Summary
Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji bir sistemleri-düzey olgu olarak anlamak için gerekli. Deneysel manipülasyon ve analitik bir yaklaşım için bir protokol bırakmak kesin, yüksek üretilen iş analizi anahtar sistemleri Biyoloji ilgi konusu bakterilerin büyüme için sunulmaktadır.
Abstract
Bakteriyel büyüme, modern mikrobiyal Fizyoloji geliştirilmesi, hem de sistem düzeyinde hücre dinamiği soruşturma merkezi bir kavramdır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bakterilerin büyüme ve genom azaltma ve transcriptome yeniden yapılanma gibi genom-wide olaylar arasındaki ilişkiler bildirdin. Bakteriyel büyüme doğru analiz büyüme bağımlı koordinasyon gen fonksiyonları ve hücresel bileşenleri anlamak için önemlidir. Buna göre bir yüksek-den geçerek şekilde Bakteriyel büyüme kesin kantitatif değerlendirilmesi gereklidir. Ortaya çıkan teknolojik gelişmeler Bakteriyel büyüme çalışmak için kullanılan yöntemlerin güncelleştirmelere izin yeni deneysel araçları sunar. Burada sunulan Protokolü Mikroplaka okuyucu dağlık iyimserlik deneysel bir işlem tekrarlanabilir ve hassas değerlendirme bakterilerin büyüme ile istihdam etmektedir. Bu iletişim kuralı birkaç büyüme değerlendirmek için kullanılan daha önce açıklanan Escherichia coli suşları. Protokol ana adımları aşağıdaki gibidir: çok sayıda küçük şişeleri hisselerinde hücre hazırlık tekrarlanabilir sonuçlar, 96-şey plakaları kullanım için yüksek üretilen iş büyüme değerlendirme ve iki büyük el ile hesaplama ile tekrarlanan testler için parametreleri (örneğin, maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu) büyüme dinamikleri temsil eden. İle karşılaştırıldığında hangi cam tüplerde bitti Ağar kaplamalar zamanında kültürlü hücreleri sayar, geleneksel koloni oluşturan birim (CFU) tahlil, mevcut yöntemi daha etkilidir ve büyüme değişiklikleri daha ayrıntılı geçici kayıt sağlar, ancak bir daha sıkı sahiptir düşük nüfus yoğunluğu algılama limitte. Özet olarak, açıklanan yöntemi kesin ve tekrarlanabilir yüksek üretilen iş analizi kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya teorik gözlemler yapmak için kullanılabilir Bakteriyel büyüme için avantajlıdır.
Introduction
Mikrobiyolojik çalışmalar genellikle bakteriyel hücre kültürü ve bakteri fizyolojisi1,2,3temel bir fenomen temsil Bakteriyel büyüme eğrileri değerlendirilmesi ile başlar. Bakteri kültürü bir temel metodoloji olduğundan temel kültür ilkeleri yaygın olarak Yayınlanan araştırma edebiyat ve ders kitapları mevcuttur. Tezgah düzeyinde önemli dikkat geleneksel büyüme medya en iyi duruma getirme ve koşullar kültür üzerinde yoğunlaştı ancak büyüme hızını denetleme, hangi büyük olasılıkla mikrobiyal fizyoloji, daha büyük anlayış sağlayacak olmamıştır 4yaygın olarak okudu. Katlanarak bakteri için hücresel devlet anahtar parametresini genom, transcriptome ve Proteom5,6,7,8 ile koordineli olduğu bildirilen büyüme oranı büyüyor . Böylece, Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi mikrobiyal Fizyoloji anlamak için önemlidir.
Bakteriyel büyüme değerlendirmek için biyokütle tahmin etmek için kullanılan deneysel yöntemleri de kurulan9,10 ve optik bulanıklık gibi biyokimyasal, fiziksel veya biyolojik parametreleri algılama temel alır. Buna ek olarak, büyüme değişiklikleri dinamik özelliklerini yakalamak için kullanılan analitik yöntemleri yaygın olarak kurulan doğrusal olmayan modelleri11,12,13, örneğin, lojistik denklemler temel alır. Büyüme dinamikleri genellikle hücre büyüme kültür zamanlanmış örnekleme tarafından optik bulanıklık ölçüm veya koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri performans elde edilir. Bu kültür ve algılama yöntemleri sınırlandırılması veri noktaları nüfus dinamikleri gerçek bir yansımasıdır ölçüm aralıkları genellikle saat içinde olduğu için ve çünkü değildir kültür durumu (örneğin, sıcaklık değişiklikleri ve Havalandırma) örnekleme anda bozulmuştur. Kültür ve analiz teknikleri teknoloji ve anlayış son gelişmeler kullanarak güncelleştirilmiş olması gerekir. Mikroplaka Okuyucular son gelişmeler bakterilerin büyüme gerçek zamanlı gözlem izin ve işçilik maliyetleri önemli ölçüde azaltabilirsiniz. Bu gelişmiş cihazlar kullanarak, Bakteriyel büyüme üzerinde son çalışmaları için yüksek üretilen iş ölçümleri14,15analitik yöntemleri bildirdi.
