Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.
Abstract
Mutierte Zebrafisch Phänotypen sind oft unvollständig penetrant, nur in einigen Mutanten manifestiert. Interessante Phänotypen, die uneinheitlich erscheinen können schwierig sein, zu studieren und zu verwirrende Ergebnisse führen können. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfache Zucht Paradigma zu erhöhen und verringern Penetranz in tödliche Zebrafisch Skelett Mutanten. Da letale Mutanten können nicht direkt gezielt gezüchtet werden, ist die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Tests eingesetzt. Diese Methode beinhaltet auch Protokolle für Kompetitive Allel spezifische PCR (KASP) Genotypisierung Zebrafisch und Färbung Larven Zebrafisch Knorpel und Knochen. Anwendung der hier beschriebenen Strategie zur Tierhaltung kann die Penetranz der eine interessante skelettalen Phänotyp ermöglicht mehr reproduzierbare Ergebnisse in downstream-Anwendungen erhöhen. Darüber hinaus kann verringern die mutierten Penetranz durch diese selektive Zuchtstrategie Entwicklungsprozesse offenbaren, die am wichtigsten ist die Funktion des mutierten Gens erfordern. Während das Skelett speziell hier betrachtet wird, schlagen wir vor, dass diese Methode für alle mutierten Zebrafisch-Linien nützlich sein wird.
Introduction
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modell für das Verständnis der Skelettbildung. Mit mutierten Zebrafisch Stämmen können Biologen Genfunktion während Skeletogenese entschlüsseln. Jedoch können Skelett mutierten Zebrafisch Phänotypen mit variabler Penetranz1,2,3,4 präsentieren die Entwicklungs- und genetische Analysen behindern können. Der Zweck dieser Methode ist dreifach. Zunächst ermöglicht Zebrafisch mutierten Linien erzeugen immer wieder schwere Phänotypen erzeugen nachgelagerte Studien wie Zeitrafferaufnahme5 und Transplantation6. Diese Art von Studien können gelähmt werden, indem er versucht, die Phänotypen zu studieren, die nur uneinheitlich manifestieren. Zweitens kann die Inzucht Zebrafisch Stämme genetischen Hintergrund Variation, also Förderung experimenteller Konsistenz und Reproduzierbarkeit verringern. Zum Beispiel alle in Situ können Hybridisierung Analysen auf eine selektiv Inzucht Belastung reduzieren verwirrende Variabilität und Schlussfolgerungen zu stärken. Drittens: Generierung von schweren und leichten Belastungen die gesamte phänotypischen Serie zeigen, die durch eine bestimmte Mutation entstehen können.
Selektive Zucht von letale Mutanten scheint auf den ersten Blick unmöglich. Wie kann eine Rasse für Penetranz, wenn die Tiere, die für die Auswahl erzielte sind tot sind? Glücklicherweise haben Methoden für die selektive Zucht von Familie Auswahl, speziell Nachkommen testen, Wirksamkeit bei der Viehzucht Programme für viele Jahre7,8gezeigt. Diese Programme dienen hauptsächlich für die selektive Zucht für Züge, die nur in einem Geschlecht, wie Milchleistung bei Kühen oder Ei-Produktion bei Hennen vorhanden sind. Die Männchen dieser Arten können nicht direkt, erzielte aber ihre Nachkommen werden ausgewertet und ein Wert wird dann an die Eltern zugewiesen. In Anlehnung an diese Strategie, beinhaltet das Protokoll hier vorgestellten erzielte die festen und gefärbten mutierten Nachkommen aus einem Paar von Zebrafisch, die heterozygot für eine Mutation von Interesse sind. Die Penetranz des Phänotyps bei den homozygoten tödlichen mutierten Nachkommen erhält die Eltern bei der Entscheidung, welche Individuen wird die nächste Generation in der Zeile zu produzieren. Wir finden, dass diese Methode ein wirksames Mittel zur Verlagerung Penetranz im Zebrafisch letale Skelett Mutanten1.
