Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Skiftande zebrafiskar dödliga skelett Mutant penetrans av avkommeprövning

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56200

Summary

Målet med detta protokoll är att förändra penetrans av dödliga skelett mutant fenotyper i zebrafisk genom selektiv avel. Dödliga mutanter inte kan odlas till vuxen ålder och födde upp själva, därför det här protokollet beskriver en metod för spårning och välja penetrans genom flera generationer av avkommeprövning.

Abstract

Zebrafiskar mutant fenotyper är ofta ofullständigt penetrant, endast manifesterar i vissa mutanter. Intressant fenotyper som inkonsekvent visas kan vara svåra att studera, och kan leda till confounding resultat. Protokollet beskrivs här är en enkel avel paradigm att öka och minska penetrans i dödliga zebrafiskar skelettet mutanter. Eftersom dödliga mutanter inte betäckas selektivt direkt, är klassiska selektiv avel strategi avkomma testning anställd. Denna metod har även protokoll för Kompetitive allel specifika PCR (KASP) genotypning zebrafiskar och färgning larval zebrafiskar brosk och ben. Tillämpa strategin djurhållning som beskrivs här kan öka penetrans av en intressant skelett fenotyp som möjliggör fler reproducerbara resultat i efterföljande program. Dessutom kan minskar den muterade penetrans genom selektiv avel strategin avslöja de utvecklingsprocesser som viktigast kräver funktionen av den muterade genen. Medan skelettet anses särskilt här, föreslår vi att denna metod kommer att vara användbar för alla zebrafiskar mutant rader.

Introduction

Zebrafiskar är en kraftfull modell för förstå skelett utveckling. Med muterade zebrafiskar stammar, kan biologer dechiffrera geners funktion under skeletogenesis. Dock kan zebrafiskar skelett mutant fenotyper presentera med variabel penetrans1,2,3,4 som kan hindra utvecklingsmässiga och genetiska analyser. Syftet med denna metod är trefaldig. Först kan radgenerering zebrafiskar mutant som konsekvent producerar svår fenotyper nedströms utvecklande studier som time-lapse recording5 och transplantation6. Dessa typer av studier kan vara lamslagen av försöker studera fenotyper som bara manifesterar inkonsekvent. För det andra, inavel zebrafiskar stammar kan minska genetiska bakgrunden variation, vilket främjar experimentella konsekvens och reproducerbarhet. Till exempel kan utför alla i situ hybridisering analyser på ett selektivt inavlade stammen minska störande variabilitet och stärka slutsatser. För det tredje, generera svåra och lindriga stammar kommer att avslöja hela fenotypiska serien som kan resultera från en viss mutation.

Vid första anblicken, verkar selektiv avel av dödliga mutanter omöjligt. Hur kan en ras för penetrans när djuren som är gjorde för urval är döda? Metoder för selektiv avel av familjen urval, särskilt avkommeprövning, har lyckligtvis visade effektivitet i boskapsuppfödning program för många år7,8. Dessa program används främst för selektiv avel för egenskaper som endast är tillgängliga i ett kön, som mjölkproduktionen hos kor eller Äggproduktionen i hönor. Manlina av dessa arter kan inte vara poängsätts direkt, men deras avkomma poängsätts och ett värde tilldelas sedan föräldrarna. Upplåning från denna strategi, innebär protokollet presenteras här scoring fasta och färgade muterade avkomman från ett par zebrafiskar som är heterozygota för en mutant gen av intresse. Penetrans av en fenotyp i homozygot dödliga muterade avkomman tilldelas till föräldrarna när man beslutar vilka individer kommer att producera nästa generation i raden. Vi tycker att denna metod är ett effektivt medel för skiftande penetrans i zebrafiskar dödliga skelett mutanter1.

Liknar andra studier, selektiv avel protokollet tar under övervägande kriterier som koppling storlek, överlevnad hos avkomman, normal utveckling av embryon och könskvot9. Men betraktas dessa faktorer inom ramen för en mutant bakgrund med målet att skifta den muterade penetrans. Därför utökar detta protokoll tidigare selektiv avel paradigm genom att erbjuda en metod för att stärka utvecklingsmässiga mutant analyser samt öka bakgrunden homogenitet.

