Summary
L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.
Abstract
Fenotipi mutanti di zebrafish sono spesso in modo incompleto con liquidi penetranti, solo che si manifesta in alcuni mutanti. Fenotipi interessanti che compaiono in modo incoerente possono essere difficili da studiare e possono portare a risultati di confondimento. Il protocollo descritto qui è un paradigma di allevamento semplice per aumentare e diminuire la penetranza nei mutanti scheletrica letale zebrafish. Perché mutanti letali non possono essere selettivamente allevati direttamente, la strategia di allevamento selettivo classico di progenie test è impiegata. Questo metodo include anche protocolli per Kompetitive Allele specifico PCR (KASP) genotipizzazione zebrafish e colorazione zebrafish larvale della cartilagine e dell'osso. Applicare la strategia di allevamento descritta qui può aumentare la penetranza di un fenotipo scheletrico interessante consentendo ulteriori risultati riproducibili in applicazioni a valle. Inoltre, diminuendo la penetranza mutante attraverso questa strategia di allevamento selettivo può rivelare i processi di sviluppo che richiedono più fondamentalmente la funzione del gene mutato. Mentre lo scheletro in particolare è considerato qui, proponiamo che questa metodologia sarà utile per tutte le linee mutanti di zebrafish.
Introduction
Zebrafish è un sistema potente modello per comprendere lo sviluppo scheletrico. Con ceppi mutanti di zebrafish, biologi possono decifrare la funzione del gene durante skeletogenesis. Tuttavia, zebrafish fenotipi mutanti scheletrico possono presentare con penetranza variabile1,2,3,4 che può ostacolare l'analisi evolutiva e genetiche. Lo scopo di questo metodo è triplice. In primo luogo, generando linee mutanti di zebrafish che costantemente producono fenotipi gravi consente studi evolutivi a valle come registrazione time-lapse trapianto e5 6. Questi tipi di studi possono essere paralizzati dal tentativo di studiare fenotipi che si manifestano solo in modo incoerente. In secondo luogo, l'inbreeding zebrafish ceppi può diminuire variazione background genetico, favorendo così la riproducibilità e consistenza sperimentale. Ad esempio, corso tutti in situ analisi di ibridazione su uno sforzo selettivamente inbred possono ridurre la variabilità confondenti e rafforzare le conclusioni. In terzo luogo, generando gravi e lievi ceppi rivelerà tutta la serie fenotipica che può derivare da una mutazione particolare.
A prima vista, l'allevamento selettivo di mutanti letali sembra impossibile. Come può una razza per penetranza quando gli animali che sono segnati per la selezione sono morti? Fortunatamente, metodi di allevamento selettivo di selezione della famiglia, in particolare progenie test, hanno dimostrato efficacia in allevamento programmi per molti anni7,8. Questi programmi sono utilizzati principalmente per l'allevamento selettivo per tratti che presenti solo in uno dei due sessi, come la produzione di latte delle vacche o produzione di uova nelle galline. I maschi di queste specie non possono essere segnati direttamente, ma loro progenie sono segnati e quindi viene assegnato un valore ai genitori. Prendendo in prestito da questa strategia, il protocollo presentato qui coinvolge segnando la prole mutante fissa e macchiata da una coppia di zebrafish che sono eterozigoti per un gene mutante di interesse. La penetranza di un fenotipo nella prole mutante letale omozigotico è assegnata ai genitori quando si decide quali individui produrrà la prossima generazione in linea. Troviamo che questo metodo è un efficace mezzo di spostamento penetranza in zebrafish mutanti scheletrica letale1.
Simile ad altri studi, questo protocollo di allevamento selettivo prende sotto criteri di considerazione come la nidiata, sopravvivenza della prole, normale sviluppo di embrioni e di rapporto del sesso9. Tuttavia, questi fattori sono considerati nel contesto di uno sfondo mutante con l'obiettivo di trasferire la penetranza mutante. Pertanto, il presente protocollo estende precedenti paradigmi di allevamento selettivo, offrendo un metodo per rafforzare analisi mutante inerente allo sviluppo, nonché di aumentare l'omogeneità di fondo.
