Summary
والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.
Abstract
وغالباً ما تعمل متحولة الزرد الاختراق غير كامل، يظهر فقط في بعض طفرات. تعمل المثيرة للاهتمام التي تظهر غير متسق يمكن أن يكون من الصعب على الدراسة، ويمكن أن يؤدي إلى التباس النتائج. بروتوكول الموصوفة هنا نموذج تربية مباشرة الزيادة والنقصان penetrance في طفرات مميتة الزرد الهيكل العظمى. لأنه لا يمكن بشكل انتقائي ولدت طفرات مميتة مباشرة، وتستخدم الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لاختبار ذرية. ويشمل هذا الأسلوب أيضا بروتوكولات الزرد التنميط كومبيتيتيفي اليل محددة بكر (الصناعية) والمصبوغة الزرد اليرقات الغضاريف والعظام. تطبيق استراتيجية تربية الموصوفة هنا يمكن أن تزيد في بينيترانسي النمط الظاهري الهيكل العظمى للاهتمام تمكين المزيد من النتائج استنساخه في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وباﻹضافة إلى ذلك، تناقص penetrance متحولة من خلال هذه الاستراتيجية الوراثي يمكن أن تكشف عن العمليات الإنمائية الأكثر حاسمة تتطلب وظيفة الجينات المتحولة. بينما على وجه التحديد يعتبر الهيكل العظمى هنا، فإننا نقترح أن هذه المنهجية ستكون مفيدة لجميع خطوط متحولة الزرد.
Introduction
الزرد نظام نموذج قوي لفهم التنمية الهيكل العظمى. مع سلالات متحولة الزرد، يمكن فك علماء البيولوجيا وظيفة الجينات أثناء سكيليتوجينيسيس. ومع ذلك، يمكن أن يقدم الزرد تعمل متحولة الهيكل العظمى مع متغير بينيترانسي1،2،3،4 التي يمكن أن تعيق تحليلات الخلقية والوراثية. والغرض من هذا الأسلوب ثلاثة إضعاف. أولاً، توليد خطوط متحولة الزرد التي تنتج دائماً تعمل شديدة تمكن الدراسات الإنمائية المتلقين للمعلومات مثل تسجيل الوقت الفاصل بين5 وزرع6. يمكن أن تكون شلت هذه الأنواع من الدراسات بمحاولة دراسة تعمل فقط المجاهرة بشكل غير متسق. ثانيا، يمكن إنقاص التهجين سلالات الزرد اختلاف الخلفية الوراثية، وبالتالي تعزيز الاتساق التجريبية وإمكانية تكرار نتائج. على سبيل المثال، أداء جميع في الموقع التهجين تحليلات على السلالة الفطرية بشكل انتقائي واحد يمكن الحد من تقلب التباس وتعزيز النتائج. ثالثا، سوف تكشف توليد سلالات شديدة وخفيفة المظهرية السلسلة بأكملها التي يمكن أن تنتج عن طفرة خاصة.
للوهلة الأولى، يبدو من المستحيل الوراثي من طفرات مميتة. كيف يمكن لسلالة واحدة ل penetrance عند الحيوانات التي هي سجل للتحديد ميتة؟ لحسن الحظ، أساليب لتربية انتقائية حسب الأسرة التحديد، التحديد ذرية الاختبار، قد أثبتت فعالية في تنمية الثروة الحيوانية البرامج للعديد من السنوات7،8. وتستخدم هذه البرامج أساسا للانتقاء الوراثي للصفات التي موجودة فقط في جنس واحد، مثل إنتاج الحليب في الأبقار أو إنتاج البيض في الدجاج. الذكور من هذه الأنواع لا يمكن أن يكون سجل مباشرة، ولكن سجل ذرياتهم وثم يتم تعيين قيمة للآباء والأمهات. الاقتراض من هذه الاستراتيجية، يتضمن البروتوكول المعروضة هنا النقاط الثابتة والملون المسخ نسل من زوج من الزرد التي متخالف لجينة متحولة للفائدة. يتم تعيين بينيترانسي من النمط الظاهري في ذرية متحولة قاتلة متماثل للآباء والأمهات عند البت فيها الأفراد سوف تنتج الجيل التالي في السطر. أننا نجد أن هذا الأسلوب وسيلة فعالة لتحويل penetrance في الزرد طفرات الهيكل العظمى القاتلة1.