Detta protokoll kräver omfattande genotypning, så det är viktigt att utveckla en tillförlitlig, snabb genotypning protokoll i förväg. Det finns många genotypning protokoll tillgängliga10,11, men vi hitta KASP genotypning12,13,14 är snabbare, mer kostnadseffektiv, och mer tillförlitlig än metoder baserat på restriktionsenzym klyvning av förstärkta sekvenser10. Därför inkluderar vi ett KASP protokoll i detta arbete. Dessutom, vi fokuserar på skelettet mutant fenotyper i detta protokoll och omfattar ett förfarande för Alcian Blue/Alizarin Red färgning modifierad från tidigare protokoll15.

Den metod som beskrivs här är en enkel strategi för skiftande dödligt mutanta penetrans uppåt eller nedåt. Medan detta protokoll fokuserar på skelettet mutant fenotyper, tror vi att det kommer att vara en användbar strategi för djurhållning av alla muterade zebrafiskar rader. I själva verket nyttan av denna avel strategi sannolikt sträcker sig bortom zebrafiskar. Vi förutspår att detta protokoll kan ändras för att skifta penetrans i ett brett spektrum av organismer. Skiftande dödliga penetrans av avkomman testning kan hjälpa till att driva utvecklingen av eventuella fosterskadande genetiker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alla experiment som beskrivs i detta protokoll slutfördes i enlighet och efterlevnad av University of Colorado och University of Oregon institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC).

1. förbereda omarkerade börjar beståndet

  1. identifiera heterozygota bärare av den muterade allelen av intresse av fin klipp 11 och genotypning ett lager av full-syskon djur med en metod för val, såsom KASP 12 , 13 , 14. Detta protokoll utfördes med zebrafiskar mef2ca b1086 stam.
  2. KASP genotypning
    Obs: Allel specifika primrar för KASP är designade av det företag som tillhandahåller reagenserna (se Tabell för material). För att erhålla lämpliga 6-karboxylgrupp-X-rodamin (ROX) färgämne koncentrationen för specifika realtids PCR-maskinen besök företagets webbplats.
    1. Plats zebrafiskar svans vävnaden i 50 μl lyseringsbuffert (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% icke-jonisk tensid, 0,3% Octylphenyl-polyetylenglykol). Tillsätt 10 µL av 10 mg/mL proteinas-K per brunn av en PCR-plattan med 96 brunnar och sammanfattad i en termocykel vid 55 ° C för 2-5 h följt av en 20 min 94 ° C inaktivering steg. Kylskåp lysis produkten efter matsmältningen.
      Obs: Lysis produkter kan användas framgångsrikt för flera månader efter beredning. När vävnad var lyserat med 50 mM NaOH, var KASP reaktionerna misslyckat. Dessa fynd tyder på att NaOH framställningsmetoden genomisk DNA inte är kompatibel med KASP.
    2. Kvantifiera genomisk DNA med en spektrofotometer. Späd genomisk DNA mallen med molekylärbiologi grade vatten så att varje reaktion innehåller ca 20-30 ng.
      Obs: Kvantifiera 4 eller 5 prover, samla dem och sedan preparera utspädningar för alla typmodeller baserat på genomsnittet. När du använder detta protokoll för vuxna svans vävnad, räcker ofta en spädning 1: 100. Exakt kvantifiering av DNA-koncentration krävs inte.
    3. Lägg till 0,14 µL KASP primern blanda och 5 µL KASP befälhavaren blanda per prov på is i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och blanda väl innan kort centrifugering för att samla in innehåll längst ned på röret.
      Obs: KASP master mix är värme och ljuskänsliga, hålla lager på is och undvika direkt ljus.
    4. Pipettera 5 µL av primer/master blanda lösningen i brunnar 96 brunnar optiska PCR-platta som lämpar sig för realtids PCR-maskinen används.
    5. Pipettera 5 µL utspädd (ca 5-7 ng/µL) DNA mall-prover i varje brunn och aspirera med en pipett till blanda.
    6. Tillsätt 5 µL nuclease-fritt vatten till 3 brunnar att tjäna som nr-mall kontroller (NTC) och tillsätt 5 µL utspädda bekräftade homozygot vildtyp, heterozygot och homozygot muterad DNA mall för positiva kontroller.
    7. Placera en optiskt klart filmen sigill över plattan säkerställa att filmen är helt slutna på varje brunn.
    8. Kort Centrifugera plattan vid 600 x g att samla innehållet längst ned och ta bort bubblor från mixen.
      Obs: Hålla plattan på is och sköld från ljus tills redo att fortsätta.
    9. Använda cykling programmet visas i tabell 1 för att utföra de viktigaste KASP reaktionen.
    10. Visa resulterande spridningsdiagrammet produceras av analys datorn. En framgångsrik reaktion kommer att visa 4 distinkta grupperingar av punkter på tomten ( figur 3): tre prov grupperingar motsvarar genotyp och en gruppering av NTCs nära ursprunget. De positiva kontrollerna bör avskilja med lämpligt urval CB.
    11. Om programmet inte känner igen tomten grupperingar som motsvarar specifika genotyper, ytterligare cykling uppsättningar kan vara krävs (tabell 2). Upprepa programmet ytterligare tills datorn identifierar snäva grupperingar av genotyp.
    12. Exportera genotypning resultaten till en kalkylbladsfil för lättare användning och analys.
  3. Hus identifierade heterozygot djuren tillsammans på vatten huvudsystemet.

2. den första rundan av avkomman Scoring

  1. Pairwise cross syskon heterozygoter
    1. efter djuren återhämta sig från fin klippet, ställa in parvisa intercrosses. Använd avdelare för att säkerställa embryon är synkron 16.
    2. Samla embryona och hålla föräldra par isolerade i avel burar.
    3. Övervaka isolerade vuxna så att aggressiv fisk kan separeras eller medföljer cover (strimlad fisk nät arbete fint). Fisk ska matas och deras vatten ändrats följer IACUC riktlinjer medan i statiska vatten.
  2. Embryo uppfödning
    1. scenen och höja de zebrafiskar embryona som larver under standart villkorar 17.
    2. Samla fenotypiskt vildtyp djur med glas pipett på dag 5 eller 6 när simblåsan är uppblåst i 75% av kopplingen. Placera fenotypiska vilda typer i barnkammaren inspelning av där föräldrarna gett dem.
      Obs: Med muterade alleler som är recessiv livsfarlig, vilket är sant i många skelett mutanter, homozygot mutanter misslyckas att formuläret Simblåsor 18 , 19. Därför fenotypiska vilda typer lätt kan urskiljas från deras muterade syskon baserat på uppblåsta Simblåsor.
  3. Alcian Blue/Alizarin Red brosk och ben färgning
    1. söva larver som inte blåsa upp sin Simblåsor med 0,17 g/L Tricaine-S i embryo media. Samla djuren i 1,5 mL mikrocentrifugrör med ett wide-bore glas Pasteur Pipettera. Lägga till mer än 100 larver per rör.
    2. Ta bort embryot vatten från varje rör och fixa djur i 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS per rör.
      Varning: Vattenhaltiga PFA är brännbara och kommer att orsaka allvarliga hud- och ögonirritation. Använd lämplig personlig skyddsutrustning som handskar och skyddsglasögon, och tvätta händerna noggrant efter användning.
    3. Rock för 1 h; längre fixering försämrar ben färgning. Kontrollera rören regelbundet under detta och alla efterföljande gungande steg att se till att inga larver ha fastnat på sidan eller klumpgranulat i botten av röret.
    4. Ta bort fixeringsvätskan från rören med glas pipett, tillsätt 1 mL 50% etanol, och rock för 10 min.
    5. Förbereda färska färgning lösning genom att lägga till 20 µL 0,5% Alizarin Red per 1 mL Alcian premix (0,04% Alcian Blue/10 mM MgCl 2 / 80% etanol). Ta bort 50% etanol, tillsätt 1 mL färgning lösning i varje rör, och rock över natten. Larverna kan förbli i fläcken i upp till 5 dagar.
    6. Ta bort fläcken lösningen från rören och tillsätt 1 mL 80% etanol/10 mM MgCl 2 lösning till varje rör. Rock rören för minst 1 tim. sköljer över natten kan producera en tydligare Alcian blå fläck.
    7. Ta bort den 80% etanol/10 mM MgCl 2 lösning från rören och tillsätt 1 mL 50-procentig etanol; rock för 5 min.
    8. Ta bort 50% etanol lösningen från rören och tillsätt 1 mL 25% etanol och rock för 5 min.
    9. Ta bort 50% etanol lösningen från rören och tillsätt 1 mL nyberedd 3% H 2 O 2 /0.5% KOH blekning lösning. Lämna caps öppna och låt rören står i ett mikro-tube rack i ca 10 min eller tills en svag brunfärgning kan ses i den övre delen av lösningen.
      Obs: Ett lager av bubblor form ovanpå lösningen. Noggrann timing krävs vid detta steg, som över blekning kommer att resultera i en dålig dubbel fläck.
    10. Ta bort den blekning lösningen och tillsätt 1 mL 25% glycerol/0.1% KOH; rock för 10 min till 1 h.
    11. Ta bort 25% glycerol/0.1% KOH-lösning från rören, tillsätt 1 mL 50% glycerol/0.1% KOH lösning i varje rör, rock i 10 min till över natten.
    12. 50% glycerol/0.1% KOH lösning ta bort rören och lägga igen till 50% glycerol/0.1% KOH lösning till varje rör. Gunga hjälper över natten bort luftbubblor som kan ackumuleras inuti larverna. Store målat skelett preparat vid 4 ° C när den inte används.
  4. Fenotyp scoring
    1. Poäng målat muterade avkomman för penetrans av den valda fenotypen. I Nichols o.a. 1 mutanter var gjorde för en förekomst av ektopisk ben.
      Obs: Eftersom zebrafiskar föräldrarna är i statiska vatten och Alizarin Red fläcken kan blekna med tiden, det är viktigt att Poäng skelett inom några dagar att fullborda skelett beredning.
    2. Penetrans är andelen av en genotyp som har en fenotyp. Beräkna den procentuella penetrans genom följande formel:
      % penetrans = (mutanter med fenotyp) / (totalt antal mutanter) × 100

3. Familjens val

  1. Välj två hög penetrans och två låga penetrans familjer för nästa generation. Förutom penetrans är det viktigt att överväga fruktsamhet och kraft när du väljer vilka familjer att fortplanta; Se diskussion för mer detaljer om detta.
  2. Ge varje föräldra par en sub lager identifierare: familjen.01,.02, etc.
  3. Hus föräldra par på det huvudsakliga systemet med flera blandade kön ' följeslagare ' fisk. Följeslagare fisk kan vara några zebrafiskar linje med permanent, uppenbara kännetecken, såsom förändrad pigmentering eller fin struktur.
    Obs: Medan många forskare hålla framgångsrikt bara häckande par i en tank, gynnsamma resultat av bostäder par med flera följeslagare fiskar. Detta valfria steg gör häckande par av djur hållas i större skolor och Hämtad enkelt så de kan korsas flera gånger som behövs. Föräldrarnas par kan korsas flera gånger för att generera stora full-syskon familjer; vänta minst en vecka innan repeat passerar samma föräldra par.
  4. Slakta larval familjer från steg 2.2.2. som inte valts för nästa generation.
  5. Etikett de tankar som innehåller larvaena vildtyp syskon från valda familjer med penetrans från deras muterade syskon och höja till vuxenlivet som vanligt.
  6. Nästa generation kommer att ha minst fyra full-syskon familjer, två för uppåtgående linjen och två för den nedåtgående linjen.
  7. När larverna når könsmognad, upprepa protokollet börjar vid steg ett med den nya generationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll är en långsiktig djurhållning teknik användbar för förståelse zebrafiskar skelett mutanter (figur 1). Selektiv avel av avkomman testning bör ge en förskjutning i övergripande penetrans både nedåt och uppåt i några generationer (figur 2). I vårt tidigare arbete körde två omgångar av selektiv formeringen den genomsnittliga penetrans nedåt från 17% till 3%1. På samma sätt i vår uppåtgående linje skiftade vi den genomsnittliga penetrans uppåt från 63% till 93% i tre generationer. Om efter fyra rundor av selektiv avel inte svarar penetrans nedåt eller uppåt, är det möjligt att den fenotyp som att vara poängsätts inte är känsliga för selektiv avel av avkomman testning.