Bu iletişim kuralı, hassas büyüme dinamikleri sonuçta nasıl büyüme oranı belirlenir ve büyüme oranı ne etken etkiler sorular adresi nicel çalışmalar için değerli olacaktır yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için amaçtır. Protokol bakterilerin büyüme tekrarlanabilir ve hassas Nefelometri için dikkate alınması gereken tüm faktörler ele alır. Deneysel yöntem ve analiz ana metin ayrıntılarıyla açıklanmıştır. Bu yöntem Bakteriyel büyüme kesin ve tekrarlanabilir analizini bir yüksek-den geçerek şekilde izin verir. Microbiologists bu iletişim kuralı ek nicel sonuçları onların deneysel kanıt türetmek için kullanabilirsiniz. Bu iletişim kuralı kavramsal sonuçlara ulaşmak için veya büyüme teorik bir bakış elde etmek için çalışan sistemleri Biyoloji çalışmaları için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. büyüme orta hazırlama
Not: en az orta M63 kimyasal bileşimi gibidir: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1.8 µM FeSO 4, 15 µM tiamin-HCl, 0.2 mM MgSO 4 ve 22 mM glikoz. M63 üç hisse senedi çözümleri karıştırılarak yapılır: beş X çözüm, % 20 glikoz ve MgSO 4 tiamin çözüm. Saat 4'te tüm çözümler depolamak ° C.
- 5 X çözüm FeSO 4 çözüm, hazırlamak için hazırlanıyor bir elektrik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet GKD 2 O 50 mL santrifüj tüpü eklemek için kullanın. Bir P-200 0,06 mL HCl 0.01 M HCl. ekleyin 36 mg FeSO 4-7 H 2 O elde edilir ve iyice karıştırın eklemek için kullanın.
- 160 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçmek ve 500 mL kabı için ekleyin. Bu sırada aşağıdakileri ekleyin: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 SO 4 ve 0.5 mL (1.1.1. adımda hazırlanan) FeSO 4 çözüm.
- Hassas pH metre, kullanarak, 7.0 pH 2 M KOH ekleyerek ayarlayın. GKD 2 O toplam hacmi 200 mL için eklemek ve bir ölçüm silindir çözüm dökün. 250 mL filtrasyon ünitesi (PVDF, 0,22 µM) kullanarak çözüm sterilize.
- % 20 glikoz çözüm hazırlama
- 200 mL GKD 2 O ölçüm silindir ölçüp 500 mL kabı dök. Manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma sırasında 50 gr şekeri ekleyin. Bir ölçüm silindir 250 mL toplam hacmiyle çözümde sulandırmak. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.
- MgSO 4 tiamin çözüm hazırlama
- 150 mL GKD 2 O 500 mL kabı için ekleyin. Manyetik karıştırıcı ile karıştırma sırasında 1.0 g tiamin-HCL ve MgSO 4-7 H 2 O. Dilute çözüm 10 g toplam hacmi 200 mL için bir ölçüm silindir ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.
- En az orta M63 hazırlama
- 5 X çözüm, % 20 glikoz çözüm, MgSO 4 tiamin çözüm, elektronik bir pipet, P-200 pipet ve 200-µL pipet ipuçları temiz bir bankta yerleştirin.
- Ölçmek 155.8 mL GKD 2 O ölçüm bir silindir ve 500 mL kabı dökün.
- Elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet, kullanarak Ekle beş X çözüm ve 4 mL % 20 glikoz çözüm 40 mL ölçülen GKD 2 için O. Daha sonra 0.2 mL MgSO 4 tiamin çözüm P-200 ile ekleyin. 1.1.3. adımda açıklandığı gibi çözüm sterilize.
2. Gliserol stok hazırlanması
- hücre kültür
Not: bakteri suşları (örneğin, W3110 ve onun azaltılmış genleri) yük banka kuruluşlardan mevcuttur. Suşlarının agar plakaları koloniler şeklinde genellikle elde edilir.- Silikon kauçuk Stoper, elektronik bir pipet, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları ve temiz bir Bank üzerinde hedef suşları (kolonileri plakaları) ile beş steril cam tüplerin yerleştirin.
