Summary
Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.
Abstract
Mutant fenotypes van zebravis zijn vaak onvolledig penetrant, alleen in sommige mutanten manifesteren. Interessante fenotypen die inconsistent worden weergegeven kunnen moeilijk zijn om te studeren, en kunnen leiden tot verwarrende resultaten. Het protocol beschreven hier is een eenvoudige fokken paradigma te verhogen of doordringendheid in dodelijke zebrafish skelet mutanten. Omdat dodelijke mutanten kunnen niet selectief rechtstreeks worden gefokt, is de strategie van de klassieke selectief fokken van nakomelingen testen werkzaam. Deze methode omvat ook protocollen voor Kompetitive Allele specifieke PCR (Kawasaki Advanced Safety) genotypering zebravis en kleuring larvale zebrafish kraakbeen en bot. Toepassing van de strategie van de veehouderij die hier worden beschreven kunt verhogen de doordringendheid van een interessante skelet fenotype waardoor meer reproduceerbare resultaten in downstream toepassingen. Bovendien kan verminderen de mutant doordringendheid via deze selectieve fokken strategie onthullen de ontwikkelings processen waarvoor de functie van het gemuteerde gen meest cruciaal. Terwijl het skelet speciaal hier wordt geacht, stellen wij voor dat deze methode nuttig voor alle zebrafish mutant lijnen zijn zal.
Introduction
De zebravis is een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de ontwikkeling van het skelet. Met mutant zebrafish stammen, kunnen biologen ontcijferen genfunctie tijdens skeletogenesis. Skelet mutant fenotypes van zebravis kunnen echter presenteren met variabele doordringendheid1,2,3,4 die ontwikkelingsstoornissen en genetische analyses kan belemmeren. Het doel van deze methode is drievoudig. Eerst, krommen zebrafish mutant die consequent ernstige fenotypen produceren kunt downstream developmental studies zoals time-lapse opname5 en -transplantatie6. Dit soort studies kunnen worden verlamd door wilt studeren fenotypen die alleen inconsistent manifesteren. Ten tweede, inteelt zebrafish stammen kan verminderen variatie in genetische achtergrond, dus het bevorderen van experimentele consistentie en reproduceerbaarheid. Bijvoorbeeld, kunnen uitvoeren van alle in situ hybridisatie analyses op een selectief ingeteelde stam verminderen van storende variabiliteit en versterken van conclusies. Ten derde, genereren van ernstige en milde stammen zal onthullen de volledige fenotypische serie die uit een bepaalde mutatie voortvloeien kunnen.
Selectieve fokken van dodelijke mutanten lijkt op het eerste gezicht onmogelijk. Hoe kan één RAS voor doordringendheid, wanneer de dieren die worden gescoord voor selectie dood zijn? Gelukkig, methoden voor selectieve fokken door familie selectie, specifiek nakomelingen testen, gebleken doeltreffendheid in veeteelt programma's voor vele jaren7,8. Deze programma's worden voornamelijk gebruikt voor selectieve fokken voor trekken die slechts in één geslacht, zoals melkproductie in koeien of eiproductie kippen aanwezig zijn. De mannetjes van deze soorten kunnen niet rechtstreeks worden gescoord maar hun nageslacht worden gescoord, en vervolgens een waarde wordt toegewezen aan de ouders. Lenen van deze strategie, gaat het hier gepresenteerde protocol scoren de vaste en gebeitst gemuteerde nakomelingen van een paar van de zebravis die heterozygoot voor een gemuteerde gen van belang zijn. De doordringendheid van een fenotype in de homozygoot dodelijke gemuteerde nakomelingen wordt toegewezen aan de ouders bij de beslissing welke personen zal produceren de volgende generatie in de lijn. Wij vinden dat deze methode een effectief middel is van het verschuiven van doordringendheid in zebrafish dodelijke skelet mutanten1.
Gelijkaardig aan andere studies, neemt dit protocol selectief fokken onder overweging criteria zoals koppeling grootte, overleven van nakomelingen, normale ontwikkeling van embryo's en sex-ratio9. Deze factoren worden echter alle beschouwd als in het kader van een mutant achtergrond met de doelstelling van het verschuiven van de mutant doordringendheid. Daarom breidt dit protocol vorige selectief fokken paradigma's door het aanbieden van een methode om te versterken developmental mutant analyses, evenals het verhogen van de homogeniteit van de achtergrond.