I en framgångsrik KASP utförs förfarande, snäva grupperingar av prover som motsvarar genotyp bör erkännas av datorprogrammet och NTCs bör vara nära beskärningen av tomten efter tillräcklig cykler har varit (figur 3). Om grupperas KASP scatter plot data inte tätt eller kontaminering i en NTC upptäcks, kommer programmet att kunna avgöra genotyper. Om de flesta prover redovisas av genotyp gruppering, men det finns fortfarande några som är tvetydiga, kan utelämna obestämd prover från datauppsättningen programmet känna igen genotypning kluster. Obestämd prov samtal och tvetydiga genotyp gruppering kan resultera från följande: förorenade reaktion blandningar där NTCs inte grupperar nära ursprunget, alltför utspädd mall DNA orsakar prover att hitta nära beskärningen under utspädda mall DNA , eller otillräckligt antal reaktion cykler. Förbereda färska NTCs om föroreningar misstänks.

En framgångsrik Alcian Blue/Alizarin Red fläck kommer ha livfullt missfärgade ben och brosk element (figur 4A) som inte är genomskinlig eller svimma (figur 4B). Gränserna för brosk elementen ska visas skarpa, och enskilda kondrocyter blir märkbara. Alizarin Red ben fläcken är vanligtvis den mer petiga av två fläckar. Solfjäderformad opercle (op) ben och klubba formad branchiostegal strålar (br) är bra indikatorer på en framgångsrika 6 dagar efter befruktning (dpf) ben fläck (figur 4A, op, br). Det blekning steget bör inte blekna fläckarna i ben och brosk samtidigt fullt clearing andra vävnader i färg. Ögonen kommer att ha en brun nyans även efter lyckad färgning och clearing. Alcian blå som är alltför koncentrerad kommer inte klar från andra vävnader att göra analys omöjligt (figur 4 c). Alcian Blue från leverantörer än den som beskrivs i materialets tabell kan också producera dålig brosk fläckar.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk översikt av selektiv avel för skelettet penetrans av avkomman testning. (A) genotyp en full-syskon familj från en mutant linje att identifiera heterozygota bärare. (B) korsar sekvensinpassning identifierade heterozygot syskon, och hålla föräldrar isoleras till dess avkomma kan vara poängsätts. (C) placera fenotypiskt vildtyp larver med uppblåsta Simblåsor i barnkammaren att höjas till vuxenlivet och åtgärda muterade larver utan uppblåsta Simblåsor för brosk och ben färgning. (D) Poäng varje koppling Alcian blå/Alizarin Red målat muterade djur för penetrans. Välj vilka familjer kommer att betäckas uppåt och nedåt och höja de fenotypiska vilda typerna från varje familj till vuxen ålder. (E) huset föräldra par med kamrater så att de kan korsas flera gånger för att generera stora full-syskon familjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Exempel på skiftande skelett Mutant penetrans av avkomman testning. Selektiv avel tillämpades som beskrivs i detta manuskript på zebrafiskar mef2cab1086 mutant. I detta experiment, som vi valt för höga eller låga penetrans av ektopisk ben mellan opercle och den branchiostegal ray i dödliga homozygot mutanter. Penetrans av ektopisk ben hos muterade avkomman tilldelades till föräldrarnas paret som var färgkodade efter penetrans som visas. Denna siffra ändrades från1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Skärmdump från programvara för KASP genotypning och resultat analyser.
I denna framgångsrika KASP reaktion bildades snäva prov grupperingar. Blå punkter är homozygot mutant, gröna punkter är heterozygota, röda punkter är homozygot vildtyp och svarta rutor är groupingsna NTCs. designerades av datorprogrammet. NTCs ligger nära ursprunget till tomten betecknar lite till ingen reaktion blandning kontaminering. Obestämd prover som ännu inte har tilldelats en genotyp skulle anges med x. Det finns ingen obestämd prover som är närvarande i denna framgångsrika avslutade kör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Bra, dåliga och fula Alcian Blue/Alizarin röd skelett preparat.
(A) visas ett exempel på en fräsch, fint färgade och rensade brosk och ben fläck. Observera de distinkta brosk element och enkelt visualiseras röd opercle (op) och branchiostegal ray (br) ben. (B) en svag brosk fläcken med bleka Alizarin Red fläcken visas. Detta prov satt vid 4 ° C i många månader resulterar i bleka brosk samt opercle och branchiostegal ray ben som är svåra att skilja. (C) en alltför färgade larv där alltför mycket Alcian Blue användes. Skalstapeln är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selektiv avel avslöjar subtiliteter genfunktion

Skifta mutant fenotyper för att vara mer eller mindre allvarliga genom selektiv avel är ett enkelt sätt att få nya insikter i geners funktion. Vid jämförelse med standardmetoder för omarkerade avel, kan det protokoll som presenteras här ge en mer fullständig förståelse av muterade fenotyper. Specifikt, genom att generera stammar som är allvarliga, kan hela bredden av muterade fenotyper avslöjas, inklusive några som var icke observerbara med omarkerade lager. Således kan nya utvecklande roller för genen studie upptäckas. Däremot kan genererar milda stammar avslöja de mest avgörande rollerna för gen av intresse. Ta, till exempel endast en enda fenotyp kvarstår i mild mutanter. Här är det sannolikt att den utvecklingsprocess som förblir störd i mild stam mest kritiskt kräver funktionen av genen. Därmed kan full fenotypiska serien av en viss mutation förstås mer fullständigt genom selektiv avel.

Att undvika inavel Depression

Avkomma till relaterade individer visar minskad överlevnad och fruktsamhet i många djur- och växtarter system, inklusive zebrafiskar20. Känd som inavel depression, de flesta modeller posit som ökade homozygosity på lokus med antingen recessiva skadliga alleler eller alleler som är fördelaktigt eftersom heterozygoter ligger bakom detta fenomen21. Studier med vildfångad zebrafisk avslöjar en låg frekvens av skadliga alleler i naturliga populationer22. Dessutom rensades ytterligare laboratorie stammar som AB recessiva letala mutationer23. Det verkar således att försiktig djurhållning kan möjliggöra obestämd inavel av valda zebrafiskar linjer. Faktiskt avslöjade en rapport nyligen att zebrafiskar kan upprätthållas av full-syskon inavel för minst 16 generationer9.

Detta protokoll betonar några enkla men kritiska steg för att säkerställa att inavlade zebrafiskar linjer fortsätter att producera tillräckligt avkomma för att vara användbar för utvecklande studier. Den mest avgörande aspekten av denna selektiv avel strategi är urvalsprocessen själv. För det första måste utveckla djur övervakas noga så att familjer med defekter eller avvikelser, olänkade att mutationen av intresse, kan väljas strikt mot. Andra, koppling storlek bör övervägas, eftersom selektiv avel kräver stora familjer. Förutom att välja par som ger stora kopplingar, stora familjer kan genereras genom upprepad korsningar av samma föräldra par. Att hålla föräldra par tankar med många andra följeslagare fisk som är lätt urskiljas från det häckande paret, såsom pigmentering eller fin mutanter, möjliggör långsiktiga bostäder av häckande par i stora hawaiimonark grupper medan ger dem möjlighet att fortfarande vara enkelt identifieras och Hämtad. Denna praxis främjar en hälsosam social miljö där föräldrarnas paret är fria att shoal med andra zebrafiskar24. Ännu kan forskaren enkelt hämta föräldrarnas paret så att de kan korsas flera gånger, möjliggör generering av mycket stora full-syskon familjer.

Att välja en valbar fenotyp

Detta protokoll innebär en hel del fenotyp scoring. Således är en begränsning att urvalet måste tillämpas på en fenotyp som är enkelt att visualisera och Poäng snabbt. Det är också viktigt att besluta på vilken scen djur kommer att vara fast och färgade för poängsättning. För ben fenotyper är det fördelaktigt att vänta tills 6 dpf eftersom benen är mer utvecklat25 och görs enkelt. För brosk mönstring mutant fenotyper, är 4 dpf ofta lämplig för fenotyp scoring26,27. Beslutar när man ska fixa djur, är det viktigt att överväga om genen av intresse har pleiotropiska roller leder till utvecklingsmässiga mutant fenotyper i andra vävnader, vilket kan resultera i confounding sekundära defekter. Exempelvis med skelett mutanter som också visar hjärtat ödem är det viktigt att fixa på 4 dpf innan sekundära defekter som en allmän försening i kondrogenes manifesteras26.

För enkelhetens skull valde vi en binär poängsystem med fokus på penetrans för vår selektiv avel. Mutant fenotyper kan dock också ha variabel expressivitet. I framtida studier, det ska bli intressant att testa om, liksom penetrans, är expressivitet känsliga för selektiv avel. D.v.s. kan frekvensen av specifika ektopisk ben former ändras genom selektiv avel?

Det här protokollet beskriver strategin klassiska selektiv avel av avkomman urval och dess tillämpning på zebrafiskar utvecklingsmässiga genetiska studier. De okomplicerade djurhållningspraxis som beskrivs här är möjliga i något laboratorium, även i små anläggningar. Genom selektiv avel, en av de största styrkorna i systemet zebrafiskar, kan fogligt genetik, utnyttjas för att lära sig om geners funktion i nyutvecklade mutanter samt mutanter som har spridits i årtionden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Chuck Kimmel för vägledning, John Dowd för hjälp att utveckla denna avel strategi, Macie Walker för hennes arbete med att finslipa skelett fläcken, och Charline Walker och Bonnie Ullmann för bra zebrafiskar råd. Detta arbete stöds av K99/R00 DE024190 till JTN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde, pelleted, solid Ted Pella Co. 18501 Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid Acros Organics 223210010
10x PBS, Aqueous Fisher BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid Anatech Ltd. 867 Must be from Anatech
Alizarin Red, solid Sigma A5533-25G
Glycerol, liquid Fisher BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid Fisher BP263500
Potassium hydroxide,  solid Fisher P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 4346906
Microseal 'B' seal BioRad MSB1001
KASP Master Mix, High ROX LGC KBS-1016-022 https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix LGC KBS-2100-100
Tris HCl, solid Fisher BP153 500
potassium chloride, solid Fisher BP366 500
Tween-20, liquid Fisher BP337 100
Nonidet P40 ThermoFisher 28324
Tricaine-S Western Chemicals
Proteinase K Fisher BP1700 100
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets Fisher 13-678-30
Nanodrop ThermoFisher for DNA quantitation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
  2. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
  3. Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
  4. DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
  5. McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
  6. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
  7. Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
  8. Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
  9. Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
  10. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
  11. Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
  12. He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
  13. Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
  14. Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
  15. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
  16. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  18. Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
  19. McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
  20. Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
  21. Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
  22. McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
  23. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  24. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
  25. Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
  26. Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
  27. Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi problemet 127 zebrafiskar kraniofaciala skelett selektiv avel avkommeprövning familj urval Kompetitive allel specifika PCR djurhållning brosk penetrans genen mutanta fenotypen
Skiftande zebrafiskar dödliga skelett Mutant penetrans av avkommeprövning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brooks, E. P., Nichols, J. T.More

Brooks, E. P., Nichols, J. T. Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing. J. Vis. Exp. (127), e56200, doi:10.3791/56200 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter