Summary
Målet med denne protokollen er å endre penetrance av dødelige skjelettlidelser mutant fenotyper i sebrafisk ved selektiv avl. Dødelige mutanter kan dyrkes til voksen og bred seg, derfor denne protokollen beskriver en metode for sporing og velge penetrance gjennom flere generasjoner av avkom testing.
Abstract
Sebrafisk mutant fenotyper er ofte ufullstendig penetrant, bare manifestert i noen mutanter. Interessant fenotyper som inkonsekvent vises kan være vanskelig å studere, og kan føre til confounding resultater. Protokollen beskrevet her er en enkel avl paradigmet for å øke og redusere penetrance i dødelige sebrafisk skjelettlidelser mutanter. Fordi dødelige mutanter ikke kan være selektivt avlet direkte, brukes den klassiske selektive formering strategien avkom testing. Denne metoden inneholder også protokoller for Kompetitive allelet bestemt PCR (KASP) genotyperingteknologi sebrafisk og flekker larver sebrafisk brusk og bein. Bruke dyrehold strategi beskrevet her kan øke penetrance av en interessant skjelettlidelser fenotypen aktivere flere reproduserbar resultater i nedstrøms programmer. I tillegg kan reduserer det muterte penetrance gjennom denne selektiv formering strategi avsløre utviklingsprosesser som krever mest avgjørende funksjonen av muterte genet. Skjelettet er spesielt som her, foreslår vi at denne metodikken vil være nyttig for alle sebrafisk mutant linjer.
Introduction
Sebrafisk er en effektiv modell for å forstå utvikling av skjelettet. Med mutant sebrafisk stammer, kan biologer dechiffrere gen funksjon under skeletogenesis. Imidlertid kan sebrafisk skjelettlidelser mutant fenotyper presentere med variabel penetrance1,2,3,4 som kan hindre utviklingsmessige og genetiske analyser. Formålet med denne metoden er tredelt. Først kan generere sebrafisk mutant linjer som konsekvent produserer alvorlig fenotyper nedstrøms utviklingsmessige studier som tid-lapse innspillingen5 og transplantasjon6. Disse slags studier kan bli ødelagt av prøver å studere fenotyper som bare inkonsekvent. Andre kan inbreeding sebrafisk stammer redusere genetisk bakgrunn variasjon, dermed fremme eksperimentelle konsistens og reproduserbarhet. For eksempel kan alle i situ hybridisering analyser på en selektivt innavlet belastning redusere forvirrende variasjon og styrke konklusjoner. Tredje vil genererer alvorlig og milde stammer avdekke hele fenotypiske serien som kan følge av en bestemt mutasjon.
Ved første øyekast, virker selektiv formering dødelige mutanter umulig. Hvordan kan en rase for penetrance når dyrene som scoret for valg er døde? Heldigvis har metoder for selektiv formering av familien utvalg, spesielt avkom testing vist effektivitet i husdyr programmer for mange år7,8. Disse programmene brukes hovedsakelig for selektiv formering for egenskaper som finnes bare i ett kjønn, som melk produksjon i kyr eller eggproduksjon i hens. Menn av disse artene kan være scoret direkte, men deres avkom scoret og verdien tilordnes deretter til foreldrene. Låne fra denne strategien, omfatter protokollen presenteres her scoring faste og farget mutant avkom fra et par sebrafisk som er heterozygote for en muterte genet av interesse. Penetrance av en fenotypen i homozygous dødelig mutant avkom er tildelt foreldrene når du bestemmer hvilke personer vil produsere neste generasjon i linjen. Vi finner at denne metoden er et effektivt middel for skiftende penetrance i sebrafisk dødelige skjelettlidelser mutanter1.
I likhet med andre studier, denne selektiv formering protokollen tar under vurdering kriterier som clutch størrelse, overlevelse av avkom, normal utvikling av embryo og sex ratio9. Men er disse faktorene alle vurdert i sammenheng med en mutant bakgrunn med sikte på å skifte den muterte penetrance. Derfor varer denne protokollen tidligere selektiv formering paradigmer tilbyr en metode for å styrke developmental mutant analyser samt øke bakgrunnen homogenitet.
