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Developmental Biology

चोट प्रेरित वार्धक्य के मूल्यांकन और कंकाल की मांसपेशी में Vivo reprogramming में

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

यहां हम चोट पर कंकाल की मांसपेशी में दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है, जबकि vivo reprogramming में उत्प्रेरण । यह विधि ऊतक पुनर्जनन और vivo मेंreprogramming के दौरान सेलुलर वार्धक्य की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

सेलुलर वार्धक्य एक तनाव प्रतिक्रिया है कि एक स्थिर सेलुलर विकास गिरफ्तारी, जो कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं, जैसे कैंसर और उंर बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है की विशेषता है । हाल ही में वार्धक्य को टिशू रिपेयर और पुनर्जनन में भी फंसाया गया है । इसलिए, विवो मेंहोनेवाला कोशिकाओं की पहचान के लिए यह तेजी से अहम हो गया है । वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (SA-β-Gal) परख है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख दोनों संस्कृति में होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए और vivo में। यह परख होनेवाला कोशिकाओं में वृद्धि हुई लाइसोसोमल सामग्री पर आधारित है, जो लाइसोसोमल β-galactosidase गतिविधि के उप इष्टतम पीएच (6 या ५.५) में histochemical का पता लगाने की अनुमति देता है । ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में अंय परख, के साथ तुलना में, यह उनके निवासी वातावरण में होनेवाला कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है, जो इस तरह के ऊतक वास्तुकला से संबंधित स्थान के रूप में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है, आकृति विज्ञान, और immunohistochemistry (आइएचसी) के माध्यम से अन्य मार्करों के साथ युग्मन की संभावना. एसए के प्रमुख सीमा-β-लड़की परख ताजा या जमे हुए नमूनों की आवश्यकता है ।

यहां, हम कैसे सेलुलर वार्धक्य सेलुलर प्लास्टिक और vivo मेंऊतक पुनर्जनन को बढ़ावा देता है समझने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम एसए का उपयोग-β-लड़की चोट है, जो एक अच्छी तरह से स्थापित करने के लिए ऊतक पुनर्जनन अध्ययन प्रणाली है पर कंकाल की मांसपेशी में होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए । इसके अलावा, हम एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में Nanog, pluripotent स्टेम कोशिकाओं के मार्कर का पता लगाने के लिए आइएचसी का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल हमें की जांच करने और प्रेरित सेलुलर प्लास्टिक और vivo reprogramming में के संदर्भ में सेलुलर वार्धक्य मात्रा में सक्षम बनाता है ।

Introduction

सेलुलर वार्धक्य तनाव प्रतिक्रिया का एक रूप है एक स्थिर कोशिका चक्र की गिरफ्तारी की विशेषता । पिछले दशक में, अनुसंधान मजबूती से स्थापित किया है कि वार्धक्य भ्रूण विकास, फाइब्रोसिस सहित विभिन्न जैविक और रोग प्रक्रियाओं के साथ जुड़ा हुआ है, और1उम्र बढ़ने जीव,2. सेलुलर वार्धक्य पहले मानव fibroblasts में उनकी प्रतिकृति उंर के अंत में पहचाना गया था telomere छोटा करने से ट्रिगर3। प्रतिकृति तनाव के अलावा, वहां कई अंय उत्तेजनाओं कि डीएनए क्षति, oxidative तनाव, oncogenic संकेतों, और जीनोमिक/epigenomic परिवर्तन, जिनमें से कोई भी अंततः p53/p21 और/या pRB रास्ते को सक्रिय कर सकते है सहित वार्धक्य पैदा कर सकता है स्थापित करने और स्थाई विकास की गिरफ्तारी के मजबूत1। होनेवाला कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक यह है कि वे चयापचय सक्रिय रहते है और मजबूती से एक वार्धक्य-जुड़े स्रावी phenotype (SASP): कई भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव, विकास कारकों, और extracellular मैट्रिक्स व्यक्त कारक4. SASP कारकों के लिए मध्यस्थता और वार्धक्य प्रभाव बढ़ाना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का प्रस्ताव किया गया है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आकर्षित करने और स्थानीय और प्रणालीगत ऊतक milieus में फेरबदल पर उनके शक्तिशाली प्रभाव के कारण1. दिलचस्प है, वार्धक्य हाल ही में ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन5,6के लिए महत्वपूर्ण होना प्रस्तावित किया गया है । इसके अलावा, हमारे सहित कई प्रयोगशालाओं से डेटा, सुझाव दिया है कि ऊतक क्षति प्रेरित वार्धक्य सेलुलर प्लास्टिक की वृद्धि हो सकती है, SASPs के माध्यम से, पुनर्जनन7-9को बढ़ावा देने के लिए । इसलिए, सभी उभरते आंकड़ों vivo मेंअध्ययन वार्धक्य के महत्व पर प्रकाश डाला ।

पोस्ट में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) युग, सेलुलर प्लास्टिक एक सेल की क्षमता के लिए एक नई पहचान प्राप्त करने और एक वैकल्पिक जब दोनों संस्कृति में अलग उत्तेजनाओं और vivo में10से अवगत कराया भाग्य को अपनाने है । यह ज्ञात है कि पूर्ण reprogramming vivo11,12 मेंप्राप्त किया जा सकता है, जहां चार यामानाका कारकों से युक्त कैसेट की अभिव्यक्ति: Oct4, Sox2, Klf4, और सी-Myc (OSKM) कई अंगों में teratomas गठन को बढ़ावा देने के लिए vivo में प्रेरित किया जा सकता है । इसलिए, एक reprogramming माउस मॉडल (i4F) एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में महत्वपूर्ण नियामकों और रास्ते है कि सेलुलर प्लास्टिक की11के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एक उपयुक्त और vivo में संवेदनशील प्रणाली को समझने की कैसे सेलुलर वार्धक्य ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में सेलुलर प्लास्टिक को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है । यहाँ, हम एक मजबूत प्रणाली और ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में वार्धक्य और सेलुलर प्लास्टिक के बीच कड़ी का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । Tibialis पूर्वकाल (टीए) मांसपेशी समूह में cardiotoxin (CTX) प्रेरित मांसपेशी क्षति का संयोजन, ऊतक पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणाली, और i4F माउस मॉडल, दोनों सेलुलर वार्धक्य का पता लगाने की अनुमति देता है और vivo में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान reprogramming ।

सेलुलर प्लास्टिक और वार्धक्य के बीच लिंक का मूल्यांकन करने के लिए, i4F चूहों तीव्र मांसपेशी क्षति पैदा करने के लिए CTX के साथ घायल हो गए हैं और 7 दिनों से अधिक doxycycline (०.२ मिलीग्राम/एमएल) के साथ इलाज vivo reprogramming में प्रेरित करने के लिए । जबकि एक CTX प्रेरित तीव्र मांसपेशी क्षति और पुनर्जनन प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है13, नैतिक कारणों के लिए, इस प्रक्रिया को वर्तमान प्रोटोकॉल में लोप हो जाएगा । टीए मांसपेशी नमूने 10 दिन चोट के बाद13में एकत्र किया जाएगा, जब होनेवाला कोशिकाओं के शिखर पहले14मनाया गया है । यहाँ, इस विस्तृत प्रोटोकॉल वार्धक्य के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन करता है (सा के माध्यम से-β-लड़की) और reprogramming (Nanog के आइएचसी धुंधला के माध्यम से).

वार्धक्य-जुड़े बीटा-galactosidase (एसए-β-लड़की) परख सबसे अधिक इस्तेमाल किया परख है होनेवाला कोशिकाओं दोनों संस्कृति में और vivo मेंपता लगाने के लिए15। अंय परख की तुलना में, SA-β-लड़की परख बरकरार ऊतक वास्तुकला, जो vivo अध्ययन में के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के साथ अपने पैतृक वातावरण में होनेवाला कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह जोड़ी के लिए संभव है सा-β-अंय मार्करों के साथ आइएचसी का उपयोग कर लड़की परख । हालांकि, SA-β-लड़की परख ताजा या जमे हुए नमूनों की आवश्यकता है, जो एक प्रमुख सीमा बनी हुई है । जब ताजा या जमे हुए ऊतकों को नियमित रूप से उपलब्ध हैं, ऐसे जमे हुए टा मांसपेशी नमूने के रूप में, एसए-β-लड़की जाहिर है सबसे उपयुक्त परख होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए है । Nanog दो कारणों के लिए reprogramed कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया मार्कर है: 1) यह pluripotency के लिए एक अनिवार्य मार्कर है; 2) अधिक महत्वपूर्ण बात, अपनी अभिव्यक्ति doxycycline (dox) से प्रेरित नहीं है, इसलिए यह यामानाका कैसेट की मजबूर अभिव्यक्ति के बजाय प्रेरित pluripotency का पता लगाता है ।

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, इस अध्ययन में प्रस्तुत दाग प्रोटोकॉल ठहराव प्रक्रिया को सरल करने के लिए अलग से आयोजित किया जा सकता है, लेकिन यह भी एक सह में किया जा सकता है एक ही खंड पर दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं कल्पना करने के लिए प्रक्रिया धुंधला ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > पशुओं को यूरोपीय समुदाय के दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया और institute पाश्चर (CETEA) की एथिक्स कमेटी ने अनुमोदित चलत.