Ähnlich wie bei anderen Studien, nimmt dieses selektive Zucht-Protokoll unter Berücksichtigung Kriterien wie normale Entwicklung der Embryonen und Geschlechterverhältnis9, Gelegegrösse, Überleben der Nachkommen. Jedoch sind alle diese Faktoren im Zusammenhang mit einem mutierten Hintergrund mit dem Ziel der Verschiebung der mutierten Penetranz berücksichtigt. Daher reicht dieses Protokoll vorherigen Auslesezüchtung Paradigmen bieten eine Methode, um Stärken Entwicklungsstörungen mutierte Analysen sowie Hintergrund Homogenität zu erhöhen.
Dieses Protokoll erfordert umfangreiche Genotypisierung, deshalb es wichtig ist auf eine zuverlässige und schnelle Genotypisierung-Protokoll zu entwickeln. Es gibt viele Genotypisierung Protokolle verfügbar10,11, jedoch finden wir die KASP Genotypisierung12,13,14 ist schneller, kostengünstiger, effizienter und zuverlässiger als Methoden basierend auf Restriktionsenzym Spaltung der amplifizierten Sequenzen10. Daher sind wir ein KASP Protokoll in dieser Arbeit. Darüber hinaus wir zielen auf Skelett mutierte Phänotypen in diesem Protokoll und ein Verfahren für Alcian blau/Alizarin rote Färbung veränderte aus früheren Protokollen15umfassen.
Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Strategie zum tödlichen mutierten Penetranz verschieben, nach oben oder unten. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf Skelett mutierte Phänotypen, glauben wir, dass es eine sinnvolle Strategie für Tierhaltung aller mutierten Zebrafisch Linien sein wird. In der Tat hinausgeht die Nützlichkeit dieser Zuchtstrategie wahrscheinlich Zebrafisch. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll geändert werden kann, um Penetranz in einer Vielzahl von Organismen zu verlagern. Verschiebung tödliche Penetranz um Nachkommen testen kann dazu beitragen, den Fortschritt der Entwicklungsstörungen Genetiker voranzutreiben.
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Protocol
alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in gemäß und in Übereinstimmung mit der University of Colorado und der University of Oregon institutionelle Animal Care and Use Ausschüsse (IACUC) abgeschlossen.
1. Vorbereitung der nicht ausgewählte Start bestand
- identifizieren heterozygote Träger des mutierten Allels des Interesses von Fin clip 11 und Genotypisierung einen Bestand von voll-Geschwister Tiere durch die Methode der Wahl, wie KASP 12 , 13 , 14. Dieses Protokoll wurde mit dem Zebrafisch-mef2ca b1086-Stamm durchgeführt.
- KASP Genotypisierung
Hinweis: Allel spezifische Primer für KASP sind von der Firma entworfen, die die Reagenzien bietet (siehe Tabelle der Materialien). Um zu erhalten die entsprechenden 6-Carboxylgruppen-X-Rhodamin (ROX) Farbstoff Konzentration für die Echtzeit-PCR-Maschine besuchen die Website des Unternehmens.- Ort der Zebrafisch Schweif Gewebe in 50 µL Lyse-Puffer (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3 % nichtionische Tenside, 0,3 % Octylphenyl-Polyethylenglykol). Fügen Sie 10 µL von 10 mg/mL Proteinase K pro Bohrloch einer 96-Well-PCR-Platte und verdauen in einem Thermocycler bei 55 ° C für 2 bis 5 h, gefolgt von einem 20 min. 94 ° C Inaktivierung Schritt hinzu. Kühlen Sie die Lyse Produkt nach Verdauung.
Hinweis: Lyse Produkte können erfolgreich für mehrere Monate nach der Zubereitung verwendet werden. Wenn Gewebe mit 50 mM NaOH lysiert wurde, blieben KASP Reaktionen erfolglos. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NaOH-Methode der genomischen DNA-Vorbereitung nicht kompatibel mit KASP. - Quantifizieren die genomische DNA mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die genomische DNA-Vorlage mit Molekularbiologie Grade Wasser, so dass jede Reaktion ca. 20-30 ng enthält.
Hinweis: Quantifizieren Sie 4 oder 5 Proben zu, bündeln sie, dann bereiten Sie Verdünnungen für alle Proben, die basierend auf dem Durchschnitt. Bei Verwendung dieses Protokolls für Erwachsene Schweif Gewebe ist eine 1: 100 Verdünnung oft ausreichend. Die genaue Quantifizierung der DNA-Konzentration ist nicht erforderlich. - Add 0,14 µL KASP Grundierung mischen und 5 µL des KASP Master pro Probe auf Eis in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen vor kurz Zentrifugieren, um Inhalt an der Unterseite des Rohres sammeln, mischen.
Hinweis: KASP master-Mix ist Wärme und Licht empfindlich, lagern auf dem Eis und vermeiden Sie direktes Licht. - Pipettieren 5 µL Grundierung/Master mix Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well optische PCR-Platte für die Echtzeit-PCR-Maschine verwendet wird.
- Pipettieren 5 µL verdünnt (ca. 5-7 ng/µL) DNA-Vorlage Proben in jedem gut und mit einer Pipette mischen Aspirieren.
- Hinzufügen 5 µL Nuklease-freies Wasser, 3 Brunnen dienen als keine-Vorlagensteuerelemente (NTC) und fügen Sie 5 µL verdünnter bestätigten homozygoter Wildtyp, heterozygot und homozygot mutierten DNA Schablone für Positivkontrollen.
- Silikondichtung eine optisch klare Folie über der Platte um sicherzustellen, dass der Film vollständig auf jedes gut versiegelt ist.
- Kurz Zentrifugieren die Platte 600 X g, der Inhalt an der Unterseite zu sammeln und um Luftblasen zu entfernen, aus dem Mix.
Hinweis: Bewahren Sie die Platte auf Eis und Schild aus Licht bis bereit zu gehen. - Verwenden Sie das Radfahren Programm in Tabelle 1 dargestellt, die Hauptreaktion KASP durchzuführen.
- Zeigen die resultierenden Streudiagramm von Analyse-Computer produziert. Eine erfolgreiche Reaktion zeigen 4 verschiedene Gruppierungen der Punkte auf dem Grundstück ( Abbildung 3): drei probieren Gruppierungen, Genotyp und eine Gruppierung von NTCs nahe dem Ursprung entspricht. Die Positivkontrollen sollten mit der entsprechenden Probe Gruppierung trennen.
- Wenn das Computerprogramm nicht die Handlung, die Gruppierungen erkennt als spezifische Genotypen, zusätzliche Radfahren Sets entspricht möglicherweise erforderlich (Tabelle 2). Das Zusatzprogramm zu wiederholen, bis der Computer enge Gruppierungen vom Genotyp erkennt.
- Die Genotypisierung Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationsdatei für eine einfachere Nutzung und Analyse exportieren.
- Ort der Zebrafisch Schweif Gewebe in 50 µL Lyse-Puffer (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3 % nichtionische Tenside, 0,3 % Octylphenyl-Polyethylenglykol). Fügen Sie 10 µL von 10 mg/mL Proteinase K pro Bohrloch einer 96-Well-PCR-Platte und verdauen in einem Thermocycler bei 55 ° C für 2 bis 5 h, gefolgt von einem 20 min. 94 ° C Inaktivierung Schritt hinzu. Kühlen Sie die Lyse Produkt nach Verdauung.
- Der identifizierten heterozygote Tiere zusammen auf dem Hauptsystem Wasser.
2. die erste Runde der Nachkommenschaft Scoring
- , nachdem die Tiere aus dem Fin-Clip erholen paarweise kreuzen Geschwister heterozygoten richten Sie paarweise Intercrosses. Teiler verwenden, um sicherzustellen, dass Embryonen sind synchrone 16.
- Sammeln die Embryonen und halten Sie die elterlichen Paare isoliert in der Zucht Käfige.
- Isolierte Erwachsene überwachen, so dass aggressive Fische können getrennt oder mit Abdeckung versehen (zerkleinerten Fisch Netze arbeiten schön). Fisch sollte gefüttert werden und ihr Wasser verändert nach IACUC Richtlinien in statische Wasser.
- Embryo Aufzucht
- Bühne und erhöhen die Zebrafisch-Embryonen, Larven unter Standardbedingungen 17.
- Sammeln phänotypisch Wildtyp Tiere mit einer Glaspipette am Tag 5 oder 6, wenn die Schwimmblase in 75 % der Kupplung aufgeblasen ist. Phänotypische Wildtypen zu platzieren, in den Kindergarten, die Aufnahme, welche Eltern ihnen ergab.
Hinweis: Mit mutierten Allele, die rezessiv tödlich, die für viele Skelett Mutanten gilt, nicht reinerbige Mutanten Form Schwimmblase 18 , 19. Daher phänotypischen Wildtypen von mutierten Geschwister basierend auf aufgeblasenen Schwimmblase leicht erkannt werden können.
- Alcian blau/Alizarin rot Knorpel und Knochen Färbung
- Larven, die ihre Schwimmblase mit 0,17 g/L Tricaine-Pumpen nicht auf zu betäuben-S im Embryo Medien. Sammeln Sie Tiere in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem weiten Bohrung Glas Pasteur pipettieren. Fügen Sie nicht mehr als 100 Larven pro Röhre.
- Embryo Wasser aus jeder Schlauch entfernen und Tiere in 1 mL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS pro Röhre beheben.
Vorsicht: Wässrige PFA ist brennbar und schwere Haut- und Augenreizungen verursachen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und waschen Sie gründlich die Hände nach Gebrauch. - Rock für 1 h; längere Fixierung beeinträchtigt Knochen zu beflecken. Überprüfen Sie die Schläuche regelmäßig während dieser und alle nachfolgenden rockende Schritte, keine Larven haben klebte an der Seite oder in den Boden des Röhrchens verklumpt.
- Das Fixiermittel aus Rohren mit einer Glaspipette zu entfernen, fügen Sie 1 mL 50 % Ethanol, und Rock für 10 min.
- Bereiten frische Färbelösung durch Zugabe von 20 µL 0,5 % Alizarin Red pro 1 mL Alcian premix (0,04 % Alcian blau/10 mM MgCl 2 / 80 % Ethanol). Entfernen Sie 50 % Ethanol zu, fügen Sie 1 mL Färbelösung zu jedem Rohr und Rock über Nacht. Larven können bis zu 5 Tage in den Fleck bleiben.
- Entfernen Sie die Fleck-Lösung aus den Rohren und jedes Rohr 1 mL 80 % Ethanol/10 mm MgCl 2 Lösung hinzufügen. Rocken Sie die Rohre für mindestens 1 h; über Nacht Spülen einen klarer Alcian blau Fleck produzieren kann.
- Entfernen Sie die 80 % Ethanol/10 mM MgCl 2 Lösung aus den Rohren und 1 mL 50 % igem Ethanol zugeben; rock für 5 min.
- Entfernen Sie die 50 %-Ethanol-Lösung aus den Rohren und 1 mL 25 % Ethanol und Rock für 5 min.
- Die 50 % ige Ethanol-Lösung aus den Rohren zu entfernen und fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 3 % H 2 O 2 /0.5% KOH Bleichbad. Lassen Sie die Kappen öffnen und lassen Sie die Rohre stehen in einem Micro-Tube Rack für ca. 10 Minuten oder bis eine schwache braune Färbung im oberen Teil der Lösung gesehen werden kann.
Hinweis: Eine Schicht Bläschen Form auf die Lösung. Sorgfältige Timing ist bei diesem Schritt über bleichen führt zu einer armen doppelte Fleck. - Bleichbad zu entfernen und fügen Sie 1 mL 25 % glycerol/0.1% KOH; rock für 10 min bis 1 h.
- 25 %-glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen, Hinzufügen jedes Rohr, Rock für 10 min über Nacht 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung 1 mL.
- 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen und wieder hinzufügen 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung für jedes Rohr. Rocken hilft über Nacht Luftblasen zu entfernen, die sich im Inneren Larven anreichern können. Store gebeizt Skelette Vorbereitungen bei 4 ° C, wenn nicht verwendet wird.
- Phänotyp erzielte
- Score gebeizt mutierte Nachkommen für die Penetranz des ausgewählten Phänotyps. In Nichols Et al. 1 durch Mutation entstehende Variationen für jedes Auftreten von ektopische Knochen erzielt wurden.
Hinweis: Da der Zebrafisch-Eltern in statische Wasser sind und der Alizarin roten Fleck kann mit der Zeit verblassen, es ist wichtig, Skelette innerhalb weniger Tage der Vollendung der skelettartigen Vorbereitung Punkten. - Penetranz ist der Anteil der ein Genotyp, der einen Phänotyp hat. Die prozentuale Penetranz nach folgender Formel zu berechnen:
% Penetranz = (Mutanten mit Phänotyp) / (Gesamtanzahl der Mutanten) × 100
- Score gebeizt mutierte Nachkommen für die Penetranz des ausgewählten Phänotyps. In Nichols Et al. 1 durch Mutation entstehende Variationen für jedes Auftreten von ektopische Knochen erzielt wurden.
3. Auswahl der
- Wählen Sie zwei hohe Penetranz und zwei geringe Penetranz Familien für die nächste Generation. Neben Penetranz ist es wichtig, Fruchtbarkeit und Vitalität zu berücksichtigen bei der Auswahl der Familien zu propagieren; Nähere Einzelheiten dazu finden Sie unter Diskussion.
- Geben jedes elterlichen paar eine Sub-Lager-ID: Familie.01,.02, etc.
- Haus elterlichen Paare auf dem Hauptsystem mit mehreren gemischten Sex ' Begleiter ' Fisch. Begleiter-Fische können jede Zebrafisch-Zeile mit permanenten, offensichtlich Unterscheidungsmerkmale, wie z. B. veränderte Pigmentierung oder Fin-Struktur werden.
Hinweis: Während viele Forscher erfolgreich nur Brutpaare in einem Tank halten, sind positive Ergebnisse durch die Unterbringung von Paaren mit mehrere Begleiter Fische gesehen. Diese optionale Schritt ermöglicht Brutpaare von Tieren in größeren Schulen gehalten werden und leicht abgerufen werden, so dass sie immer wieder überquert werden können, je nach Bedarf. Elterliche Paare können wiederholt überschritten werden, um voll-Geschwister Großfamilien zu generieren; warten Sie mindestens eine Woche vor der Wiederholung überqueren das gleiche elterliche paar. - Cull die Larven Familien aus Schritt 2.2.2. nicht für die nächste Generation ausgewählt wurden.
- Beschriften Sie die Behälter mit den Wildtyp Geschwister Larven aus ausgewählten Familien mit Penetranz von mutierten Geschwister und bis zum Erwachsenenalter als normal erhöhen.
- Die nächste Generation müssen mindestens vier volle Geschwister Familien, zwei für die Linie nach oben und nach unten gerichtete Linie.
- Bei Larven geschlechtsreif, wiederholen Sie das Protokoll beginnend bei Schritt eins mit der neuen Generation.
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Representative Results
Dieses Protokoll ist eine langfristige Haltung Technik nützlich für Verständnis Zebrafisch Skelett Mutanten (Abbildung 1). Selektiver Zucht von Nachkommen testen sollte eine Verschiebung im allgemeinen Penetranz nach unten und nach oben in ein paar Generationen (Abbildung 2) ergeben. In unserer bisherigen Arbeit fuhren zwei Runden der Zuchtauslese die durchschnittliche Penetranz nach unten von 17 % auf 3 %1. Ebenso im Sortiment nach oben wir die durchschnittliche Penetranz nach oben verschoben von 63 % auf 93 % in drei Generationen. Wenn nach vier Runden der Zuchtauslese die Penetranz nicht nach unten oder nach oben reagiert, ist es möglich, dass der Phänotyp, der erzielt wird, ist nicht empfindlich auf selektive Zucht von Nachkommen zu testen.
In einer erfolgreichen KASP durchgeführt Verfahren, enge Gruppierungen von Proben entspricht Genotyp sollte durch das Computerprogramm erkannt werden, und die NTCs sollte in der Nähe des Ursprungs des Grundstückes befinden, nachdem genügende Zyklen wurden (Abbildung 3). Wenn KASP Scatter Plot-Daten nicht eng gruppiert ist oder Verunreinigungen in einem NTC erkannt wird, wird das Programm Genotypen bestimmen möglich. Wenn die meisten Proben werden vom Genotyp Gruppierung erkannt, aber es noch einige gibt, die nicht eindeutig sind, können weglassen unbestimmte Proben aus dem Datensatz des Programms Genotypisierung Cluster zu erkennen. Unbestimmte Probe Anrufe und mehrdeutige Genotyp Gruppierung aus Folgendes ergeben: kontaminierte Reaktionsgemischen in dem Gruppieren NTCs nicht in der Nähe des Ursprungs, stark verdünnte Vorlage DNA Proben verursacht, in der Nähe des Ursprungs zu finden unter-verdünnt Vorlage DNA , oder unzureichende Zahl von Reaktionszyklen. Bereiten Sie frische NTCs, wenn Kontamination vermutet wird.
Ein erfolgreiche Alcian blau/Alizarin roten Fleck wird vibrierend befleckt Knochen und Knorpel Elemente (Abbildung 4A), die nicht transparent sind oder schwache (Abbildung 4 b). Die Grenzen der Knorpel Elemente sollte knackig erscheinen, und einzelne Chondrozyten werden erkennbar. Der Alizarin Red Knochen Fleck ist in der Regel mehr pingelig die zwei Flecken. Die fächerförmigen Opercle (Op) Knochen und Stick förmigen Branchiostegal Strahlen (Br) sind gute Indikatoren für eine erfolgreiche 6 Tage Post Düngung (Dpf) Knochen Fleck (Abbildung 4A, Op, Br). Die bleichende Schritt sollten die Flecken in den Knochen und Knorpel nicht verblassen, während die anderen Gewebe Farbe vollständig löschen. Die Augen haben einen braunen Farbton auch nach erfolgreichen Färbung und clearing. Alcian-blau, das ist zu hoch konzentriert wird nicht klar, aus anderen Geweben Analyse unmöglich (Abbildung 4). Alcian Blau von Anbietern als beschrieben in das Material Tabelle können auch schlechte Knorpel Flecken produzieren.
Abbildung 1 . Schematische Übersicht über selektive Zucht für Skelett Penetranz durch Nachkommen testen. (A) Genotyp eine voll-Geschwister Familie aus einer mutierten, heterozygote Träger zu identifizieren. Überqueren Sie (B) paarig identifizierten heterozygot Geschwister und Eltern Sie isoliert bis Nachkommen erzielt werden können. Legen Sie (C) phänotypisch Wildtyp-Larven mit überhöhten Schwimmblase in der Krippe bis zum Erwachsenenalter erhöht werden, und beheben mutierte Larven ohne überhöhten Schwimmblase für Knorpel und Knochen zu beflecken. (D) Score jede Kupplung Alcian blau/Alizarin Rot gebeizt mutierte Tieren für Penetranz. Wählen Sie, welche Familien werden gezüchtet werden, nach oben und unten und heben Sie die phänotypische Wildtypen von jeder Familie bis zum Erwachsenenalter. (E) elterliche Haus paart sich mit Begleiter, so dass sie immer wieder überquert werden können, um voll-Geschwister Großfamilien zu generieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Beispiel der Verschiebung Skelett mutierte Penetranz durch Nachkommen testen. Selektiver Zucht war wie beschrieben in diesem Manuskript auf mef2cab1086 mutierten Zebrafisch angewendet. In diesem Experiment wählten wir für hohe oder niedrige Penetranz ektopische Knochen zwischen den Opercle und den Branchiostegal Ray in tödliche reinerbigen Mutanten. Penetranz ektopische Knochen bei den mutierten Nachkommen wurde das elterliche paar zugeordnet, die durch die Penetranz farblich gekennzeichnet war, wie gezeigt. Diese Zahl wurde von1geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Screenshot von Software für KASP Genotypisierung und Ergebnisse Analysen verwendet.
In dieser erfolgreichen KASP Reaktion bildeten sich enge Probe Gruppierungen. Blaue Punkte sind homozygot Mutant, grüne Punkte sind heterozygot, rote Punkte sind homozygoter Wildtyp und schwarze Quadrate sind, dass die NTCs. Gruppierungen durch das Computerprogramm bezeichnet wurden. Die NTCs befinden sich in der Nähe des Ursprungs des Grundstücks bedeutet wenig bis gar keine Reaktion Mischung Kontamination. Unbestimmte Proben, die nicht noch einen Genotyp zugeordnet werden würde mit einem x angezeigt werden. Es gibt keine unbestimmten Proben anwesend in diesem erfolgreich abgeschlossenen Lauf. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Gut, schlecht und hässlich Alcian blau/Alizarin roten Skelett Vorbereitungen.
(A) ein Beispiel für einen Fleck frisch, schön gefärbten und geräumten Knorpel und Knochen wird angezeigt. Beachten Sie die unterschiedlichen Knorpel Elemente und leicht visualisierte rote Opercle (Op) und Branchiostegal Ray (Br) Knochen. (B) eine schwache Knorpel Fleck mit verblassten Alizarin roten Fleck angezeigt wird. In diesem Beispiel saß bei 4 ° C für viele Monate was verblasst Knorpel sowie Opercle und Branchiostegal Ray Knochen, die schwer zu unterscheiden sind. (C) eine stark gefärbten Larven in denen zuviel Alcian blau verwendet wurde. Der Maßstab ist 200 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Selektiver Zucht stellt Feinheiten der Genfunktion
Shifting mutierte Phänotypen um mehr oder weniger stark durch selektive Zucht ist eine einfache Möglichkeit, neue Einblicke in Genfunktion. Im Vergleich zu standard-Methoden der nicht ausgewählte Zucht kann das Protokoll hier vorgestellten ein viel umfassenderes Verständnis der mutierten Phänotypen ergeben. Insbesondere kann durch die Generierung von Stämmen, die schwere, die volle Bandbreite der mutierten Phänotypen aufgedeckt werden, darunter auch einige, die uneinsehbar mit nicht ausgewählte Aktien waren. So können neue entwicklungspolitische Rollen für das Gen unter Studie entdeckt. Umgekehrt kann die Generierung von milden Sorten die wichtigsten Rollen für das gen des Interesses offenbaren. Nehmen, zum Beispiel nur ein einziger Phänotyp weiterhin mild Mutanten. Hier ist es wahrscheinlich, dass der Entwicklungsprozess, der meisten kritisch gestörten in der milden Belastung bleibt die Funktion des Gens erfordert. Daher kann die volle phänotypischen Serie einer bestimmten Mutation durch selektive Zucht mehr in vollem Umfang verstanden werden.
Vermeidung von Inzuchtdepression
Die Nachkommen von verwandten Individuen zeigen reduzierte überleben und Fruchtbarkeit in viele Tier- und Pflanzenarten Systeme, einschließlich Zebrafisch20. Bekannt als Inzuchtdepression, die meisten Modelle postulieren, dass erhöhte Population an Loci mit schädliche rezessive Allele oder Allele, die nützlich sind, wie heterozygote dieses Phänomen21zugrunde liegen. Studien mit Wildfang Zebrafisch zeigen eine geringe Häufigkeit von schädlichen Allele in natürlichen Populationen22. Darüber hinaus wurden Laborbelastungen wie AB weitere tödliche rezessive Mutationen23gelöscht. So scheint es, dass sorgfältige Haltung unbestimmte Inzucht der ausgewählten Zebrafisch-Linien ermöglichen könnte. In der Tat zeigte ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass Zebrafisch durch voll-Geschwister Inzucht für mindestens 16 Generationen9aufrechterhalten werden kann.
Dieses Protokoll betont ein paar einfache, aber wichtige Schritte, um sicherzustellen, dass Inzucht Zebrafisch-Linien weiterhin genügend Nachwuchs für Studien zu produzieren. Der wichtigste Aspekt dieser selektive Zucht-Strategie ist das Auswahlverfahren selbst. Erstens muss entwickeln Tiere sorgfältig überwacht werden, so dass Familien mit Entwicklungsschäden oder Anomalien, die Verknüpfung zu der Mutation von Interesse, streng gegen ausgewählt werden können. Zweite, Kupplung Größe sollte betrachtet werden, wie selektiver Zucht große Familien erfordert. Neben der Auswahl von Paaren, die liefern große Kupplungen, kinderreiche Familien durch wiederholte Kreuze von den gleichen Eltern paar erzeugt werden können. Elterlichen Paare erlaubt in Becken mit vielen anderen Begleiter Fische, die leicht aus Zuchtpaar, z. B. Pigmentierung oder Fin Mutanten erkennen sind für langfristige Unterbringung der Brutpaare in Sicht Großgruppen, während so dass sie immer noch leicht sein identifiziert und abgerufen werden. Diese Praxis fördert ein gesundes soziales Umfeld, wo das elterliche paar mit anderen Zebrafisches24Untiefe können. Noch kann die Forscher einfach das elterliche paar abrufen so dass sie immer wieder überquert werden können ermöglicht die Generierung von voll-Geschwister sehr Großfamilien.
Wahl eines wählbaren Phänotyps
Dieses Protokoll beinhaltet eine Vielzahl von scoring-Phänotyp. Somit ist eine Einschränkung, dass die Auswahl muss auf einen Phänotyp angewendet werden, die einfach zu visualisieren und schnell Punkte. Es ist auch wichtig zu entscheiden, auf welche Stufe Tiere werden fixiert und gefärbt für das scoring. Für Knochen Phänotypen ist es vorteilhaft, bis 6 Dpf zu warten, weil die Knochen sind mehr entwickelt25 und leichter erzielt wird. Für Knorpel Musterung mutierte Phänotypen eignet sich 4 Dpf oft für Phänotyp erzielte26,27. Bei der Entscheidung, wann man Tiere zu beheben, ist es wichtig zu prüfen, ob das gen des Interesses hat pleiotrope Rollen führt zu Entwicklungsstörungen mutierten Phänotypen in anderen Geweben, die verwirrende sekundäre Defekte führen können. Zum Beispiel mit Skelett Mutanten angezeigt, die auch Herz-Ödem ist es wichtig, bei 4 Dpf zu beheben, bevor sekundäre Defekte wie eine allgemeine Verzögerung werden26manifestieren.
Der Einfachheit halber haben wir eine Binärdatei, die scoring-System mit Schwerpunkt auf Penetranz für unsere selektive Zucht. Mutierte Phänotypen können jedoch auch Variable Expressivität haben. In Zukunft Studien, es wird interessant sein zu testen wenn wie Penetranz, Expressivität für selektive Zucht empfindlich ist. Das heißt, kann die Häufigkeit von bestimmten ektopische Knochen Formen durch selektive Zucht werden verändert?
Dieses Protokoll beschreibt die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Auswahl und seine Anwendung auf Zebrafisch genetischen Studien. Die unkomplizierte Haltungspraktiken, die hier beschrieben sind in jedem Labor, auch in kleinen Anlagen möglich. Durch selektive Zucht, eine der größten Stärken des Systems der Zebrafisch, können gefügig Genetik genutzt werden, um erfahren Sie mehr über Genfunktion in neu entwickelten Mutanten sowie Mutanten, die seit Jahrzehnten propagiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten Chuck Kimmel für Führung, John Dowd um Hilfe bei der Entwicklung dieser Zuchtstrategie, Macie Walker für ihre Arbeit in den skelettartigen Fleck zu perfektionieren und Charline Walker und Bonnie Ullmann für hilfreiche Zebrafisch Beratung danken. Diese Arbeit wurde von K99/R00 DE024190, JTN unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
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