Summary
여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.
Abstract
세포 노화는 안정적인 세포 성장 체포, 암과 노화 등 많은 생리와 병리학 과정에 대 한 중요 한 특징은 스트레스 반응이 다. 최근, 노화 또한 조직 수리 및 재생에 연루 되었습니다. 따라서, 그것은 점점 노화 세포에 vivo에서식별에 중요 한 되고있다. 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 노화 세포 모두 문화에 vivo에서감지 하는 가장 널리 사용 되 분석 결과가 이다. 이 분석 결과 기반 노화 세포에서 증가 lysosomal 내용을 lysosomal β-galactosidase 활동의 조직화 학적인 탐지 중형 pH 6 (5.5)에서 수 있습니다. 다른 분석 실험, cytometry, 같은 비교 관련 조직 구조, 형태, 위치와 같은 중요 한 정보를 제공 합니다 그들의 거주 환경에 노화 세포의 식별 수 있습니다 그리고 커플링 immunohistochemistry (IHC)를 통해 다른 마커와 가능성. SA-β-Gal 분석 결과의 주요 한계는 신선 또는 냉동 샘플의 요구 사항입니다.
여기, 우리가 어떻게 세포 노화를 이해 하는 상세한 프로토콜 현재 셀룰러 소성 및 조직 재생 비보를 촉진. SA-β-Gal 사용 하 여 조직 재생 연구에 기초가 튼튼한 시스템은 부상 시 골격 근육에 노화 세포를 감지. 또한, IHC 사용 하 여 유전자 변형 마우스 모델에서 Nanog, 만능 줄기 세포의 마커를 감지. 이 프로토콜 검사 하 고 세포 노화 유발된 세포가 소성 그리고 vivo에서 프로그래밍의 맥락에서 정할 수 있습니다.
Introduction
세포 노화 스트레스 응답 안정적인 세포 주기 검거가 특징의 한 형태입니다. 지난 10 년간에서 연구는 단단히 설립 노화 배아 개발, 섬유 증, 및1,2노화 하는 유기 체를 포함 하 여 다양 한 생물 학적 및 병 적인 프로세스와 연결 된. 세포 노화는 그들의 일차 수명 telomere 단축3에 의해 실행의 끝에 인간의 섬유 아 세포에서 처음 확인 되었다. 일차 스트레스, 노화, DNA 손상, 산화 스트레스, 종양 신호는의 결국에 p53/p21 또는 pRB 통로 활성화 하는 게놈/epigenomic 변경 등을 일으킬 수 있는 다른 많은 자극 있습니다. 설정 하 고 영구 성장 체포1강화. 노화 세포의 중요 한 특성 중 하나는 그들은 metabolically 활성 상태로 유지 하 고 견고 하 게 표현 하는 노화에 관련 된 분 비 형 (SASP): 많은 염증 성 cytokines, 성장 인자, 세포 외 매트릭스의 분 비 요인4. SASP 요소를 중재 하 고 면역 세포를 유치 하 고 지역 및 조직의 조직 milieus1변경에 그들의 강력한 효과 인해 노화 효과 증폭에 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 흥미롭게도, 노화 최근 제안 되었습니다 조직 수리 및 재생5,6에 대 한 중요 한 것. 또한, 우리를 포함 한 여러 연구소에서 데이터 조직 손상-유도 노화 세포가 소성, SASPs, 재생7-9홍보를 통해 강화 수 있습니다 제안 했다. 따라서, 모든 신흥 데이터 노화 비보의 중요성을 강조 표시 합니다.
게시물 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 시대에 세포가 소성은 새로운 정체성을 획득 하 고 두 문화 그리고 vivo에서10에 다른 자극에 노출 되 면 대체 운명 채택 셀의 능력 이다. 그것은 알려져 그 전체 프로그래밍 하 달성 vivo에서11,12, 수 어디의 표현은 4 야 마나카 요소를 포함 하는 카세트: Oct4, Sox2, Klf4및 c-Myc (OSKM) 유도 수 비보에 여러 장기에 teratomas 형성을 촉진. 따라서, 중요 한 레 귤 레이 터와 셀룰러 소성11에 대 한 중요 한 경로 식별 하는 강력한 시스템으로 재프로그래밍 마우스 모델 (i4F)를 사용할 수 있습니다.