- Cam tüp Bunsen Burner ağız silikon kauçuk tıpa açmadan önce ortaya çıkarmak. Tüp açıldıktan sonra silikon kauçuk tıpa aleve maruz ve hafifçe kap cam tüp geri yerleştirin.
- 5 mL M63 bir cam tüpler ve diğer dört tüpler için 4.5 mL M63 eklemek için elektronik pipet ve tek kullanımlık serolojik pipet kullanın.
- Bir koloni alıp 5 mL M63 içeren cam tüpte aşılamak için P-200 ipucu kullanın.
- Bir süspansiyon yapmak için girdap tüp. O zaman, çözüm 10 kat seyreltik tarafından Bu çözümün 0.5 mL 4.5 mL M63 içeren dört tüpler birine transfer.
- Kalan tüpler 2.1.5. adımda açıklanan işlemi yineleyin. Beş farklı konsantrasyonları ile seyreltme serisi (dilutions 1, 10, 100, 1000 ve 10.000) şimdi hazırdır.
- Cam tüp ve 2.1.2. adımda açıklandığı gibi silikon kauçuk stoper ağızlarını sterilize. Stoper tüplerini kap. Kontaminasyon silikon kauçuk stoper kırışıklıklar değil.
- Önceden ısıtılmış sallayarak kuluçka 37 ° C'de beş tüpler yerleştirin ve 200 devir / dakikada sallamak. Kültür gecede veya 10-30 h. için kuluçkaya
- Seçimi gliserol hisse senedi için kültür
- Önceden ısıtılmış oda sıcaklığında M63 orta, P-1,000, 1.000-µL pipet ipuçları ve tek kullanımlık bir küvet temiz bir bankta yerleştirin.
- Ekle 1000 µL M63 tek kullanımlık bir küvet için bir P-1, 000 ile. Tek kullanımlık küvet bir Spektrofotometre yerleştirin, sabit bir dalga boyu 600 adlı programını başlatmak nm ve ölçü birimi boş.
- Beş cam tüpler temiz kürsüye sallayarak kuluçka taşımak.
- Atmak M63 tek kullanımlık küvet gelen ve aynı tek kullanımlık küvet bir P-1, 000 ile 1.000 µL kültür ekleyin. 2.2.2. adımda açıklandığı gibi hücre kültürü (OD 600) optik bulanıklık ölçmek.
Not: herhangi bir kontaminasyon ve hassas bir ölçüm elde etmek için cam boru ve açıklandığı gibi alev ve girdap kültür önce örnekleme stoppers maruz. Özellikle hücre yoğunluğu düşük olduğu zamanlarda güvenilir sonuçlar alabilmek için tekrarlanan ölçüler, tavsiye edilir. - Beş hücre kültürleri, erken üstel büyüme aşamasında birini (OD 600 = 0,01 - 0,05) gliserol hisse senedi için.
Not: birden çok kültürü yoğunlukları optimum menzili içinde varsa, 0,05 en yakın yaygın olarak seçili.
- Tekrarlanan testleri için gliserol hisse senedi olun.
Not: Bu on hisse senetleri hazırlamak için tanımlanır. Daha büyük veya daha küçük miktarlarda deneysel gereksinimlerine göre yapılabilir.- Steril % 60 gliserol çözüm getirin, on 1.5 mL mikrotüpler, P-1,000 sterilize ve P-200, 1000 ve 200 µL pipet ipuçları ve bir microtube stand temiz bir bankta.
- Ekleyin 250 µL sterilize % 60 gliserol çözüm ve 1.5 mL microtube ve mix için seçili hücre kültürünün 750 µL tarafından pipetting.
Not: Stok birimi değişkendir, ancak her zaman % 60 gliserol hücre kültürü için 1:3 oranını korumak; Bu % 15 gliserol son bir konsantrasyon sonuçlanır. - Kalan dokuz mikrotüpler microtube tribünde yer ve her tüpün 2.3.2. adımda hazırlanan karışımı 100 µL dağıtmak. Şimdi ileride kullanmak için on aynı gliserol hisse senedi vardır.
- Derin dondurucu-80, hisse senetleri depolamak ° C.
3. Büyüme eğrileri elde
- yukarıya Mikroplaka okuyucu ayarlama.
