Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

Abstract

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא תגובה מתח זה מאופיין על ידי מעצר צמיחה סלולרי יציב, וזה חשוב עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון סרטן, הזדקנות. לאחרונה, הזדקנות ביולוגית גם היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות. לכן, זה הפך קריטי יותר ויותר לזהות תאים senescent ויוו. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) assay הוא הבדיקה הנפוצה ביותר לזהות תאים senescent הן בתרבות והן ויוו. Assay הזה מבוסס על התכנים lysosomal מוגבר תאים senescent, מה שמאפשר זיהוי פתולוגיה lysosomal β-galactosidase פעילות ב- pH suboptimum (6 או 5.5). לעומת מבחני אחרים, כגון cytometry זרימה, זה מאפשר הזיהוי של תאים senescent בסביבתם תושב, המציע מידע בעל ערך כגון מיקום הנוגעים הארכיטקטורה רקמות, המורפולוגיה, ו האפשרות של צימוד עם סמנים אחרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC). המגבלה העיקרית של SA-β-גל וזמינותו היא הדרישה של דגימות טרי או קפוא.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מקדמת הסלולר פלסטיות ורקמות התחדשות בתוך vivo. אנו משתמשים SA-β-גל כדי לזהות תאים senescent בשריר השלד על פגיעה, אשר היא מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות. יתר על כן, אנו משתמשים IHC כדי לזהות Nanog, סמן של תאי גזע pluripotent, במודל של עכברים מהונדס. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון ולכמת הזדקנות ביולוגית הסלולר בהקשר של פלסטיות הסלולר המושרה ואת ויוו התכנות.

Introduction

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא צורה של התגובה לעקה מאופיין על ידי מעצר יציב של מחזור התא. בעשור האחרון, מחקר הקימה בחוזקה הזדקנות ביולוגית מזוהה עם תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים כולל התפתחות, פיברוזיס של האורגניזם בתהליך ההזדקנות1,2. הזדקנות ביולוגית הסלולר זוהה לראשונה ב fibroblasts האנושי בסוף על תוחלת החיים שלהם replicative המופעלות על-ידי טלומר קיצור3. מלבד הלחץ replicative, ישנם הרבה גירויים אחרים, זה יכול לגרום הזדקנות ביולוגית, כולל ה-DNA נזק, סטרס חמצוני, אותות oncogenic גנומית/epigenomic תיקונים קטנים, שכל אחד מהם יכול בסופו של דבר להפעיל המסלולים p53/p21 ו/או pRB כדי לבסס ולחזק את מעצרו של צמיחה קבוע1. אחד המאפיינים החשובים של תאים senescent הוא שהם נשארים פעילים סמויה ו robustly אקספרס (SASP) הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה: הפרשת ציטוקינים דלקתיים רבים, גורמי גדילה ו מטריצה חוץ-תאית גורמים4. גורמים SASP הוצעו כדי לשחק תפקיד חשוב תיווכה ותגביר את אפקט הזדקנות ביולוגית, בגלל השפעתם חזק על משיכת תאים חיסוניים ושינוי המקומי ומערכתית רקמת milieus1. מעניין, הזדקנות ביולוגית הוצע לאחרונה להיות חשובה עבור רקמות תיקון והתחדשות5,6. בנוסף, נתונים מספר מעבדות, כולל שלנו, הציע כי רקמת נזק-induced הזדקנות ביולוגית יכול להגביר פלסטיות סלולרית, באמצעות SASPs, כדי לקדם התחדשות7–9. לכן, כל הנתונים המתעוררים להדגיש את החשיבות של לימוד הזדקנות ביולוגית בתוך vivo.

בעידן פוסט pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) פלסטיות הסלולר הוא הקיבולת של תא לרכוש זהות חדשה, לאמץ מגורל חלופי כאשר הם נחשפים לגירויים שונים ב- תרבות, אין ויוו10. זה ידוע כי התכנות מלאה יכולה להיות מושגת ויוו11,12, שבו הביטוי בקלטת המכיל ארבעה גורמים יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4ו- c-Myc (OSKM) יכול להיות מושרה ויוו לקדם היווצרות teratomas באיברים רבים. לכן, מודל העכבר reprogrammable (i4F) יכול לשמש מערכת חזקה כדי לזהות הרגולטורים קריטי מסלולים חשובים עבור הסלולר פלסטיות11.