مماثلة لغيرها من الدراسات، يأخذ هذا البروتوكول الوراثي تحت النظر في معايير مثل حجم مخلب، بقاء النسل، والتطور الطبيعي للأجنة، ونسبة الجنس9. ومع ذلك، هذه العوامل جميعا نظرت في سياق خلفية متحولة بهدف تحويل penetrance متحولة. ولذلك، يمتد هذا البروتوكول السابق الوراثي نماذج بتوفير طريقة لتعزيز التحليلات متحولة التنموية، فضلا عن زيادة تجانس الخلفية.
يتطلب هذا البروتوكول التنميط واسعة النطاق، حيث أنه من المهم وضع بروتوكول الوراثي السريع، ويمكن الاعتماد عليها في وقت مبكر. هناك كثير من التنميط البروتوكولات المتوفرة10،11، ومع ذلك نجد الصناعية التنميط12،،من1314 أسرع وتكلفة أكثر كفاءة وأكثر موثوقية من أساليب استناداً إلى انشقاق إنزيم التقييد لتضخيم تسلسل10. ولذلك، نقوم بتضمين بروتوكول الصناعية في هذا العمل. بالإضافة إلى ذلك، نركز على الهيكل العظمى تعمل المسخ في هذا البروتوكول وتشمل إجراء السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر تلطيخ معدلة من البروتوكولات السابقة15.
الأسلوب الموصوفة هنا وضع استراتيجية واضحة لتحويل penetrance متحولة قاتلة إلى الأعلى أو إلى الأسفل. بينما يركز هذا البروتوكول على الهيكل العظمى تعمل متحولة، ونعتقد أنها ستكون استراتيجية مفيدة لتربية جميع خطوط الزرد المسخ. وفي الواقع، فائدة هذه الاستراتيجية تربية يحتمل يمتد إلى أبعد من الزرد. ونتنبأ بأنه يمكن تعديل هذا البروتوكول إزاحة penetrance في طائفة واسعة من الكائنات الحية. تحويل penetrance القاتلة عن طريق اختبار ذرية يمكن أن تساعد في دفع التقدم المحرز في أي الوراثة التنموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأنجزت جميع التجارب المبينة في هذا البروتوكول وفقا والامتثال من جامعة كولورادو وجامعة "ولاية أوريغون رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك)-
1-إعداد "الأوراق المالية غير محددة ابتداء من"
- تحديد الناقلين متخالف من اليل طافرة من اهتمام زعنفة مقطع 11 والتنميط بمخزون حيوانات كامل-الأخوة بأسلوب الاختيار، مثل الصناعية 12 ، ، من 13 14. وأجرى هذا البروتوكول مع سلالة mef2ca b1086 الزرد.
- التنميط الصناعية
ملاحظة: تم تصميم الإشعال اليل محددة للصناعية بالشركة التي توفر والكواشف (انظر الجدول للمواد). للحصول على تركيز صبغ (روكس) 6-الكربوكسيل-س-والرودامين المناسبة لجهاز PCR الوقت الحقيقي معين بزيارة موقع الشركة.- مكان الأنسجة ذيل الزرد في 50 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (10 ملم تريس (pH 8.3)، 50 مم بوكل، مجكل 1.5 مم 2، 0.3% الفاعل غير الأيونية، 0.3% أوكتيلفينيل-البولي إيثيلين جليكول). إضافة 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل ك بروتيناز الواحدة وكذلك لوحة بكر 96-جيدا وهضم في cycler حرارية في 55 درجة مئوية ح 2-5 تليها خطوة المنظمة 94 درجة مئوية 20 دقيقة. بردت المنتج تحلل بعد الهضم.
ملاحظة: يمكن استخدام منتجات تحلل بنجاح لعدة أشهر بعد الإعداد. عندما تم تفكيك النسيج باستخدام 50 مم هيدروكسيد الصوديوم، وردود الفعل الصناعية لم تنجح. وتوحي هذه النتائج أن طريقة هيدروكسيد الصوديوم المجينية الحمض النووي إعداد غير متوافق مع الصناعية-
قياس - في الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. تمييع قالب الحمض النووي الجينوم باستخدام البيولوجيا الجزيئية الصف المياه حيث أن كل رد يحتوي على ما يقرب من 20-30 نانوغرام.