Not: (bkz: malzemeler tablo) plaka okuyucu kullanılan belirli phrasing burada kullanılan tırnak işaretleri gösterisinde gösterilen koşulları.- Açık belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Açık " iletişim kuralları " içinde " Görev Yöneticisi " ve seçin " Yeni Oluştur ". Seçin " standart protokol ".
- Aç " yordam " ve ayarlarını yapın. Açık " sıcaklık ayarla " ve seçin " kuluçka makinesi üzerinde ". Ayarla " sıcaklık " 37 ° c ve " degrade " 0 ° C. onay " Onceden " sonraki adımla devam etmeden önce. Açık " başlatmak Kinetik ", set " çalışma zamanı " için 24:00:00 ya da 48:00:00, ve " aralığı " 00:30:00 ve 01:00:00 için.
Not: Tüm 96 de plaka okumak için yaklaşık 1 dakika sürer. - Aç " sallamak " ve " sallamak modu " olarak " lineer ". Kontrol " Constitution sallamak " ve " frekans " 567 BGBM. Açık " okuma ", kontrol " Absorbans ", " son nokta/Kinetik ", ve " Monochromators. " ayarla " dalga boyu " 600.
- Tıklama " doğrula " yordam doğru olduğunu onaylamak için. ' I tıklatın " kurtarmak " ileride kullanmak üzere yeni bir program olarak kaydetmeyi.
- Gerçek zamanlı büyüme kayıt
- aşısını kültür örnekleri 96-şey plaka üzerinde konumlarını belirtmek için bir 96-şey plaka sembol (8 × 12 tablo) çizin. Tablo baskı ve deneme için bir başvuru olarak kullanın.
Not: Mikroplaka kenarlarında bulunan kuyu yalnızca buharlaşma nedeniyle boş orta içermelidir. - Yer sterilize edilmiş bir 96-şey düz alt Mikroplaka kapak, P-1000, 1000-µL pipet ipuçları, P-200, 200-µL pipet ipuçları, birkaç 1.5 mL mikrotüpler, bir 8-çok kanallı pipet, steril reaktif su deposu, oda sıcaklığında M63 ve gliserol ile temiz bir banka hisse senetleri (2.3 adımda hazırlanan).
- Yaklaşık 25 mL M63 reaktif havzanın ekleyin. Bu depo stok için aşağıdaki adımların tümünü kullanın.
- Ekleyin 900 µL M63 mikrotüpler seri dilutions yapmak için hazırlık için.
- Gliserol stok oda sıcaklığında erimek. 900 µL eklemek M63 çözdürülen gliserol hisse senedi ve girdap. Bu orijinal gliserol hisse senedi 10 kat bir seyreltme içinde sonuç.
- 900 µL M63 ve girdap içeren başka bir microtube için 10 kat seyreltme transfer 100 µL. Bu 100-fold bir seyreltme olur.
- Tekrarlama adım dilutions için istediğiniz sayıyı elde kadar 3.2.6.
- Doldurmak wells 200 µL M63 kullanarak Mikroplaka kenarında bir 8 kanallı pipet (P-200).
Not: Bu kuyu boş kullanılabilir. - Yük 200 µL her adımda 3.2.4 - 3.2.7 başvuru tablosu (Adım 3.2.1) göre Mikroplaka wells için hazırlanan örnek seyreltilmiş. Girdap seyreltilmiş numune önceden yükleme ve yük aynı örnek birden çok Wells için çeşitli konumları plaka üzerinde.
- 96-şey Mikroplaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin.
- Aç " okunur Şimdi " içinde " Görev Yöneticisi " ve program (Bölüm 3.1) seçin. ' I tıklatın " Tamam " ölçümünü başlatmak için. Veri analizi (Bölüm 4) için yeni bir deneysel dosya kaydı saklamak.
- aşısını kültür örnekleri 96-şey plaka üzerinde konumlarını belirtmek için bir 96-şey plaka sembol (8 × 12 tablo) çizin. Tablo baskı ve deneme için bir başvuru olarak kullanın.
4. Veri analizi
- verme bir USB bellek için gerçek zamanlı büyüme hızında veri (Bölüm 3.2) sonuçlarını bir metin dosyası olarak sopa.
Not: Bir 96-iyi biçimlendirilmiş sonuçlar (eğriler) plaka okuyucu gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Saatlik kayıtları (OD değerleri) bir tablo olarak verilebilir; satır ve sütunları iyi numarası (örneğin, A1, B1) ve ölçüm saat (örneğin, 00:00:59) temsil sırasıyla. - Elektronik tablo yazılımı ile metin dosyası açın.
- Saatlik OD 600 okur 96-şey Mikroplaka sayısı daha fazla çözümleme için yeni bir çalışma sayfasına kopyalayın.
- Arka plan okur, çıkarma zaman her örneğinin saatlik okuma sıfırdan de.
Not: kolaylık sağlamak için boş ortalama değerini içeren M63 kuyuları (Adım 3.2.8)-ebilmek var olmak kullanılmış ile arka plan değeri. - Maksimal nüfus yoğunluğu tahmin etmek için beş ardışık OD 600 okuma ortalamasını hesaplamak.
Not: Maksimal OD 600 karşılık gelen büyüme eğrisi beş ardışık OD 600 okuma en büyük ortalama değeri tanımlanır. - Hesaplamak büyüme oranı, μ (s -1), tüm çift ardışık değerleri aşağıdaki denklemi OD 600 uygulayarak:
Not: Bu denklemde ben C ve C ı + 1 herhangi iki ardışık zaman nokta (Ben t ve t ı + 1, OD 600 değerleri temsil sırasıyla). Doğal logaritma LN gösterir. - Zamanla büyüme oranı değişiklikleri saatlik OD 600 dayalı Calculate adım 4,6 göre okur. Ortalama ve standart sapma maksimum büyüme oranı tahmin etmek için beş ardışık büyüme oranları hesaplamak.
Not: En büyük ortalama en küçük standart sapma ile ilgili büyüme eğrisi maksimal büyüme oranı tanımlanır.
5. 96-iyi okur (isteğe bağlı) genel önyargı teyit
Not: her iki plaka okuyucu ve tüketim 96-şey plaka önyargılı ölçümleri neden olabilir. Son derece hassas ve tekrarlanabilir sayısal sonuçlar elde etmek için genel önyargı 96-şey plaka teyit önerilir.
- 96-şey plaka ve plaka okuyucu için önyargı testi 3.2.2 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Ekle 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü M63. Gliserol stok aynı santrifüj tüpü ve girdap ekleyin. Askıya alınmış çözüm bir steril reaktif rezervuar transfer.
- Askıya alınmış çözüm 200 µL 96-şey plakasına aktarmak için bir 8 kanallı pipet kullanın.
- 96-şey plaka plaka okuyucu üzerinde yerleştirin ve ölçüm başlar.
- Kayıt OD 600 saatlik okur ve 4 bölümde açıklandığı gibi analiz. 96-iyi okur gerektirebileceği önyargı belirlemek için her şey hesaplanan maksimal büyüme oranı ve nüfus yoğunluğu karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan yöntemi dinamik Bakteriyel büyüme sürekli, yüksek üretilen iş bir şekilde çeşitli zaman aralıkları (dakikadan gün saat) birden fazla optik yoğunluk ölçümleri alır bir 96-şey biçimi okuyucu kullanarak yakalamak için bir yol sağlar. E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir ürün yelpazesine büyüme eğrileri tam olarak tek bir deneyi (şekil 1A) elde edilebilir. Açıklanan yöntemi ile karşılaştırıldığında geleneksel yöntem (CFU tahlil) genellikle daha uzun örnekleme zaman aralıkları (şekil 1B) gerektirir ve birden çok kültür gerekli ise emek yoğun olur. Buna ek olarak, her kültür örnekleme zaman CFU tahlil için tekrarlanan ölçümleri için kullanılan hücre kültürünün küçük bir birim kullanımını gerektirir. Ayrıca, zaman Puan algılama için sınırlı sayıda büyüme oranı ve maksimal OD600doğru hesaplanması için gerekli olan örnekleme noktaları kaçırabilir. Ancak, bir alt algılama sınırı 10 CFU tahlil vardır3 - 104 hücre/mL, en az iki büyüklük daha fazla hassas optik bulanıklık tahlil daha yapma (OD600yaklaşık 10 algılama sınırlaması vardır 0,001 =5 -106 hücre/mL). Açıklanan yöntemi büyüme dynamics sistemleri düzeyi çalışmaları için pratik ve verimli deneysel aracını sağlar.