מערכת מתאימה ורגיש ויוו הכרחי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מסדיר פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. כאן, אנו מציגים מערכת איתנה, פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות ביולוגית פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. הנזק שריר שילוב של cardiotoxin (אקס) המושרה בקבוצה השריר השוקתי הקדמי (TA), מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות, המודל העכבר i4F, מאפשר הזיהוי של הזדקנות ביולוגית הסלולר והן vivo התכנות במהלך התחדשות השרירים.

כדי להעריך את הקשר בין הסלולר פלסטיות הזדקנות ביולוגית, עכברים i4F נפגע עם אקס כדי לגרום לנזק חריפה הינם מטופלים עם דוקסיציקלין (0.2 מ"ג/מ"ל) במשך 7 ימים כדי לגרום ויוו התכנות. אמנם אקס המושרה לנזק חריפה התחדשות פרוטוקול כבר שפורסמו לאחרונה13, מסיבות מוסריות, הליך זה יושמט בפרוטוקול הנוכחי. TA שריר מדגמים ייאספו בגיל 10 ימים שלאחר פגיעה13, כאשר השיא של תאים senescent בעבר נצפו14. . הנה, פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית (דרך SA-β-גל) ואת התיכנות (דרך IHC צביעת של Nanog).

הזדקנות ביולוגית-הקשורים בטא-galactosidase (SA-β-גל) וזמינותו היא וזמינותו הנפוצות ביותר לזהות senescent התאים שניכם תרבות, אין ויוו15. לעומת מבחני אחרים, וזמינותו SA-β-גל מאפשר הזיהוי של התאים senescent בסביבה הטבעית שלהם האדריכלות רקמות ללא פגע, אשר חשוב במיוחד למחקר ויוו . יתר על כן, זה אפשרי זוג וזמינותו SA-β-גל עם סמנים אחרים באמצעות IHC. עם זאת, וזמינותו SA-β-גל לדרוש את דגימות טרי או קפוא, הנשאר מגבלה עיקרית. כאשר רקמות טרי או קפוא זמינות באופן שגרתי, כגון דגימות שריר ת א קפואים, SA-β-גל היא כמובן וזמינותו המתאימים ביותר כדי לזהות תאים senescent. Nanog הוא הסמן להשתמש כדי לזהות תאים reprogramed משתי סיבות: 1) זה סמן חיוני עבור pluripotency; 2) ויותר חשוב, הביטוי שלה לא מונעת על ידי דוקסיציקלין (dox), ולכן הוא מזהה pluripotency המושרה במקום הביטוי כפויה בקלטת יאמאנאקה.

חשוב לציין, הפרוטוקולים מכתימים שהוצגו במחקר זה יכול להתבצע בנפרד כדי לפשט את ההליך כמת, אך ניתן לבצע גם הליך שיתוף מכתימים כדי להמחיש את שניהם senescent, גזע pluripotent על אותו סעיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חיות שטופלו לפי הנחיות הקהילה האירופית, ועדת האתיקה של הפרוטוקולים Institut Pasteur (CETEA) אישרה.

1. ההכנות של הפתרונות מניות

  1. להכין את החומרים לבניית השריר לדוגמה קיבוע. להמיס 0.5 ג'י tragacanth מסטיק עם 20 מ ל מים ב RT כדי להפוך המדיום הטבעה-הקפאה עבור שריר קיבעון.
  2. להכין את הפתרונות עבור צביעת SA-β-גל-
    1. להכין מלאי פתרונות של K 3 Fe(CN) 6 (100 מ מ), K 4 Fe(CN) 6 (100 מ מ), MgCl 2 (1 מ') על ידי המסת אבקות בהתאמה במים מזוקקים.
    2. להכין את הפתרון מניות של 0.2% C 20 H 6 Br 4 נה 2 O 5 (אאוזין) על-ידי לדלל אותה במים.
    3. להכין הפתרון מניות של C 14 H 15 BrClNO 6 (X-גל) (50 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת אבקה X-גל ב- C 3 H 7 אין (dimethylformamide, DMF).
    4. K חנות 3 Fe(CN) 6 ו- K פתרונות 4 Fe(CN) 6-4 ° C, ו- MgCl 2-RT.
      הערה: X-גל ניתן לאחסן ב- aliquot ב-20 ° C, עד 6 חודשים. אאוזין הפתרון יכול להיות שמרו ב RT, לאחר סינון במידת הצורך. K-3-Fe(CN)-6 K 4 Fe(CN) 6 פתרונות protectedfromthe אור בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. X-גל פתרון אינו יציב במים והוא חייב להיות מוגן מפני האור.
  3. הכנה של הפתרונות Nanog מכתים: הפתרון permeabilization מכיל 0.1% נה 3 ג' 6 H 5 או 7 (ציטראט trisodium), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (טריטון X-100) במים מזוקקים, אשר צריך להיות מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין את הפתרון חסימה המכילה 5% סרום שור עוברית (FBS) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), צריך להיות מאוחסן ב- RT.