Dit protocol vereist uitgebreide genotypering, dus is het belangrijk om een betrouwbare, snelle genotypering protocol op voorhand. Er zijn vele genotypering protocollen beschikbaar10,11, maar we vinden de Kawasaki Advanced Safety genotypering12,13,14 is sneller, meer kosten efficiënte en betrouwbaarder dan methoden op basis van restrictie-enzym splitsing van versterkte sequenties10. We nemen daarom een Kawasaki Advanced Safety-protocol in dit werk. Bovendien, we focus op skelet mutant fenotypen in dit protocol en omvatten een procedure voor Alcian blauw/Alizarine rood kleuring gemodificeerde van eerdere protocollen15.
De hier beschreven methode is een eenvoudige strategie voor het verschuiven van dodelijke mutant doordringendheid, naar boven of naar beneden. Terwijl dit protocol is gericht op het skelet mutant fenotypen, wij geloven dat het zal een nuttige strategie voor veehouderij van alle mutant zebrafish regels. In feite, overstijgt het nut van deze fokken strategie waarschijnlijk zebrafish. We voorspellen dat dit protocol kan worden gewijzigd om te verschuiven van doordringendheid in een brede waaier van organismen. Dodelijke doordringendheid verschuiven door het testen van de nakomelingen kan helpen duwen voorwaarts de voortgang van elk ontwikkelings geneticus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle experimenten beschreven in dit protocol werden voltooid in overeenstemming en naleving van de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Oregon institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC).
1. voorbereiding van de niet-geselecteerde beginnen voorraad
- identificeren heterozygoot dragers van de mutant allel van belang door fin bijknippen 11 en genotypering een voorraad van full-broer/zus dieren door een methode van keuze, zoals Kawasaki Advanced Safety 12 , 13 , 14. Dit protocol werd uitgevoerd met de stam van de zebravis mef2ca b1086. Kawasaki Advanced Safety genotypering
Opmerking: De specifieke primers allel voor Kawasaki Advanced Safety zijn ontworpen door het bedrijf dat de reagentia (Zie Tabel van materialen). De juiste 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) kleurstof concentratie voor de specifieke real-time PCR machine bezoek als u de website van de vennootschap.- Plaats de zebravis staart weefsel in 50 µL van lysis buffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0,3% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 0,3% Octylphenyl-polyethyleenglycol). 10 µL van 10 mg/mL proteïnase-K per putje van een 96-Wells PCR plaat en verteren in een thermische cycler bij 55 ° C gedurende 2-5 uur gevolgd door een 20 min 94 ° C inactivatie stap toevoegen. Het product van de lysis van de koelkast na vertering.
Opmerking: Lysis producten kunnen met succes worden gebruikt voor enkele maanden na bereiding. Wanneer het weefsel was lysed met 50 mM NaOH, waren de Kawasaki Advanced Safety reacties niet succesvol. Deze bevindingen stellen voor dat de methode van de NaOH van genomic DNA preparaat niet compatibel met Kawasaki Advanced Safety is. - Kwantificeren de genomic DNA met een spectrofotometer. Verdun de genomic DNA-sjabloon met behulp van moleculaire biologie rang water zodat elke reactie ongeveer 20-30 ng bevat.
Opmerking: Kwantificeren van 4 of 5 monsters, bundelen ze en maak verdunningen voor alle monsters op basis van het gemiddelde. Wanneer u dit protocol voor volwassen staart weefsel, is een 1:100-verdunning vaak voldoende. De precieze kwantificering van de concentratie van DNA is niet vereist. - Toevoegen 0.14 µL van de Kawasaki Advanced Safety primer mix en 5 µL van de Kawasaki Advanced Safety meester Meng per monster op ijs in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en meng goed voor kort centrifugeren voor het verzamelen van inhoud aan de onderkant van de buis.
Opmerking: Kawasaki Advanced Safety master mix is warmte en licht gevoelige, houden van de voorraad op ijs en vermijden van direct licht. - Pipetteer 5 µL van primer/master mix oplossing in de wells van een 96-Wells optische PCR plaat geschikt voor de real-time PCR-machine wordt gebruikt.
- Pipetteer 5 µL van verdund (ongeveer 5-7 ng/µL) DNA-monsters van de sjabloon in elk goed en gecombineerd met een pipet te mengen.