Bu protokol önemli bir avantajı, bir ortak gliserol stoktan tekrarlanan ölçüler götürüyor. Araştırmacılar herhangi bir zaman ölçeği kültür anda belirlemek için izin verir ve kültürler öngörülemeyen olaylar nedeniyle doymuş engeller nedeniyle birden çok hücre kültürleri çeşitli seyreltme oranlarda erken üstel büyüme aşamasında olması son derece yararlı olduğunu. Kültür ve ölçümler bir büyüme son derece benzer sonuçları sunulan protokolünde Bölüm 2.2 (şekil 2A), açıklandığı gibi farklı seyreltme oranları kullanılarak başlatılan beş kültürlerin hazırlanmıştır ortak stoklarının tekrarladı Dynamics analizi. De üst üste birden fazla büyüme eğrileri tekrarlanan ve bağımsız ölçümleri (N = 6) (şekil 2Büst panel), küçük farkı (2B şekilalt panel), özellikle sırasında veya üssel faz ( ile Şekil 2B, gölgeli alan). Bu sonuçları açıklanan yöntemi son derece tekrarlanabilir sonuçlar sunar öneririz.
96-iyi okur genel önyargı tahmin önerilir. Mevcut yönteminde vahşi tipi E. coli büyüme izleme tarafından küresel önyargı tahmin edilmektedir Bölüm 5 iletişim kuralında tanımlandığı gibi W3110 süzün. Örneğin, veri işleme ve aygıt hataları'küresel dalgalanma temsil eden önemli varyasyon 96 wells (şekil 3A), arasında gösterdi büyüme eğrileri büyüme oranları hesaplanan. Bu hatalar plaka üzerinde çeşitli yerlerde birden fazla kuyu içine aynı örnek yükleyerek maskelenebilir. Yavaş yavaş değişiklikler düşey yönde gözlendi gibi buna karşılık, maksimal OD600 sonuçları için açık konumu bağımlı eğilimler gösterdi, maksimal OD600 yavaş yavaş sütun 2 kuyulardan bu birine arttı sütun 11 96-şey plaka (şekil 3B) üzerinde. Önyargılı sonuçları önlemek için aynı örnek 96-şey plaka tekrarlanan ölçümler için her iki tarafında bulunan kuyu içine yüklenecek tavsiye edilir. Maksimal OD600 değerleri içinde gerektirebileceği önyargı hem Isıtma ve verimliliği mühürleme tarafından belirlenir buharlaşma oranlarındaki değişim sonucu kabul edilir. 96-şey Mikroplaka ortasında wells ile karşılaştırıldığında, kenarlarında bulunan kuyu Mikroplaka mühürleme etkisinden kaynaklanan çeşitli buharlaşma oranlarını yansıtan nispeten daha yüksek değerler göstermek eğiliminde. Buna ek olarak, aynı önyargı testine tabi diğer 96-şey Mikroplaka nerede iyi plaka üzerinde yer oldu üzerinde göre benzer yön değişiklikleri gösterdi beri önyargı ölçüde plaka okuyucu üzerinde bağlı olabilir. Böylece, 96-iyi okur ise maksimal nüfus yoğunluğu belirleme çalışmaları genel önyargı değerlendirmek önemlidir. Tüm Isıtma ve sallayarak verimliliği ve 96-şey Mikroplaka neden onların belirli genel önyargı var piyasada bulunan plaka okuyucu büyük ölçüde verimlilik mühürleme tarafından ayrıştırılan.
Bu yöntem Bakteriyel büyüme sistematik analizi için tasarlanmıştır ve iki önemli parametre, örneğin, genellikle çok çeşitli sistemleri biyoloji, evrim, gibi alanlarda uygulanır, büyüme oranı ve hücre yoğunluk analiz etmek için kullanılabilir ve Ekoloji16,17. Elektronik tablo kullanarak el ile hesaplama büyüme oranı ve hücre yoğunluğu değerlendirilmiş parametrelerinin üretmek için ham okuma işlenmesi göstermek için sunulmuştur. Saatlik büyüme oranları ilk ham okuma Protokolü bölümünde 4.6 bir veri kümesi olarak sıralı değişiklikleri büyüme oranları (şekil 4B) göre büyüme eğrisi (şekil 4A) üzerinden hesaplanır. Anlamına gelir ve standart sapmalar her beş ardışık büyüme oranları sırayla iktisap (şekil 4 c-D), ve en büyük ortalama büyüme oranı en küçük standart sapma ile büyüme maksimal büyüme oranı tanımlanır eğri (şekil 4 c-D, vurgulanan). Maksimal hücre yoğunluğu (OD600) benzer şekilde analiz edilir (şekil 4E-F). Hesaplanan büyüme oranı ve hücre yoğunluğu daha sonra daha fazla çözümleme için tabi. Açıklanan hesaplamaları otomatik olarak kullanarak hesaplama platformları (programlama dilleri), gerçekleştirilebileceğini unutmayın örneğin, R ve Python.