Denne protokollen krever omfattende genotyperingteknologi, så det er viktig å utvikle en pålitelig, rask genotyperingteknologi protokoll på forhånd. Det er mange genotyperingteknologi protokoller tilgjengelig10,11, men vi finner de KASP genotyperingteknologi12,13,14 koster raskere, mer effektiv og mer pålitelig enn metoder basert på begrensning enzym cleavage forsterket sekvenser10. Derfor inkludere vi en KASP protokoll i dette arbeidet. I tillegg vi fokusere på skjelettlidelser mutant fenotyper i denne protokollen og inkludere en prosedyre for Alcian blå/Alizarin rød flekk endret tidligere protokoller15.
Metoden beskrevet her er en enkel strategi for skiftende dødelige mutant penetrance oppover eller nedover. Mens denne protokollen fokuserer på skjelettlidelser mutant fenotyper, tror vi det vil være en nyttig strategi for dyrehold alle mutant sebrafisk linjer. Faktisk nytten av dette avl strategi sannsynlig strekker seg utover sebrafisk. Vi spår at denne protokollen kan endres for å skifte penetrance i et bredt spekter av organismer. Skiftende dødelige penetrance avkom tester kan hjelpe push fremover fremdriften for alle utviklingsmessige genetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble avsluttet i samsvar og overholdelse av University of Colorado og University of Oregon institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC).
1. forbereder umerkede starter aksjen
- identifiserer heterozygote bærere av det muterte allelet rundt av fin utklipp 11 og genotyperingteknologi et lager av full-sibling dyr av en metode for valg, som KASP 12 , 13 , 14. Denne protokollen ble utført med sebrafisk mef2ca b1086 belastningen.
- KASP genotyperingteknologi
Merk: Allelet bestemt primere for KASP er designet av selskapet som gir reagenser (se Tabell for materiale). For å få riktig 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) fargestoff konsentrasjonen for bestemte sanntid PCR maskinen webstedet selskapet.- Plass sebrafisk hale vevet i 50 µL av lyseringsbuffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1, 5 mM MgCl 2, 0,3% ikke-ioniske surfactant, 0,3% Octylphenyl-polyetylenglykol). Legge til 10 µL av 10 mg/mL proteinasen-K per brønn 96-brønns PCR plate og sammendrag i en termisk cycler ved 55 ° C i 2-5 h etterfulgt av en 20 min 94 ° C inaktivering trinn. Kjøleskap lysis produktet etter fordøyelsen.
Merk: Lysis produktene kan brukes med hell i flere måneder etter forberedelse. Når vev var lysed med 50 mM NaOH, var KASP reaksjonene mislykket. Disse funnene tyder på at metoden NaOH genomisk DNA forberedelser ikke er kompatibel med KASP. - Kvantifisere genomisk DNA bruker et spektrofotometer. Fortynne genomisk DNA malen molekylærbiologi klasse vann slik at hver reaksjon inneholder ca 20-30 ng.
Merk: Kvantifisere 4 eller 5, samle dem og deretter forberede fortynninger for alle utvalg basert på gjennomsnittlige. Når denne protokollen til voksen hale vev, er en 1: 100 fortynning ofte tilstrekkelig. Presis kvantifiseringen DNA konsentrasjon kreves ikke. - Legg til 0.14 µL av KASP primer bland og 5 µL KASP Master blande per prøve på is i en 1,5 mL microcentrifuge rør og bland godt før kort sentrifugering å samle innholdet på bunnen av røret.
Merk: KASP master blandingen er varme og lysfølsom, holde lager på is og unngå lys. - Pipetter 5 µL av primer/master blande løsning i brønnene av en 96-brønns optisk PCR plate egnet for sanntids PCR maskinen brukes.
- Pipetter 5 µL av fortynnet (ca 5-7 ng/µL) DNA mal-prøver i hvert godt og Sug opp med en pipette blande.
- Legge til 5 µL av nuclease-fritt vann 3 brønner som no-mal kontroller (NTC) og legge til 5 µL utvannet bekreftet homozygous wild type, heterozygote og homozygous mutant DNA mal for positiv kontroller.
- Plasserer en optisk klar film segl over platen sikrer at filmen er helt forseglet i hver brønn.
- Kort sentrifuge plate 600 x g å samle innholdet nederst og fjerne bobler fra blandingen.
Merk: Holde plate is og skjold fra lys helt klar til å fortsette. - Bruke sykling programmet vist i tabell 1 for å utføre viktigste KASP reaksjonen.
- Se den resulterende spredningsdiagram produsert av analyse datamaskinen. En vellykket reaksjon vil vise 4 forskjellige grupperinger av poeng på tomten ( Figur 3): tre prøve grupperinger tilsvarer genotype, og en gruppering av NTCs nær opprinnelse. Positiv kontrollene skal skille med passende eksempel grupperingen.
- Hvis programmet ikke gjenkjenner tomten grupperinger som tilsvarer bestemte genotyper, ekstra sykling sett kan være nødvendig (tabell 2). Gjenta det ekstra programmet til datamaskinen gjenkjenner stramt grupperinger av genotype.
- Eksportere genotyperingteknologi resultatene til en regnearkfil for enklere bruk og analyse.
- Plass sebrafisk hale vevet i 50 µL av lyseringsbuffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1, 5 mM MgCl 2, 0,3% ikke-ioniske surfactant, 0,3% Octylphenyl-polyetylenglykol). Legge til 10 µL av 10 mg/mL proteinasen-K per brønn 96-brønns PCR plate og sammendrag i en termisk cycler ved 55 ° C i 2-5 h etterfulgt av en 20 min 94 ° C inaktivering trinn. Kjøleskap lysis produktet etter fordøyelsen.
- Huset identifisert heterozygote dyrene på viktigste vannsystemet.
2. den første runden av avkom scoret
- parvis krysse søsken heterozygotes
- etter dyrene gjenopprette fra fin klippet, definere parvis intercrosses. Bruke skilleark for å sikre embryoer er synkron 16.
- Samle embryoene og holde foreldrenes parene i avl merder.
- Skjermen isolert voksne slik at aggressiv fisk kan atskilt eller leveres med deksel (makulert fisk garn arbeid pent). Fisk skal fôres og vann endret følgende IACUC retningslinjer i statisk vann.
- Embryo oppdrett
- scenen og heve de sebrafisk embryoene til Larvene under standard betingelser 17.
- Samle svært vill-type dyr med et glass pipette på dag 5 eller 6 når svømmeblæren er oppblåst i 75% av clutch. Plasser fenotypiske ville typene i barnehagen opptak som foreldre gitt dem.
Merk: Med mutant alleler som recessiv dødelige, som er sant for mange skjelettlidelser mutanter, homozygous mutanter ikke skjemaet svømmeblære 18 , 19. Derfor fenotypiske ville typene kan skjelnes lett fra deres mutant søsken basert på oppblåste svømmeblære.
- Alcian blå/Alizarin rød brusk og bein flekker
- bedøve larver som ikke økning svømmeblæren bruke 0,17 g/L Tricaine-S i fosteret medier. Samle dyr i 1,5 mL microcentrifuge rør med en bred-fødte glass Pasteur pipetter. Legge til 100 Larvene per tube.
- Fjerne fosteret vann fra hver rør og løse dyr i 1 mL av 2% paraformaldehyde i 1 x PBS per tube.
Forsiktig: Vandig PFA er brennbart og vil forårsake alvorlige hud og øyne irritasjon. Bruke riktig personlig verneutstyr som hansker og vernebriller, og vask hendene etter bruk. - Rock 1t; lengre fiksering svekker bein flekker. Når rørene regelmessig i løpet av denne og alle påfølgende rock skritt for å sikre ingen Larvene har blitt fast til siden eller klumpet seg i bunnen av røret.
- Fjern bindemiddel fra rør ved hjelp av en glass pipette, Legg 1 mL av 50% etanol, og rock i 10 min.
- Forberede frisk flekker løsning ved å legge til 20 µL på 0,5% Alizarin rød per 1 mL av Alcian premix (0,04% Alcian blå/10 mM MgCl 2 / 80% etanol). Fjern 50% etanol, Legg 1 mL av flekker løsning på hvert rør og rock over natten. Larvene kan forbli i flekken i opp til 5 dager.
- Fjerne flekken løsningen fra rørene og legger 1 mL av 80% etanol/10 mM MgCl 2 løsning til hver tube. Rock rør for minst 1 t; skylling overnatting kan produsere en klarere Alcian blå flekk.
- Fjerne den 80% etanol/10 mM MgCl 2 løsning fra rørene og legge 1 mL av 50% etanol, rock i 5 min.
- Fjern 50% etanol løsningen fra rørene og tilsett 1 mL av 25% etanol og rock i 5 min.
- Fjern 50% etanol løsningen fra rørene og tilsett 1 mL nylagde 3% H 2 O 2 /0.5% KOH bleking løsningen. Caps åpne og la rør stå i i en mikro-tube rack i ca 10 min eller til en svak brun farge kan sees i den øvre delen av løsningen.
Merk: Et lag med bobler skjemaet på toppen av løsningen. Forsiktig timing er nødvendig på dette trinnet som over bleking vil resultere i en dårlig dobbel flekk. - Fjerne bleking løsningen og legge 1 mL av 25% glycerol/0.1% KOH, rock i 10 min til 1 h.
- Fjerner 25% glycerol/0.1% KOH løsning fra rørene, legge 1 mL av 50% glycerol/0.1% KOH løsning til hver rør, rock i 10 min å.
- Fjerne 50% glycerol/0.1% KOH løsningen fra rørene og legge igjen 50% glycerol/0.1% KOH løsning til hver rør. Gynge vil over natten hjelpe fjerne luftbobler som kan akkumuleres i larver. Store farget skjelettlidelser forberedelser på 4 ° C når ikke brukes.
- Fenotypen scoring
- Score farget mutant avkom for penetrance av valgte fenotypen. I Nichols et al. 1 mutanter ble scoret noen forekomst av ektopisk bein.
Merk: Siden sebrafisk foreldrene er i statisk vann og Alizarin rød flekk kan falme med tid, er det viktig å score skjeletter innen få dager å fullføre skjelettet preparatet. - Penetrance er andelen av et genotype som har en fenotypen. Beregne den prosent penetrance formelen nedenfor:
% penetrance = (mutanter med fenotypen) / (totalt antall mutanter) × 100
- Score farget mutant avkom for penetrance av valgte fenotypen. I Nichols et al. 1 mutanter ble scoret noen forekomst av ektopisk bein.
3. Familien utvalg
- Velg to høye penetrance og to lav penetrance familier for neste generasjon. I tillegg til penetrance er det viktig å vurdere fruktbarhet og kraft når du velger hvilke familier overføres; se diskusjon for mer informasjon om dette.
- Gi hver foreldrenes par en sub lager ID: familien.01, 0,2, etc.
- Huset foreldrenes par på hovedsiden system med flere blandet sex ' kameraten ' fisk. Fisk kan være noen sebrafisk linje med permanent, åpenbare kjennetegn, for eksempel endret pigmentering eller fin struktur.
Merk: Mens mange forskere med hell oppbevare bare hekkende par i en tank, gode resultater er sett av boliger par med flere fisk. Dette valgfrie trinnet kan hekkende par dyr holdes i større skoler og hentet lett slik at de kan være gjentatte ganger krysset etter behov. Foreldrekontroll par kan krysses gjentatte ganger for å generere store full-sibling familier; Vent i minst en uke før gjenta krysset samme foreldre par. - Cull larver familiene fra trinn 2.2.2. som ble ikke valgt for neste generasjon.
- Etikett tankene med vill-type søsken Larvene fra valgte familier penetrance fra deres mutant søsken og heve til voksen som normal.
- Neste generasjon vil ha minst fire full-sibling familier, to for oppadgående linje og to for nedover linjen.
- Når Larvene når seksuell modenhet, gjenta protokollen starter på trinn en med den nye generasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen er en langsiktig dyrehold teknikk nyttig for forståelse sebrafisk skjelettlidelser mutanter (figur 1). Selektiv formering avkom tester skal gi et skifte i generell penetrance både nedover og oppover i noen generasjoner (figur 2). I vår tidligere arbeid kjørte to rundene av selektiv formering den gjennomsnittlige penetrance nedover fra 17% til 3%1. Tilsvarende i vår oppadgående linje flyttet vi den gjennomsnittlige penetrance oppover fra 63% til 93% i tre generasjoner. Hvis etter fire runder med selektiv formering penetrance ikke svarer nedover eller oppover, er det mulig at fenotypen som er scores ikke er følsom for selektiv formering avkom tester.
I en vellykket KASP utført prosedyren, stramt grupperinger av prøver tilsvarer genotype må gjenkjennes av programmet, og NTCs finnes nær opprinnelsen til tomten etter tilstrekkelig sykluser har blitt (Figur 3). Hvis KASP scatter plottet dataene grupperes ikke tett eller forurensning i en NTC oppdages, vil programmet kunne bestemme genotyper. Hvis mest prøvene er anerkjent av genotype gruppering, men det er fortsatt noen som er tvetydige, kan utelater ubestemt prøver fra datasettet tillate programmet å gjenkjenne genotyperingteknologi klynger. Ubestemt eksempel samtaler og tvetydig genotype gruppering kan skyldes følgende: forurenset reaksjon blandinger som ikke grupperer NTCs nær opprinnelse, over utvannet mal DNA forårsaker prøver å finne nær opprinnelse, under-utvannet mal DNA , eller utilstrekkelig antall reaksjon sykluser. Forbered frisk NTCs hvis forurensning er mistenkt.