- Toevoegen 5 µL nuclease-vrij water aan 3 putjes om te dienen als neen-template besturingselementen (NTC) en voeg 5 µL van verdunde bevestigde homozygoot wild type, heterozygoot homozygoot mutant DNA sjabloon en voor de positieve controles.
- Plaatst u een optisch duidelijk film zegel op de plaat ervoor te zorgen dat de film volledig is verzegeld op elk putje.
- Kort centrifugeren de plaat duikt met 600 x g te verzamelen van de inhoud aan de onderkant en belletjes uit de mix verwijderen.
Opmerking: Houd de plaat op ijs en schild van licht tot klaar om verder te gaan. - De fietsen programma vermeld in tabel 1 te gebruiken voor het uitvoeren van de belangrijkste Kawasaki Advanced Safety reactie.
- De resulterende scatterplot geproduceerd door de computer van de analyse weergeven Een succesvolle reactie 4 afzonderlijke groepen van punten op het perceel ( Figuur 3) zal tonen: drie proeven groeperingen overeenkomen met genotype en een groepering van de NTC in de buurt van de oorsprong. De positieve controle moeten scheiden met de adequate steekproef grouping.
- Het computerprogramma herkent niet de plot groeperingen als corresponderend met specifieke genotypen, extra sets fietsen kunnen worden vereist (tabel 2). De extra programma herhalen totdat de computer strakke groeperingen door genotype herkent.
- De genotypering resultaten exporteren naar een spreadsheet-bestand voor eenvoudiger gebruik en analyse.
- Plaats de zebravis staart weefsel in 50 µL van lysis buffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0,3% niet-ionogene oppervlakteactieve stof, 0,3% Octylphenyl-polyethyleenglycol). 10 µL van 10 mg/mL proteïnase-K per putje van een 96-Wells PCR plaat en verteren in een thermische cycler bij 55 ° C gedurende 2-5 uur gevolgd door een 20 min 94 ° C inactivatie stap toevoegen. Het product van de lysis van de koelkast na vertering.
- Huis van de geïdentificeerde heterozygoot dieren samen op het hoofdsysteem water.
2. de eerste ronde van nakomelingen scoren
- paarsgewijs Kruis broer/zus heterozygoten
- nadat de dieren uit de fin clip herstellen, paarsgewijs intercrosses instellen. Scheidingslijnen gebruiken om ervoor te zorgen dat embryo's worden synchroon 16.
- Verzamelen van de embryo's en de ouderlijke paren geïsoleerd in het kweken van kooien houden.
- Geïsoleerde volwassenen controleren zodat agressieve vis kunnen worden gescheiden of van dekking voorzien (geraspte vis netten werk mooi). Vis moeten worden gevoed en hun water gewijzigd volgens IACUC richtlijnen terwijl in statische water.
- Embryo's fokken
- fase en verhogen de zebravis embryo's larven onder standaardomstandigheden 17.
- Verzamelen fenotypische wild-type dieren met behulp van een glazen pipet op dag 5 of 6 wanneer de zwemblaas is opgeblazen in 75% van de koppeling. Plaats van fenotypische wilde typen in de opname van welke ouders leverde hen kinderkamer.
Opmerking: Met mutant allelen die kunnen dodelijk, die voor veel skelet mutanten geldt, homozygoot mutanten niet formulier zwemmen blazen 18 , 19. Daarom fenotypische wilde soorten gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van hun mutant broers en zussen, gebaseerd op de opgeblazen zwemmen blazen.
- Alcian blauw/Alizarine Red kraakbeen en bot kleuring
- verdoving larven die doen niet blazen hun duik blazen met behulp van 0,17 g/L tricaïne-S in embryo media. Dieren in 1,5 mL microcentrifuge buizen met een wide-boring glazen pipet van Pasteur verzamelen. Toevoegen van niet meer dan 100 larven per buis.
- Verwijderen van embryo water uit elke buis en lossen van dieren in 1 mL 2% paraformaldehyde in 1 x PBS per buis.
Let op: Waterige PFA is brandbaar en zal leiden tot ernstig huid- en oogirritatie. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en oogbescherming, en handen grondig wassen na gebruik. - Rock voor 1 h; langere fixatie schaadt bot kleuring. De buizen controleren regelmatig tijdens dit en alle latere rockende stappen om ervoor te zorgen geen larven zijn vast aan de kant of in de onderkant van de buis samengeklonterd.
