Summary
O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.
Abstract
Zebrafish fenótipos mutantes são frequentemente incompleta penetrante, manifestando-se apenas em alguns mutantes. Fenótipos interessantes que aparecem de forma inconsistente podem ser difícil de estudar e podem levar a confundir os resultados. O protocolo descrito aqui é um paradigma de reprodução simples para aumentar e diminuir penetrância em mutantes esquelético zebrafish letal. Porque os mutantes letais não podem ser seletivamente criados diretamente, a estratégia de reprodução seletiva clássico de teste de progênie é empregada. Esse método também inclui protocolos para Kompetitive alelo específico do PCR (KASP) genotipagem zebrafish e coloração zebrafish larval de cartilagem e osso. Aplicar a estratégia de criação descrita aqui pode aumentar a penetrância de um fenótipo esquelético interessante, permitindo que mais resultados reprodutíveis em aplicações a jusante. Além disso, diminuindo a penetrância mutante através desta estratégia de reprodução seletiva pode revelar os processos de desenvolvimento que requerem mais crucialmente a função do gene mutado. Enquanto o esqueleto é especificamente considerado aqui, propomos que esta metodologia será útil para todas as linhas mutantes zebrafish.
Introduction
O peixe-zebra é um sistema poderoso modelo para a compreensão do desenvolvimento esquelético. Com cepas mutantes zebrafish, biólogos podem decifrar a função dos genes durante a skeletogenesis. No entanto, zebrafish esquelético fenótipos mutantes podem apresentar com penetrância variável1,2,3,,4 que pode dificultar as análises genéticas e do desenvolvimento. A finalidade desse método é triplo. Primeiro, gerar zebrafish linhas mutantes que consistentemente produzem fenótipos graves permite a jusante do desenvolvimento estudos como lapso de tempo de gravação transplantação de5 e6. Esses tipos de estudos podem ficar inválidos ao tentar estudar fenótipos que apenas manifestam inconsistentemente. Em segundo lugar, consanguinidade zebrafish cepas pode diminuir a variação do fundo genético, promovendo assim a reprodutibilidade e consistência experimental. Por exemplo, realizando todos os em situ podem reduzir variabilidade confundimento e reforçar conclusões análises de hibridação em uma estirpe seletivamente pura. Em terceiro lugar, gerar tensões graves e suaves irá revelar toda a série fenotípica que pode resultar de uma mutação específica.
À primeira vista, a reprodução seletiva de mutantes letais parece impossível. Como pode uma raça para penetrância quando os animais que são marcados para seleção estão mortos? Felizmente, métodos de reprodução seletiva por seleção de família, especificamente a descendência testes, demonstraram eficácia na pecuária programas para muitos anos7,8. Estes programas são usados principalmente para reprodução seletiva para os traços que só estão presentes em um sexo, como a produção de leite em vacas ou produção de ovos em galinhas. Os machos destas espécies não podem ser marcados diretamente, mas seus descendentes são marcados e um valor é atribuído aos pais. Endividamento a partir desta estratégia, o protocolo aqui apresentado envolve marcando o fixo e manchados mutante prole de um par de zebrafish que são heterozigotos para um gene mutante de interesse. A penetrância de um fenótipo na prole mutantes letais homozigotos é atribuída aos pais quando decidir quais indivíduos irão produzir a próxima geração da linha. Achamos que este método é um meio eficaz de deslocamento penetrância em zebrafish mutantes esquelética letal1.
Similar a outros estudos, este protocolo de reprodução seletiva leva sob critérios de consideração como tamanho da embreagem, sobrevivência da prole, normal desenvolvimento de embriões e uma relação de sexo9. No entanto, esses fatores são considerados no contexto de um fundo mutante com o objetivo de desviar a penetrância mutante. Portanto, este protocolo amplia paradigmas anteriores de reprodução seletiva, oferecendo um método para fortalecer as análises mutantes do desenvolvimento, bem como aumentar a homogeneidade de fundo.
Este protocolo requer genotipagem extensa, por isso é importante desenvolver um protocolo confiável, rápida genotipagem com antecedência. Existem muitos genotipagem protocolos disponíveis10,11, no entanto, encontramos o KASP genotipagem12,13,14 é mais rápido, de custo mais eficiente e mais confiável do que os métodos baseada na clivagem de enzima de restrição de sequências amplificadas10. Portanto, nós incluímos um protocolo KASP neste trabalho. Além disso, podemos focar esqueléticos fenótipos mutantes neste protocolo e incluir um procedimento para Alcian Blue/alizarina Red coloração modificada de anteriores protocolos15.
O método descrito aqui é uma estratégia simples para comutação penetrância mutante letal para cima ou para baixo. Enquanto este protocolo incide sobre fenótipos mutantes esqueléticos, acreditamos que vai ser uma estratégia útil para a criação de todas as linhas de zebrafish mutante. De fato, a utilidade desta estratégia de reprodução provável estende-se além do zebrafish. Prevemos que este protocolo pode ser modificado para deslocar penetrância em uma ampla gama de organismos. Penetrância letal de movimento através do teste de progênie pode ajudar a impulsionar o progresso de qualquer geneticista do desenvolvimento.
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Protocol
todos os experimentos descritos neste protocolo foram concluídos em conformidade e cumprimento da Universidade do Colorado e a Universidade de Oregon institucional Animal cuidado e uso de comitês (IACUC).
1. preparando o estoque desmarcado começando
- identificar heterozigotos portadores do alelo mutante de interesse pela barbatana clip- 11 e um estoque de animais completo-irmão de genotipagem por um método de escolha, tais como KASP 12 , 13 , 14. Este protocolo foi realizado com a estirpe de mef2ca b1086 de zebrafish.
- Genotipagem KASP
Nota: Primers específicos de alelo para KASP são projetados pela empresa que fornece os reagentes (ver Tabela de materiais). Para obter a concentração adequada 6-carboxila-X-rodamina (ROX) corante para a máquina específica de PCR em tempo real visite o site da empresa.- Lugar o tecido de cauda de peixe-zebra em 50 µ l de tampão de lise (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% tensoativo não-iônico, 0,3% octilfenil-polietileno glicol). Adicione 10 µ l de 10 mg/mL Proteinase K por alvéolo de um prato PCR de 96 poços e resumida em um termociclador a 55 ° C, durante 2-5 h, seguido por uma etapa de inactivação de 94 ° C 20 min. Refrigerar o produto de lise após digestão.
Nota: produtos de Lise podem ser usados com sucesso por vários meses após o preparo. Quando o tecido era lysed usando 50mm NaOH, as reações de KASP foram infrutíferas. Estes achados sugerem que o método de NaOH de preparação de DNA genômico não é compatível com KASP. - Quantificar o DNA genômico, usando um espectrofotômetro. Diluir o modelo de DNA genômico usando água de grau de biologia molecular, de modo que cada reação contém aproximadamente 20-30 ng.
Nota: Quantificar 4 ou 5 amostras, piscina-los e, em seguida, preparar diluições para todas as amostras com base na média. Quando usando esse protocolo para tecido adulto cauda, uma diluição de 1: 100, muitas vezes é suficiente. A quantificação precisa da concentração de DNA não é necessária. - Add 0,14 µ l do primer KASP misturar e 5 µ l do mestre KASP misturar por amostra no gelo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e misture bem antes de centrifugação brevemente para coletar conteúdo na parte inferior do tubo.
Nota: KASP mestre mix é calor e luz sensível, manter estoque no gelo e evitar a luz direta. - Pipeta 5 µ l de primer/mestre misturar a solução para os poços de uma placa de 96 poços óptico PCR apropriado para a máquina PCR em tempo real sendo usada.
- Pipeta 5 µ l de diluído (aproximadamente 5-7 ng/μL) amostras de DNA modelo em cada bem e Aspire com uma pipeta para misturar.
- Adicionar 5 µ l de água livre de nuclease 3 poços para servir como controles não-modelo (NTC) e adicionar 5 µ l de diluídos confirmado homozigoto tipo selvagem, heterozigoto e homozigoto modelo de DNA mutante para controlos positivos.
- Coloque um selo do filme opticamente clara sobre a placa, garantindo que o filme é totalmente fechado sobre cada bem.
- Brevemente centrifugar a placa a 600 x g para coletar o conteúdo na parte inferior e remover bolhas de mistura.
Nota: Manter a placa no gelo e escudo de luz até que esteja pronto para prosseguir. - Usar o programa ciclismo mostrado na tabela 1 para realizar a principal reação KASP.
- Ver os o gráfico de dispersão resultante produzido por computador a análise. Uma reação de sucesso mostrará 4 grupos distintos de pontos sobre a trama ( Figura 3): três agrupamentos correspondente ao genótipo e um agrupamento dos NTCs perto da origem da amostra. Os controles positivos devem segregar com o agrupamento de amostras adequadas.
- Se o programa de computador não reconhece o enredo agrupamentos como correspondente de genótipos específicos, adicionais de ciclismo de moda podem ser necessário (tabela 2). Repita o programa adicional até que o computador reconhece e agrupamentos apertados pelo genótipo.
- Exportar os resultados da genotipagem para um arquivo de planilha para facilitar a utilização e a análise.
- Lugar o tecido de cauda de peixe-zebra em 50 µ l de tampão de lise (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% tensoativo não-iônico, 0,3% octilfenil-polietileno glicol). Adicione 10 µ l de 10 mg/mL Proteinase K por alvéolo de um prato PCR de 96 poços e resumida em um termociclador a 55 ° C, durante 2-5 h, seguido por uma etapa de inactivação de 94 ° C 20 min. Refrigerar o produto de lise após digestão.
- Os animais heterozigotos identificados juntos no sistema de água principal da casa.
2. a primeira rodada de progênie marcando
- Cruz Pairwise heterozigotos irmão
- depois que os animais recuperar-se do clip de barbatana, configurar inter-cruzamentos emparelhados. Usar divisores para garantir que os embriões são síncronos 16.
- Recolher os embriões e manter os pares parentais isolados em gaiolas de criação.
- Monitorar adultos isolados para que peixes agressivos podem ser separados ou fornecidos com tampa (de peixe desfiado redes de trabalho muito bem). Peixes devem ser alimentados e sua água mudou seguindo orientações IACUC enquanto na água estática.
- Embrião criação
- palco e elevar os embriões de zebrafish para larvas sob condições padrão 17.
- Recolher animais fenotipicamente selvagem-tipo, usando uma pipeta de vidro no dia 5 ou 6 quando a bexiga natatória é inflada em 75% da embreagem. Coloque fenotípicos tipos selvagens no berçário gravação de que os pais rendeu-lhes.
Nota: Com alelos mutantes que são recessiva letal, o que é verdadeira de muitos mutantes esqueléticos, homozigotos mutantes não conseguem forma natatórias 18 , 19. Portanto, fenotípicos tipos selvagens podem ser discernidos facilmente de seus irmãos mutantes baseados no inflado natatórias.
- Alcian Blue/alizarina Red cartilagem e osso coloração
- anestesiar as larvas que não inflar seus natatórias usando 0,17 g/L tricaina-S em embriões. Colete animais em tubos de 1,5 mL microcentrifuga com um vidro largo-furo pipeta Pasteur. Adicionar a não mais de 100 larvas por tubo.
- Remover água de embrião de cada tubo e corrigir animais em 1 mL de 2% paraformaldeído em PBS 1x por tubo.
Atenção: PFA aquosa é combustível e irá causar irritação cutânea e ocular grave. Usar equipamento de protecção adequado como luvas e óculos de proteção e lave bem as mãos após o uso. - Rock para 1h; fixação mais prejudica a coloração de osso. Verificar os tubos regularmente durante esta e todas as etapas subsequentes de balanço para não garantir que nenhuma larva tem tornar-se preso ao lado ou aglutinadas no fundo do tubo.
- Retire o fixador de tubos utilizando uma pipeta de vidro, adicione 1 mL de etanol a 50% e o rock de 10 min.
- Preparar fresco coloração solução adicionando 20 µ l de 0,5% de vermelho de alizarina por 1 mL de Alcian premix (0,04% Alcian Blue/10 mM MgCl 2 / 80% de etanol). Retire 50% de etanol, adicionar 1 mL de solução para cada tubo e pedra de coloração durante a noite. Larvas podem permanecer na mancha por até 5 dias.
- Remover a mancha solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol/10 mM MgCl 2 solução de 80% a cada tubo. Agitar os tubos pelo menos 1 h; enxaguar a noite pode produzir uma mancha mais clara de Alcian Blue.
- Remover o 80% etanol/10 mM MgCl 2 solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 50%; rock para 5 min.
- Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 25% e rock 5 min.
- Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL recém-preparada 3% H 2 O 2 /0.5% solução de branqueamento KOH. Deixar as tampas abertas e deixe os tubos fique um rack de microtubo por cerca de 10 min ou até uma coloração marrom fraca pode ser vista na parte superior da solução.
Nota: Uma camada de forma bolhas no topo da solução. Cuidado de sincronismo é necessário neste passo, tão mais branqueamento resultará em uma mancha de dupla pobre. - Remover a solução de branqueamento e adicionar 1 mL de glycerol/0.1% 25% KOH; rock para 10 min a 1 h.
- Remover a solução KOH glycerol/0.1% 25% dos tubos, adicionar 1 mL de solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo, rocha por 10 minutos durante a noite.
- Remover a solução KOH glycerol/0.1% de 50% dos tubos e novamente adicionar solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo. Balançando a noite irá ajudar a remover as bolhas de ar que podem se acumular dentro de larvas. Loja manchado esqueléticas preparações a 4 ° C, quando não está sendo usado.
- Fenótipo marcando
- Pontuação manchado mutante prole para a penetrância do fenótipo selecionado. Em Nichols et al 1 mutantes foram marcados por qualquer ocorrência de osso ectópico.
Nota: Como os pais de zebrafish estão na água estática e a mancha de vermelho de alizarina pode desaparecer com o tempo, é importante marcar esqueletos dentro de alguns dias de completar a preparação esquelética. - Penetrância é a proporção de um genótipo que tem um fenótipo. Calcular a porcentagem penetrância pela seguinte fórmula:
% penetrância = (mutantes com fenótipo) / (número total de mutantes) × 100
- Pontuação manchado mutante prole para a penetrância do fenótipo selecionado. Em Nichols et al 1 mutantes foram marcados por qualquer ocorrência de osso ectópico.
3. Seleção família
- escolher dois alta penetrância e duas famílias de baixa penetrância para a próxima geração. Além de penetrância, é importante considerar a fecundidade e vigor ao escolher quais famílias para propagar; consulte a discussão para mais detalhes sobre isso.
- Dá um identificador de estoque subcada par parental: família.01,.02, etc
- Casa parentais pares no sistema principal com vários sexo misto ' companheiro ' peixes. Peixe do companheiro pode ser qualquer linha de zebrafish com características distintivas permanentes, óbvias, tais como a estrutura alterada de pigmentação ou fin.
Nota: Enquanto muitos pesquisadores com sucesso mantém apenas casais em um tanque, resultados favoráveis são vistos pela carcaça de pares com vários peixes de companheiro. Nesta etapa opcional permite que casais de animais a ser mantido nas escolas maiores e facilmente recuperada e podem ser repetidamente atravessaram conforme necessário. Pares dos pais podem ser atravessados repetidamente para gerar grandes famílias cheio-irmão; Espere pelo menos uma semana antes de repetir cruzando o mesmo par parental. - Abater as famílias larvas da etapa 2.2.2. que não foram selecionados para a próxima geração.
- Rotular os tanques contendo as larvas do selvagem-tipo irmão de famílias selecionadas com a penetrância de seus irmãos mutantes e elevar-se até à idade adulta como normal.
- a próxima geração terá pelo menos quatro famílias cheio-irmãos, dois para a linha ascendente e dois para a linha descendente.
- Quando as larvas atingem a maturidade sexual, repetir o protocolo iniciando no primeiro passo com a nova geração.
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Representative Results
Este protocolo é uma técnica de maneio a longo prazo útil para a compreensão do zebrafish esquelético os mutantes (Figura 1). Reprodução seletiva através do teste de progênie deve produzir uma mudança em geral penetrância descendente e ascendente em poucas gerações (Figura 2). Em nosso trabalho anterior, duas rodadas de reprodução seletiva dirigimos a penetrância média para baixo de 17% para 3%1. Da mesma forma, em nossa linha ascendente, nós mudou a penetrância média para cima de 63% para 93% em três gerações. Se depois de quatro rodadas de reprodução seletiva a penetrância não responde para baixo ou para cima, é possível que o fenótipo que está sendo marcado não é sensível a reprodução seletiva através do teste de progênie.
Em uma bem sucedida KASP procedimento, apertado, agrupamentos de amostras correspondente ao genótipo devem ser reconhecidos pelo programa de computador, e os NTCs devem estar localizados próximo a origem da trama após ciclos suficientes tem sido realizado (Figura 3). Se os dados de plotagem de dispersão KASP não é firmemente agrupados ou contaminação em um NTC é detectada, o programa será incapaz de determinar os genótipos. Se a maioria das amostras são reconhecidos pelo agrupamento de genótipo, mas ainda há algumas que são ambíguas, omitir indeterminadas amostras do conjunto de dados pode permitir que o programa reconhecer aglomerados de genotipagem. Chamadas de amostra indeterminada e agrupamento de genótipo ambígua podem resultar do seguinte: misturas de reação contaminada na qual NTCs não agrupará perto da origem, o modelo excessivamente diluídos DNA causando amostras para localizar próximo a origem, sob diluída modelo DNA , ou número insuficiente de ciclos de reação. Prepare-se fresco NTCs se houver suspeita de contaminação.
Uma mancha de vermelho de alizarina/azul de Alcian sucesso vibrantemente ter manchado elementos osso e cartilagem (Figura 4A) que não são transparentes ou desmaiar (Figura 4B). Os limites dos elementos cartilagem devem aparecer nítidos e condrócitos individuais serão perceptíveis. A mancha de osso de vermelho de alizarina é geralmente a mais frágil das duas manchas. O osso em forma de ventilador opercle (PO) e vara em forma de raios branquiostegais (br) são bons indicadores de uma bem sucedida 6 dias pós fertilização (dpf) osso mancha (Figura 4A, op, br). A etapa de branqueamento não deve desaparecer as manchas no osso e cartilagem ao limpar totalmente os outros tecidos de cor. Os olhos terá uma tonalidade marrom mesmo após coloração bem sucedida e de compensação. Alcian Blue é muito concentrada não limpará de outros tecidos fazendo análise impossível (Figura 4). Azul de Alcian de fornecedores diferente daquele descrito na tabela do material também pode produzir manchas de cartilagem pobre.
Figura 1 . Visão esquemática da reprodução seletiva, para esquelética penetrância através do teste de progênie. (A) genótipo uma família completa-irmão de uma linhagem mutante para identificar portadores heterozigotos. (B) por pares cruzar irmãos heterozigotos identificados e manter os pais isolados até prole pode ser marcado. (C) Coloque fenotipicamente selvagem-tipo larvas com natatórias infladas no berçário para ser elevado à vida adulta e corrigir larvas mutantes sem natatórias infladas de cartilagem e osso manchar. (D) marcar cada embreagem de Alcian Blue/manchado de vermelho de alizarina animais mutantes para penetrância. Selecione quais famílias serão criadas para cima e para baixo e levantem os tipos de wild fenotípicos de cada família para a vida adulta. (E) casa parental pares com companheiros para que eles repetidamente podem ser atravessados para gerar grandes famílias cheio-irmão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Exemplo de deslocamento esquelética mutante penetrância através do teste de progênie. Reprodução seletiva conforme descrito neste manuscrito foi aplicada para o peixe-zebra mutante de mef2cab1086 . Neste experimento, selecionamos para alta ou baixa penetrância do osso ectópico entre o opercle e o ray branquiostegais em mutantes homozigotos letais. Penetrância de osso ectópico em mutantes prole foi designada para o par parental, que era um código de cores por penetrância conforme mostrado. Esta figura foi modificada de1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Captura de tela do Software usado para KASP genotipagem e análises de resultados.
Nesta reação KASP bem-sucedida, formaram-se agrupamentos de amostra apertado. Pontos azuis são homozigoto mutante, pontos verdes são heterozigotos, pontos vermelhos são homozigoto selvagem-tipo e quadrados pretos são que os NTCs. agrupamentos foram designados pelo programa de computador. Os NTCs estão localizados perto da origem da trama que significa pequena ou nenhuma contaminação da mistura de reação. Amostras indeterminadas que ainda não estejam atribuídas a um genótipo ia ser indicadas com um x. Existem há exemplos indeterminados presentes nesta bem sucedida execução concluída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Bom, o mau e o feia Alcian Blue/alizarina vermelhas preparações esqueléticas.
(A) um exemplo de uma mancha de cartilagem e osso fresco, bem manchado e apurada é mostrado. Observe os elementos distintos da cartilagem e facilmente visualizado vermelho opercle (PO) e branquiostegais (br) o ray bones. (B) uma fraca cartilagem mancha desbotada vermelho de alizarina mancha é mostrada. Esta amostra sentou-se a 4 ° C por muitos meses, resultando em cartilagem desbotada, bem como opercle e branquiostegais ray ossos que são difíceis de distinguir. (C) uma larva excessivamente manchada em que foi usado muito Alcian Blue. Barra de escala é 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Reprodução seletiva revela sutilezas da função dos genes
Deslocando os fenótipos mutantes para ser mais ou menos grave por reprodução seletiva é uma maneira simples de ganhar novos insights sobre a função do gene. Quando comparado com os métodos padrão de reprodutores selecionados, o protocolo apresentado aqui pode render uma compreensão muito mais completa dos fenótipos mutantes. Especificamente, gerando tensões que são graves, a amplitude total dos fenótipos mutantes pode ser revelada, incluindo algumas que foram não observável com estoques não selecionados. Assim, podem ser descobertas novas funções do desenvolvimento para o gene em estudo. Por outro lado, gerar tensões suaves pode revelar as funções mais cruciais para o gene de interesse. Tome, por exemplo, apenas um único fenótipo persiste em mutantes suaves. Aqui é provável que o processo de desenvolvimento que permanece interrompido na cepa suave mais aclamados pela crítica requer a função do gene. Daí, a série completa fenotípica de uma determinada mutação pode ser mais plenamente entendida através da reprodução seletiva.
Evitando a depressão de consanguinidade
A prole de indivíduos relacionados demonstram reduzida sobrevivência e fecundidade em muitos sistemas vegetais e animais, incluindo o zebrafish20. Conhecida como depressão de consanguinidade, a maioria dos modelos postular que aumentou a homozigotia em loci com alelos deletérios recessivos ou alelos que são benéficos como heterozigotos subjazem a este fenómeno de21. Estudos com selvagens capturados zebrafish revelam uma baixa frequência de alelos deletérios em populações naturais de22. Além disso, cepas de laboratório como AB mais absolveram de mutações letal recessivo23. Assim, parece que essa criação cuidadosa pode permitir a endogamia indefinida de linhas selecionadas zebrafish. Com efeito, um relatório recente revelou que zebrafish pode ser mantida por completo-irmão endogamia para gerações pelo menos 169.
Este protocolo enfatiza alguns passos simples, mas essenciais para garantir que as linhas puras do zebrafish continuam a produzir suficiente descendência para ser útil para estudos do desenvolvimento. O aspecto mais importante desta estratégia de reprodução seletiva é o processo de seleção em si. Primeiro, desenvolver os animais deve ser cuidadosamente monitorizado para que famílias com defeitos no desenvolvimento ou anormalidades, desvinculadas para a mutação de interesse, podem ser selecionadas rigorosamente contra. Em segundo lugar, embreagem tamanho deve ser considerado, como reprodução seletiva requer grandes famílias. Além de selecionar os pares que geram grandes garras, famílias grandes podem ser geradas através de cruzamentos de repetição do mesmo par parental. Manter pares parentais em tanques com o companheiro de muitos outro peixes, que são facilmente discernidos a partir o casal reprodutor, como pigmentação ou barbatana mutantes, permite a habitação a longo prazo de casais em grandes grupos coespecíficas enquanto permitindo-lhes ainda ser facilmente identificados e obtida. Esta prática promove um ambiente social saudável, onde o par parental é livre para cardume com outros zebrafish24. Ainda o pesquisador pode facilmente recuperar o par parental para que eles podem ser cruzados repetidamente, permitindo a geração de grandes famílias cheio-irmão.
Escolhendo um fenótipo selecionável
Este protocolo envolve uma grande quantidade de fenótipo marcando. Assim, uma limitação é que a seleção precisa ser aplicada para um fenótipo que é fácil de Visualizar e marcar rapidamente. Também é importante decidir em que animais de palco serão fixo e manchados para pontuar. Para fenótipos de osso, é vantajoso esperar até 6 dpf porque os ossos estão mais desenvolveram25 e serão mais facilmente marcados. Por cartilagem padronização fenótipos mutantes, dpf 4 vezes é adequado para fenótipo marcando26,,27. Em decidir quando corrigir animais, é importante considerar se o gene de interesse tem funções pleiotrópicos levando a fenótipos mutantes do desenvolvimento em outros tecidos, o que podem resultar em confusão defeitos secundários. Por exemplo, com mutantes esqueléticos que também exibem edema de coração, é importante fixar no dpf 4 antes secundários defeitos como um atraso geral na condrogênese manifesto26.
Para simplificar, nós escolhemos um binário sistema focando penetrância para nossa reprodução seletiva de pontuação. No entanto, os fenótipos mutantes também podem ter expressividade variável. No futuro, estudos, será interessante testar se, como penetrância, expressividade é sensível à reprodução seletiva. Ou seja, a frequência de formas específicas de osso ectópico pode ser alterada por meio de reprodução seletiva?
Este protocolo descreve a estratégia clássica de reprodução seletiva de progênie seleção e sua aplicação para estudos genéticos no desenvolvimento do zebrafish. As práticas de criação simples descritas aqui são possíveis em qualquer laboratório, mesmo em pequenas instalações. Por meio de reprodução seletiva, uma das maiores forças do sistema zebrafish, tractable genética, pode ser aproveitado para aprender sobre a função dos genes mutantes recentemente desenvolvidos, bem como mutantes que têm sido propagados por décadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Chuck Kimmel para orientação, John Dowd para ajudar a desenvolver esta estratégia de reprodução, Macie Walker por seu trabalho em aperfeiçoar a mancha esquelética e Charline Walker e Bonnie Ullmann para conselhos úteis zebrafish. Este trabalho foi financiado pelo DE024190 K99/R00 para JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
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