ملاحظة: تحديد حجم العينات 4 أو 5، وتجمع لهم، ثم إعداد تخفيف لجميع العينات على أساس المتوسط. عند استخدام هذا البروتوكول للأنسجة ذيل الكبار، كثيرا ما يكفي إضعاف 1: 100. التحديد الكمي الدقيق لتركيز الحمض النووي ليس مطلوباً- - الإضافية 0.14 ميكروليتر من التمهيدي الصناعية مزيج و 5 ميليلتر من الأصول الرأسمالية الصناعية مزيج كل عينة على الجليد إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة ومزيج جيد من قبل سينتريفوجينج بإيجاز لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: الصناعية الرئيسية مزيج الحرارة والضوء حساسة، والاحتفاظ بالأوراق المالية على الجليد وتجنب الضوء المباشر- - بيبيت 5 ميليلتر من التمهيدي/ماجستير مزيج الحل في آبار صفيحة بكر البصري 96-كذلك مناسبة للجهاز PCR الوقت الحقيقي تستخدم.
- بيبيت 5 ميليلتر من المخفف (حوالي 5-7 نانوغرام/ميليلتر) عينات الحمض النووي القالب إلى كل جيدا ونضح مع ماصة لخلط-
- إضافة 5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لآبار 3 لتكون بمثابة قالب لا يتحكم (المجلس الوطني الانتقالي) وإضافة 5 ميليلتر المخففة المؤكدة متماثل البرية نوع، قالب الحمض النووي متحولة متخالف ومتماثل لعناصر إيجابية-
- ضع ختم فيلم واضح بصريا على لوحة ضمان أن الفيلم الكامل مختومة في كل بئر-
- الطرد المركزي باختصار اللوحة في 600 x ز لجمع المحتويات في الجزء السفلي وإزالة فقاعات من المزيج.
ملاحظة: الاحتفاظ صفيحة الجليد ودرع من الضوء حتى على استعداد للمضي قدما- - استخدام برنامج ركوب الدراجات في الجدول 1 للقيام برد فعل الصناعية الرئيسية- عرض
- مؤامرة مبعثر الناتجة التي تنتجها الكمبيوتر تحليل. سوف تظهر رد فعل ناجح 4 مجموعات متميزة من النقاط على الأرض ( الشكل 3): ثلاثة عينة التجمعات المقابلة للنمط الوراثي، وتجميع NTCs القرب من الأصل واحد. يجب فصل عناصر إيجابية مع تجميع عينة ملائمة.
- إذا لم يتعرف البرنامج الحاسوبي على الأرض قد يكون المجموعات كالمقابلة للأنماط الجينية المحددة، ركوب الدراجات مجموعات إضافية المطلوبة (الجدول 2). كرر البرنامج الإضافي حتى يتعرف الكمبيوتر التجمعات ضيق بالنمط الوراثي.
- تصدير نتائج التنميط إلى ملف جدول بيانات لسهولة الاستخدام والتحليل-
- مكان الأنسجة ذيل الزرد في 50 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (10 ملم تريس (pH 8.3)، 50 مم بوكل، مجكل 1.5 مم 2، 0.3% الفاعل غير الأيونية، 0.3% أوكتيلفينيل-البولي إيثيلين جليكول). إضافة 10 ميليلتر من 10 ملغ/مل ك بروتيناز الواحدة وكذلك لوحة بكر 96-جيدا وهضم في cycler حرارية في 55 درجة مئوية ح 2-5 تليها خطوة المنظمة 94 درجة مئوية 20 دقيقة. بردت المنتج تحلل بعد الهضم.
- بيت الحيوانات متخالف المحددة معا في نظام المياه الرئيسي.
2-"أول جولة من ذرية التهديف"
- بيرويس الصليب heterozygotes الأخوة
- بعد استرداد الحيوانات من قصاصة زعنفة، إعداد إينتيركروسيس العشوائية. استخدم الفواصل للتأكد من الأجنة متزامن 16-
- جمع الأجنة والحفاظ على أزواج الوالدين معزولة في تربية أقفاص.
- رصد الكبار معزولة بحيث يمكن فصل الأسماك العدوانية أو توفير الغطاء (الأسماك تمزيقه شبكات عمل جيد). يجب أن تكون تغذية الأسماك وتغير المياه الخاصة بهم في أعقاب IACUC المبادئ التوجيهية أثناء وجوده في المياه الساكنة.
- تربية الجنين
- المرحلة ورفع الأجنة الزرد لليرقات تحت الظروف القياسية 17-
- جمع الحيوانات البرية من نوع فينوتيبيكالي باستخدام ماصة زجاجية يوم 5 أو 6 عندما يتم تضخم المثانة السباحة في 75 في المائة مخلب. ضع المظهرية الأنواع البرية في الحضانة تسجيل الآباء التي حققت لهم.
ملاحظة: مع المسخ الآليلات المتنحية المميتة، وينطبق على العديد من طفرات الهيكل العظمى، التي تفشل طفرات متماثل بشكل أكياس السباحة 18 ، 19. ولذلك، يمكن بسهولة تمييز المظهرية البرية أنواع من أشقائهم متحولة استناداً إلى تضخم السباحة قرب.
- السيان الأزرق/الأليزارين "الأحمر" الغضاريف والعظام تلطيخ
- تخدير اليرقات عدم تضخيم بهم قربه السباحة 0.17 غرام/لتر تريكيني باستخدام-S في وسائل الإعلام الجنين. جمع الحيوانات إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب مع زجاج على نطاق تحمل بيبيت باستور. إضافة اليرقات لا يزيد عن 100 كل أنبوبة. إزالة الماء الجنين من كل أنبوبة
- وإصلاح الحيوانات في 1 مل بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x كل أنبوب.
تنبيه: منهاج العمل المائية القابلة للاحتراق وسوف يسبب تهيج العين والجلد خطيرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل القفازات وحماية العين، وغسل اليدين جيدا بعد استخدام. - روك ح 1؛ ويضعف التثبيت أطول تلطيخ العظام. فحص الأنابيب بانتظام خلال هذا وقد تصبح عالقة إلى الجانب جميع الخطوات هزاز اللاحقة لضمان لا اليرقات أو تجمعت في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إزالة مثبت من أنابيب استخدام ماصة زجاجية، أضف 1 مل من الإيثانول 50%، والصخور للحد الأدنى 10
- تحضير الطازجة تلطيخ الحل بإضافة 20 ميليلتر من 0.5% بريمكس "الأليزارين الأحمر" كل 1 مل السيان (0.04% السيان الأزرق/10 مم مجكل 2/الإيثانول 80%). إزالة 50% إيثانول، أضف 1 مل من تلطيخ الحل لكل أنبوب، والصخور بين عشية وضحاها. يمكن أن تبقى اليرقات في وصمة عار لمدة 5 أيام- إزالة الحل وصمة عار من الأنابيب
- وإضافة 1 مل من 80 ٪ الإيثانول/10 مم مجكل 2 الحل لكل أنبوبة. روك أنابيب لح 1 على الأقل؛ الشطف بين عشية وضحاها يمكن أن تنتج وصمة الأزرق السيان أكثر وضوحاً.
- إزالة 80 ٪ الإيثانول/10 مم مجكل 2 الحل من الأنابيب وإضافة 1 مل إيثانول 50%؛ والصخور للحد الأدنى 5
- إزالة الحل الإيثانول 50% من الأنابيب وإضافة 1 مل من الإيثانول 25% والصخور للحد الأدنى 5
- إزالة الحل الإيثانول 50% من الأنابيب وإضافة 1 مل طازج 3 ٪ ح 2 س 2 /0.5% كوه تبيض الحل. اترك فتح الأغطية واسمحوا الأنابيب الوقوف على حامل أنبوب الجزئي لحوالي 10 دقيقة أو حتى يمكن أن ينظر إليه تلون بني باهتة في الجزء العلوي من الحل-
ملاحظة: طبقة من شكل فقاعات على رأس الحل. تبيض سيؤدي إلى توقيت غير مطلوب في هذه الخطوة، كما أكثر حذراً في وصمة ضعف فقراء. - إزالة الحل تبيض وإضافة 1 مل من 25% glycerol/0.1% كوه؛ روك لمدة 10 دقائق إلى حاء – 1
- إزالة الحل كوه glycerol/0.1% 25% من الأنابيب، وإضافة 1 مل محلول 50% glycerol/0.1% كوه لكل أنبوبة، روك لمدة 10 دقائق بين عشية وضحاها. إزالة الحل كوه glycerol/0.1% 50% من الأنابيب
- وإضافة 50% glycerol/0.1% كوه الحل مرة أخرى لكل أنبوبة. التأرجح بين عشية وضحاها سوف تساعد على إزالة فقاعات الهواء التي يمكن أن تتراكم داخل اليرقات. مخزن الملون الاستعدادات الهيكل العظمى عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام.