- Het fixeer van buizen met behulp van een precisiepipet glas verwijderen, voeg 1 mL 50% ethanol, en rock gedurende 10 minuten
- Voorbereiden verse kleurstofoplossing door het toevoegen van 20 µL van 0,5% Alizarine rood per 1 mL Alcian Meng (0,04% Alcian blauw/10 mM MgCl 2 / 80% ethanol). Verwijderen van 50% ethanol en voeg 1 mL kleurstofoplossing aan elke buis, en rock's nachts. Larven kunnen blijven in de vlek tot maximaal 5 dagen.
- Verwijderen van de vlek-oplossing van de buizen en voeg 1 mL van 80% ethanol/10 mM MgCl 2 oplossing aan elke buis. Rock van de buizen voor ten minste 1 uur; spoelen overnachting kan produceren een duidelijker Alcian blauw-vlek.
- Verwijderen van de 80% ethanol/10 mM MgCl 2 oplossing van de buizen, voeg 1 mL 50% ethanol en rock voor 5 min.
- Verwijderen van de 50% ethanol oplossing van de buizen en voeg 1 mL 25% ethanol en rock voor 5 min.
- Verwijder de oplossing van 50% ethanol uit de buisjes en voeg 1 mL vers bereide 3% H 2 O 2 /0.5% KOH bleken oplossing. Laat de caps open en laat de buisjes staan in in een rek van de micro-buis gedurende ongeveer 10 min of totdat een vage bruine verkleuring kan worden gezien in het bovenste deel van de oplossing.
Opmerking: Een laag van bubbels formulier op de top van de oplossing. Zorgvuldige timing is nodig bij deze stap zo voorbij bleken zal resulteren in een slechte dubbele vlek. - Verwijder de bleken oplossing en voeg 1 mL 25% glycerol/0.1% KOH; rock voor 10 min. tot 1 h.
- 25% glycerol/0.1% KOH-oplossing verwijderen uit de buizen, voeg 1 mL van 50% glycerol/0.1% KOH-oplossing aan elke buis, rock voor 10 min naar girale.
- 50% glycerol/0.1% KOH-oplossing verwijderen uit de buisjes en 50% glycerol/0.1% KOH-oplossing opnieuw toe te voegen aan elke buis. Rocking zal 's nachts helpen verwijderen van luchtbellen die binnen larven accumuleren kunnen. Winkel gekleurd skelet preparaten bij 4 ° C wanneer niet wordt gebruikt.
- Fenotype scoren
- Score gekleurd gemuteerde nakomelingen voor de doordringendheid van het geselecteerde fenotype. In Nichols et al. 1 mutanten werden gescoord voor een voorval van ectopische bot.
Opmerking: Omdat de ouders van de zebravis in statische water en de Alizarine rode vlek met de tijd verdwijnen kan, het is belangrijk te scoren skeletten binnen een paar dagen van de voltooiing van het skelet voorbereiding. - Doordringendheid is het aandeel van een genotype dat een fenotype heeft. Het percentage doordringendheid berekenen door de volgende formule:
% doordringendheid = (mutanten met fenotype) / (totale aantal mutanten) × 100
- Score gekleurd gemuteerde nakomelingen voor de doordringendheid van het geselecteerde fenotype. In Nichols et al. 1 mutanten werden gescoord voor een voorval van ectopische bot.
3. Familie selectie
- Kies twee hoge doordringendheid en twee lage doordringendheid gezinnen voor de volgende generatie. Naast doordringendheid is het belangrijk om te overwegen van vruchtbaarheid en kracht bij het kiezen van welke gezinnen te propageren; Zie discussie voor meer details hierover.
- Geven elk ouderlijke paar een sub voorraad id: familie.01,.02, etc.
- Huis ouderlijke paren op het hoofdsysteem met verschillende gemengde seks ' metgezel ' vis. Metgezel vis kunnen elke regel van de zebravis met permanente, duidelijk onderscheidende kenmerken, zoals de gewijzigde structuur van de pigmentatie of fin.
Opmerking: Terwijl veel onderzoekers met succes alleen fokken paren in een tank houden, gunstige resultaten worden gezien door de huisvesting van de paren met verschillende metgezel vis. Deze optionele stap kunt fokken van paren van dieren te worden bewaard in de grotere scholen en gemakkelijk ontvangen zodat zij herhaaldelijk overschreden worden kunnen zo nodig. Ouderlijke paren kunnen herhaaldelijk worden overschreden voor het genereren van grote full-broer/zus gezinnen; wacht ten minste één week voordat herhalen hetzelfde ouderlijke paar oversteken. - Ruiming van de larvale gezinnen uit stap 2.2.2. die niet werden geselecteerd voor de volgende generatie.
- Label de tanks met de wild-type sibling larven uit geselecteerde gezinnen waar de doordringendheid van hun mutant broers en zussen en verhogen naar volwassenheid als normale.
- De volgende generatie zal hebben ten minste vier volledige-broer/zus families, twee voor de opwaartse lijn en twee voor de neerwaartse lijn.
- Wanneer larven geslachtsrijp, herhaal het protocol begint bij stap één met de nieuwe generatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is een lange termijn veehouderij techniek handig voor begrip zebrafish skelet mutanten (Figuur 1). Selectieve fokken door het testen van de nakomelingen moet opleveren een verschuiving in de algehele doordringendheid zowel neerwaartse en opwaartse in een paar generaties (Figuur 2). In onze eerdere werk reed twee rondes van het selectieve fokken naar beneden de gemiddelde doordringendheid van 17% tot 3%1. Ook in onze opwaartse lijn verschoof we de gemiddelde doordringendheid omhoog van 63% tot 93% in drie generaties. Als na vier ronden van het selectieve fokken de doordringendheid niet naar beneden of naar boven reageert, is het mogelijk dat het fenotype dat wordt gescoord niet gevoelig voor selectieve fokken door het testen van de nakomelingen is.
In een succesvolle Kawasaki Advanced Safety procedure, strakke groeperingen van monsters overeenkomt met genotype dient te worden erkend door het computerprogramma en het NTC moeten worden gevestigd in de buurt van de oorsprong van het perceel, na voldoende cycli zijn geweest uitgevoerd (Figuur 3). Als de Kawasaki Advanced Safety scatter plot gegevens gegroepeerd is niet strak of verontreiniging in één NTC is gedetecteerd, zal het programma kunnen bepalen van genotypen. Als de meeste monsters worden herkend door genotype groeperen, maar er zijn nog enkele die zijn dubbelzinnig, kan onbepaald monsters van de gegevensset weglaten toestaan dat het programma om te herkennen van genotypering clusters. Onbepaald monster oproepen en dubbelzinnige genotype groepering kunnen voortvloeien uit het volgende: verontreinigde reactie mengsels waarin NTC niet groeperen in de buurt van de oorsprong, teveel verdunde sjabloon DNA monsters veroorzaken om te zoeken in de buurt van de oorsprong, onder verdunde sjabloon DNA , of onvoldoende aantal reactie cycli. Bereiden verse NTC als vermoed wordt.
Een succesvolle Alcian blauw/Alizarine rode vlek zal hebben bruisende gekleurd been en kraakbeen elementen (figuur 4A), die niet transparant zijn of zwakke (figuur 4B). De grenzen van het kraakbeen elementen moeten worden helder weergegeven, en individuele chondrocyten zullen waarneembaar. De vlek Alizarine rood been is meestal de meer pietluttige van de twee vlekken. De waaiervormige opercle (op) bot en stok vormige branchiostegal stralen (br) zijn goede indicatoren van een succesvolle 6 dagen post bevruchting (dpf) bot vlek (figuur 4A, op br). Het bleken stap moet de vlekken in de botten en het kraakbeen niet vervagen terwijl volledig wissen de andere weefsels van kleur. De ogen krijgen een bruine tint zelfs na succesvolle kleuring en wissen. Alcian blauw, die is te geconcentreerd zal niet duidelijk van andere weefsels analyse niet onmogelijk (figuur 4C) te maken. Alcian Blue van leveranciers dan beschreven in de materiaal tabel kunnen tevens arme kraakbeen vlekken produceren.
Figuur 1 . Schematisch overzicht van de selectieve fokken voor skelet doordringendheid door nakomelingen testen. (A) Genotype een full-broer/zus-familie vanaf een mutant lijn te identificeren heterozygoot vervoerders. (B) Pair-wise cross geïdentificeerde heterozygoot broers en zussen, en houden van ouders geïsoleerd totdat nakomelingen kan worden gescoord. (C) plaats fenotypische wild-achtige larven met opgeblazen zwemmen blazen in de kinderkamer worden verhoogd naar volwassenheid, en oplossen van mutant larven zonder opgeblazen zwemmen blazen voor kraakbeen en bot kleuring. (D) Score elke koppeling van Alcian blauw/Alizarine rood gekleurd mutant dieren voor doordringendheid. Selecteer welke families naar boven en naar beneden zal worden gefokt en verhogen de fenotypische wilde typen van elke familie naar volwassenheid. (E) huis ouderlijke paren met metgezellen zodat zij herhaaldelijk voor het genereren van grote full-broer/zus gezinnen kunnen worden overschreden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Voorbeeld van het skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen. Selectieve fokken werd zoals beschreven in dit manuscript toegepast op de zebravis mef2cab1086 mutant. Wij hebben in dit experiment gekozen voor hoge of lage doordringendheid van ectopische bot tussen de opercle en de branchiostegal-straal in dodelijke homozygoot mutanten. Doordringendheid ectopische bot in gemuteerde nakomelingen werd toegewezen aan de ouderlijke paar die was vergelijkende door doordringendheid, zoals wordt weergegeven. Dit cijfer werd vanaf1gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Schermafdruk van Software die wordt gebruikt voor Kawasaki Advanced Safety genotypering en resultaten Analyses.
In deze succesvolle Kawasaki Advanced Safety reactie, werden strakke monster groeperingen gevormd. Blue punten zijn homozygoot mutant, groene stippen zijn heterozygoot rode punten zijn homozygoot wild-type en zwarte vierkantjes zijn dat de NTC. groeperingen werden aangewezen door het computerprogramma. De NTC bevinden zich in de buurt van de oorsprong van de plot betekenende weinig tot geen reactie mengsel besmetting. Onbepaald monsters die nog niet zijn toegewezen een genotype zou worden aangegeven met een x. Er zijn geen onbepaald voorbeelden aanwezig in deze succesvolle voltooide run. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Goed, slecht en lelijk Alcian blauw/Alizarine rode skelet preparaten.
(A) een voorbeeld van een fris, mooi gekleurd en gewiste kraakbeen en bot vlek wordt weergegeven. Noteer de verschillende kraakbeen elementen en gemakkelijk gevisualiseerde rode opercle (op) en branchiostegal (br) ray botten. (B) een zwakke kraakbeen vlek met vervaagde Alizarine rode vlek wordt weergegeven. In dit voorbeeld zat bij 4 ° C voor vele maanden resulterend in verschoten kraakbeen, evenals opercle en branchiostegal ray botten die moeilijk zijn te onderscheiden. (C) een overdreven gebeitst larve waarin teveel Alcian Blue werd gebruikt. De bar van de schaal is 200 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selectieve fokken onthult de subtiliteit van de genfunctie
Verschuiven van de mutant fenotypen om meer of minder ernstig door selectief fokken is een eenvoudige manier om te krijgen van nieuwe inzichten in genfunctie. In vergelijking met standaardmethoden voor niet-geselecteerde fokken, kan het protocol hier gepresenteerd een veel vollediger begrip van mutant fenotypen opleveren. In het bijzonder door het genereren van spanningen die ernstig zijn, kan de volledige breedte van de mutant fenotypen worden onthuld, waaronder enkele die onwaarneembare met niet-geselecteerde bestanden waren. Dus kunnen nieuwe ontwikkelings rollen voor het gen bestudeerd worden ontdekt. Omgekeerd, genereren milde stammen kan onthullen de meest cruciale rol voor het gen van belang. Neem, bijvoorbeeld, slechts een enkele fenotype volhardt in milde mutanten. Hier is het waarschijnlijk dat het ontwikkelings proces dat meest kritisch verstoord in de milde stam blijft de functie van het gen vereist. Vandaar, de volledige fenotypische serie van een bepaalde mutatie vollediger kan worden begrepen door selectief fokken.
Het vermijden van inteelt depressie
De nakomelingen van verwante personen aantonen verminderde overleving en vruchtbaarheid vele dier- en plantensoorten systemen, met inbegrip van de zebravis20. Inteelt depressie genoemd, de meeste modellen poneren dat verhoogd homozygosity bij loci met recessieve allelen van schadelijke of allelen die voordelig zijn als heterozygoten ten grondslag liggen aan dit fenomeen21. Studies met wild gevangen zebravissen onthullen een lage frequentie van schadelijke allelen in natuurlijke populaties22. Bovendien zijn laboratorium stammen zoals AB verder gewist van recessief-letale mutaties23. Dus, lijkt het dat zorgvuldige veehouderij onbepaalde inteelt van geselecteerde zebrafish lijnen kan leiden. Inderdaad, een recent rapport geopenbaard dat zebrafish kan worden gehandhaafd door full-broer/zus inteelt voor ten minste 16 generaties9.
Dit protocol legt de nadruk op een paar simpele maar essentiële stappen om ervoor te zorgen dat ingeteelde zebrafish lijnen blijven produceren genoeg nakomelingen om bruikbaar voor ontwikkelingsstoornissen studies te zijn. Het belangrijkste aspect van deze strategie van selectieve fokken is het selectieproces zelf. Eerst, ontwikkeling van dieren moet zorgvuldig gecontroleerd worden zodat gezinnen met ontwikkelingsstoornissen gebreken of afwijkingen, ongekoppelde aan de mutatie van belang, strikt tegen kunnen worden geselecteerd. Tweede, koppeling grootte moet worden beschouwd, als selectief fokken grote gezinnen vereist. Naast het selecteren van paren die opbrengst grote klauwen, grote gezinnen kunnen worden gegenereerd door middel van herhaling kruisen van hetzelfde ouderlijke paar. Houden van ouderlijke paren in tanks met vele andere metgezel vis, die gemakkelijk van het fok-paar, zoals pigmentatie of fin mutanten onderscheiden zijn, voorziet in langdurige behuizing van het fokken van paren in grote conspecific groepen terwijl zodat ze kunnen nog steeds gemakkelijk worden geïdentificeerd en opgehaald. Deze praktijk bevordert een gezonde sociale omgeving waarin de ouderlijke paar vrij zijn om met andere zebrafish24shoal. Nog kunt de onderzoeker gemakkelijk ophalen het ouderlijke paar zodat zij herhaaldelijk kunnen worden overschreden waardoor de generatie van zeer grote full-broer/zus gezinnen.
Het kiezen van een selecteerbare fenotype
Dit protocol omvat een grote hoeveelheid fenotype scoren. Een beperking is dus dat de selectie worden toegepast op een fenotype die gemakkelijk moet te visualiseren en snel scoren. Het is ook belangrijk om te bepalen bij welke dieren stadium zal worden vastgesteld en gekleurd om te scoren. Voor bot fenotypen is het voordelig om te wachten tot 6 dpf omdat de beenderen zijn meer ontwikkeld25 en gemakkelijker zal worden gescoord. Voor kraakbeen patronen mutant fenotypen, is 4 dpf vaak geschikt voor fenotype26,27te scoren. In het bepalen wanneer dieren vast te stellen, is het belangrijk om te overwegen als het gen van belang heeft pleiotropic rollen leidt tot ontwikkelingsstoornissen mutant fenotypen in andere weefsels, wat kunnen leiden tot secundaire gebreken verstorende. Bijvoorbeeld met skelet mutanten die ook weergeven hart oedeem is het belangrijk om op te lossen op 4 dpf voordat secundaire gebreken zoals een algemene vertraging in chondrogenesis26 manifesteren.
Voor eenvoud, kozen we voor een binaire scoring systeem gericht op doordringendheid voor onze selectieve fokken. Mutant fenotypen hebben echter ook variabele expressiviteit. In de toekomst studies, het zal interessant zijn om te testen als, zoals doordringendheid, expressiviteit gevoelig voor selectieve fokken is. Dat wil zeggen, kan de frequentie van specifieke ectopische bot shapes worden gewijzigd door selectief fokken?
Dit protocol beschrijft de strategie van de klassieke selectief fokken van nakomelingen selectie en de toepassing ervan op de zebravis developmental genetische studies. De eenvoudige veehouderijpraktijken die hier beschreven zijn mogelijk in een laboratorium dat, zelfs in kleine installaties. Door selectief fokken, één van de grootste troeven van de zebravis systeem, kan hanteerbare genetica, worden aangewend om te leren over genfunctie in nieuw ontwikkelde mutanten evenals mutanten die decennialang hebben doorgegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Chuck Kimmel voor begeleiding, John Dowd voor hulp bij de ontwikkeling van deze strategie fokken, Macie Walker voor haar werk in het perfectioneren van de skeletal vlek, en Charline Walker en Bonnie Ullmann voor nuttig zebrafish advies. Dit werk werd gesteund door K99/R00 DE024190 te JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