Questo protocollo richiede vasta genotipizzazione, quindi è importante sviluppare un protocollo affidabile, rapido genotipizzazione in anticipo. Ci sono molti genotipizzazione protocolli disponibili10,11, tuttavia troviamo il KASP genotipizzazione12,13,14 è più veloce, costo più efficiente e più affidabile rispetto ai metodi basato sulla fenditura di enzima di restrizione di sequenze amplificate10. Di conseguenza, includiamo un protocollo KASP in questo lavoro. Inoltre, ci concentriamo sui fenotipi mutanti scheletrici in questo protocollo e includono una procedura per colorazione modificate da precedenti protocolli15Alcian blu/alizarina rossa.
Il metodo qui descritto è una strategia semplice per letale mutante penetranza di spostamento verso l'alto o verso il basso. Mentre questo protocollo si concentra sui fenotipi mutanti scheletrici, crediamo che sarà una strategia utile per allevamento di tutte le linee di zebrafish mutanti. Infatti, l'utilità di questa strategia di allevamento probabile si estende di là di zebrafish. Prevediamo che questo protocollo può essere modificato per spostare penetranza in una vasta gamma di organismi. Lo spostamento di penetranza letale progenie test può aiutare a spingere in avanti il progresso di qualsiasi genetista inerente allo sviluppo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tutti gli esperimenti descritti nel presente protocollo sono stati completati in conformità e rispetto dell'Università del Colorado e la University of Oregon istituzionale Animal Care e uso comitati (IACUC).
1. preparare il brodo non selezionati a partire
- identificare portatori eterozigoti dell'allele del mutante di interesse da pinna clip 11 e genotipizzazione uno stock di animali pieno-fratello germano di un metodo di scelta, come KASP 12 , 13 , 14. Questo protocollo è stato effettuato con il ceppo mef2ca b1086 zebrafish.
- Genotipizzazione KASP
Nota: Il primer specifico Allele per KASP è progettato dalla società che fornisce i reagenti (Vedi Tabella materiali). Per ottenere la concentrazione di colorante (ROX) 6-carbossi-X-rodamina corretta per la specifica macchina PCR in tempo reale visitare il sito Web aziendale.- Luogo il tessuto di coda di zebrafish in 50 µ l di tampone di lisi (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, tensioattivo non ionico di 0,3%, 0,3% Octylphenyl-polietilenglicole). Aggiungere 10 µ l di proteinasi K 10 mg/mL per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e digest in un termociclatore a 55 ° C per 2-5 h seguita da una fase di inattivazione di 94 ° C 20 min. Refrigerare il prodotto di lisi dopo digestione.
Nota: Lisi prodotti possono essere utilizzati con successo per diversi mesi dopo la preparazione. Quando il tessuto è stato lisato utilizzando 50 mM NaOH, le reazioni di KASP erano infruttuosi. Questi risultati suggeriscono che il metodo di NaOH di preparazione di DNA genomico non è compatibile con KASP. - Quantificare il DNA genomic usando uno spettrofotometro. Diluire il modello di DNA genomico utilizzando acqua di grado di biologia molecolare, in modo che ogni reazione contiene circa 20-30 ng.
Nota: Quantificare 4 o 5 campioni, li, quindi preparare diluizioni per tutti i campioni sulla base della media. Quando si utilizza questo protocollo per tessuto adulto coda, spesso è sufficiente una diluizione di 1: 100. Non è necessaria la quantificazione precisa della concentrazione di DNA. - Aggiungi 0,14 µ l di primer KASP mescolare e 5 µ l di master KASP mescolare per campione su ghiaccio in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare bene prima brevemente centrifugazione per raccogliere contenuti nella parte inferiore del tubo.
Nota: Mix master KASP è calore e luce sensibile, tenere scorte sul ghiaccio ed eviti la luce diretta. - Pipettare 5 µ l di primer/master mescolare la soluzione nei pozzetti di una piastra PCR 96 pozzetti ottico adatto per la macchina PCR in tempo reale in uso.
- Pipettare 5 µ l di diluito (circa 5-7 ng / µ l) esempi di modelli di DNA in ogni bene e aspirare con una pipetta per mescolare.