< p class = "jove_title" > 1. स्टॉक समाधानों की तैयारियां

  1. मांसपेशी नमूना निर्धारण के लिए सामग्री तैयार करते हैं । tragacanth गम के ०.५ g भंग करने के लिए आरटी में 20 मिलीलीटर पानी के साथ मांसपेशियों के निर्धारण के लिए ठंड-embedding मध्यम बनाने के लिए ।
  2. के लिए समाधान तैयार करें SA-& #946;-Gal धुंधलान.
    1. के स्टॉक समाधान तैयार करें k 3 Fe (CN) 6 (१०० mM), k 4 Fe (CN) 6 (१०० mM), MgCl 2 (1m) आसुत जल में संबंधित चूर्ण को भंग करके ।
    2. के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ०.२% C 20 H 6 Br 4 न 2 O 5 (Eosin) करके इसे पानी में कमजोर ।
    3. के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें c 14 h 15 BrClNO 6 (x-gal) (५० mg/मब) को भंग करके x-gal powder को c 3 h 7 (dimethylformamide, DMF).
    4. Store k 3 Fe (cn) 6 और k 4 fe (cn) 6 समाधान at 4 & #176; C, और MgCl 2 at RT.
      नोट: X-gal में संग्रहित किया जा सकता aliquot पर-20 & #176; C, 6 माह तक । Eosin समाधान आरटी में रखा जा सकता है और यदि आवश्यक छानने के बाद reused । k 3 Fe (cn) 6 और k 4 Fe (cn) 6 समाधान protectedfromthe प्रकाश हैं । एक्स-लड़की समाधान पानी में स्थिर नहीं है और प्रकाश से संरक्षित किया जाना है ।
  3. Nanog धुंधलाने के लिए समाधानों की तैयारी: permeabilization समाधान में ०.१% न 3 C 6 H 5 O 7 (trisodium साइट्रेट), ०.१% c 14 h 22 o (c 2 h 4 O) n (n = 9-10) (ट्राइटन X-१००) आसुत जल में, 4 & #176 पर संग्रहित किया जाना चाहिए; C. फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), जो आरटी.
    4. में संग्रहित किया जाना चाहिए युक्त अवरुद्ध समाधान तैयार
< p class = "jove_title" > 2. सा-& #946;-लड़की धुंधला पर जमे हुए टा मांसपेशी धारा

  1. tragacanth गम की एक छोटी राशि काग की एक स्लाइस पर रखकर टा मांसपेशी के लिए निर्धारण सामग्री तैयार करते हैं ।
  2. घायल चूहों दोनों लिंगों (2 महीने पुराने, C57/B6) के साथ 10 दिन पहले घायल हो गए cardiotoxin (CDX) पहले वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > १३ . नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही माउस से गैर घायल (पंजाबियों इंजेक्शन) टा का प्रयोग करें । अगर vivo reprogramming में वांछित है, एक ही दिन (प्रकाश से सुरक्षित) पर पीने के पानी में Dox (1 मिलीग्राम/एमएल) के साथ प्रत्येक माउस का इलाज, सही CTX चोट के बाद ।
    नोट: Dox समाधान 7 दिनों की कुल उपचार अवधि के लिए हर 3 दिन में परिवर्तित करने की आवश्यकता है ।
    1. पहले वर्णित के रूप में चूहों से दोनों टा मांसपेशियों (घायल और नियंत्रण) को अलग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ) < सुप वर्ग = "xref" > १३ . अनुप्रस्थ वर्गों को सुनिश्चित करने के लिए, tragacanth गम में टा मांसपेशी के बाहर का पट्टा डालें और मोटे तौर पर & #190 छोड़ दें; बाहर की मांसपेशी का हिस्सा (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्र 1b ) और फ्रीज सीधे तरल नाइट्रोजन में कूल्ड isopentane for & #60; 1 min.
      नोट: सुनिश्चित करें कि टा मांसपेशी एक सीधा स्थिति में है और काग के केंद्र में है । नमूनों पर संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C या धे cryosectioned म 10 & #181; मी वर्गों.
  3. प्रक्रिया टा मांसपेशियों के रूप में वर्णित < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b .
    1. प्रत्येक स्लाइड के ऊपरी बाएँ स्थान पर दस भिन्न स्लाइड पर सही क्रम में 1 st -10 th अनुभागों को वितरित करें. प्रथम स्लाइड पर 1 st अनुभाग के निकटवर्ती 11 th अनुभाग को रखें; 12 गु खंड दूसरी स्लाइड पर 2 एन डी अनुभाग के अलावा सही रखा जा करने के लिए इसी क्रम का पालन करेंगे । इस प्रक्रिया को दोहराएं 10 अनुभाग/स्लाइड तक दस स्लाइड (कुल में १०० अनुभाग) के लिए पहले खंड और अंतिम अनुभाग के बीच ंयूनतम 1 mm दूरी सुनिश्चित करने के लिए प्राप्त कर रहे हैं ।
  4. 1% paraformaldehyde और ०.२% glutaraldehyde वाले पंजाबियों में 4 मिनट के लिए वर्गों को ठीक । पंजाबियों से धो लें, 2x & #160; 10 min. अगले, पंजाब में वर्गों की मशीन (पीएच = ५.५) 30 मिनट के लिए RT.
    पर सभी चरणों का पालन करें नोट: निर्धारण एंजाइमी गतिविधि बनाए रखने के लिए हल्के होना चाहिए । हुड के तहत इस कदम का प्रदर्शन । पंजाब के पीएच महत्वपूर्ण है और एक्स-लड़की समाधान प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए ।
  5. में एक्स-लड़की समाधान की मशीन युक्त: 4 मिमी K3Fe (cn) 6 , 4 मिमी K4Fe (cn) 6 , 2 मिमी MgCl2, और ४०० & #181; g/एमएल एक्स-लड़की पंजाब में, पीएच = ५.५ । ३७ पर अंधेरे में मशीन & #176; C 24 के एक ंयूनतम के लिए ज. पंजाब, 3x 10 मिनट, RT.
    पर के साथ स्लाइड धो लो नोट: मशीन 24 घंटे की एक ंयूनतम आवश्यकता है और ४८ घंटे के लिए पिछले कर सकते है को अधिकतम करने के लिए SA-& #946;-लड़की संकेत । समाधान के लिए गर्मी के 24 घंटे के बाद बदलने की जरूरत है । स्लाइड को प्रकाश से सुरक्षित किया जाना चाहिए । यदि केवल SA-& #946;-Gal धुंधला करना वांछित है, चरण २.५ से जारी रखें । यदि Nanog के साथ सह-धुंधलाना वांछित है, तो कृपया आगे बढ़ें कदम ३.१.
  6. 30 मिनट के लिए पंजाबियों में 1% paraformaldehyde में स्लाइड तय करें । ०.२% eosin के साथ पंजाब, 3x 10 min. Counterstain के साथ स्लाइड धो लें । 1 मिनट के लिए eosin समाधान में स्लाइड विसर्जित और आसुत जल के साथ संक्षेप में उन्हें कुल्ला । अंत में, जलीय गैर fluorescing बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट (सामग्री के तालिका देखें) ।
    नोट: इसके उपरांत निर्धारण का कार्य करना अनिवार्य है । हुड के तहत इस कदम का प्रदर्शन । सभी कदम RT.
    7. पर प्रदर्शन कर रहे हैं
< p class = "jove_title" > 3. Immunohistochemistry प्रयोग विरोधी Nanog एंटीबॉडी

  1. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde युक्त पंजाबियों के साथ स्लाइड को ठीक करें । पंजाबियों, 2x 10 मिनट के साथ धो २०० & #181; सीधे स्लाइड पर permeabilization समाधान के एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए मशीन ।
    1. । पंजाबियों, 2x 5 मिनट और पिछले धोने में के साथ स्लाइड धो २०० & #181 का उपयोग करें; L पंजाबियों से युक्त ०.२५% BSA सीधे स्लाइड पर । RT.
      पर इन सभी चरणों का पालन करें चेतावनी: डाकू के तहत निर्धारण कदम प्रदर्शन ।
  2. प्राथमिक विरोधी Nanog एंटीबॉडी के साथ मशीन स्लाइड (अंतिम एकाग्रता: १.२५ यूजी/रातोंरात 4 & #176; ग में 5% FBS युक्त पंजाबियों । पंजाबियों के साथ स्लाइड धो, 2x 10 मिनट और पिछले धोने में उपयोग २०० & #181; L पंजाबियों से युक्त ०.२५% BSA के लिए 5 min. RT.
    पर सभी धुलाई कदम प्रदर्शन नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए गीले कागज तौलिया के साथ एक बॉक्स में स्लाइड की मशीन.
  3. के साथ १०० & #181; L की ऄब-एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए तैयार किट (देखें Table of सामग्री ) के लिए ४५ min., 3x 5 मिन के साथ स्लाइड धो, माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए । सभी चरणों को प्रकाश से सुरक्षा के साथ RT पर निष्पादित करें.
  4. दृश्यावलोकन
    1. प्रथम, पतला 3, 3 & #39;-diaminobenzidine (c 12 h 14 N 4 c 12 h 18 Cl 4 N 4 ( 4 HCl), ढाब) में सब्सट्रेट बफर द्वारा प्रदान की किट का उपयोग करने के लिए तैयार (20 & #181; एल के लिए 1 मिलीलीटर सब्सट्रेट बफर समाधान). Add १०० & #181; ढाब समाधान के एल सीधे प्रत्येक स्लाइड पर और भ.
      पर 10 मिनट की एक अधिकतम के लिए मशीन नोट: पतला ढाब समाधान नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए और 4 & #176; C पर एक सप्ताह तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है । मशीन समय पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, लेकिन सभी स्लाइड के लिए एक ही रखा जाना चाहिए ।
    2. को पानी से कुल्ला करके ढाब हल निकाल लें । Counterstain तेज लाल समाधान के साथ स्लाइड (उपयोग करने के लिए तैयार, सामग्री के तालिका देखें) 20 मिनट के लिए । स्लाइड को पानी से धोकर फिर से संक्षिप्त करें.
    3. उंहें 5 मीटर के लिए ९५% इथेनॉल के साथ निर्जलीकरणमें १००% इथेनॉल, 2x 5 मिनट के बाद । अंत में, त्वरित-सख्त बढ़ते मध्यम (सामग्री के तालिका देखें) के साथ स्लाइड माउंट ।
    4. उज्ज्वल क्षेत्र में माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड 20X पर निरीक्षण पृष्ठभूमि से बचने के लिए ।
      नोट: तेज लाल समाधान आरटी पर रखा जा सकता है और छानने के बाद फिर से इस्तेमाल किया ।
< p class = "jove_title" > 4. विश्लेषण और ठहराव

  1. SA-& #946;-Gal ठहराव
      के
    1. स्लाइड को स्कैन करें और प्राप्त किए गए चित्रों के आधार पर प्रत्येक स्लाइड पर श्रेष्ठ अनुभागों का चयन करे । ठहराव के लिए कम 2 वर्गों/टीए का प्रयोग करें । न्यायाधीश धारा & #39; एस ऊतक अखंडता, धुंधला की गुणवत्ता, और counterstaining के आधार पर गुणवत्ता । ठहराव के लिए, नमूनों के बीच में अधिकतम संभव दूरी के साथ दो उच्चतम गुणवत्ता वर्गों का चयन करें, जो एसए-& #946 के बेहतर प्रतिनिधित्व की अनुमति देता है;-पूरे टा मांसपेशी भर में लड़की ठहराव ।
    2. ठहराव of SA-& #946;-Gal धनात्मक कक्ष (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
      1. मैन्युअल रूप से सबसे छोटा और सबसे बड़ा धनात्मक SA-& #946;-Gal कक्षों का चयन करके पिक्सेल आकार का रैंक निर्धारित करता है ।
        1. ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्कैन की गई स्लाइड की डिजिटल छवि खोलें ।
        2. में, & #39 पर क्लिक करें; श्लेष & #39; & #62; & #39; उपकरण & #39; & #62; & #39; रोि मैनेजर & #39; & #62; & #39; श्लेष & #39; & #62; & #39; सेट माप & #39; & #62; & #39; चय क्षेत्र & #39;. चयन उपकरण का उपयोग करें और सबसे छोटा और सबसे बड़ा सकारात्मक सा-& #946;-लड़की सेल और इसे रॉय प्रबंधक में जोड़ें पर क्लिक करके & #39; add & #39;. & #39 का उपयोग कर आकार को मापने; उपाय & #39; बटन और बाद में उपयोग के लिए मान सहेजें ।
      2. सभी दृश्यमान धनात्मक कक्षों को सुनिश्चित करने के लिए थ्रेशोल्ड पैरामीटर समायोजित करें चयनित हैं ।
        1. छवि को धूसर स्केल पर क्लिक करके परिवर्तित करें & #39; image & #39; & #62; & #39; टाइप & #39; & #62; & #39; 8-बिट & #39; (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 2a ). अगला, जाना & #39; Image & #39; & #62; & #39; समायोजित & #39; & #62; & #39; थ्रेसहोल्ड & #39;, तब तक दूसरा कर्सर ले जाएं जब तक कि सभी धनात्मक सा-& #946;-Gal कक्षों को लाल रंग में समाहित किया गया है (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा b ), तो click & #39; गू & #39;.
          2. क्लिक करके कणों का विश्लेषण
        2. & #39; श्लेष & #39; & #62; & #39; विश्लेषण कण & #39; & #62; & #39; आकार (पिक्सेल ^ 2) & #39;, और चरण 4.1.2.1 में निर्धारित मान को लागू करें, & #39; परिपत्र क & #39;: & #39; 0.00-1.00 & #39;, & #39 पर क्लिक करें; ok & #39;; एक सारांश सभी का गिना कणों रॉय प्रबंधक में दिखाया गया है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ).
      3. मूल छवि के लिए सभी चयनित कणों स्थानांतरण । सही ठहराव सुनिश्चित करने के लिए चयन को मैंयुअली समायोजित करें । धनात्मक कक्ष जोड़ें (हरा तीर, < सबल वर्ग = "xfig" > आरेख 2E ) और/या false धनात्मक कक्षों को निकालें (लाल तीर, < सबल वर्ग = "xfig" > आरेख 2E ). अंत में, खंड को रेखांकित करके क्षेत्र को मापने (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ) का प्रयोग & #39; चयन उपकरण & #39;. Click & #39; रोि धक & #39; & #62; & #39; Add & #39; & #62; & #39; उपाय & #39;.
      4. महत्वपूर्ण बात, अनुभाग के क्षेत्र द्वारा सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को सामान्य.
  2. Nanog ठहराव
    1. चमकीले क्षेत्र में माइक्रोस्कोप के तहत Nanog बढ़ाई पर मैन्युअल के तहत सकारात्मक कोशिकाओं की गणना 20X नोट: फास्ट रेड counterstaining टा मांसपेशी की आकृति विज्ञान का अच्छा मूल्यांकन की अनुमति देता है । हालांकि, धुंधला बहुत हल्का है और अनुभाग की एक स्पष्ट रूपरेखा का अभाव है । स्कैनर अक्सर अनुभागों की सीमा की पहचान करने के लिए विफल रहता है और सही रूप से फ़ोकस नहीं कर सकता । यह खंड का पता लगाने के लिए स्कैनिंग या एक अधिक संवेदनशील स्कैनर का उपयोग करने से पहले वर्गों के किनारों चक्र के लिए मार्कर का उपयोग करने के लिए संभव है. वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, यह सबसे Nanog सकारात्मक कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से गणना करने के लिए कुशल है ।

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Representative Results

मांसपेशियों की चोट का पता लगाने-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य

यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि मांसपेशी चोट क्षणिक सेलुलर वार्धक्य14लाती है । 10 दिनों के बाद चोट (डीपीआई), क्षतिग्रस्त myofibers के बहुमत केंद्र स्थित नाभिक के साथ उत्थान के दौर से गुजर रहे हैं, पुनः उत्पन्न myofibers की एक बानगी है, और मांसपेशियों की वास्तुकला फिर से स्थापित किया गया है । घुसपैठ भड़काऊ कोशिकाओं नाटकीय रूप से कम कर रहे हैं, जबकि कुछ क्षेत्रों में दिखाई शेष । 10 DPI एक अच्छा समय बिंदु एसए द्वारा होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए है-β-लड़की, के बाद से वहां कम गल और भड़काऊ मांसपेशी में मौजूद कोशिकाओं को धुंधला के साथ हस्तक्षेप । दाग की विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए, एक ही चूहे से पंजाब के साथ इंजेक्शन टीए (चित्र 1a) एक महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

एसए-β-Gal सकारात्मक कोशिकाओं का एक बेहतर और अधिक सटीक मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए, प्रादेशिक मांसपेशी के विभिन्न विमानों से वर्गों एक ही स्लाइड में रखा जाता है (चित्र 1b) । काउंटर eosin के साथ धुंधला ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा एसए-β-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं के स्वत: ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है । Eosin काउंटर धुंधला खंड है, जो डिजिटल स्कैनर सही ध्यान के साथ वर्गों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है रूपरेखा । यह ध्यान से रेंज और पता लगाने की दहलीज (चित्रा 2a-डी) को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, एक मैन्युअल रूप से उपचारात्मक प्रक्रिया और अधिक सटीक पता लगाने और ठहराव (चित्रा 2E) की अनुमति देने के लिए आवश्यक है ।

सेलुलर वार्धक्य की सुविधा में vivo reprogramming में पेशी

reprogramming माउस मॉडल (i4F) सेलुलर प्लास्टिक और पुनर्जनन पर वार्धक्य के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली प्रदान करता है । मांसपेशी चोट पर, i4F चूहों dox के साथ इलाज कर रहे हैं vivo मेंreprogramming प्रेरित करने के लिए. 7 दिन dox (1 मिलीग्राम/उपचार सेलुलर स्तर पर reprogramming प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, जबकि अभी भी अच्छी तरह से चूहों द्वारा सहन किया जा रहा है (चित्र 3ए) । इसलिए, हम i4F चूहों से 10 dpi में घायल मांसपेशियों की फसल 7 दिनों के लिए dox के साथ इलाज किया ।

हालांकि यह सह-सा के धुंधला प्रदर्शन करने के लिए संभव है-β-Nanog के साथ लड़की, यह ठहराव के लिए अनुशंसित नहीं है संभावित हस्तक्षेप दाग के कारण. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, काउंटर धुंधला डिजिटल स्कैनर का पता लगाने के लिए आवश्यक है । एसए के लिए सबसे अच्छा काउंटर धुंधला-β-Nanog के साथ एक साथ लड़की तेजी से लाल orhematoxylin है । हालांकि, काउंटर पर दाग या तो SA-β-Gal या Nanog संकेत पर मास्क हो सकता है । इसलिए, अधिक सटीक ठहराव के लिए, बेहतर है कि वे लगातार स्लाइड्स पर अलग से प्रदर्शन करें (चित्र बी) । द्वारा SA-β-Gal सकारात्मक और Nanog बगल स्लाइड से सकारात्मक कोशिकाओं को बढ़ाता है, हम उनके बीच एक सकारात्मक संबंध (चित्रा 3सी) की स्थापना की, सेलुलर प्लास्टिक और पुनर्जनन पर वार्धक्य की एक संभावित भागीदारी का सुझाव.

Figure 1
चित्रा 1: मांसपेशी चोट के बाद वार्धक्य स्तर का मूल्यांकन करें । (क) मांसपेशियों की चोट वार्धक्य प्रेरित किया रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) स्नायु अनुभाग तैयारी का योजनाबद्ध निरूपण. (ग) eosin के साथ SAβGal धुंधला counterstained के प्रतिनिधि छवियां । तीर SA-β-Gal+ कक्षों को इंगित करें । स्केल पट्टियां = ५० µm. (D) ठहराव सा-β-Gal+ कोशिकाओं में घायल और गैर-घायल टा-मांसपेशी । प्रत्येक डॉट एक व्यक्ति जानवर से मेल खाती है । सांख्यिकीय महत्व दो पूंछ छात्र ´ एस टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था: * * * p & #60; ०.००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: ठहराव-β-Gal+ की ImageJ सॉफ़्टवेयर द्वारा कक्ष । (a-D) ImageJ सॉफ्टवेयर इंटरफेस में एक मांसपेशी अनुभाग के स्क्रीन शॉट्स । ग्रे स्केल करने के लिए एक मांसपेशी अनुभाग छवि परिवर्तित करने के स्क्रीन शॉट (a); अनुभाग में सभी SA-β-Gal + कक्षों का चयन करना (B); चयनित कणों का विश्लेषण कर रहा है (C); रॉय प्रबंधक में सभी गिना particals का सारांश (D)। (ङ) मैनुअल उपचारात्मक प्रक्रिया की स्क्रीन शॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: की मांसपेशी चोट के बाद vivo reprogramming में मूल्यांकन । (क) vivo reprogramming और मांसपेशियों की चोट के बाद वार्धक्य स्तर में मूल्यांकन करने के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) एसए के प्रतिनिधि छवियों-β-लड़की और क्षतिग्रस्त कंकाल की मांसपेशी के जमे हुए वर्गों पर धुंधला Nanog । eosin के साथ SAβGal धुंधला counterstained (बाएं); तेज लाल (दाएं) के साथ Nanog counterstained का immunohistochemical दाग । गैर घायल मांसपेशियों के ऊपर और घायल मांसपेशी नीचे दिखाया गया है । स्केल पट्टियां = ५० µm. (C) ठहराव और SA-β-Gal + और Nanog+ के सहसंबंध क्रमिक अनुभागों में (n = 9 चूहों, मान प्रति माउस 2 अनुभागों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

५० एमएल के लिए वॉल्यूम
१०० mM स्टॉक K3Fe (CN)6 समाधान 2 मिलीलीटर
१०० mM स्टॉक K4Fe (CN)6 समाधान 2 मिलीलीटर
1 M MgCl2 १०० μL
५० मिलीग्राम/एमएल एक्स-लड़की ४०० μL
पंजाबियों (पीएच ५.५) ४५.५० एमएल

तालिका 1:५० मिलीलीटर X-gal समाधान की संरचना ।

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Discussion

यहां, हम reprogramming चूहों के कंकाल की मांसपेशी में दोनों होनेवाला और pluripotent स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और दोनों वार्धक्य यों तो और vivo मेंसेलुलर प्लास्टिक प्रेरित, और ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन में वार्धक्य की भूमिका की जांच ।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (SA-β-Gal) परख के कंकाल की मांसपेशी में vivo होनेवाला कोशिकाओं में का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस एंजाइम गतिविधि आम तौर पर अंलीय पीएच ४.५16,17पर मापा जाता है, जबकि यह परख, इष्टतम पीएच (६.० या ५.५) में वृद्धि हुई लाइसोसोमल β-galactosidase गतिविधि, होनेवाला कोशिकाओं के साथ विशेष रूप से जुड़े का पता लगाता है । इसलिए, यह वार्धक्य-संबद्ध गतिविधि का एक विशिष्ट पता लगाना सुनिश्चित करने के लिए पीएच (ph = 6 या ५.५) को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, eosin के साथ काउंटर धुंधला एसए के स्वत: ठहराव-β-लड़की+ कोशिकाओं, जहां कमजोर और फैलाना संकेतों की गिनती नहीं कर रहे है के लिए आवश्यक है । संभावित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, यह बेहतर है कि एक ही व्यक्ति पूरी गिनती प्रक्रिया करता है ।

हालांकि एसए-β-लड़की परख होनेवाला कोशिकाओं के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और स्वीकार किए जाते हैं, यह वार्धक्य के लिए एक विशेष मार्कर नहीं है । यह सुझाव दिया गया है कि संस्कृति में धाराप्रवाह कोशिकाओं एसए के लिए झूठी धनात्मकता का कारण हो सकता है-β-लड़की18। परख की संवेदनशीलता सेल प्रकार और ऊतक vivo19में निर्भर प्रकार हो सकता है । इसलिए, यह अन्य स्वतंत्र विहित मार्करों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, जैसे प्रसार की कमी, वार्धक्य मध्यस्थों की वृद्धि की अभिव्यक्ति (p16, एआरएफ, p53, p21, और p27), और विभिन्न SASP कारकों का स्राव, आगे की पुष्टि करने के लिए और विशेषताएं vivo मेंवार्धक्य । इसके अलावा, उचित नकारात्मक नियंत्रण परिणामों की व्याख्या के लिए अपरिहार्य हैं, विशेष रूप से vivo में अध्ययन के लिए.

तथ्य यह है कि एसए-β-लड़की परख सही नहीं है के बावजूद, यह vivo में अध्ययन के लिए विशेष रूप से बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है । यह अपने निवासी वातावरण में बरकरार ऊतक वास्तुकला के साथ होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए अलग शारीरिक और रोग में होनेवाला कोशिकाओं की भूमिका की आगे की समझ को सुविधाजनक बनाने संदर्भों. इसके अलावा, यह होनेवाला कोशिकाओं की सेलुलर पहचान निर्धारित करने के लिए सेल सतह मार्करों के रूप में अन्य मार्करों के immunostaining के साथ युग्मित किया जा सकता है; या उपजी मार्करों पुनर्जनन और tumorigenesis में वार्धक्य की क्षमता की भागीदारी की जांच करने के लिए । पहले, हम एक ही खंड में या बंद निकटता में वार्धक्य और vivo reprogramming8के बीच संभावित कड़ी की जांच करने के लिए Nanog के धुंधला immunohistochemical के साथ एसए-β-लड़की परख प्रदर्शन किया । हालांकि इस प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी पर ध्यान केंद्रित है, यह निश्चित रूप से अंय ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

हाल ही में, सेलुलर वार्धक्य ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन, सबसे SASPs7,8,9के माध्यम से होने की संभावना में फंसाया गया है । कैसे वार्धक्य ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन के लिए योगदान के तंत्र को समझना निश्चित रूप से अपक्षयी दवा पर एक जबरदस्त प्रभाव पड़ेगा । यह परख vivo मेंहोनेवाला कोशिकाओं की पहचान और ठहराव की सुविधा के लिए एक महत्वपूर्ण और मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम उसके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए Clemire Cimper के ऋणी हैं । H.L. की प्रयोगशाला में कार्य institute पाश्चर द्वारा वित्त पोषित किया गया, केंद्र राष्ट्रीय डालो ला सूक्ष्म वैज्ञानिक, और Agence नेशनल डे ला सूक्ष्म (Laboratoire d'Excellence पुनरुद्धार, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-७३), द Agence राष्ट्रीयकृत डे ला सूक्ष्म (ANR-16-CE13-0017-01) व स्नेहन चाप (PJA २०१६१२०५०२८). सीसी और एसी को पुनर्जीवित कंसोर्टियम से पीएच. डी और postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

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References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

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Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

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