적합 하 고 민감한 vivo에서 시스템은 어떻게 세포 노화를 이해에 필수적인 조직 재생의 맥락에서 세포가 소성을 조절. 여기, 우리는 강력한 시스템 및 노화와 조직 재생의 맥락에서 셀룰러 소성 사이의 링크를 평가 하는 상세한 프로토콜 제시. 유도 하는 cardiotoxin (CTX)의 조합 근육 손상 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 그룹, 조직 재생, i4F 마우스 모델을 공부 하 고 잘 설립 시스템에에서 수 세포 노화와 생체 내에서 의 검색 근육 재생성 하는 동안 프로그래밍.
세포가 소성 및 노화 사이의 링크를 평가 하려면 i4F 마우스 급성 근육 손상을 유발 하는 CTX 부상 되며 doxycycline (0.2 mg/mL) 7 일 이상 vivo에서 재프로그래밍을 유도 하는 것으로 치료. CTX 급성 근육 손상을 유발 하는 동안 재생 프로토콜 윤리적인 이유를 위해 최근에 출판 된13되었습니다 현재 프로토콜에이 절차를 생략 됩니다. 노화 세포의 피크 이전 관찰 되었습니다14때 따 근육 샘플 10 일 게시물 부상13, 수집 됩니다. 여기,이 상세한 프로토콜 (SA-β-Gal)를 통해 노화의 수준 및 재활 (IHC Nanog의 얼룩)를 통해 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 설명 합니다.
노화 관련 베타-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 문화 그리고 vivo에서15에 노화 세포 모두를 감지 하는 가장 일반적으로 사용 되 분석 결과가 이다. 다른 분석 실험에 비해, SA-β-Gal 분석 결과 그대로 조직 아키텍처, vivo에서 학문에 대 한 특히 중요 한 그들의 네이티브 환경에서 노화 세포의 식별 수 있습니다. 또한, IHC를 사용 하 여 다른 표식으로 SA-β-Gal 분석 결과 하 가능 하다. 그러나, SA-β-Gal 분석 결과 주요 제한 남아 있는 신선 또는 냉동 샘플 필요지 않습니다. 신선 또는 냉동 조직 냉동된 따 근육 샘플 같은 정기적으로 사용할 수 있을 때, SA-β-Gal은 명백히 노화 세포를 감지 하는 가장 적합 한 분석 결과 이다. Nanog는 두 가지 이유로 reprogramed 셀을 검출 하는 데 사용 하는 마커: 1) 그것은 pluripotency;에 대 한 필수적인 마커 2) 더 중요 한 것은, 그 표현 doxycycline (dox)에 의해 구동 하지 않으면, 따라서 유도 pluripotency 보다는 야 마나카 카세트의 강제 식 감지.
그것은 중요 한 것,이 연구에서 제시 하는 얼룩 프로토콜 정량화 절차를 단순화 하기 위해 별도로 실시 될 수 있지만 모두 노화를 시각화 하는 공동 얼룩 절차 및 pluripotent 줄기 세포 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다.
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Protocol
동물 인 파스퇴르 (CETEA) 승인 프로토콜의 윤리 위원회와 유럽 공동체 지침에 의하여 처리 했다.
1. 재고 솔루션의 준비
- 근육 샘플 고정을 위한 자료 준비. 20 mL 물 근육 고정을 위한 동결 포함 매체 수 있도록 RT에서 tragacanth 껌의 0.5 g을 녹.
- SA-β-Gal 얼룩에 대 한 솔루션을 준비.
- 재고의 솔루션 K 3 Fe(CN) 6 (100 m m), K 4 Fe(CN) 6 (100 m m), MgCl 2 (1m) 증류수에 각각 분말을 용 해 하 여 준비.
- 물에 희석 하 여 0.2% C 20 H 6 Br 4 나 2 O 5 (오신)의 재고 솔루션을 준비.
- 없음 (dimethylformamide, DMF) C 3 H 7에서 X-여자 분말을 용 해 하 여 C 14 H 15 BrClNO 6의 재고 솔루션 (X-gal) (50 mg/mL)를 준비.
- 저장소 K 3 Fe(CN) 6 및 4 ° C에서 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 및 MgCl 2 실시간
참고: X 걸 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 수에 최대 6 개월. 오신 솔루션 RT에서 보관 하 고 필요한 경우 필터링 후 다시 사용할 수 있습니다. K 3 Fe(CN) 6 및 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 protectedfromthe 빛을 있습니다. X gal 솔루션 물에서 불안정과 빛 으로부터 보호 되어야 했다.