2. Staining SA-β-גל בחלק שריר TA קפוא

  1. להכין החומר קיבוע עבור שריר ת א על ידי הנחת כמות קטנה של tragacanth מסטיק על חתיכת פקק.
  2. עכברים נפגע משני המינים (2 בן חודש, C57/B6) נפצעו 10 ימים לפני עם cardiotoxin (CDX) כפי שתואר לעיל 13. שימוש שאינו נפגע TA (הזרקת PBS) מן העכבר זהה של הפקד שלילי. אם אין ויוו התכנות רצוי, לטפל בכל עכבר עם Dox (1 מ"ג/מ"ל) במי השתייה באותו יום (מוגן מפני האור), מיד לאחר הפציעה אקס.
    הערה: הפתרון Dox צריך להיות שונה כל 3 ימים עבור משך הטיפול הכולל של 7 ימים.
    1. לבודד שני השרירים TA (נפגע ולשלוט) של עכברים כפי שתואר לעיל ( איור 1 א') 13. כדי להבטיח הסעיפים רוחבי, להכניס המסטיק tragacanth הגיד דיסטלי של שריר ת א ולא להשאיר בערך ¾ חלק השריר בחוץ ( איור 1B) ומקפיאים ישירות בחנקן נוזלי מקורר איזופנטאן עבור < 1 הגבלת
      הערה: ודא שלשריר ת א הוא מאונך, במרכז של הפקק. דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C, או ישירות cryosectioned בסעיפים 10 מיקרומטר.
  3. לעבד את השרירים TA כפי שמתואר על איור 1B.
    1. להפיץ 1 th st-10 סעיפים בסדר הנכון על גבי עשר שקופיות שונות במיקום השמאלי העליון של כל שקופית. למקם את המקטע th 11 סמוכים במקטע st 1 בשקופית הראשונה; בסעיף ה 12 יעברו באותו סדר למקם נכון חוץ בסעיף 2 nd על שקופית ראשונה. חזור על תהליך זה עד סעיפים 10/שקופית מתקבלים עבור שקופיות עשר (סעיפים 100 סה כ) כדי להבטיח מינימום 1 מ"מ המרחק בין החלק הראשון לבין המקטע האחרון.
  4. לתקן את הסעיפים במשך 4 דקות ב- PBS המכיל 1% paraformaldehyde ו- 0.2% גלוטראלדהיד. לשטוף עם PBS, 2 x 10 דקות. בשלב הבא, דגירה בסעיפים PBS (ה-pH = 5.5) במשך 30 דקות לבצע את כל השלבים ב RT.
    הערה: הקיבעון חייב להיות מתון כדי לשמור על פעילות אנזימטיות. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. ה-pH של מגניב הוא קריטי, הפתרון X-גל חייב להיות מוגן מפני האור.
  5. Incubate במקטעים המכילים X-גל פתרון: 4 מ מ K3Fe(CN) 6, 4 מ מ K4Fe(CN) 6, 2 מ מ MgCl2 ו 400 µg/mL X-גל ב- PBS, pH = 5.5. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 24h. לשטוף את השקופיות עם PBS, 3 x 10 דקות, ב- RT.
    הערה: הדגירה דורש מינימום של 24 שעות ביממה, יכול להימשך למשך 48 שעות על מנת למקסם את האות SA-β-גל. הפתרון צריך להיות שונה לאחר 24 שעות של דגירה. השקופיות צריכים להיות מוגנים מפני אור. אם רק מכתימה SA-β-גל היא הרצויה, המשך לשלב 2.5. אם צביעת במשותף עם Nanog רצוי, אנא דלג קדימה לשלב 3.1.
    6. Paraformaldehyde
  6. תיקון שקופיות 1% ב- PBS במשך 30 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 10 מינימלית Counterstain עם 0.2% אאוזין. לטבול את השקופיות הפתרון אאוזין עבור 1 דקות ולשטוף אותם עם מים מזוקקים בקצרה. לבסוף, לטעון את השקופיות מימית-שאינם-ואזוריט הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: זה חיוני לבצע את קיבוע שאחרי. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. כל הפעולות מבוצעות ב- RT.