- Aggiungere 5 µ l di acqua priva di nucleasi di 3 pozzi per servire come modello di no controlli (NTC) e aggiungere 5 µ l di tipo selvaggio omozigotico confermato diluito, eterozigotico e omozigotico modello DNA mutante per controlli positivi.
- Posto un sigillo di film otticamente chiaro sopra il piatto, verificando che il film è completamente sigillato su ciascun pozzetto.
- Centrifugare brevemente la piastra a 600 x g per raccogliere il contenuto nella parte inferiore e per rimuovere le bolle dal mix.
Nota: Tenere la piastra su ghiaccio e scudo dalla luce fino al momento di procedere. - Utilizzare il programma ciclismo illustrato nella tabella 1 per eseguire la reazione principale di KASP.
- Mostra il grafico a dispersione risultante prodotto da computer analysis. Una reazione successo mostrerà 4 distinti raggruppamenti di punti sul terreno ( Figura 3): tre raggruppamenti corrisponde al genotipo e un raggruppamento di NTCs vicino all'origine di esempio. I controlli positivi dovrebbero separare con il raggruppamento di campione appropriato.
- Se il programma del computer non riconosce la trama possono essere raggruppamenti come corrispondenti ai genotipi specifici, ulteriori set di ciclismo necessaria (tabella 2). Ripetere il programma aggiuntivo fino a quando il computer riconosce raggruppamenti stretti dal genotipo.
- Esportare i risultati della genotipizzazione in un file di foglio di calcolo per analisi e uso più facile.
- Luogo il tessuto di coda di zebrafish in 50 µ l di tampone di lisi (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, tensioattivo non ionico di 0,3%, 0,3% Octylphenyl-polietilenglicole). Aggiungere 10 µ l di proteinasi K 10 mg/mL per pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti e digest in un termociclatore a 55 ° C per 2-5 h seguita da una fase di inattivazione di 94 ° C 20 min. Refrigerare il prodotto di lisi dopo digestione.
- Gli animali eterozigoti identificati insieme sul sistema acqua principale della casa.
2. the primo Round di progenie segnando
- Croce Pairwise heterozygotes di pari livello
- dopo gli animali recupero dalla clip pinna, impostare intercrosses pairwise. Utilizzare divisori affinché gli embrioni sono sincroni 16.
- Raccogliere gli embrioni e tenere le coppie parentali isolate in gabbie di allevamento.
- Monitor adulti isolati in modo che pesci aggressivi possono essere separati o fornito con coperchio (pesce tagliuzzato reti lavoro ben). Dovrebbero essere alimentati con pesce e loro acqua cambiata seguendo linee guida IACUC mentre in acqua statica.
- Embrione allevamento
- palco e sollevare gli embrioni di zebrafish alle larve sotto condizioni standard 17.
- Raccogliere fenotipico selvaggio-tipo animali usando una pipetta di vetro il giorno 5 o 6 quando la vescica natatoria è gonfiata nel 75% della frizione. Posto fenotipici tipi selvatici nel vivaio di registrazione di cui i genitori hanno reso loro.
Nota: Con alleli mutanti che sono recessivo letale, che è vero per molti mutanti scheletrici, mutanti omozigoti non forma vesciche natatorie 18 , 19. Pertanto, fenotipici tipi selvatici possono essere facilmente individuabile dal mutante di pari livello basati su gonfiato vesciche natatorie.
- Alcian blu/alizarina rosso della cartilagine e dell'osso colorazione
- anestetizzare le larve che non gonfiano loro vesciche natatorie utilizzando 0,17 g/L tricaina-S media dell'embrione. Raccogliere gli animali in provette per microcentrifuga da 1,5 mL con un bicchiere di wide-bore pipetta Pasteur. Aggiungere non più di 100 larve per tubo.
- Rimuovere l'embrione acqua da ciascuna provetta e difficoltà animali in 1 mL di 2% paraformaldeide in PBS 1X per provetta.
Attenzione: Acquosa PFA è infiammabile e causerà grave irritazione cutanea e oculare. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale come guanti e occhiali di protezione e lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso. - Rock per 1h; fissazione più altera la macchiatura dell'osso. Controllare i tubi regolarmente durante questo e tutti i passaggi successivi a dondolo affinché nessun larve hanno diventare bloccati al lato o raggruppati nella parte inferiore del tubo.
- Rimuovere il fissativo da tubi usando una pipetta di vetro, aggiungere 1 mL di etanolo al 50% e rock per 10 min.
- Preparare fresco macchiatura soluzione aggiungendo 20 µ l di 0,5% rosso alizarina per 1 mL di Alcian premix (0,04% Alcian blu/10mm MgCl 2 / 80% di etanolo). Eliminare l'etanolo di 50%, aggiungere 1 mL di soluzione per ogni tubo e roccia di colorazione durante la notte. Le larve possono rimanere nella macchia fino a 5 giorni.
- Rimuovere la soluzione di macchia dai tubi e aggiungere 1 mL di 80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione ad ogni provetta. Rock le provette per almeno 1 h; risciacquo pernottamento può produrre una più chiara macchia blu di Alcian.
- Rimuovere l'80% etanolo/10mm MgCl 2 soluzione dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 50%; rock per 5 min.
- Rimuovere la soluzione di etanolo 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di etanolo al 25% e rock per 5 min.
- Rimuovere la soluzione di etanolo al 50% dai tubi e aggiungere 1 mL di preparato fresco 3% H 2 O 2 /0.5% soluzione sbiancante di KOH. Lasciare il tappi aperto e lasciare che i tubi di stare in un rack di micro-tubo per circa 10 minuti o fino a quando una debole colorazione marrone può essere visto nella parte superiore della soluzione.
Nota: Uno strato di forma di bolle in cima la soluzione. Attenta temporizzazione è necessario a questo punto, come sopra lo sbiancamento si tradurrà in un povero macchia double. - Rimuovere la soluzione sbiancante e aggiungere 1 mL di 25% glycerol/0.1% KOH; rock per 10 min a 1 h.
- Rimuovere la soluzione di KOH glycerol/0.1% 25% dai tubi, aggiungere 1 mL di soluzione KOH glycerol/0.1% 50% in ogni provetta, roccia per 10 min a tutta la notte.
- Rimuovere la soluzione KOH glycerol/0.1% 50% dai tubi e nuovamente aggiungere 50% glycerol/0.1% soluzione di KOH in ogni provetta. A dondolo durante la notte vi aiuterà a rimuovere le bolle d'aria che può accumularsi all'interno di larve. Archivio macchiato scheletrici preparazioni a 4 ° C quando non in uso.
- Fenotipo segnando
- Punteggio macchiato prole mutante per la penetranza del fenotipo selezionato. In Nichols et al. 1 mutanti sono stati segnati per qualsiasi occorrenza dell'osso ectopico.
Nota: Poiché i genitori di zebrafish sono in acqua statica e la macchia di colore rosso di alizarina può scomparire col tempo, è importante segnare gli scheletri in pochi giorni di completare la preparazione scheletrica. - Penetranza è la proporzione di un genotipo che ha un fenotipo. Calcolare la percentuale penetranza dalla seguente formula:
% penetranza = (mutanti con fenotipo) / (numero totale di mutanti) × 100
- Punteggio macchiato prole mutante per la penetranza del fenotipo selezionato. In Nichols et al. 1 mutanti sono stati segnati per qualsiasi occorrenza dell'osso ectopico.
3. Selezione della famiglia
- Scegli due alta penetranza e due famiglie di penetranza bassa per la prossima generazione. Oltre a penetranza, è importante considerare la fecondità e vigore quando si sceglie quali famiglie di propagare; vedere la discussione per maggiori dettagli su questo.
- Dare ogni coppia genitoriale un identificatore stock sub: famiglia,01,,02, ecc
- Casa parentale coppie sul sistema principale con diversi sesso misto ' compagno ' pesce. Compagno pesce può essere qualsiasi linea di zebrafish con permanente, evidenti caratteristiche distintive, come struttura alterata pigmentazione o fin.
Nota: Mentre molti ricercatori mantenere con successo solo allevamento coppie in un serbatoio, i risultati favorevoli sono visti da alloggiamento coppie con parecchi pesci compagno. Questo passaggio facoltativo consente allevamento coppie di animali per essere tenuti nelle scuole più grandi e facilmente recuperate in modo da può essere attraversati più volte se necessario. Coppie dei genitori possono essere attraversate più volte per generare famiglie numerose pieno di pari livello; attendere almeno una settimana prima ripetizione attraversando la stessa coppia genitoriale. - Abbattere le famiglie larvale dal punto 2.2.2. che non sono stati selezionati per la prossima generazione.
- Etichettare i serbatoi che contengono le larve di pari livello di selvaggio-tipo da famiglie selezionate con la penetranza dai loro fratelli germani mutante e sollevare fino all'età adulta come normale.
- La prossima generazione avrà almeno quattro famiglie di pieno-sibling, due per la linea verso l'alto e due per la linea verso il basso.
- Quando le larve raggiungono la maturità sessuale, ripetere il protocollo partendo dal punto uno con la nuova generazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo è una tecnica di allevamento a lungo termine utile per mutanti di comprensione zebrafish scheletrico (Figura 1). Allevamento selettivo di progenie test dovrebbe produrre un cambiamento in generale penetranza sia verso il basso e verso l'alto in poche generazioni (Figura 2). Nel nostro lavoro precedente, due turni di allevamento selettivo ha guidato la penetranza media verso il basso dal 17% al 3%1. Allo stesso modo, nella nostra linea ascendente, abbiamo spostato la penetranza media verso l'alto dal 63% al 93% in tre generazioni. Se dopo quattro turni di allevamento selettivo la penetranza non risponde verso il basso o verso l'alto, è possibile che il fenotipo che è stato segnato non è sensibile all'allevamento selettivo dalla prova di progenie.
In un successo KASP procedura, stretto raggruppamenti di campioni corrispondenti al genotipo dovrebbero essere riconosciuti dal programma per computer, e il NTCs dovrebbe trovarsi vicino all'origine della trama dopo che sono stati sufficienti cicli effettuata (Figura 3). Se i dati di trama scatter KASP non vengono raggruppati strettamente o contaminazione in un NTC viene rilevato, il programma sarà Impossibile determinare genotipi. Se la maggior parte dei campioni sono riconosciuta dal genotipo di raggruppamento, ma ci sono ancora alcuni che sono ambigui, omettendo indeterminati campioni dal set di dati può consentire al programma di riconoscere i cluster di genotipizzazione. Campione indeterminato chiamate e raggruppamento ambiguo genotipo possono derivare da quanto segue: miscele di reazione contaminati in cui NTCs non verranno gruppo vicino all'origine, eccessivamente diluito modello DNA causando campioni per individuare vicino all'origine, sotto-diluito il DNA del modello , o insufficiente numero di cicli di reazione. Preparare NTCs fresco se si sospetta la contaminazione.
Una macchia di Alcian Blue/alizarina rosso successo sarà hanno vibrante colorate elementi dell'osso e della cartilagine (Figura 4A) che non sono trasparenti o deboli (Figura 4B). I confini degli elementi cartilagine dovrebbero apparire croccanti, e condrociti individuali sarà percepibili. La macchia di osso rosso alizarina è solitamente la più esigente delle due macchie. L'osso a forma di ventaglio opercle (op) e il bastone a forma di raggi branchiostegal (br) sono buoni indicatori di una macchia di osso di successo 6 giorni post fertilizzazione (dpf) (Figura 4A, op, br). Il passo d'imbianchimento dovrebbe non sbiadiscono le macchie nell'osso e cartilagine mentre compensazione completamente gli altri tessuti di colore. Gli occhi avrà una tonalità marrone anche dopo il successo di colorazione e di compensazione. Alcian blu che è troppo concentrata non verrà cancellata da altri tessuti facendo analisi Impossibile (Figura 4). Alcian blu da fornitori diversi da quello descritto nella tabella del materiale è in grado di produrre anche macchie di cartilagine poveri.
Figura 1 . Descrizione schematica di allevamento selettivo per scheletrica penetranza di progenie test. (A) genotipo una famiglia completa di pari livello da una linea mutante per identificare i portatori eterozigoti. (B) attraversare pairwise fratelli eterozigoti identificati e mantenere i genitori isolati fino a quando prole può essere segnato. (C) posto fenotipico selvaggio-tipo larve con vesciche natatorie gonfiati in vivaio per essere sollevato fino all'età adulta e difficoltà larve mutanti senza vesciche natatorie gonfiati per la macchiatura dell'osso e della cartilagine. (D) Punteggio ottenuto ogni frizione di Alcian blu/rosso alizarina macchiato animali mutanti per penetranza. Selezionare quali famiglie saranno allevarsi verso l'alto e verso il basso e sollevare i tipi di wild fenotipici da ogni famiglia fino all'età adulta. (E) casa parentale coppie con compagni così che essi possono essere attraversati ripetutamente per generare famiglie numerose pieno-sibling. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Esempio di spostamento scheletrico penetranza mutante dalla prova di progenie. Allevamento selettivo come descritto in questo manoscritto è stato applicato il mutante di mef2cab1086 di zebrafish. In questo esperimento, abbiamo selezionato per alta o bassa penetranza dell'osso ectopico tra il opercle e il raggio di branchiostegal nei mutanti omozigoti letale. Penetranza dell'osso ectopico nella prole mutante è stato assegnato alla coppia parentale che era color-coded di penetranza come mostrato. Questa figura è stata modificata da1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Screen Shot dal Software utilizzato per la genotipizzazione di KASP e analisi risultati.
In questa reazione KASP successo, raggruppamenti stretto campione sono stati formati. Punti blu sono omozigote mutante, punti verdi sono eterozigoti, i punti rossi sono omozigoti wild type e i quadrati neri sono che i raggruppamenti NTCs. sono stati indicati dal programma per computer. Il NTCs si trovano vicino all'origine della trama che significa poco o nessuna contaminazione di miscela di reazione. Indeterminato i campioni che non sono ancora assegnati un genotipo sarebbero indicati con una x. Non ci sono nessun indeterminato campioni presenti in questa riuscita esecuzione completata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Buono, cattivo e brutto Alcian blu/alizarina rossi scheletrici preparazioni.
(A) è riportato un esempio di una macchia fresca, ben macchiato e sgomberato della cartilagine e dell'osso. Nota l'elementi distinti della cartilagine e facilmente visualizzati opercle rosso (op) e le ossa branchiostegal ray (br). (B) una cartilagine debole macchia con rosso alizarina sbiadito macchia è mostrato. In questo esempio si è seduto a 4 ° C per molti mesi conseguente sbiadita della cartilagine così come opercle e branchiostegal ray ossa che sono difficili da distinguere. (C) un'over-macchiato della larva in cui è stato utilizzato troppo blu di Alcian. La barra della scala è di 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allevamento selettivo svela sottigliezze della funzione del Gene
Lo spostamento di fenotipi mutanti per essere più o meno gravi di allevamento selettivo è un modo semplice per acquisire nuove conoscenze in funzione del gene. Quando confrontato con i metodi standard di allevamento non selezionato, il protocollo qui presentato può produrre una comprensione più completa dei fenotipi mutanti. In particolare, tramite la generazione di ceppi che sono gravi, può essere rivelata l'intera gamma di fenotipi mutanti, tra cui alcuni che sono stati non osservabili con gli stock non selezionati. Così, si possono scoprire nuovi ruoli inerenti allo sviluppo per il gene in esame. Al contrario, generando ceppi mite può rivelare i ruoli più cruciali per il gene di interesse. Prendete, ad esempio, solo un singolo fenotipo persiste in lieve mutanti. Qui è probabile che il processo di sviluppo che rimane interrotto nel ceppo mite più criticamente richiede la funzione del gene. Quindi, la serie completa fenotipica di una data mutazione può essere più pienamente compreso attraverso l'allevamento selettivo.
Evitando la depressione da inincrocio
Prole di individui correlati dimostrare in molti sistemi animali e vegetali, tra cui zebrafish20ridotta sopravvivenza e fecondità. Conosciuto come depressione da inbreeding, maggior parte dei modelli ipotizzano che l'omozigosi a loci con alleli recessivi deleteri o alleli che sono utili come gli eterozigoti sono alla base di questo fenomeno21è aumentato. Gli studi con il danio zebrato pescato rivelano una bassa frequenza di alleli deleteri in popolazioni naturali22. Inoltre, ceppi di laboratorio come AB più ulteriormente sono stati liquidati di mutazioni letali recessive23. Così, sembra che quello Agricoltura attenta potrebbe consentire l'inbreeding indefinito di zebrafish selezionato linee. Infatti, un recente rapporto ha rivelato che zebrafish possa essere mantenuta dal pieno-sibling consanguineità per almeno 16 generazioni9.
Questo protocollo sottolinea alcuni passaggi semplici ma critici per garantire che le linee «inbred» zebrafish continuino a produrre abbastanza prole per essere utile per studi evolutivi. L'aspetto più importante di questa strategia di allevamento selettivo è il processo di selezione. In primo luogo, lo sviluppo di animali deve essere attentamente monitorato affinché le famiglie con difetti inerenti allo sviluppo o anomalie, non collegate alla mutazione di interesse, possono essere selezionate rigorosamente contro. In secondo luogo, frizione dimensioni dovrebbero essere considerate, come allevamento selettivo richiede grandi famiglie. Oltre alla selezione di coppie che producono grandi frizioni, famiglie numerose possono essere generate attraverso incroci ripetizione della stessa coppia genitoriale. Mantenere le coppie di genitori in vasche con molti altri compagno pesci, che sono facilmente individuabile dalla coppia di allevamento, come pigmentazione o pinna mutanti, permette per alloggiamento a lungo termine delle coppie in grandi gruppi di conspecifici di nidificanti, mentre permettendo loro di ancora essere facilmente identificato ed estratto. Questa pratica favorisce un ambiente sociale sano, dove la coppia genitoriale è libera di shoal con altri di zebrafish24. Ancora il ricercatore può facilmente recuperare la coppia genitoriale così che essi possono essere attraversati ripetutamente, consentendo la generazione di famiglie molto numerose pieno-sibling.
Scegliendo un fenotipo selezionabile
Questo protocollo comporta una grande quantità di fenotipo segnando. Quindi, una limitazione è che la selezione deve essere applicato a un fenotipo che è facile da visualizzare e Punteggio ottenuto rapidamente. Inoltre è importante decidere a quali animali fase saranno fisso e macchiati per il punteggio. Per i fenotipi dell'osso, è preferibile attendere dpf 6 perché le ossa sono più sviluppato25 e verranno segnati più facilmente. Per cartilagine patterning fenotipi mutanti, 4 dpf è spesso adatto per fenotipo segnando26,27. Nel decidere quando Difficoltà animali, è importante considerare se il gene di interesse ha ruoli pleiotropici che conduce ai fenotipi mutanti inerente allo sviluppo in altri tessuti, che possono provocare difetti secondari di confondimento. Ad esempio, con i mutanti scheletrici che visualizzare anche l'edema del cuore che è importante fissare al dpf 4 prima che manifestino difetti secondari come un ritardo generale in chondrogenesis26.
Per semplicità, abbiamo scelto un binario sistema concentrandosi sulla penetranza per il nostro allevamento selettivo di punteggio. Tuttavia, fenotipi mutanti possono anche avere espressività variabile. In futuro gli studi, sarà interessante verificare se, come penetranza, espressività è sensibile all'allevamento selettivo. Vale a dire la frequenza di forme specifiche dell'osso ectopico può essere modificata attraverso l'allevamento selettivo?
Questo protocollo descrive la strategia di allevamento selettivo classico della selezione di progenie e la sua applicazione a studi di genetica dello sviluppo di zebrafish. Le pratiche di allevamento semplice descritte qui sono possibili in qualsiasi laboratorio, anche nelle piccole strutture. Attraverso l'allevamento selettivo, uno dei maggiori punti di forza del sistema zebrafish, trattabile genetica, possono essere sfruttate per conoscere la funzione del gene in mutanti di nuova concezione come pure mutanti che sono state propagate per decenni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Chuck Kimmel per l'orientamento, John Dowd aiuto nello sviluppo di questa strategia di allevamento, Macie Walker per il suo lavoro nel perfezionare la macchia scheletrica e Charline Walker e Bonnie Ullmann per zebrafish utili consigli. Questo lavoro è stato supportato da K99/R00 DE024190 a JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