- التهديف النمط الظاهري
- نقاط الملون ذرية متحولة بينيترانسي من النمط الظاهري المحدد. في نيكولز وآخرون كانت حققت طفرات 1 عن أي تواجد للعظام خارج الرحم.
ملاحظة: نظراً لأن الوالدين الزرد في المياه الساكنة ووصمة عار "الأليزارين الأحمر" يمكن أن تتلاشى مع مرور الوقت، من المهم أن نقاط هياكل عظمية في غضون أيام قليلة من الانتهاء من إعداد الهيكل العظمى- - بينيترانسي هو نسبة الوراثي الذي يحتوي النمط الظاهري. حساب بينيترانسي المئة بالصيغة التالية:
بينيترانسي % = (طفرات مع النمط الظاهري)/(إجمالي عدد من طفرات) × 100
- نقاط الملون ذرية متحولة بينيترانسي من النمط الظاهري المحدد. في نيكولز وآخرون كانت حققت طفرات 1 عن أي تواجد للعظام خارج الرحم.
3. اختيار الأسرة
بينيترانسي- اختر اثنين عالية وأسرتين penetrance منخفضة للجيل القادم. بالإضافة إلى بينيترانسي، من المهم النظر في خصوبة وحيوية عند اختيار الأسر التي للنشر؛ انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول هذا.
- يعطي كل زوج الأبوية معرفاً أسهم فرعية: الأسرة،.01.02، إلخ
- البيت أزواج الوالدين على النظام الأساسي مع الجنس المختلط عدة ' رفيق ' الأسماك. رفيق الأسماك يمكن أن يكون أي خط الزرد مع السمات المميزة الدائمة، واضحة، مثل تغيير الهيكل تصبغ أو fin.
ملاحظة: في حين تبقى العديد من الباحثين بنجاح فقط تربية أزواج في خزان، تعتبر نتائج إيجابية بالإسكان أزواج مع عدة رفيق الأسماك. هذه الخطوة اختيارية يسمح تربية أزواج من الحيوانات يجب أن يوضع في المدارس الكبرى واسترجاعها بسهولة حيث أنها يمكن أن تكون مرارا وتكرارا عبرت حسب الحاجة. يمكن عبروا أزواج الوالدين مرارا وتكرارا لتوليد الأسر الكبيرة كاملة-المشابهة؛ الانتظار قبل تكرار عبور زوج الأبوية نفس أسبوع واحد على الأقل. - إعدام عائلات اليرقات من الخطوة 2.2.2. التي اختيرت لا للجيل القادم-
- تسمية الدبابات المحتوية على اليرقات الأخوة البرية من نوع من الأسر المختارة مع بينيترانسي من أشقائهم متحولة ورفع إلى مرحلة البلوغ بشكل طبيعي-
- الجيل القادم سوف يكون الأسر كامل-الأخوة مالا يقل عن أربعة، اثنان للخط التصاعدي واثنان للخط النزولي.
- عندما تصل اليرقات إلى مرحلة النضج الجنسي، كرر البروتوكول بدءاً من خطوة واحدة مع الجيل الجديد-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول أسلوب تربية طويلة الأمد مفيدة لفهم الزرد طفرات الهيكل العظمى (الشكل 1). تربية انتقائية عن طريق اختبار ذرية ينبغي أن تسفر عن تحول في بينيترانسي عموما كل التنازلي والتصاعدي في بضعة أجيال (الشكل 2). في عملنا السابق، قاد جولتين من الوراثي penetrance متوسط الانخفاض من 17% إلى 3%1. وبالمثل، في خط تصاعدي، نحن تحول penetrance متوسط أعلى من 63% إلى 93% في ثلاثة أجيال. إذا بعد أربع جولات من الوراثي لم يستجب بينيترانسي إلى الأسفل أو إلى الأعلى، فمن الممكن أن النمط الظاهري الذي هو قيد سجل ليست حساسة لتربية انتقائية عن طريق اختبار ذرية.
في الصناعية ناجحة تنفيذ الإجراء، ضيق التجمعات العينات المطابقة للنمط الوراثي ينبغي أن تعترف بالبرنامج الحاسوبي، وينبغي أن يقع NTCs القرب من أصل المؤامرة بعد دورات كافية (الشكل 3). إذا لم يتم تجميع البيانات مؤامرة مبعثر الصناعية محكم أو يتم الكشف عن التلوث في المجلس الوطني الانتقالي واحد، لن يتمكن البرنامج من تحديد الأنماط الجينية. إذا اعترف الوراثي تجميع معظم العينات، ولكن هناك لا تزال بعض التي تتسم بالغموض، إهمال عينات غير محدد من مجموعة البيانات قد يسمح البرنامج للاعتراف بمجموعات التنميط. المكالمات نموذج غير محدد وتجميع الوراثي غامضة قد تنتج عن ما يلي: رد فعل الملوثة الخلائط التي سوف تتباين ليس تجميع قرب الأصل، قالب الإفراط المخفف الحمض النووي يسبب العينات لتحديد موقع القرب من الأصل، تحت المخفف قالب الحمض النووي ، أو عدم كفاية عدد دورات رد فعل. إعداد جديدة وتتباين في حالة الاشتباه في التلوث.
وصمة السيان الأزرق/الأليزارين "الأحمر" ناجحة قد ملون حيوي العناصر العظام والغضاريف (الشكل 4 أ) التي لا تتسم بالشفافية أو ضعاف (الشكل 4 باء). يجب أن تظهر حدود العناصر الغضروف هش، و chondrocytes الفردية سوف تكون ملحوظة. وصمة العظام "الأليزارين الأحمر" هو عادة أكثر صعب من البقع اثنين. العظم أوبيركلي على شكل مروحة (البروتوكول الاختياري) وعصا على شكل أشعة برانتشيوستيجال (br) مؤشرات جيدة لنجاح أيام 6 وظيفة التسميد (إدارة الشرطة الاتحادية) العظام وصمة (الشكل 4A, op, br). الخطوة تبيض ينبغي أن لا تتلاشى البقع في العظام والغضاريف بينما تماما إزالة أنسجة أخرى للون. وسيكون العيون لوناً بني حتى بعد نجاح تلطيخ وتطهير. وسوف الأزرق السيان أن يتركز جداً ليس من الواضح من الأنسجة الأخرى مما يجعل من المستحيل تحليل (الشكل 4). السيان الزرقاء من بائعين خلاف الموضحة في الجدول المواد التي يمكن أيضا أن تنتج البقع الغضروف الفقراء.
الشكل 1 . نظرة عامة التخطيطي للانتقاء الوراثي للهيكل العظمى بينيترانسي عن طريق اختبار ذرية. (أ) التركيب الوراثي أسرة كاملة-الأخوة من خط متحولة لتحديد شركات النقل متخالف. (ب) عبر بيرويس الأشقاء متخالف المحددة، وإبقاء الآباء معزولة حتى يمكن أن يكون سجل ذرية. (ج) وضع اليرقات فينوتيبيكالي البرية من نوع مع تضخم السباحة قربه في الحضانة لرفعه إلى سن الرشد، وإصلاح اليرقات المسخ دون قربه السباحة تضخم الغضاريف والعظام تلطيخ. (د) نقاط كل مخلب من السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر الملون الحيوانات المسخ بينيترانسي. قم بتحديد الأسر التي سيتم تربيتها إلى الأعلى وإلى الأسفل ورفع الأنواع البرية المظهرية من كل أسرة إلى مرحلة البلوغ. (ﻫ) أزواج منزل الوالدين مع رفاقه حتى أن عبروا مرارا وتكرارا لتوليد الأسر الكبيرة كاملة-الأخوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مثال لتحويل الهيكل العظمى Penetrance متحولة عن طريق اختبار ذرية. تطبيق للمسخ mef2cab1086 الزرد الوراثي كما هو موضح في هذه المخطوطة. في هذه التجربة، اخترنا ل penetrance عالية أو منخفضة من العظام حمل خارج الرحم بين أوبيركلي ورأى برانتشيوستيجال في طفرات متماثل الفتاكة. تم تعيين penetrance العظام حمل خارج الرحم في ذرية متحولة زوج الوالدين الذين كان مرمزة بينيترانسي كما هو موضح. تم تعديل هذا الرقم من1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . شاشة طلقة من البرمجيات المستخدمة للتنميط الصناعية وتحليل النتائج.