En vellykket Alcian blå/Alizarin rød flekk vil har vibrantly farget bein og brusk elementer (figur 4A) som ikke er gjennomsiktig eller svak (figur 4B). Grensene for brusk elementene vises skarpe, og personlige chondrocytes blir synlig. Alizarin rød bein flekken er vanligvis den mer finicky to flekker. Fan-formet opercle (op) bein og stokk formet branchiostegal stråler (br) er gode indikatorer på en vellykket 6 dager innlegget befruktning (dpf) bein flekk (figur 4A, op, br). Bleking trinnet skal ikke visne flekker i beina og brusken mens fullt clearing andre vev av farge. Øynene får en brun nyanse selv etter vellykket flekker og fjerne. Alcian blå som er for konsentrert vil ikke klart fra andre vev gjør analyse umulig (figur 4C). Alcian blå fra leverandører enn beskrevet i materialet tabell kan også produsere dårlig brusk flekker.
Figur 1 . Skjematisk oversikt over selektiv formering for skjelettlidelser Penetrance avkom tester. (A) Genotype full-sibling familien en mutant linje å identifisere heterozygote bærere. (B) Pair-wise kryss identifisert heterozygote søsken og holde foreldrene isolert til avkom kan være scoret. (C) sett svært vill-type Larvene med oppblåst svømmeblære i barnehagen å heves til voksen og fikse mutant Larvene uten oppblåst svømmeblære for brusk og bein flekker. (D) Score hver clutch Alcian blå/Alizarin rød farget mutant dyr for penetrance. Velg hvilke familier blir oppdrettet oppover og nedover og heve fenotypiske ville typene fra hver familie til voksen. (E) House foreldre par med ledsagere slik at de gjentatte ganger kan krysses for å generere store full-sibling familier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksempel på skiftende skjelettlidelser Mutant Penetrance avkom tester. Selektiv formering ble som beskrevet i dette manuskriptet brukt sebrafisk mef2cab1086 mutant. I dette eksperimentet valgte vi for høy eller lav penetrance av ektopisk bein mellom opercle og branchiostegal-ray i dødelige homozygous mutanter. Penetrance av ektopisk bein i mutant avkom ble tildelt foreldrenes paret som var fargekodet av penetrance som vist. Dette tallet ble endret fra1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Skjermbilde fra programvare KASP genotyperingteknologi og resultater analyser.
I denne vellykkede KASP reaksjon, ble fast prøven grupperinger dannet. Blått er homozygous mutant, grønne punkter er heterozygote, røde punkter er homozygous vill-type og svarte firkanter er NTCs. grupperingene ble utpekt av programmet. NTCs ligger nær opprinnelsen til handlingen viser liten eller ingen reaksjon blanding forurensning. Ubestemt prøver som ennå ikke er tilordnet et genotype ville angis med en x. Det er ikke ukjent prøver i denne vellykkede fullførte kjøringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Gode, dårlige og stygge Alcian blå/Alizarin rød skjelettlidelser forberedelser.
(A) vises et eksempel på en frisk, pent farget og ryddet brusk og bein flekk. Merk forskjellige brusk elementene og lett visualisert røde opercle (op) og branchiostegal ray (br) bein. (B) en svak brusk flekker med falmede Alizarin rød flekk vises. Dette eksemplet satt på 4 ° C i mange måneder som resulterer i falmet brusk, samt opercle og branchiostegal ray bein som er vanskelig å skille. (C) en over farget Larven hvor mye Alcian blå ble brukt. Skala baren er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektiv formering avsløre nyanser av gen funksjon
Skiftende mutant fenotyper å være mer eller mindre alvorlige av selektiv formering er en grei måte å få ny innsikt i gen funksjon. Sammenlignet med standard metoder for umerkede avl, kan protokollen presenteres her gi en mer komplett forståelse av mutant fenotyper. Spesielt ved å generere stammer som er alvorlige, kan den fulle bredden av mutant fenotyper bli avslørt, inkludert noen som var unobservable med umerkede aksjer. Dermed kan nye utviklingsmessige roller for genet under studien oppdages. Omvendt, genererer milde stammer kan avsløre de mest avgjørende rollene for genet av interesse. Ta, for eksempel bare en enkelt fenotypen vedvarer i mild mutanter. Her er det sannsynlig at utviklingsprosessen som gjenstår forstyrret i mild belastningen mest kritikerroste krever funksjonen av genet. Derfor kan full fenotypiske serien av en gitt mutasjon være mer fullstendig forstått gjennom selektiv avl.
Unngå Inbreeding depresjon
Avkom av relaterte personer viser redusert overlevelse og fruktbarhet i mange dyre- og plantelivet systemer, inkludert sebrafisk20. Kjent som inbreeding depresjon, de fleste modeller posit at økt homozygosity på loci recessiv skadelige alleler eller alleler som er gunstig heterozygotes ligger dette fenomenet21. Studier med villfanget sebrafisk avsløre en lav frekvens av skadelige alleler i naturlige populasjoner22. Videre ble laboratorium stammer som AB ytterligere tømt recessiv dødelige mutasjoner23. Dermed virker det forsiktig dyrehold kan tillate ubestemt inbreeding valgte sebrafisk linjer. Faktisk viste en fersk rapport at sebrafisk kan opprettholdes av full-sibling inbreeding for minst 16 generasjoner9.
Denne protokollen understreker noen enkle, men avgjørende skritt for å sikre at innavlet sebrafisk linjer fortsette å produsere nok avkom å være nyttig for utviklingsmessige studier. Den mest avgjørende aspekten av denne selektiv formering strategien er utvelgelsesprosessen selv. Først må utvikle dyr nøye overvåket slik at familier med utviklingsmessige feil eller avvik, koblet mutasjon av interesse, kan velges strengt mot. Andre, clutch størrelse bør anses som selektiv formering krever store familier. I tillegg velge par som gir store klør, store familier kan genereres gjennom gjenta kors av samme foreldre par. Holde foreldrenes par i tanker med mange andre følgesvenn fisk, som er lett fanges fra avl paret, for eksempel pigmentering eller fin mutanter, gir langsiktig bolig av hekkende par i store conspecific grupper mens slik at de kan fortsatt være lett identifisert og hentet. Denne øvelsen fremmer et sunt sosiale miljø der foreldre paret er gratis å shoal med andre sebrafisk24. Ennå kan forskeren enkelt hente foreldrenes paret slik at de kan krysses gjentatte ganger, slik at genereringen av stor full-sibling familier.
Velge en valgbar fenotypen
Denne protokollen innebærer mye fenotypen scoring. Dermed er en begrensning at valget må brukes på en fenotypen som er lett å visualisere og scorer raskt. Det er også viktig å bestemme på hvilket stadium dyr vil være fast og farget for scoring. Bein fenotyper er det en fordel å vente til 6 dpf fordi bein er mer utviklet25 og scores lettere. For brusk mønstre mutant fenotyper, er 4 dpf ofte egnet for fenotypen scoret26,27. Bestemme når man skal fikse dyr, er det viktig å vurdere om genet av interesse har pleiotropic roller fører til utviklingsmessige mutant fenotyper i andre vev, som kan føre til confounding sekundær feil. For eksempel med skjelettlidelser mutanter som også vise hjertet ødem er det viktig å fikse på 4 dpf før sekundære feil som en generell forsinkelse i chondrogenesis manifestere26.
For enkelhet valgte vi en binær poengsystem fokuserer på penetrance for våre selektiv formering. Imidlertid har mutert fenotyper variabel expressivity også. I fremtidige studier, det vil være interessant å teste hvis, som penetrance, expressivity er følsomme for selektiv formering. Dvs kan hyppigheten av bestemte ektopisk bein figurene endres gjennom selektiv avl?
Denne protokollen beskriver den klassiske selektive formering strategien avkom utvalg og sin søknad til sebrafisk utviklingsmessige genetiske studier. Grei dyrehold-retningslinjer som er beskrevet her er mulig i et laboratorium, selv i små anlegg. Gjennom selektiv avl, en av de største styrkene til sebrafisk systemet, kan medgjørlig genetikk, bli brukt for å lære om gen funksjon i nyutviklet mutanter samt mutanter som er overført i flere tiår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Chuck Kimmel for veiledning, John Dowd for hjelp i å utvikle denne avl strategi, Macie Walker for sitt arbeid i å perfeksjonere skjelettlidelser flekken, og Charline Walker og Bonnie Ullmann for nyttig sebrafisk råd. Dette arbeidet ble støttet av K99/R00 DE024190 til JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