3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן Anti-Nanog

  1. לתקן את השקופיות עם PBS המכיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות לשטוף עם PBS, 2 x 10 דק להוסיף 200 µL של הפתרון permeabilization ישירות על השקופיות, תקופת דגירה של 5 דקות.
    1. שטיפת שקופיות עם PBS, 2 x 5 דקות, בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל 0.25% BSA ישירות על השקופיות. ביצוע כל הצעדים הללו-RT.
      התראה: בצע את שלב קיבוע מתחת למכסה המנוע.
  2. Incubate שקופיות עם נוגדן נגד ראשי-Nanog (ריכוז סופי: 1.25 ug/mL) לילה ב 4 ° C ב- PBS המכילה 5% FBS. שקופיות עם PBS, 2 x 10 דקות וקונטה בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל BSA 0.25% עבור 5 דק. בצע כל הכביסה מדרגות בכל RT.
    הערה: דגירה שקופיות בתוך קופסה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע אידוי.
    3. שקופיות
  3. Incubate עם µL 100 של נוגדנים משניים ראב-HRP מ מוכן לשימוש קיט (ראה טבלה של חומרים) במשך 45 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 5 דק ', כדי להסיר נוגדנים משניים. לבצע את כל השלבים ב RT עם הגנה מפני האור.
  4. ויזואליזציה
    1. תחילה, לדלל את 3,3 '-diaminobenzidine (ג 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), כי אמחה קלות) במאגר המצע מסופקים על ידי מוכן להשתמש ערכת (20 µL של DAB עבור 1 מ"ל של המצע בופר). להוסיף 100 µL של פתרון DAB ישירות על גבי כל שקופית ולאחר תקופת דגירה של לכל היותר 10 דקות ב- RT.
      הערה: הפתרון מדולל DAB צריך להיות מוכן טרי, ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 º C. זמן הדגירה יכול להיות מותאם כדי למזער את האות רקע אבל חייב להישמר זהה עבור כל השקופיות.
    2. להסיר הפתרון DAB על ידי שטיפה עם מים. Counterstain השקופיות עם פתרון מהיר אדום (מוכן להשתמש, ראה את הטבלה של חומרים) במשך 20 דקות לשטוף את השקופיות עם מים שוב בקצרה.
    3. מייבשים אותם עם אתנול 95% עבור 5 מ'ואחריו 100% אתנול, 2 x 5 דקות. לבסוף, לטעון את השקופיות הקשחת מהיר הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).
    4. לצפות בשקופיות במיקרוסקופ בשדה בהיר בגיל 20 X כדי להימנע רקע.
      הערה: פתרון מהיר אדום יכול להיות שמרו ב RT ומשמש מחדש לאחר סינון.