Şekil 1 büyüme eğrileri ile çeşitli yöntemleri satın aldı. (A) büyüme eğrilerinin çoklu alım. Dört farklı büyüme eğrileri E. coli suşlarının çeşitli genleri ifade bir yüksek-den geçerek şekilde elde. E. coli hücreleri içinde en az orta M63 yetiştirilmiştir ve OD600 okuma değişimler 1-h aralıklarla Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Soldan suşları (sayı 0) doğru olan E. coli W3110 vahşi türü için ve onun azaltılmış genleri numaraları 1, 10 ve 18 (daha önce5, sırasıyla açıklanmıştır). (B) büyüme eğrisi CFU tahlil kullanılarak elde edilebilir. Vahşi türü E. coli hücreleri (sayı 0) kültürlü ve belirtilen süre noktalarda birkaç saat içinde örnek. Büyüme değişiklikleri CFU tahlil kullanarak tahmin edilmiştir. Açık dairelerden kayıt veya örnekleme noktaları gösteriyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tekrarlanabilir ölçümler tekrarladı. (A) çeşitli seyreltme oranı gecede kültürleris. E. coli hücreleri tüpler 1-10,000-fold belirtildiği gibi çeşitli çoklu seyreltme hesaplı aşılanmış. Hücreleri 37 ° C'de yaklaşık 12 h için 200 devirde sallayarak ile kültürlü. Son OD600 değerleri (soldan sağa) beş hücre kültürleri 1,51, 0,74, 0,05, 0.008 0.001, idi. Kültür OD600 0,05 ile ortak gliserol hisse senedi için kullanıldı. (B) son derece tekrarlanabilir ölçümler. Altı bağımsız büyüme eğrileri (üst, gri çizgiler) aynı E. coli baskı satın aldı ve altı pozisyonlardan Mikroplaka ve ortak gliserol stokunun iki şişeleri üzerinde hesaplanan. Siyah çizgi altı büyüme eğrileri ortalamasını temsil eder. Hesaplanan (alt) varyasyon altı tekrarlanan ölçüler (CV) katsayıları vardı ve sürekli düşük puan pembe gölgeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 96-şey biçiminin Genel önyargı. (A) büyüme oranları ısı haritası. E. coli hücre hisse senedi en az orta M63 askıya ve eşit (12 × 8 tablo olarak temsil edilen) Mikroplaka 96 Wells yüklendi. OD600 değişimler Mikroplaka okuyucu kullanarak iletişim kuralı 5 bölümde açıklandığı gibi elde edilmiştir. Kırmızı beyaz geçiş 0,7 0.9 h-1büyüme oranlarını gösterir. (B) ısı haritası maksimal OD600. Kırmızı beyaz geçiş 1.2 den 0,9 maksimal OD600 değerleri gösterir. Büyüme oranı ve maksimal OD600 için şekil 4' te açıklandığı gibi olacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 analizi büyüme eğrileri. (A) büyüme eğrilerinin ham veri. Saatlik OD600 okuma karşı kültür zaman çizilir. Açık dairelerden örnekleme zamanları gösterir. (B) Temporal büyüme oranları değiştirir. Saatlik büyüme oranları arasında iki ardışık OD600 okuma 4,6 içinde açıklanan denklem göre hesaplanır. (C) büyüme oranları demek. Beş ardışık büyüme oranları ortalaması pürüzsüz büyüme oranları vermek için hesaplanır. (D) standart sapma ortalama büyüme oranları. Standart sapma aynı beş ardışık büyüme oranları hesaplanır. Maksimal büyüme oranı en küçük standart sapma ile kırmızı ile vurgulanacaktır. (E) OD600demek. Beş ardışık OD600 değerlerin ortalamasını pürüzsüz OD600belirlemek için hesaplanır. (F) OD600 değerleri standart sapmalarının demek. Aynı beş ardışık OD600 değerlerin standart sapmasını hesaplar. En küçük standart sapma ile maksimal OD600 kırmızıyla vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik adımlar protokolündeki hücreleri ve çeşitli pozisyonlarda Mikroplaka üzerinde birden fazla Wells aynı örnekleri çoğaltmasını katlanarak büyüyen bir hisse senedi hazırlanması içerir. Daha önce microbiologists bir gece öncesi Kültür Kültür başladı. Bu yöntem Bakteriyel büyüme gecikme süresini azaltmak iken, tekrarlanabilir büyüme eğrileri elde etmek zordur. Şekil 2' de gösterildiği gibi ortak gliserol hisse senetleri kullanarak bağımsız ölçüleri tekrarlanabilir ve kesin sonuçlar sağlar hemen hemen aynı büyüme eğrileri, sonuçlandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi kuyu çeşitli yerlerinde biraz farklı okuma, ölçümlerin küresel arka plan kabul edileceği ver. Bakteriyel büyüme kantitatif değerlendirilmesi için bu arka plan düşünülmelidir. Örnekleri çeşitli plaka yerlerde deneysel çoğaltma için birden çok kuyu için aşı için küresel eğilimler hesap önerilir.