- Nanog 얼룩에 대 한 솔루션의 준비: permeabilization 솔루션 포함 0.1% 나 3 C 6 H 5 O 7 (trisodium 시트르산), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) 증류수에 4에 저장 한다 ° c. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 실시간에 저장 한다 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 포함 된 차단 솔루션 준비
2. 냉동 따 근육 섹션에 SA-β-Gal 얼룩
- 껌 코르크의 조각에는 tragacanth의 작은 금액을 삽입 하 여 타 근육에 대 한 고정 재료 준비.
- 부 상자는 쥐 (2 달 오래 된, C57/B6) 남녀의 13 위에서 설명한 cardiotoxin (CDX)와 10 일 전에 부상을 했다. 동일한 마우스에서 아닌 부상 (PBS 주입) TA를 사용 하 여 부정적인 제어. Vivo에서 프로그래밍을 원하는 경우 치료 Dox (1 mg/mL)와 각 마우스 식 수에서 (빛에서 보호), 같은 날에 CTX 부상 직후.
참고: Dox 솔루션 7 일의 총 치료 기간 동안 3 일 마다 변경 될 필요가 있다.- 쥐 앞에서 설명한 ( 그림 1A) 13에서 두 따 근육 (부상 및 제어)를 분리. 가로 섹션을 확인, tragacanth 껌 따 근육의 원심 힘 줄을 삽입 하 고 ( 그림 1B) 밖에 서 근육의 약 ¾ 부분 두고 액체 질소에 직접 고정을 위한 isopentane 냉각 < 1 분
참고: TA 근육은 코르크의 센터에 수직 위치에 다는 것을 확인 하십시오. 샘플-80 ° C 또는 직접 10 µ m 섹션에서 cryosectioned에 저장 될 수 있다.
- 쥐 앞에서 설명한 ( 그림 1A) 13에서 두 따 근육 (부상 및 제어)를 분리. 가로 섹션을 확인, tragacanth 껌 따 근육의 원심 힘 줄을 삽입 하 고 ( 그림 1B) 밖에 서 근육의 약 ¾ 부분 두고 액체 질소에 직접 고정을 위한 isopentane 냉각 < 1 분
- 따 근육 그림 1B에 설명 된 대로 처리.
각 슬라이드의 상단 왼쪽된 위치에 10 다른 슬라이드에 올바른 순서로
- 분포는 1 st-10 번째 섹션입니다. 첫 번째 슬라이드;에 11 번째 섹션 1 세인트 섹션에 인접 한 장소 12 번째 섹션 외에 두 번째 슬라이드에 2 nd 섹션 오른쪽 배치 순서를 따를 것 이다. 10 섹션/슬라이드 10 슬라이드 (총 100 섹션)에 대 한 첫 번째 섹션 및 마지막 섹션 사이의 최소 1 m m 거리를 보장 하기 위해 가져온 때까지이 프로세스를 반복 합니다.
- 1 %paraformaldehyde 및 0.2%도 포함 하는 PBS에 4 분에 대 한 섹션을 수정. PBS, 2 x 10 분 씻어. 다음, PBS에 섹션을 품 어 (pH = 5.5) 30 분에 대 한 실시간에 모든 단계를 수행
참고: 고정 효소 활동을 유지 하기 위해 가벼운 수 있다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. PBS의 pH 중요 하 고 X-여자 솔루션 빛 으로부터 보호 되어야 합니다. - X gal 솔루션 포함 하 품 섹션: 4 m m K3Fe(CN) 6, 4 m m K4Fe(CN) 6, 2 m MgCl2, m 및 400 µ g/mL X Gal에서 PBS, pH = 5.5. 3 x 10 분, 실시간에 PBS 가진 슬라이드 24 h. 세척의 최소 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어
참고:는 인큐베이션 최소 24 시간을 필요 하며 SA-β-Gal 신호를 최대화 하기 위해 48 시간 동안 지속 될 수 있다. 솔루션 24 시간의 외피 후 변경 될 필요가 있다. 슬라이드는 빛 으로부터 보호 되어야 한다. SA-β-Gal 얼룩을 원하는 경우에 2.5 단계로 진행 합니다. 공동 Nanog와 얼룩을 원하는 하시기 바랍니다 앞으로 단계로 건너뜁니다 3.1. - 수정 슬라이드 1% paraformaldehyde PBS에서 30 분 세척에 대 한 슬라이드와 함께 PBS, 0.2% 오신와 3 x 10 분 Counterstain. 1 분 오신 솔루션에 슬라이드를 담가 그리고 증류수로 간단히 씻. 마지막으로, 수성 비 fluorescing 장착 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조).
참고: 후 고정을 수행 하기 위해 필수적 이다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. 모든 단계를 실시간에 수행
3. Immunohistochemistry 안티 Nanog 항 체
- PBS PBS, 슬라이드에 직접 permeabilization 솔루션의 2 x 10 분 추가 200 µ L 10 분 세척에 대 한 4 %paraformaldehyde 포함 된 슬라이드를 수정 하 고 5 분 동안 품 어.
- 세척 PBS, 2 x 5 분와 마지막 세척, 사용 200 µ L PBS 포함 하는 슬라이드에 직접 0.25 %BSA에서 슬라이드. 실시간에서 이러한 모든 단계를 수행
주의: 후드 고정 단계 수행.
- 세척 PBS, 2 x 5 분와 마지막 세척, 사용 200 µ L PBS 포함 하는 슬라이드에 직접 0.25 %BSA에서 슬라이드. 실시간에서 이러한 모든 단계를 수행
- 기본 안티-Nanog 항 체와 품 슬라이드 (최종 농도: 1.25 ug/mL) 5%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 하룻밤 FBS. PBS, 2 x 10 분와 슬라이드를 세척 하 고 마지막 세척에 사용 200 µ L PBS 0.25% BSA 5 분 수행에 대 한 포함 된 모든 세척 단계에서 실시간
참고: 증발을 방지 하기 위해 젖은 종이 타월로 상자에서 슬라이드를 품 어. - 품 슬라이드 랩 HRP 이차 항 체의 100 µ L 사용 하 여 준비 키트 (재료의 표 참조) 45 분 세척에 PBS, 3 x 5 분와 슬라이드에 대 한 2 차 항 체를 제거. 빛에서 보호와 RT에서 모든 단계를 수행 하십시오.
- 시각화
- 먼저는 3, 3을 희석 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), 소량) 기판 버퍼에 키트 (20 µ L DAB의 기판 버퍼 솔루션의 1 ml)을 사용 하 여 준비에 의해 제공. 각 슬라이드에 직접 소량 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 10 분의 최대 품 어
참고: 희석된 DAB 솔루션 갓 준비 한다 및 4 ° c.에 1 주까지 동안 저장 될 수 있다 보육 시간 배경 신호를 최소화 하기 위해 조정할 수 있지만 모든 슬라이드에 대 한 동일을 유지 합니다. - 물으로 rinsing 하 여 DAB 솔루션을 제거 합니다. Counterstain 빠른 빨간 솔루션 (준비가 사용 테이블의 자료를 참조 하십시오) 슬라이드 20 분 세척에 대 한 물 슬라이드 다시 짧게.
- 5 m 95% 에탄올과 그들을 탈수합니다100% 에탄올, 2 x 5 분 뒤에. 마지막으로, 빠른 경화 설치 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조).
- 관찰 20 X 피하기 위해 배경에서 밝은 분야에서 현미경 슬라이드.
참고: 빠른 빨간 솔루션 RT에서 보관 및 다시 사용할 수 필터링 후.
- 먼저는 3, 3을 희석 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), 소량) 기판 버퍼에 키트 (20 µ L DAB의 기판 버퍼 솔루션의 1 ml)을 사용 하 여 준비에 의해 제공. 각 슬라이드에 직접 소량 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 10 분의 최대 품 어
4. 분석 및 정량화
- SA-β-Gal 정량화
- 슬라이드를 검사 하 고 인수 이미지에 따라 각 슬라이드에 최고의 섹션을 선택 하십시오. 2 섹션/TA를 사용 하 여는 정량화에 대 한. 판사는 섹션 ' s 품질 조직 무결성, 얼룩, 및 counterstaining의 품질에 따라. 정량화에 대 한 전체 타 근육에 걸쳐 SA-β-Gal 정량화의 더 나은 표현 수 있는 샘플, 사이 최대 가능한 거리와 두 개의 최고 품질 섹션 선택.
- SA-β-Gal 긍정적인 세포 ( 그림 2)의 부 량.
- 확인 수동으로 작고 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 선택 하 여 픽셀 크기의 순위
- .
- ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 스캔 한 슬라이드의 디지털 이미지를 엽니다.
- 인터페이스에서 클릭 ' 분석 ' > ' 도구 ' > ' ROI 관리자 ' > ' 분석 ' > ' 측정을 설정 ' > ' 선택 영역 '. 선택 도구를 사용 하 고 작은 서라운드 및 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 클릭 하 여 ROI 관리자에 추가 ' 추가 '. 측정 하는 사용 하 여 크기는 ' 측정 ' 버튼 하 고 나중에 사용에 대 한 값을 저장.
- 모든 보이는 긍정적인 셀 선택 되도록 임계값 매개 변수를 조정.
- 변환을 클릭 하 여 그레이 스케일 이미지
- ' 이미지 ' > ' 유형 ' > ' 8 비트 ' ( 그림 2A). 다음에 서 ' 이미지 ' > ' 조정 ' > ' 임계값 ', 모든 긍정적인 SA-β-Gal 셀 레드 ( 그림 2B)에 덮여 때까지 두 번째 커서를 이동한 다음 클릭 합니다 ' 적용 '.
- 클릭 하 여 분석 입자 ' 분석 ' > ' 분석 입자 ' > ' 크기 (픽셀 ^2) ', 그리고 단계 4.1.2.1에에서 정의 된 값을 적용, 입력 ' 순환 ': ' 0.00-1.00 ', 클릭 ' 확인 '; 모든 요약 한는 계산된 입자 ROI 관리자 ( 그림 2D)에 표시 됩니다.
- 원본 이미지에 모든 선택 된 입자를 전송. 정확한 부 량을 수동으로 선택 영역을 조정 합니다. 긍정적인 세포 (녹색 화살표, 그림 2E)를 추가 및/또는 거짓 긍정적인 세포 (빨간 화살표, 그림 2E) 제거. 마지막으로, 사용 하 여 섹션 ( 그림 2D)으로 표시 하 여 영역을 측정에서 ' 선택 도구 '. 클릭 ' ROI 관리자 ' > ' 추가 ' > ' 측정 '.
- 섹션의 영역에 의해 긍정적인 셀의 수를 중요 한 것은, 정상화.
- 20 배 확대에 수동으로 밝은 분야에서 현미경 Nanog 긍정적인 셀.
참고: 빠른 빨간 counterstaining TA 근육의 형태학의 좋은 평가 수 있습니다. 그러나, 얼룩이 지는 아주 가벼운 이며 명확한 개요 섹션의 부족. 스캐너는 종종 섹션의 경계를 식별 하 실패 하 고 제대로 초점을 수 없습니다. 스캔 하기 전에 섹션의 가장자리를 원 하거나 더 민감한 스캐너 섹션을 사용 하 여 마커를 사용 하 여 가능 하다. 현재 프로토콜에 대 한 그것은 가장 효율적 Nanog 긍정적인 세포를 수동으로 계산.
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Representative Results
근육 부상 유발 세포 노화를 감지
그것은 최근에 입증 되었습니다 근육 부상을 과도 세포 노화14유도. 10 일 후 부상 (DPI)에서 손상 된 myofibers의 대부분 위치 핵, myofibers, 재생의 품질 증명으로 재생을 겪고 있다 그리고 근육의 아키텍처는 다시 설립. 침투 염증 세포는 특정 지역에 표시 하면서 극적으로 감소 된다. 10 DPI 있기 때문에 적은 괴 사 성 및 염증 성 세포는 얼룩과 방해 하는 근육에 SA-β-Gal에 의해 노화 세포를 감지 하는 좋은 시간 점입니다. 얼룩의 특이성을 결정, TA 같은 마우스 (그림 1A)에서 PBS를 주입 중요 한 부정적인 통제로 사용 됩니다.
SA-β-Gal 긍정적인 세포의 더 나은 및 더 정확한 평가 위해, TA 근육의 다른 비행기에서 섹션 같은 슬라이드 (그림 1B)에 배치 됩니다. 카운터와 오신 얼룩 ImageJ 소프트웨어에 의해 SA-β-Gal 긍정적인 세포의 자동 정량화에 대 한 중요 하다. 오신 카운터 얼룩 정확한 초점으로 섹션을 검출 하기 위하여 디지털 스캐너를 수 있는 섹션을 설명 합니다. 그것은 신중 하 게 범위와 감지 (그림 2A-D)의 임계값을 정의 하는 것이 중요. 또한, 수동으로 큐레이터 과정 더 정확한 탐지 및 정량화 (그림 2E) 허용에 필수적 이다.
세포 노화 vivo에서 근육에 프로그래밍을 용이 하 게
재프로그래밍 마우스 모델 (i4F) 셀룰러 소성 및 재생에 노화의 영향을 평가 하는 이상적인 시스템을 제공 합니다. 근육 부상 시 i4F 마우스 dox 재활 vivo에서유도 하는 것으로 취급 됩니다. 7 일 dox (1 mg/mL) 치료는 여전히 생쥐 (그림 3A)에 의해 잘 용납 되 고 하면서 세포 수준에서 프로그래밍을 유도 하기 충분 합니다. 따라서, 우리는 i4F 마우스 dox 7 일에 대 한 치료에서 10 Dpi에서 다친된 근육 수확.
SA-β-Gal Nanog와의 공동 착 수행할 수 있지만, 그것은 잠재적인 방해 얼룩 때문에 정량화에 대 한 권장 하지 않습니다. 위에서 설명 했 듯이 카운터 얼룩은 디지털 스캐너 탐지에 대 한 필수적입니다. 최고의 카운터 Nanog 함께 SA-β-Gal에 대 한 얼룩은 빨리 빨간 orhematoxylin입니다. 그러나, 카운터 얼룩 SA-β-Gal 또는 Nanog 신호 동안 마스크 수 있습니다. 따라서, 보다 정확한 정량화에 대 한 연속 슬라이드 (그림 3B)에 별도로 그들을 수행 하는 더 나은입니다. SA-β-Gal 양수와 Nanog 긍정적인 셀 인접 한 슬라이드에서 측정, 우리 설립 (그림 3C), 그들 사이 긍정적인 상관 관계 노화 세포가 소성 및 중생의 잠재적인 관련 제안.
그림 1: 근육 부상 후 노화 수준 평가. (A) 노화를 유도 하는 데 사용 하는 근육 부상 전략의 도식 대표. (B) 근육 섹션 준비의 도식 적인 표현입니다. (C) SAβGal counterstained 오신와 얼룩의 대표 이미지. 화살표는 SA-β-Gal+ 셀을 가리킵니다. 스케일 바 = 50 µ m. SA-β-Gal+ 의 (D) 정량화 부상 및 부상 비 타-근육 세포. 각 점 개별 동물에 해당합니다. 통계적 의미는 양측 Student´s t-검정에 의해 평가 되었다: * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ImageJ 소프트웨어에 의해 SA-β-Gal+ 세포의 정량화. (A-D) 스크린 샷 ImageJ 소프트웨어 인터페이스에서 근육의. 규모 (A); 회색을 근육 섹션 이미지 변환의 스크린 샷 선택 모든 SA-β-Gal + 셀 섹션 (B); 분석 된 입자 (C); 투자 수익 관리자 (D)에 모든 계산된 particals의 요약. ((E)) 수동 큐레이터 과정의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: vivo에서 근육 부상 후 프로그래밍의 평가. (A) 회로도 표현을 근육 부상 후 비보에 프로그래밍 및 노화 수준 평가. (B) SA-β-Gal 및 Nanog 손상된 골격 근육의 냉동된 섹션에 얼룩의 대표 이미지. SAβGal counterstained (왼쪽); 오신와 얼룩 immunohistochemical Nanog 빠른 빨간색 (오른쪽)과 counterstained의 얼룩. 비 손상 근육 위쪽 및 부상 근육 아래에 표시 됩니다. 스케일 바 = 50 µ m. (C) 정량화 및 SA-β-Gal + 및 연속 단원의 Nanog+ 셀의 상관 관계 (n = 9 마우스 값 나타냅니다 마우스 당 2 섹션의 평균). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 볼륨 50 ml | |
| 100 m m 재고 K3Fe(CN)6 솔루션 | 2 mL |
| 100 m m K4Fe(CN)6 솔루션을 재고 | 2 mL |
| 1 M MgCl2 | 100 Μ |
| 50 mg/mL X-여자 | 400 Μ |
| PBS (pH 5.5) | 45.50 mL |
표 1: 50ml X gal 솔루션의 구성.
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Discussion
여기, 선물이 모두 노화를 검출 하는 방법 및 pluripotent 줄기 세포 재프로그래밍 쥐의 골격 근육. 이 방법은 평가 척도 모두 노화 세포가 소성에 vivo에서, 유도 그리고 조직 수리 및 재생에 노화의 역할을 검토 사용 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 골격 근육에 노화 세포 vivo에서 감지 하 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 사용 합니다. 이 분석 결과 중형 pH 6.0 (5.5), 연관 특히 노화 세포,이 효소의이 활동은 일반적으로 산 성 pH 4.516,17에서 측정 하는 동안에 증가 lysosomal β-galactosidase 활동을 감지 합니다. 따라서, 그것은 pH를 조정 하는 것이 중요 (pH = 6 또는 5.5) 노화 관련 활동의 특정 한 탐지를 위해. 또한, 카운터 오신와 얼룩 약하고 확산 신호 계산 되지 않습니다, SA-β-Gal+ 세포의 자동 정량화에 대 한 필수적입니다. 잠재적인 변화를 방지 하려면 것이 좋습니다 같은 사람이 전체 계산 절차를 수행 합니다.
SA-β-Gal 분석 결과 가장 널리 사용 되 고 노화 세포에 대 한 바이오 마커를 허용, 노화에 대 한 독점 마커 아니다. 그것은 문화에 오버 합칠 셀 SA-β-Gal18거짓 양성을 발생할 수 있습니다 제안 되었습니다. 분석 결과의 감도 셀 수 있으며 조직 입력 종속 vivo에서19. 따라서, 그것은 확산, 노화 중재자 (p16, ARF, p53, p21, 그리고 p27)의 증가 표현 및 다양 한 SASP 요소의 분 비의 부족 등 다른 독립 정식 마커 추가 확인 하 고 특성을 사용할 필요가 노화 비보 또한, 적절 한 부정적인 컨트롤은 특히 vivo에서 학문에 대 한 결과 해석 하기 위한 불가결.
SA-β-Gal 분석 결과 사실에도 불구 하 고 완벽 한, 그것은 특히 귀중 한 정보를 제공 vivo에서 학문. 그것은 그대로 조직 구조, 생리 및 병 적인 다른 노화 세포의 역할의 더 이해를 촉진 하는 중요 한 정보를 제공 하 그들의 거주 환경에 노화 세포의 검출을 허용 컨텍스트입니다. 또한, 그것은 노화 세포; 세포 id를 확인 세포 표면 마커 등 다른 마커의 immunostaining와 결합 될 수 있다 또는 재생 및 tumorigenesis 노화의 잠재적인 관련 검사 stemness 마커. 이전에 우리는 SA-β-Gal 분석 결과 immunohistochemical Nanog 같은 섹션에서 또는 가까운 근접에서 노화와 비보에 8프로그래밍 사이 잠재적인 연결을 조사 하의 얼룩과 수행. 이 프로토콜은 골격 근육에 초점을 맞추고, 그러나 그것은 확실히 다른 조직에 확장할 수 있다.
최근, 세포 노화 조직 수리 및 재생, SASPs7,,89통해 대부분에 연루 되었습니다 했다. 노화 조직 수리 및 재생에 기여 하는 방법의 메커니즘을 이해 해도 재생 의학에 엄청난 영향을 확실히 것입니다. 이 분석 결과 식별을 용이 하 게 하는 중요 하 고 가치 있는 도구를 제공 합니다 그리고 vivo에서세포 노화의 정량화.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 Clemire Cimper에 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 빚을입니다. H.L.의 연구실에서 작업 파스퇴르, 검색 과학 센터 국가 부 라와 직원 회 드 라 검색 (응용 d'Excellence, 소생 Investissement d'Avenir;에 의해 투자 되었다 ANR-10-LABX-73), 직원 회 드 라 검색 (ANR-16-CE13-0017-01) 및 Fondation 호 (PJA 20161205028). 참조 및 교류는 박사에 의해 부활 컨소시엄에서 박사 장학 자금을.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre |
Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
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