في هذا الرد الصناعية الناجحة، شكلت تجمعات عينة ضيقة. النقاط الزرقاء هي المسخ متماثل والنقاط الخضراء متخالف، النقاط الحمراء البرية من نوع متماثل، والمربعات السوداء تجمعات NTCs. تم تعينه البرنامج الحاسوبي. تتباين تقع بالقرب أصل الأرض مما يدل على القليل إلى أي رد فعل خليط التلوث. أن الإشارة إلى عينات غير محددة لم يتم تعيينها حتى الآن النمط وراثي مع x. وهناك أية عينات غير محددة موجودة في هذا المدى المكتملة الناجحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الجيدة والسيئة والقبيحة السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر الاستعدادات الهيكل العظمى.
(أ) يتم عرض مثال من وصمة الغضاريف والعظام الطازجة ولطيف الملون وتطهيرها. ملاحظة عناصر متميزة الغضاريف وتصور بسهولة أوبيركلي أحمر (البروتوكول الاختياري) وعظام رأي (br) برانتشيوستيجال. (ب) وصمة عار الغضاريف ضعيفة مع تﻻشى "الأليزارين الأحمر" يظهر وصمة عار. هذه العينة جلس 4 درجات مئوية لعدة شهور أدى إلى تﻻشى الغضاريف، فضلا عن رأي أوبيركلي وبرانتشيوستيجال العظام التي يصعب التمييز. (ج) يرقة الإفراط الملون التي يستخدم فيها الكثير الأزرق السيان. شريط مقياس 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الوراثي، يكشف عن الخفايا وظيفة الجينات
التحول تعمل متحولة أن تكون أكثر أو أقل حدة بالانتقاء الوراثي طريقة مباشرة لاكتساب رؤى جديدة في وظيفة الجينات. بالمقارنة مع الأساليب القياسية لتربية غير محددة، يمكن أن تسفر عن البروتوكول المعروضة هنا فهم كثير أكثر اكتمالا لتعمل المسخ. على وجه التحديد، عن طريق توليد سلالات شديدة، اتساع نطاق كامل من تعمل متحولة قد تكشف عن، بما في ذلك بعض أن ينتبه مع الأرصدة غير محددة. وهكذا، يمكن اكتشاف أدوار إنمائية جديدة للجينات قيد الدراسة. وفي المقابل، توليد سلالات خفيفة يمكن أن تكشف عن الأدوار الأكثر أهمية للجينات للفائدة. تتخذ، على سبيل المثال، استمرت النمط الظاهري واحد فقط في طفرات خفيفة. هنا فمن المرجح أن تتطلب العملية التنموية التي ما زالت معطلة في سلالة خفيفة الأهم وظيفة الجينات. ومن ثم، يمكن أن يفهم أكمل سلسلة المظهرية الكاملة من طفرة معينة عن طريق الانتقاء الوراثي.
تجنب الاستيلاد الاكتئاب
ذرية الأفراد ذات الصلة تبين انخفاض البقاء على قيد الحياة والخصوبة في كثير من النظم الحيوانية والنباتية، بما في ذلك الزرد20. يعرف باسم الاكتئاب الاستيلاد، يفترض معظم النماذج التي زادت هوموزيجوسيتي في المكان مع الآليلات المتنحية الضارة أو الآليلات التي تعود بالفائدة كما heterozygotes تكمن وراء هذه الظاهرة21. وتكشف الدراسات مع الزرد اشتعلت البرية تردد المنخفض من الآليلات الضارة في السكان الطبيعية22. وعلاوة على ذلك، أزيلت سلالات المختبر مثل AB المزيد من الطفرات المتنحية المميتة23. وهكذا، يبدو أن تربية متأنية مما قد يسمح بزواج إلى أجل غير مسمى لخطوط الزرد المحدد. وفي الواقع، كشف تقرير الأخيرة يمكن الحفاظ على ذلك الزرد بزواج الأخوة كامل لأجيال على الأقل 169.
ويؤكد هذا البروتوكول بضع خطوات بسيطة ولكنها حاسمة لضمان استمرار خطوط الزرد الفطرية إنجاب ما يكفي يكون مفيداً للدراسات الإنمائية. الجانب الأكثر أهمية لهذه الاستراتيجية الوراثي هو عملية الاختيار نفسها. أولاً، وضع الحيوانات يجب بعناية رصد حيث أن الأسر بعيوب الإنمائية أو شذوذ، غير مرتبط بالطفرة للفائدة، يمكن تحديد صارم ضد. ينبغي النظر في حجم الثاني، مخلب، كما يتطلب الوراثي الأسر الكبيرة. بالإضافة إلى تحديد أزواج التي تسفر عن براثن الكبيرة، والأسر الكبيرة يمكن أن تتولد عن طريق الصلبان تكرار لنفس زوج الأبوية. حفظ أزواج الوالدين في خزانات مع العديد من المرافق الأخرى الأسماك، الذي يتم بسهولة تمييز من زوج تربية، مثل التصبغ أو طفرات زعنفة، يسمح للإسكان طويل الأجل لتربية أزواج في مجموعات كونسبيسيفيك كبيرة حين يكون السماح لهم بما زالت بسهولة حددت واستردادها. وتشجع هذه الممارسة بيئة اجتماعية صحية فيها بحرية شوال مع غيرها الزرد24زوج الأبوية. بعد الباحث يمكن بسهولة استرداد زوج الوالدين حيث أنه يمكن عبروا مرارا وتكرارا، تمكين جيل أسر كاملة-الأخوة كبيرة جداً.
اختيار النمط الظاهري قابل للتحديد
ويشمل هذا البروتوكول قدرا كبيرا من التهديف النمط الظاهري. وهكذا، قيد واحد هو أن التحديد يجب أن تطبق على النمط الظاهري أنه من السهل تصور ونقاط سريعة. من المهم أيضا أن تقرر ما هي الحيوانات المرحلة سوف تكون ثابتة والملون للتهديف. تعمل العظام، من المفيد أن تنتظر حتى 6 إدارة الشرطة الاتحادية لأن العظام هي أكثر نمواً25 وسوف تكون أكثر سهولة وسجل. الغضاريف الزخرفة تعمل متحولة، 4 إدارة الشرطة الاتحادية غالباً مناسبة للنمط الظاهري سجل26،27. في تحديد متى يمكنك إصلاح الحيوانات، من المهم النظر في إذا كان الجين لمصلحة أدوار بليوتروبيك المؤدية إلى تعمل متحولة التنموية في الأنسجة الأخرى، مما يؤدي إلى التباس العيوب الثانوية. على سبيل المثال، مع طفرات الهيكل العظمى التي تعرض أيضا ذمة القلب من المهم إصلاح الساعة 4 إدارة الشرطة الاتحادية قبل العيوب الثانوية مثل تأخير عامة في تشوندروجينيسيس البيان26.
للبساطة، اخترنا ثنائي سجل النظام مع التركيز على بينيترانسي لأعمالنا الوراثي. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تعمل متحولة التعبيرية متغير. في المستقبل دراسات، سيكون من المثير للاهتمام أن اختبار إذا، مثل بينيترانسي، التعبيرية حساس للانتقاء الوراثي. هذا هو، يمكن تغيير تواتر الأشكال المحددة العظام حمل خارج الرحم عن طريق الانتقاء الوراثي؟
ويصف هذا البروتوكول الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لتحديد النسل وتطبيقه على الدراسات الجينية الإنمائية الزرد. تربية مباشرة الممارسات الموصوفة هنا ممكنة في أي مختبر، حتى في المنشآت الصغيرة. من خلال تربية انتقائية، واحدة من أعظم مواطن القوة في النظام الزرد، يمكن تسخير علم الوراثة، وتتبعها لمعرفة المزيد عن وظيفة الجينات في طفرات المطورة حديثا، فضلا عن طفرات التي قد تم نشرها منذ عقود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن أشكر كيميل تشاك للتوجيه ووكر Macie لعملها في إتقان وصمة عار الهيكل العظمى، ووكر تشارلين ودوود جون للحصول على مساعدة في وضع هذه الاستراتيجية تربية أولمان بوني لمشورة مفيدة الزرد. وأيد هذا العمل DE024190 K99/R00 إلى جتن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