Hataları işleme ek olarak, değişiklik ve deneysel cihazları ve malzemeleri elde sorun giderme düşünülmelidir. Birkaç gelişmiş Mikroplaka Okuyucular ticari olarak kullanılabilir. Onlar ışık dalga boyu, Isıtma veya soğutma, modunu ayarlama yöntemi gibi özellikleri ve şekilde ve sallayarak frekans geniş bir varyasyon göstermektedir. Sıvı cilt değişiklikleri büyük ölçüde OD600 okuma etkiler çünkü bizim deneyime dayalı, buharlaşma yüksek üretilen iş çalışmalarda ele alınmalıdır. Buharlaşma Mikroplaka Okuyucular ve Mikroplaka Mimarlık tarafından kullanılan Isıtma yöntemi nedeniyle oluşur. Isıtma yaygın olarak uygulanan ticari Mikroplaka Okuyucular iki mod tarafından sıcak hava ısıtma ve sıcak bir tabak ile Isıtma. Bu protokol için kullanılan Mikroplaka okuyucu sıcak plaka Mikroplaka ortamda hızla esen sıcak hava kadar kuru çünkü buharlaşma azaltmak için bir Isıtma yöntemi olarak kullanılır. Mikroplaka da dikkatle seçilmesi gerekir. Farklı 96-şey Mikroplaka (ile kapakları) farklı düzeylerde buharlaşma neden. Açıklanan yöntemi buharlaşma azaltır derin bir kapalı kapak ile plaka biçimi kullanır.
Çalışma durağan faz analiz büyüme eğrisi gerektiriyorsa, Ayrıca, sonra bir şekilde ve Mikroplaka okuyucu sallayarak frekans dikkate alınmalıdır. Kültür sırasında sallayarak büyüyen hücreler aynı şekilde medyada askıya sağlar. Uygunsuz sallayarak veya düşük frekans etrafında iyi kenar veya daha düşük ya da yüksek--dan gerçek okuma yanlış okuma sonuçlanan bir yüksek yoğunluklu merkezde yığmak hücre neden olabilir. Sallayarak açıklanan yöntemi kullanır doğrusal, çift yönlü. 8 şeklinde sallayarak modu muhtemelen yeterli olsa da, biz sallayarak dairesel modu önermiyoruz.
Önemli Bu yöntem hücre kültür orta buharlaşma kısıtlamasıdır. Maksimal kültür hacmi küçük olduğu için Yani, 200 µL, kuluçka 37 ° C'de önemli buharlaşma neden olur. Bu nedenle, bu yöntem 48 h. daha uzun süre Ayrıca kültür için uygun değildir, optik algılama (OD600) bu yoğunluğu sınırlı olduğundan düşük yoğunluklu hücre kültürleri kaçınılmalıdır. Onlar daha uzun zaman gerektirir ve OD600algılama sınırın altına birlikte düşünüldüğünde, çok yavaş büyüyen hücreler/suşları veya çok düşük başlangıç konsantrasyonu kültürler tercih edilen, etkilenmez.
Bu yöntem için sistematik araştırmalar son derece avantajlı olan hassas, yüksek üretilen iş ölçümler verir. Temsil edici bir sonuç olarak, kolayca ve tekrarlanarak E. coli suşlarının çeşitli genom dizileri ve/veya orta ile bir ürün yelpazesine değerlendirmek için bu yöntem sağlar5. Tüplerde kültür ve el ile örnekleri farklı zaman noktalarda ölçüm geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, açıklanan daha az emek ve zaman yoğun yöntemidir. Gelecekteki uygulamaları ve geliştirme yöntemi otomasyon deneysel manipülasyon ve sayısal analiz dahil kabul edilir. Otomatik ölçüm ve robotik uygulama olan hücre büyümesini değerlendirilmesi ve bakteriyel ve memeli hücreleri kullanarak hayatta kalma testleri son derece verimli ve güvenilir bir yönteme yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kohei Tsuchiya CFU tahlil örnek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen maddi bir Grant-in-Aid tarafından bilimsel araştırma (C) No 26506003 için (BWY) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya desteklenmiştir.
Acknowledgments
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