4. ניתוח, כימות

  1. SA-β-גל כמת
    1. סרוק את השקופיות ובחרו הסעיפים הכי טוב בכל שקופית המבוסס על תמונות נרכשות. להשתמש לפחות 2 סעיפים/ת א עבור כימות. לשפוט את המקטע ' s איכות המבוססת על רקמות תקינות, איכות של צביעת, ו counterstaining. עבור כימות, לבחור בין שני המקטעים באיכות הגבוהה ביותר עם המרחק אפשרי המקסימלי בין דגימות, אשר מאפשר ייצוג טוב יותר של SA-β-גל כימות לאורך כל השריר TA-
    2. כימות של SA-β-גל חיובי תאים ( איור 2).
      1. לקבוע הדירוג של גודל פיקסל על-ידי בחירה ידנית הקטן ביותר, את התאים SA-β-גל חיובי הגדול.
        1. פתחו את התמונה הדיגיטלית של השקופית סריקה באמצעות תוכנת ImageJ.
        2. הממשק, לחץ על ' ניתוח ' > ' כלי ' > ' רועי מנהל ' > ' ניתוח ' > ' קבע מדידה ' > ' בחר אזור '. השתמש בכלי בחירה ולהקיף הקטן ביותר ואת הכי חיובי SA-β-גל תא ולהוסיף אותו למנהל רועי על ידי לחיצה על ' הוסף '. למדוד את גודל באמצעות ' מידה ' כפתור ולשמור את הערכים לשימוש מאוחר יותר.
      2. להתאים את הפרמטר סף כדי להבטיח כל התאים הגלויים חיובי נבחרו.
        1. להמיר התמונה סולם אפור על ידי לחיצה ' תמונות ' > ' סוג ' > ' 8 סיביות ' ( איור 2 א). בשלב הבא, ללכת ' תמונות ' > ' התאם ' > ' סף ', להזיז את הסמן השני עד כל התאים SA-β-גל חיובי מכוסים בצבע אדום ( איור 2B) ולאחר מכן לחץ ' החל '.
        2. ניתוח חלקיקים על-ידי לחיצה ' נתח ' > ' חלקיקים לנתח ' > ' גודל (פיקסל ^ 2) ', והחלת את הערך המוגדר בשלב 4.1.2.1, הזן ' מעגליות ': ' 0.00 1.00 ', לחץ על ' בסדר '; סיכום של כל מה חלקיקים שנספרו מוצג במנהל ROI ( איור דו-ממדי).
      3. להעביר את כל החלקיקים שנבחרו לתמונה המקורית. להתאים את הבחירה באופן ידני כדי להבטיח כימות מדויק. הוסף תאים חיוביים (חץ ירוק, איור 2E) ו/או להסיר תאים חיובי כוזב (חץ אדום, 2E איור). לבסוף, למדוד את השטח על ידי חלוקה לרמות באמצעות סעיף ( איור דו-ממדי) ' הכלי בחירה '. לחץ על ' רועי מנהל ' > ' הוסף ' > ' מידה '.
      4. חשוב, לנרמל את מספר התאים חיובי על-ידי האזור של המקטע.
  2. Nanog כמת
    1. לספור את התאים Nanog חיובי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באופן ידני בהגדלה X 20-
      הערה: counterstaining מהר אדום מאפשר הערכה טובה של המורפולוגיה של שריר ת א. עם זאת, ההכתמה קלילה מאוד, חסר מתווה ברור של המקטע. הסורק לעיתים קרובות לא יצליח לזהות את הגבול של הסעיפים, לא יכול להתמקד כראוי. זה אפשרי להשתמש סמן בעיגול את הקצוות של הסעיפים לפני סריקה או להשתמש בסורק רגיש יותר לזהות את המקטע. עבור פרוטוקול הנוכחי, זה היעילה לספור את התאים חיובי Nanog באופן ידני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גילוי שריר הנוצרות על-ידי פגיעה הסלולר הזדקנות ביולוגית

זה לאחרונה הוכח כי פגיעה בשריר גורם הזדקנות ביולוגית הסלולר ארעי14. ב- 10 ימים לאחר פציעה (DPI), רוב myofibers פגום הם עוברים תהליך התחדשות עם גרעינים במיקום מרכזי, סימן היכר של רגנרציה myofibers, ואת הארכיטקטורה של השריר נוצרת מחדש. תאים דלקתיים infiltrating מופחתים באופן דרמטי תוך שמירה על גלוי באזורים מסוימים. 10 DPI מהווה נקודת זמן טוב לזהות תאים senescent מאת SA-β-גל, כיוון שיש פחות נמק דלקתיים ותאי נוכח לשריר להפריע ההכתמה. כדי לקבוע יחודיות של ההכתמה, TA הזריק PBS מהעכבר אותו (איור 1 א') משמש פקד שלילי קריטי.

כדי להבטיח הערכה טובה יותר ומדויקת יותר של תאים חיוביים SA-β-גל, מקטעים של מטוסים שונים של שריר TA מוצבים את אותה שקופית (איור 1B). מונה מכתים עם אאוזין חשוב עבור כימות אוטומטית של התאים SA-β-גל חיובי על-ידי תוכנת ImageJ. אאוזין מונה מכתים מתווה המקטע, אשר מאפשר בסורק דיגיטלי לזהות הסעיפים עם המוקד הנכון. חשוב להגדיר בקפידה הטווח ואת סף הגילוי (איור 2 א-ד). בנוסף, תהליך ידני אצר חיוני כדי לאפשר זיהוי, כימות (איור 2E) מדויק יותר.

הזדקנות ביולוגית הסלולר מקלה ויוו התכנות בשריר

מודל העכבר reprogrammable (i4F) מספק מערכת אידיאלית כדי להעריך את ההשפעה של הזדקנות ביולוגית-פלסטיות הסלולר והתחדשות. על פגיעה בשריר, עכברים i4F מטופלים עם dox לזירוז התיכנות ויוו. 7 ימים dox (1 מ"ג/מ"ל) הטיפול הוא מספיק כדי לגרום התכנות ברמה התאית, תוך עדיין להיות נסבל היטב על ידי עכברים (איור 3 א). לכן, נקצור השרירים פצועים-DPIs 10 מ i4F עכברים שטופלו dox במשך 7 ימים.

למרות שניתן לבצע שיתוף ההגדלה של SA-β-גל עם Nanog, לא מומלץ על כימות בשל פוטנציאל הפרעה מוכתמים. כפי שהוזכר לעיל, מונה מכתים חיונית לגילוי סורק דיגיטלי. הדלפק הטוב צביעת עבור SA-β-גל יחד עם Nanog הוא orhematoxylin מהר אדום. עם זאת, מונה מכתים עשוי להסוות מעל האות ' SA-β-גל ' או ' Nanog. לכן, על כימות מדויקת יותר, עדיף לבצע אותם בנפרד בשקופיות רצופים (איור 3B). מאת לכימות SA-β-גל חיובי ותאים Nanog חיובי משקופיות סמוכים, הקמנו מתאם חיובי ביניהם (איור 3C), רומז על מעורבות פוטנציאלי של הזדקנות ביולוגית-פלסטיות הסלולר והתחדשות.

Figure 1
איור 1: להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית לאחר פגיעה בשריר. (א) ייצוג סכמטי של האסטרטגיה פציעת שריר בשימוש כדי לגרום הזדקנות ביולוגית. (B) ייצוג סכמטי של הכנת סעיף שריר. (ג) תמונות נציג של SAβGal מכתים counterstained עם אאוזין. חצים הצבע התאים SA-β-גל+ . גודל ברים = 50 מיקרומטר. (ד) כימות של SA-β-גל+ תאים פצוע, פצוע שאינו TA-השריר. כל נקודה מקביל חיה בודדים. מובהקות סטטיסטית הוערכה על ידי דו-זנבית Student´s מבחן t: * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: כימות של SA-β-גל+ תאים על-ידי תוכנת ImageJ. (י-ם) צילומי מסך של קטע שריר בממשק התוכנה ImageJ. צילום מסך של המרת תמונת מקטע שרירים כדי אפור מידה (א); בחירת כל רכיב ה-SA-β-גל + תאים באזור ' ' (ב'); ניתוח החלקיקים שנבחר (ג); סיכום של כל particals שנספרו במנהל ROI (D). (ה) מסך צילום של תהליך curation ידנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הערכת ויוו התכנות לאחר פגיעה בשריר. (א) ייצוג סכמטי להעריך ויוו התכנות הזדקנות ביולוגית ורמת לאחר פגיעה בשריר. (B) להחליפן בתמונות של SA-β-גל ו Nanog מכתים במקטעי קפוא של שרירי השלד פגום. SAβGal מכתים counterstained עם אאוזין (משמאל). נוגדן של Nanog counterstained עם רד מהר (מימין). השרירים נפגע שאינם מוצגים על השריר הפגוע ועליון להלן. גודל ברים = 50 מיקרומטר. (ג) כמת, המתאם של SA-β-גל + ותאים Nanog+ בסעיפים רצופים (n = 9 עכברים, הערך מייצג הממוצע של 2 סעיפים לכל העכבר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נפח עבור 50 מ
פתרון6 K3Fe(CN) מניות 100 מ מ 2 מ
100 מ מ במניה K-4פתרון6 Fe(CN) 2 מ
MgCl 1 מ'2 100 ΜL
50 מ"ג/מ"ל X-גל 400 ΜL
PBS (pH 5.5) 45.50 mL

טבלה 1: ההרכב של 50 מ ל X-גל פתרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לאתר את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד של עכברים reprogrammable. ניתן להשתמש בשיטה זו להעריך לכמת בשני הזדקנות ביולוגית, זירוז פלסטיות הסלולר ויווושל לבחון את התפקיד של הזדקנות ביולוגית של רקמות תיקון והתחדשות.

בפרוטוקול הנוכחי, וזמינותו הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) משמש כדי לזהות ויוו senescent התאים בשריר השלד. Assay זו מזהה את פעילות מוגברת lysosomal β-galactosidase ב- pH suboptimum (6.0 או 5.5), הקשורים באופן ספציפי עם תאים senescent, בזמן הפעילות של אנזים זה נמדד בדרך כלל ב- pH חומצי 4.516,17. לכן, חשוב להתאים את רמת החומציות (pH = 6 או 5.5) כדי להבטיח זיהוי ספציפי של פעילות הקשורים הזדקנות ביולוגית. בנוסף, מונה מכתים עם אאוזין הוא חיוני עבור כימות אוטומטית של תאים SA-β-גל+ , איפה אותות חלשים וחסרי ' מאטום לשקוף ' אינן נספרות. כדי למנוע את השתנות פוטנציאליים, עדיף כי אותו אדם יבצע כל תהליך הספירה.

למרות וזמינותו SA-β-גל ביותר בשימוש נרחב ומקובל סמן עבור תאים senescent, זה לא סמן בלעדית עבור הזדקנות ביולוגית. הוצע כי confluent יתר התאים בתרבות עלול לגרום חיוביות כוזבות SA-β-גל18. הרגישות של וזמינותו יכול להיות סוג התא והקלד הרקמות תלויות ויוו19. לכן, יש צורך להשתמש סמנים הקנוני עצמאיים אחרים, כגון חוסר שגשוג, ביטוי מוגבר של מגשרים הזדקנות ביולוגית (p16 הב, p53, p21, p27), ההפרשה של גורמים שונים SASP, נוסף לאשר ולאפיין הזדקנות ביולוגית בתוך vivo. יתר על כן, ראוי פקדים שליליים הם לארגונה לפרש תוצאות, במיוחד עבור לימוד ויוו .

למרות העובדה כי SA-β-גל assay אינו מושלם, הוא מספק מידע חשוב במיוחד למחקר ויוו . היא מאפשרת הגילוי של תאים senescent בסביבתם תושב האדריכלות רקמות ללא פגע, מתן מידע קריטי בקידום של ההבנה של תפקיד התאים senescent שונים פיזיולוגיים ופתולוגיים הקשרים. יתר על כן, זה יכול להיות משולב עם immunostaining של סמנים אחרים, כגון סמני פני שטח התא כדי לקבוע את זהות הסלולר של תאים senescent; stemness סמני לבחון מעורבות אפשרית של הזדקנות ביולוגית התחדשות, tumorigenesis או.... בעבר, ביצענו את הבדיקה SA-β-גל עם נוגדן של Nanog באותו מקטע או בסמיכות לחקור את הקשר הפוטנציאלי בין הזדקנות ביולוגית ויוו התכנות8. בעוד פרוטוקול זה מתמקדת שרירי השלד, זה ניתן בהחלט להרחיב לרקמות אחרות.

לאחרונה, הזדקנות ביולוגית הסלולר היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות, ככל הנראה באמצעות SASPs-7,-8,-9. הבנת המנגנונים של איך הזדקנות ביולוגית תורמת רקמות תיקון והתחדשות בהחלט תהיה השפעה עצומה על רפואה רגנרטיבית. זה וזמינותו מספק כלי חשוב ובעל ערך כדי להקל על הזיהוי, כימות של senescent תאים ויוו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

. אנחנו חבים Clemire Cimper לתמיכה טכנית מעולה שלה. העבודה במעבדה של מרגשת מומן על ידי מכון פסטר, מרכז לאומי pour la רשרש מדעי, ואת סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (d'Excellence Laboratoire Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-16-CE13-0017-01) ואת Fondation ארק (PJA 20161205028). . סיסי, איי. סי ממומנות על ידי Ph.d., פוסט דוקטורנטים מן האיחוד להחיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 128 הזדקנות ביולוגית הסלולר ויוו התכנות גזע pluripotent העכבר reprogrammable מודל פגיעה בשריר cardiotoxin התחדשות הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase מכתים
הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, <em>In Vivo</em> התכנות בשריר השלד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter