés et les manuels scolaires parce que la culture bactérienne est une méthodologie fondamentale. À l’échelle de banc, une attention particulière a traditionnellement été axée sur l’optimisation des milieux et des conditions de culture, mais contrôle le taux de croissance, qui permettrait sans doute une plus grande compréhension de la physiologie microbienne, n’a pas été étudiés4. Pour les bactéries en croissance exponentielle, un paramètre-clé de l’État cellulaire est le taux de croissance, qui a été rapporté pour être coordonné avec le génome, transcriptome et du protéome5,6,7,8 . Ainsi, une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la physiologie microbienne.

Pour évaluer la croissance bactérienne, les méthodes expérimentales utilisées pour estimer la biomasse sont bien établis9,10 et sont basées sur la détection des paramètres biochimiques, physiques ou biologiques, telles que la turbidité optique. En outre, les méthodes analytiques utilisées pour capturer les propriétés dynamiques des changements de croissance couramment reposent sur des modèles non linéaires établi11,12,13, par exemple, les équations logistiques. Dynamique de croissance est généralement acquises par échantillonnage chronométré de la croissance des cellules en culture par mesure de turbidité optique ou effectuant des tests d’unité (CFU) formatrices. La limitation de ces méthodes de détection et de mise en culture, c’est que les points de données ne sont pas un reflet fidèle de la dynamique des populations, parce que les intervalles de mesure sont souvent en heures et que la condition de la culture (p. ex., changements de température et aération) est perturbée au moment de l’échantillonnage. Techniques de culture et d’analyse doivent être actualisés à l’aide des développements récents dans la technologie et la compréhension. Les progrès récents dans des lecteurs de microplaque permettent l’observation en temps réel de la croissance bactérienne et diminuent considérablement les coûts de main-d'œuvre. En utilisant ces dispositifs avancés, les dernières études sur la croissance bactérienne ont signalé des méthodes analytiques pour les mesures haut débit14,15.

Le but du présent protocole est d’évaluer la dynamique de croissance précis d’une manière de haut débit, qui est très utile pour les études quantitatives qui finalement répondre aux questions de la façon dont le taux de croissance est déterminé et quels facteurs influent sur le taux de croissance. Le protocole porte sur tous les facteurs qui doivent être pris en compte pour la quantification précise et reproductible de la croissance bactérienne. La méthode expérimentale et l’analyse sont décrites en détail dans le texte principal. Cette méthode permet l’analyse précise et reproductible de la croissance bactérienne dans une manière de haut débit. Microbiologistes peuvent utiliser ce protocole, de déduire des résultats quantitatifs supplémentaires leurs preuves expérimentales. Ce protocole peut également servir pour les études en biologie des systèmes qui tentent de tirer des conclusions conceptuelles ou pour obtenir un aperçu théorique de la croissance.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparer le milieu de culture

Remarque : la composition chimique des M63 moyenne minimale est la suivante : 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM thiamine-HCl, 0,2 mM MgSO 4 et 22 mM de glucose. M63 est fabriqué en mélangeant trois solutions mères : solution X cinq, 20 % de glucose et MgSO 4 solution de thiamine. Conserver toutes les solutions à 4 ° C.

  1. Préparation de la solution X cinq
    1. préparation FeSO 4 solution, utilisez une pipette électrique et une pipette jetable sérologique pour ajouter ddH 2 O dans un tube à centrifuger de 50 mL. Utiliser un P-200 pour ajouter 0,06 mL HCl pour obtenir 0,01 M HCl. Ajouter 36 mg FeSO 4-7 H 2 O et mélanger bien.
    2. Mesure 160 mL FD 2 O dans une éprouvette graduée et ajoutez-le dans un bécher de 500 mL. Ajoutez le code suivant dans l’ordre suivant : 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2,0 g (NH 4) 2 SO 4 et 0,5 mL de solution de 4 FeSO (préparée à l’étape 1.1.1).
    3. à l’aide d’un pH-mètre précision, ajuster le pH à 7.0 en ajoutant 2 M KOH. Verser la solution dans une éprouvette graduée et ajouter des ddH 2 O pour un volume total de 200 mL. Stériliser la solution à l’aide d’une unité de filtration de 250 mL (PVDF, 0,22 µM).
  2. Préparation de la solution de 20 % de glucose
    1. mesurer 200 mL FD 2 O dans une éprouvette graduée et le verser dans un bécher de 500 mL. Tout en mélangeant à l’aide d’un agitateur magnétique, ajouter 50 g de glucose. Diluer la solution dans une éprouvette graduée pour un volume total de 250 mL. Stériliser la solution comme indiqué au point 1.1.3.
  3. Préparation de la solution de thiamine MgSO 4
    1. Ajouter 150 mL FD 2 O dans un bécher de 500 mL. Tout en mélangeant avec un agitateur magnétique, ajouter 1,0 g de thiamine-HCl et 10 g de MgSO 4-7 H 2 O. diluer la solution dans une éprouvette graduée pour un volume total de 200 mL. Stériliser la solution comme indiqué au point 1.1.3.
  4. Préparation minimale moyenne M63
    1. Placer la solution X 5, la solution de glucose à 20 %, la solution de thiamine MgSO 4, une pipette Electronique, une pipette P-200 et pointes de pipette de 200 µL sur un banc propre.
    2. Mesure mL 155,8 ddH 2 O dans une éprouvette graduée et verser dans un bécher de 500 mL.
    3. à l’aide de la pipette Electronique et pipette sérologique jetable, ajouter 40 mL de la solution X 5 et 4 mL de solution de glucose 20 % à la ddH mesurée 2 O. Puis, ajouter 0,2 mL de solution de thiamine MgSO 4 avec le P-200. Stériliser la solution comme indiqué au point 1.1.3.

2. Préparer le Stock de glycérol

  1. Cell culture
    Remarque : les souches bactériennes (p. ex., W3110 et génomes réduits) sont disponibles auprès des organismes bancaires de souche. Les souches sont generalement sous forme de colonies sur milieu gélosé.
    1. Placer cinq tubes de verre stérilisé avec bouchons en caoutchouc silicone, une pipette Electronique, P-1,000, pointes de pipette 1 000 µL, P-200, pointes de pipette de 200 µL et les souches de la cible (colonies sur des plaques) sur un banc propre.
    2. Exposer l’embouchure du tube de verre pour un bec Bunsen avant d’ouvrir le bouchon de caoutchouc de silicone. Exposer le bouchon en caoutchouc de silicone à la flamme après que le tube est ouvert et puis légèrement Replacez le bouchon sur le tube en verre.
    3. Utiliser la pipette électronique et sérologique pipette à usage unique à ajouter à un des tubes de verre et 4,5 mL M63 aux quatre autres tubes 5 mL M63.
    4. Utiliser la pointe de P-200 à prélever une colonie et elle inoculer dans le tube de verre contenant 5 mL M63.
    5. Vortex le tube pour faire une suspension. Ensuite, diluer la solution 10 fois en transférant 0,5 mL de cette solution à l’un des quatre tubes contenant 4,5 mL M63.
    6. Répéter le processus décrit à l’étape 2.1.5 pour les tubes restants. Une série de dilutions avec cinq concentrations différentes (dilutions de 1, 10, 100, 1000 et 10 000) est maintenant prêt.
    7. Stériliser la bouche des tubes de verre et les bouchons de caoutchouc de silicone comme indiqué au point 2.1.2. Cap des tubes avec les bouchons. Éviter la contamination par le froissement ne pas les bouchons de caoutchouc silicone.
    8. Placer les cinq tubes dans un incubateur à agitation pré chauffé à 37 ° C et la secouer à 200 tr/min. Incuber la culture pendant la nuit ou pendant 10 à 30 h.
  2. Sélection de la culture pour le stock de glycérol
    1. Placer le milieu de la température de la pièce pré chauffé M63, P-1,000, pointes de pipette 1 000 µL et une cuvette jetable sur un banc propre.
    2. Ajouter 1000 µL M63 à une cuvette jetable avec un P-1, 000. Placez la cuvette jetable dans un spectrophotomètre, démarrer le programme à une longueur d’onde fixe de 600 nm et mesure le blank.
    3. Déplacer les tubes de cinq verre de l’incubateur à agitation au banc propre.
    4. M63 jeter de la cuvette jetable et ajouter 1 000 culture µL à la même cuvette jetable avec un P-1, 000. Mesurer la turbidité optique de la culture cellulaire (OD 600) comme indiqué au point 2.2.2.
      Remarque : Pour éviter toute contamination et de réaliser une mesure précise, exposer les tubes de verre et les bouchons à la flamme comme décrit et vortex la culture avant l’échantillonnage. Pour garantir des résultats fiables, mesures répétées sont recommandés, particulièrement lorsque la densité cellulaire est faible.
    5. Des cinq cultures cellulaires, choisir celui qui est dans la première phase de croissance exponentielle (OD 600 = 0,01 - 0,05) pour le stock de glycérol.
      Remarque : Si plusieurs cultures ont des densités dans la plage optimale, le plus près à 0,05 communément estsélectionné.
  3. Faire les stocks de glycérol pour essais répétés.
    NOTE : Ce qui est décrit pour la préparation des stocks de dix. Quantités plus grandes ou plus petites peuvent être faites selon les conditions expérimentales.
    1. Place de la solution de glycérol 60 % stérilisé, dix stérilisé microtubes de 1,5 mL, P-1,000 et P-200, 1 000 et 200 µL-pointes de pipette et un microtube de se tenir debout sur un banc propre.
    2. Ajouter 250 µL stérilisé 60 % solution de glycérol et 750 µL de la culture de cellule sélectionnée au microtubes de 1,5 mL et mélanger par pipetage.
      Remarque : Le volume de stock est variable, mais toujours maintenir un ratio de 1:3 de 60 % de glycérol pour culture cellulaire ; Il en résulte une concentration finale de 15 % de glycérol.
    3. Placer les neuf microtubes restants dans le socle de microtube et déposer 100 µL du mélange préparé à l’étape 2.3.2 dans chaque tube. Il y a maintenant dix actions de glycérol identique pour une utilisation future.
    4. Conserver les stocks dans un congélateur à -80 ° C.

3. Acquérir les courbes de croissance

  1. mise en place le lecteur de microplaque.
    Remarque : Les termes montrés en spectacle de guillemets le phrasé spécifique utilisé sur le lecteur utilisé ici (voir la Table des matières).
    1. Ouvrir le logiciel. Ouvert " protocoles " dans " Gestionnaire des tâches " et choisissez " créer nouveau ". Choisissez " protocole Standard ".
    2. Open " procédure " et d’ajuster les paramètres. Ouvert " Réglez la température ", puis sélectionnez " incubateur sur ". La valeur " température " à 37 ° C et " Gradient " à 0 ° C. Vérifiez " préchauffage " avant de continuer avec l’étape suivante. Ouvert " cinétique commencer ", ensemble " moment de l’exécution " à 24:00:00 ou 48:00:00, et " intervalle " de 00:30:00 ou 01:00.
      Remarque : Il faut environ 1 min à lire un entier 96 plaque bien.
    3. Open " Shake " et " Mode Shake " comme " linéaire ". Vérifier " Coprotection Shake " et définissez " fréquence " à 567 cpm. Ouvert " lire ", vérifier " Absorbance ", " point de terminaison/cinétique ", et " monochromateurs. " Set " longueur d’onde " à 600.
    4. Click " Validate " pour confirmer que la procédure est correcte. Cliquez sur " enregistrer " de l’enregistrer dans un nouveau programme pour une utilisation future.
  2. En temps réel, enregistrement de croissance
    1. dessiner un pictogramme de la plaque à 96 puits (8 × 12 table) pour indiquer les positions des échantillons inoculés la culture sur la plaque à 96 puits. Imprimer le tableau et l’utiliser comme une référence pour l’expérience.
      Remarque : Les puits situés sur les bords de la microplaque ne doivent contenir que vide moyen dû à l’évaporation.
    2. Place un plat de 96 puits stérilisé bas microplaque avec couvercle, P-1000, pointes de pipette 1000 µL, P-200, pointes de pipette de 200 µL, plusieurs microtubes de 1,5 mL, une pipette à 8-multicanal, un réservoir de réactif stérilisé, température ambiante M63 et le glycérol stocks (préparés à l’étape 2.3) sur un banc propre.
    3. Ajouter environ 25 mL M63 dans le réservoir de réactif. Utiliser ce stock de réservoir pour toutes les étapes suivants.
    4. Ajouter 900 µL M63 aux microtubes en préparation pour faire des dilutions sériées.
    5. Décongeler le stock de glycérol à température ambiante. Ajouter 900 µL M63 au stock de glycérol décongelés et vortex. Cela se traduit par une dilution de 10 fois le stock de glycérol original.
    6. Transférer 100 µL de la dilution 10 fois à un autre microtube contenant 900 µL de M63 et vortex. Cela se traduit par une dilution de 100 fois.
    7. Répéter l’étape 3.2.6 jusqu'à ce que le nombre désiré de dilutions est atteints.
    8. Remplir les puits au bord de la microplaque avec 200 µL M63 en utilisant une pipette à 8 canaux (P-200).
      Remarque : Ces puits peuvent être utilisés comme le blanc.
    9. Charge 200 µL de chaque échantillon préparé en étapes 3.2.4 - 3.2.7 de la microplaque selon la table de référence (étape 3.2.1) dilué. Vortex le prieur échantillons dilués à charge et charge le même échantillon dans plusieurs puits à varié emplacements sur la plaque.
    10. Placer la Microplaque 96 puits sur le lecteur de plaque.
    11. Open " lire maintenant " dans " Gestionnaire des tâches " et choisir le programme (section 3.1). Cliquez sur " OK " pour commencer à mesurer. Sauvegarder l’enregistrement dans un nouveau fichier expérimental pour l’analyse des données (article 4).

4. Analyse des données

  1. exportation les résultats des données en temps réel des taux de croissance (section 3.2) à une mémoire USB stick dans un fichier texte.
    Remarque : Un résultat au format 96 puits (courbes) s’affiche sur le lecteur de plaque en temps réel. Les enregistrements horaires (valeurs do) peuvent être exportés sous forme de tableau ; les lignes et les colonnes représentent les nombres bien (p. ex., A1, B1) et le temps de mesure (par exemple, 00:00:59), respectivement.
  2. Ouvrir le fichier texte avec un logiciel tableur.
  3. Copiez les lectures de 600 OD horaires de la Microplaque 96 puits dans une nouvelle feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
  4. Soustraire l’arrière-plan se lit au temps zéro des lectures horaires de chaque échantillon bien.
    Remarque : Pour plus de commodité, la valeur moyenne de l’essai à blanc puits contenant M63 (étape 3.2.8) peut être utilisé comme la valeur background.
  5. Calculer la moyenne des cinq lectures consécutives de 600 OD pour estimer la densité de population maximale.
    NOTE : La plus grande valeur moyenne des cinq consécutifs OD 600 lectures est définie comme la maximale de l’OD 600 de la courbe de croissance correspondante.
  6. Calculer le taux de croissance, µ (h -1), en appliquant l’équation suivante pour toutes les paires de valeurs consécutives de OD 600 :
    Equation
    Remarque : dans cette équation, C i et C i + 1 représentent les valeurs de 600 OD deux points consécutifs de temps (t i et t i + 1, respectivement). Indique de LN logarithme népérien.
  7. Calculer les changements dans le taux de croissance au fil du temps basées sur l’horaire OD 600 lit selon étape 4.6. Calculer la moyenne et l’écart-type des cinq taux de croissance consécutive pour estimer le taux de croissance maximal.
    Remarque : La moyenne plus grande avec le plus petit écart est définie comme le taux de croissance maximal de la courbe de croissance correspondante.

5. Confirmant le biais Global de la dispose de 96 puits (facultatif)

Remarque : les deux la plaque lecteur et la plaque à 96 puits consommable peuvent provoquer des mesures biaisées. Pour obtenir des résultats quantitatifs très précis et reproductibles, confirmant le biais global de la plaque à 96 puits est hautement recommandé.

  1. Préparer la plaque 96 puits et le lecteur de plaque pour la partialité, comme décrit à la section 3.2.2.
  2. Ajouter 20 mL M63 dans un tube à centrifuger de 50 mL stérilisés. Ajouter le stock de glycérol dans le même tube à centrifuger et vortex. Transférer la solution suspendue dans un réservoir de réactif stérilisé.
  3. Utiliser une pipette à 8 canaux pour transférer 200 µL de la solution suspendue à la plaque à 96 puits.
  4. Placer la plaque à 96 puits sur le lecteur et lancer la mesure.
  5. Enregistrement horaire OD 600 lit et analyse tel que décrit à l’article 4. Comparer la densité de population et taux de croissance maximale calculée de chaque puits pour déterminer la localisation partialité les lectures de 96 puits.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La méthode décrite fournit un moyen de capturer la croissance bactérienne dynamique de façon continue et à haut débit en utilisant un lecteur de format 96 puits qui prend plusieurs mesures de la densité optique à divers intervalles de temps (à partir de minutes, heures ou jours). Les courbes de croissance d’un assortiment de souches d’Escherichia coli exprimant différents génomes peuvent être précisément acquises dans une expérience simple (Figure 1 a). En comparaison avec la méthode décrite, la méthode traditionnelle (le test d’UFC) généralement requiert plus longs intervalles de temps d’échantillonnage (Figure 1 b) et demande beaucoup de travail si la culture multiple est nécessaire. En outre, chaque fois que la culture d’échantillonnage pour l’analyse de l’UFC nécessite l’utilisation d’un petit volume de culture cellulaire qui ne peut pas être utilisé pour des mesures répétées. En outre, un nombre limité de points dans le temps pour la détection peut manquer les points de prélèvement d’échantillons qui sont nécessaires pour le calcul correct de la croissance et la maximale de l’OD600. Cependant, l’analyse de l’UFC a une limite inférieure de détection, 103 -4 10 cellules/mL, ce qui en fait au moins deux ordres de grandeur plus sensible que le test de turbidité optique (OD600= 0,001, qui a une limite de détection d’environ 105 -106 cellules/mL). La méthode décrite fournit un outil expérimental pratique et efficace pour les systèmes des études sur la dynamique de croissance.

Un avantage majeur de ce protocole est qu’il faut des mesures répétées d’un stock commun de glycérol. Avoir plusieurs cultures cellulaires à divers taux de dilution au début de la phase exponentielle de croissance est très utile car elle permet aux chercheurs de déterminer le temps de culture à une échelle de temps et évite d’avoir saturé de cultures en raison d’événements imprévisibles. Répété de culture et les mesures de l’actions ordinaires, qui ont été préparées à partir d’une des cultures cinq initiés en utilisant des taux de dilution différent tel que décrit dans le protocole section 2.2 (Figure 2 a), a présenté des résultats très semblables de la croissance analyse de la dynamique. Plusieurs courbes de croissance des mesures répétées et indépendants (N = 6) se chevauchés bien (Figure 2 bpanneau supérieur), avec peu de variance (Figure 2 bpanneau inférieur), en particulier au cours de la phase exponentielle ( Figure 2 b, coin ombragé). Ces résultats suggèrent que la méthode décrite fournit des résultats très reproductibles.

Estimer le biais global de la dispose de 96 puits est fortement recommandée. Dans la présente méthode, le biais global est estimé en contrôlant la croissance de la souche sauvage e. coli souche W3110 tel que décrit dans le protocole, l’article 5. Par exemple, le taux de croissance calculée à partir des courbes de croissance montrés une variation significative parmi les 96 puits (Figure 3 a), qui représente la fluctuation mondiale provenant de la manipulation de données et les erreurs de l’appareil. Ces erreurs peuvent être masquées en chargeant le même échantillon dans les puits multiples à différents lieux sur la plaque. En revanche, le maximum de l’OD600 a montré un biais clairement dépendante de localisation pour les résultats, comme changements graduels ont été observées le long de l’axe vertical, c'est-à-dire le maximum de l’OD600 graduellement augmenté provenant des puits de la colonne 2 à ceux de colonne 11 sur la plaque à 96 puits (Figure 3 b). Afin d’éviter les résultats biaisés, le même échantillon est recommandé pour être chargés dans les puits situés sur les deux côtés de la plaque à 96 puits pour des mesures répétées. Le biais localisation dans les valeurs maximales de600 OD est censé pour résulter de la variation des taux d’évaporation, qui sont déterminés par le chauffage et le scellage des gains d’efficience. En comparaison avec les puits dans le milieu de la Microplaque 96 puits, les puits situés sur les bords avaient tendance à afficher les valeurs relativement plus élevés, reflétant les taux d’évaporation varié résultant de l’effet d’étanchéité de la microplaque. En outre, puisque les autres Microplaque 96 puits soumis à l’essai même biais ont montré des changements de direction similaires basées sur où le puits est situé sur la plaque, l’ampleur du biais peut dépendre le lecteur. Ainsi, il est important d’évaluer le biais global du 96 puits se lit dans les études qui déterminent la densité de population maximale. Les lecteurs de plaques disponibles dans le commerce qu'ont tous leur partialité globale spécifique causée par le chauffage et le secouant l’efficacité et la Microplaque 96 puits sont en grande partie différenciés en scellant l’efficacité.

Cette méthode est conçue pour l’analyse systématique de la croissance bactérienne, et il peut être utilisé pour analyser les deux paramètres principaux, c'est-à-dire, densité de taux et de la cellule de croissance, qui sont généralement appliquées dans une grande variété de domaines, tels que la biologie des systèmes, évolution, et écologie16,17. Le calcul manuel à l’aide de la feuille de calcul est introduit pour montrer la transformation des lectures brutes pour produire les paramètres évalués de densité taux et cellules de croissance. Les taux horaires de croissance sont tout d’abord calculées à partir des lectures brutes de la courbe de croissance (Figure 4 a) selon le protocole article 4.6 comme un ensemble de données séquentielles changements dans les taux de croissance (Figure 4 b). Les moyennes et les écarts de chaque cinq taux de croissance consécutifs sont acquis dans l’ordre (Figure 4-D), et le taux de croissance moyen plus grand avec le plus petit écart est défini comme le taux de croissance maximal de la croissance courbe (Figure 4-D, a mis en évidence). La densité cellulaire maximale (OD600) est analysée de la même façon (Figure 4E-F). La densité de taux et cellules de croissance calculé sont ensuite soumis à une analyse plus approfondie. Notez que les calculs décrits peuvent être automatiquement réalisées à l’aide de plates-formes informatiques (langages de programmation), par exemple, R et Python.

Figure 1
Courbes de croissance figure 1 acquis avec diverses méthodes. (A) multiples acquisitions des courbes de croissance. Courbes de croissance de quatre différentes souches d’Escherichia coli exprimant différents génomes ont été obtenus dans des conditions haut débit. Les cellules d’e. coli ont été cultivés en M63 moyen minimal, et les changements dans l’OD600 lectures ont été enregistrées par un lecteur de microplaques à intervalles de 1 h. Les souches de gauche à droite le type sauvage d’e. coli W3110 (numéro 0) et génomes réduits numéros 1, 10 et 18 (décrit précédemment5), respectivement. Courbe de croissance (B) obtenu à l’aide de l’analyse de l’UFC. Le sauvage-type cellules d’Escherichia coli (numéro 0) ont été cultivées et ont été échantillonnés à des points de l’heure indiquée pendant plusieurs heures. Les changements de croissance ont été estimées en utilisant l’analyse de l’UFC. Des cercles indiquent l’enregistrement ou les points d’échantillonnage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Mesures répétées reproductibles. (A) des cultures une nuit ou Pluss de taux de dilution variées. les cellules d’e. coli ont été inoculés dans des tubes à plusieurs taux de dilution, qui variait de 1-à 10,000-fold, comme il est indiqué. Les cellules sont cultivées à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min pendant environ 12 h. Les valeurs finales de600 OD les cinq des cultures de cellules (de gauche à droite) étaient respectivement de 1,51, 0,74, 0,05, 0,008 et 0,001. La culture avec OD600 de 0,05 a été utilisée pour le stock commun de glycérol. (B) des mesures hautement reproductibles. Six courbes de croissance indépendante (lignes dessus, gris) de la même souche d’e. coli ont été acquis et calculées à partir de six postes sur la microplaque et deux coupes de la commune stock de glycérol. La ligne noire représente la moyenne des courbes de six croissance. Les coefficients de variation (CV) des six mesures répétées ont été calculés (en bas), et les points faibles stables sont ombragées en rose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 biais Global du Format 96 puits. Carte de chaleur (A) des taux de croissance. Le stock de cellules d’Escherichia coli a été suspendu en M63 moyenne minimale et chargé également dans les 96 puits de la microplaque (représenté par un tableau de 12 × 8). Les changements en OD600 ont été obtenus en utilisant le lecteur de microplaques, tel que décrit à l’article 5 du protocole. La gradation du blanc au rouge indique les taux de croissance de 0,7 à 0,9 h-1. (B) carte de chaleur des OD maximale600. La gradation du blanc au rouge indique les valeurs maximales de OD600 de 0,9 à 1,2. Les calculs du taux de croissance et maximale OD600 sont décrits à la Figure 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 analyse des courbes de croissance. (A) les données brutes des courbes de croissance. L’horaire OD600 lectures sont tracées contre le temps de la culture. Des cercles indiquent les temps d’échantillonnage. Temporal (B) des changements dans les taux de croissance. Taux de croissance horaire entre deux lectures de600 OD consécutifs sont calculées selon l’équation décrite en 4.6. Taux de croissance moyens de (C) . La moyenne des cinq taux de croissance consécutifs sont calculés pour donner le taux de croissance sans heurt. (D) des écarts de taux de croissance moyens. L’écart le même cinq consécutives des taux de croissance est calculé. Le taux de croissance maximal avec le plus petit écart est surligné en rouge. (E) signifie que l’OD600. La moyenne des cinq valeurs consécutives de600 OD est calculée pour déterminer le bon OD600. (F) écarts d’OD600 valeurs moyennes. Écart-type des mêmes cinq consécutifs OD600 valeurs est calculée. La maximale600 OD, avec le plus petit écart est surlignée en rouge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation d’un stock commun en croissance exponentielle des cellules et la réplication des mêmes échantillons dans plusieurs puits à différentes positions sur la microplaque. Auparavant, microbiologistes ont commencé la culture d’une culture avant une nuit ou plus. Alors que cette méthode peut réduire le temps de latence de la croissance bactérienne, il est difficile d’obtenir des courbes de croissance reproductibles. Comme illustré à la Figure 2, les mesures indépendantes en utilisant les stocks communs de glycérol conduit à des courbes de croissance presque identiques, qui fournissent des résultats précis et reproductibles. Comme illustré à la Figure 3, puits à divers endroits donnent lectures légèrement différentes, qui est considéré comme le contexte global des mesures. Pour l’évaluation quantitative de la croissance bactérienne, on envisagera cette toile de fond. L’inoculation des échantillons à plusieurs puits aux endroits variés plaque pour réplication expérimentale est fortement recommandée pour tenir compte des biais mondial.

En plus de gérer les erreurs, envisagera la modification et dépannage dérivé des dispositifs expérimentaux et les fournitures. Plusieurs lecteurs de microplaque avancées sont disponibles dans le commerce. Ils montrent une grande variation dans les caractéristiques, telles que la méthode d’ajustement de la longueur d’onde de lumière, le mode de chauffage ou de refroidissement et la manière et la fréquence des secousses. Basé sur notre expérience, évaporation doit être adressée dans les études de haut débit car les variations de volume liquide influencent grandement OD600 lectures. Évaporation est causée par la méthode de chauffage utilisé par les lecteurs de microplaques et l’architecture de la microplaque. Les deux modes de chauffage généralement implémentées dans des lecteurs de microplaque commerciaux sont chauffage par air chaud et chauffage avec une plaque chauffante. Le lecteur de microplaques utilisé dans le présent protocole utilisé la plaque de cuisson comme une méthode de chauffage pour diminuer l’évaporation car le milieu dans la microplaque serait rapidement tarir le soufflage de l’air chaud. Les plaques de microtitration doit également être sélectionnée avec soin. Plaques de microtitration different 96 puits (avec couvercles) causent différents niveaux d’évaporation. La méthode décrite utilise le format de la plaque avec un couvercle couvert profond, ce qui réduit l’évaporation.

En outre, si l’étude nécessite une analyse de la phase stationnaire de la courbe de croissance, alors la manière et la fréquence des secousses dans le lecteur de microplaques doivent tenir compte. Agitation durant la culture assure que les cellules en croissance sont suspendues uniformément dans les médias. Agitation impropre ou basse fréquence peut causer les cellules à empiler sur le pourtour du puits ou dans le centre à une densité élevée, ayant pour résultat les lectures fausses qui sont soit inférieure ou supérieure à lectures réelles. La méthode décrite utilise linéaires, bidirectionnel secouant. Alors que le mode d’agitation en forme de 8 est probablement suffisant, nous ne recommandons pas le mode circulaire des secousses.

La limitation majeure de cette méthode est l’évaporation de la milieu de culture cellulaire. Le volume maximal de la culture étant petit, c'est-à-dire200 µL, incubation à 37 ° C provoque une évaporation importante. Ainsi, cette méthode ne consiste pas pour cultiver plus de 48 h. en outre, les cultures de cellules de faible densité doivent être évitées car la détection optique (OD600) est limitée à ces densités. Globalement, très lentes croissance cellules/foulures ou cultures très faible concentration initiale ne sont pas privilégiées, car ils nécessitent plus de temps et sont inférieures à la limite de détection de OD600.

Cette méthode donne des mesures précises, haut débit, qui sont très avantageux pour des relevés systématiques. Comme un résultat représentatif, cette méthode permet d’évaluer un assortiment des souches d’e. coli avec diverses séquences génomiques et/ou moyen facilement et de façon reproductible5. Par rapport aux méthodes traditionnelles de culture en tubes et mesure manuellement d’échantillons à des moments différents, la méthode décrite est moins de travail et temps intensif. Les applications futures et le développement de la méthode sont censés pour impliquer l’automatisation de la manipulation expérimentale et analyse computationnelle. Application automatique de mesure et de la robotique conduira à une méthode hautement efficace et fiable d’évaluer la croissance cellulaire et de survie les tests utilisant des cellules bactériennes et mammaliennes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nous remercions Kohei Tsuchiya pour fournir l’exemple de test d’UFC. Ce travail a été partiellement financé par une subvention pour la recherche scientifique (C) no 26506003 (à BWY) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie, Japon.

Acknowledgments

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2HPO4 Wako 164-04295
KH2PO4 Wako 166-04255
(NH4)2SO4 Wako 019-03435
MgSO4-7H2O Wako 138-00415
Thiamine-HCl Wako 201-00852
glucose Wako 049-31165
HCl Wako 080-01066
Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) Wako 094-01082
KOH Wako 168-21815
Glycerol Wako 075-00611
Centrifuge tube (50 mL, sterilized) WATSON 1342-050S
Pipette Tips, 200 µL WATSON 110-705Y
Pipette Tips, 1,000 µL WATSON 110-8040
Microtube (1.5 mL) WATSON 131-715C
8 multichannel-pipette WATSON NT-8200
PASORINA STIRRER AS ONE 2-4990-02
Glass cylinder (200 mL) AS ONE 1-8562-07
Precision pH mater AS ONE AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200 GILSON 1-6855-05
Pipetman P-1000 GILSON 1-6855-06
Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) SANPLATEC SAN27014
Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) SANPLATEC SAN27015
Microtube stand BM Bio 801-02Y
Vortex BM Bio BM-V1
Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) Sigma-Aldrich Corning, 3370
Corning Costar reagent reservoir (50 mL) Sigma-Aldrich Corning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) Merck Millipore SCGVU02RE
Pipet-Aid XP DRUMMOND 4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR) TAITEC 0053778-000
Disposal cell (1.5 mL) Kartell 1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter A23616
EPOCH2 BioTek 2014-EP2-002 / EPOCH2T
Beaker (500 mL) IWAKI 82-0008
BIO clean bench Panasonic MCV-B131F
Glass tubes NICHIDEN RIKA GLASS P-10M~P-30 /101019
Silicone rubber stoppers ShinEtsu Polymer T-19
Bacterial strains Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
  2. Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
  3. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  4. Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
  5. Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
  6. Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
  7. Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
  8. Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
  9. Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
  10. Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
  11. Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
  12. Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
  13. Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
  14. Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
  15. Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
  16. Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
  17. Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).

Tags

Microbiologie question 127 croissance bactérienne courbe de croissance taux de croissance densité cellulaire haut-débit lecteur de microplaques plaque à 96 puits Escherichia coli
Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurokawa, M., Ying, B. W. Precise,… More

Kurokawa, M., Ying, B. W. Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth. J. Vis. Exp. (127), e56197, doi:10.3791/56197 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter