Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll å oppdage både senescent og pluripotent stamceller i skjelettmuskulatur på skader, mens inducing i vivo omprogrammering. Denne metoden er egnet for vurdere rollen til mobilnettet senescence under vev gjenfødelse og omprogrammere i vivo.

Abstract

Mobilnettet senescence er en stress reaksjon som er preget av en stabil mobilnettet vekst arrestasjon, noe som er viktig for mange fysiologiske og patologiske prosesser som kreft og aldring. Nylig har senescence også vært involvert i reparasjon av vev og gjenfødelse. Derfor har det blitt stadig mer kritisk til å identifisere senescent celler i vivo. Senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen er den mest brukte analysen å oppdage senescent celler både kultur og i vivo. Denne analysen er basert på økt lysosomale innholdet i senescent celler, som gjør det histochemical påvisning av lysosomale β-galactosidase aktivitet ved suboptimum pH (6-5.5). Sammenlignet med andre analyser, som flowcytometri, dette gjør identifikasjon av senescent celler i deres bosatt miljø, som gir verdifull informasjon som hvor knyttet til vev arkitektur, morfologi, og muligheten for kopling med andre indikatorer via immunohistochemistry (IHC). Stor begrensning av SA-β-Gal analysen er behovet av friske eller frosne prøvene.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å forstå hvordan mobil senescence fremmer mobilnettet plastisitet og vev gjenfødelse i vivo. Vi bruker SA-β-Gal for å oppdage senescent celler i skjelettmuskulatur ved skade, som er en godt etablert system å studere vev gjenfødelse. Dessuten, vi bruker IHC for å oppdage Nanog, en markør av pluripotent stilk celler, i en transgene musemodell. Denne protokollen kan vi undersøke og kvantifisere mobilnettet senescence i forbindelse med indusert mobilnettet plastisitet og i vivo omprogrammering.

Introduction

Mobilnettet senescence er en form for stressrespons preget av en stabil celle syklus arrestasjon. I det siste tiåret, har forskning fast etablert at senescence er forbundet med ulike biologiske og patologiske prosesser inkludert embryonale utvikling og fibrose organisme aldring1,2. Mobilnettet senescence ble først identifisert i menneskelig fibroblaster på slutten av levetiden replicative utløst av telomere forkortelse3. Foruten replicative stress er det mange andre stimuli som kan indusere senescence, inkludert DNA skade, oksidativt stress, kreftfremkallende signaler og genomisk/epigenomic endringer, som kan til slutt aktivere p53/p21 og/eller pRB veier å etablere og forsterke den permanente vekst arrestasjon1. En viktig kjennetegner senescent celler er at de forblir metabolically aktiv og robust express en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP): utskillelsen av mange inflammatoriske cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulær matrix faktorer4. SASP faktorer er foreslått å spille en viktig rolle i formidling og forsterke senescence effekten, på grunn av sin potente effekt på tiltrekke immunceller og endre lokale og systemisk vev miljøer1. Interessant, har senescence nylig blitt foreslått å være viktig i vev reparasjon og regeneration5,6. I tillegg har data fra flere labs, inkludert vår, foreslått at vev skade-indusert senescence kan forbedre cellulære plastisitet, via SASPs, å fremme regenerering7-9. Derfor markere alle nye data betydningen av å studere senescence i vivo.

I innlegget indusert pluripotent stamceller (iPSC) era er mobilnettet plastisitet kapasiteten i en celle til å anskaffe en ny identitet og vedta en alternativ skjebne når utsatt for ulike stimuli både i kultur og i vivo10. Det er kjent at full omprogrammering kan oppnås i vivo11,12, der uttrykket av den kassetten som inneholder fire Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4og c-Myc (OSKM) kan være indusert i vivo å fremme teratomer formasjon i flere organer. Derfor kan kan programmeres om musemodell (i4F) brukes som et kraftig system for å identifisere kritiske regulatorer og veier som er viktige for mobilnettet plastisitet11.

En egnet og følsom i vivo system er viktig å forstå hvordan mobil senescence regulerer mobilnettet plastisitet i sammenheng med vev gjenfødelse. Her presenterer vi et robust system og en detaljert protokoll å vurdere sammenhengen mellom senescence og mobilnettet plastisitet i sammenheng med vev gjenfødelse. Kombinasjonen av cardiotoxin (CTX) indusert muskel skaden Tibialis fremre (TA) muskelgruppe, en godt etablert system vev gjenfødelse, og i4F musemodell, gjør påvisning av både mobilnettet senescence og i vivo omprogrammere under muskulære.

For å vurdere sammenhengen mellom mobilnettet plastisitet og senescence, er i4F mus skadet med CTX å indusere akutt muskel skader og behandlet med doxycycline (0,2 mg/mL) over 7 dager å indusere i vivo omprogrammering. Mens en CTX indusert akutt muskel skader og gjenfødelse-protokollen er nylig publisert13, etiske grunner, blir denne prosedyren utelatt i gjeldende protokollen. TA muskel prøver hentes på 10 dager innlegg skade13, når toppen av senescent celler er tidligere observert14. Her beskriver denne detaljerte protokollen alle trinnene som er nødvendig å vurdere nivået på senescence (via SA-β-Gal) og reprogramming (via IHC farging av Nanog).

Senescence-assosiert beta-galactosidase (SA-β-Gal) analysen er den mest brukte analysen å oppdage senescent celler både i kultur og i vivo15. Sammenlignet med andre analyser, kan SA-β-Gal analysen identifikasjon av senescent celler i deres eget miljø med intakt vev arkitektur, som er spesielt viktig for i vivo studie. Videre er det mulig å par SA-β-Gal analysen med andre markører bruker IHC. Imidlertid krever SA-β-Gal analysen friske eller frosne prøvene, som fortsatt er en stor begrensning. Når friske eller frosne vev er rutinemessig tilgjengelig, som frosne TA muskel prøver, er SA-β-Gal åpenbart egnede analysen å oppdage senescent celler. Nanog er den brukes til å oppdage reprogramed celler av to grunner: 1) det er en viktig indikator for pluripotency; 2) enda viktigere, uttrykket er drevet av doxycycline (dox), derfor oppdager indusert pluripotency i stedet for tvungen uttrykk for Yamanaka kassetten.

Det er viktig å merke seg flekker protokollene i denne studien kan utføres separat for å forenkle kvantifisering prosedyren, men kan også gjøres i en co flekker prosedyre for å visualisere både senescent og pluripotent stamceller i samme inndeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

dyrene ble behandlet som EU retningslinjer og etikk av Institut Pasteur (CETEA) godkjent protokoller.

1. forberedelser lager løsninger

  1. forberede materialet for muskel eksempel fiksering. Oppløse 0,5 g tragacanth tyggegummi med 20 mL vann på RT gjøre innebygging av frysing mediet for muskel fiksering.
  2. Forberede løsninger for SA-β-Gal farging.
    1. Forberede lager løsninger K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) ved å løse opp de respektive pulver i destillert vann.
    2. Forberede lagerløsning 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eosin) ved å fortynne den i vann.
    3. Forberede lagerløsning C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) ved å løse opp pulveret X-gal i C 3 H 7 ingen (vannistedenfor, DMF).
    4. Store K 3 Fe(CN) 6 og K 4 Fe(CN) 6 løsninger på 4 ° C, og MgCl 2 på RT.
      Merk: X-gal kan lagres i aliquot på 20 ° C, opp til 6 måneder. Eosin løsning kan holdes på RT og gjenbrukt etter filtrering om nødvendig. K 3 Fe(CN) 6 og K 4 Fe(CN) 6 løsninger er protectedfromthe lys. X-gal løsning er ikke stabil i vann og må beskyttes mot lys.
  3. Utarbeidelse av løsninger for Nanog flekk: permeabilization løsningen inneholder 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (trisodium citrate), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) i destillert vann, som bør lagres på 4 ° C. forberede blokkerer løsningen inneholder 5% fosterets bovin serum (FBS) i fosfat-bufret saltvann (PBS), som skal lagres på rett

2. SA-β-Gal Beising på frosset TA muskel delen

  1. forberede fiksering materiale for TA muskelen ved å plassere en liten mengde av tragacanth tyggegummi på et stykke cork.
  2. Skadet mus av begge kjønn (2 måned gamle, C57/B6) ble skadet 10 dager før med cardiotoxin (CDX) som beskrevet tidligere 13. Bruk ikke-skadde (PBS injeksjon) TA fra samme musen som kontrollen negative. Hvis i vivo omprogrammering ønskes, behandle hver mus med Dox (1 mg/mL) i drikkevannet på samme dag (beskyttet fra lyset), rett etter CTX skade.
    Merk: Dox løsningen må endres hver 3 dager for en total behandling varighet på 7 dager.
    1. Isolere begge TA musklene (skadet og kontrollere) fra mus som beskrevet tidligere ( figur 1A) 13. Å sikre de tverrgående delene, distale senen av TA muskel inn tragacanth tannkjøtt og la omtrent ¾ del av muskelen utenfor ( figur 1B) og fryse direkte i flytende nitrogen avkjølt isopentane for < 1 min.
      Merk: Kontroller at TA muskelen er i en vinkelrett posisjon og i midten av kork. Eksempler kan lagres på-80 ° C eller direkte cryosectioned i 10 µm seksjoner.
  3. Behandle TA musklene som beskrevet i figur 1B.
    1. Fordel 1 st -10 th deler i riktig rekkefølge på ti forskjellige lysbilder ved øvre venstre hvert lysbilde. Plass den 11 th tilstøtende til delen for 1 st i første lysbildet. 12 th delen vil følge samme rekkefølge skal plasseres rett tillegg delen 2 nd på det andre lysbildet. Gjenta denne prosessen til 10 deler/gli hentes for ti lysbilder (100 seksjoner totalt) for å sikre minimum 1 mm avstand mellom den første og den siste inndelingen.
  4. Fikse delene for 4 min i PBS som inneholder 1% paraformaldehyde og 0,2% glutaraldehyde. Vask med PBS, 2 x 10 min. Deretter ruge avsnittene i PBS (pH = 5.5) 30 min. utføre alle trinnene på rett
    Merk: Fiksering må være mild å opprettholde enzymatisk aktivitet. Utføre dette trinnet under panseret. PH i PBS er kritisk og X-gal løsningen må beskyttes mot lys.
  5. Incubate inndelinger i X-gal løsning inneholder: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 og 400 µg/mL X-Gal i PBS, pH = 5.5. Inkuber i mørket på 37 ° C i minst 24 h. vask lysbildene med PBS, 3 x 10 min, ved RT.
    Merk: Inkubering krever minst 24 timer og kan vare i 48 timer å maksimere SA-β-Gal signalet. Løsningen må endres etter 24 timers inkubasjon. Lysbildene skal beskyttes fra lys. Hvis bare SA-β-Gal flekker er ønskelig, fortsetter du med trinn 2.5. Hvis co farging med Nanog, går du videre til trinn 3.1.
  6. Fastsette lysbilder i 1% paraformaldehyde i PBS for 30 min. vask lysbilder med PBS, 3 x 10 min. Counterstain med 0,2% eosin. Fordype lysbildene i den eosin løsningen for 1 min, og skyll med destillert vann kort. Til slutt, mount lysbildene med vandig ikke-fluorescing montering medium (se Tabell av materialer).
    Merk: Det er viktig å utføre etter fiksering. Utføre dette trinnet under panseret. Alle trinnene utføres på RT.

3. Immunohistochemistry bruker Anti-Nanog antistoff

  1. fikse lysbildene med PBS som inneholder 4% paraformaldehyde 10 min. vaskes med PBS, 2 x 10 min. legge 200 µL permeabilization løsningen direkte på lysbildene og Inkuber i 5 min.
    1. Vask lysbilder med PBS, 2 x 5 min og i siste vask, bruk 200 µL PBS med 0,25% BSA direkte på lysbildene. Utføre alle disse trinnene på rett
      Forsiktig: Utfør fiksering trinn under panseret.
  2. Incubate lysbilder med primære anti-Nanog antistoffer (siste konsentrasjon: 1,25 ug/mL) overnatting på 4 ° C i PBS inneholder 5% FBS. Vask lysbilder med PBS, 2 x 10 min og i siste vask, bruk 200 µL PBS med 0,25% BSA for 5 min. utføre alle vask trinn på RT.
    Merk: Ruge lysbilder i en boks med vått papirhåndkle for å hindre fordampning.
  3. Incubate lysbilder med 100 µL rAb-HRP sekundære antistoff fra en klar til bruk kit (se Tabell for materiale) for 45 min. vask lysbilder med PBS, 3 x 5 min, å fjerne sekundære antistoff. Utføre alle skritt på RT beskyttelse fra lys.
  4. Visualisering
    1. først fortynne 3,3 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) i Substratbufferen levert av klar til å bruke kit (20 µL av DAB for 1 mL av underlaget buffer løsning). Legg 100 µL av DAB løsning direkte på hvert lysbilde og ruge maksimalt 10 min på rett
      Merk: Utvannet DAB løsningen skal tilberedes ferskt og kan lagres i opptil en uke på 4 ° C. Inkubasjon tiden kan justeres for å minimere bakgrunn signalet, men må holdes det samme for alle lysbildene.
    2. Fjerne DAB løsningen ved skylling med vann. Counterstain lysbilder med rask rød løsning (klar til bruk, se Tabellen for materiale) i 20 min. vask lysbildene med vann igjen kort.
    3. Tørke dem med 95% etanol 5 meteri etterfulgt av 100% etanol, 2 x 5 minutter. Til slutt, mount lysbildene med rask-herding montering medium (se Tabell av materialer).
    4. Observere lysbildene under mikroskopet lyse innen 20 X å unngå bakgrunnen.
      Merk: Rask rød løsning kan holdes på RT og brukes på nytt etter filtrering.

4. Analyse og kvantifisering

  1. SA-β-Gal kvantifisering
    1. skanne lysbilder og velge de beste delene på hvert lysbilde basert på ervervet bildene. Bruke minst 2 deler/TA kvantifiseringen. Dømme delen ' s kvalitet basert på vev integriteten, kvaliteten på flekker, og counterstaining. Kvantifiseringen, velger de to høyeste kvalitet delene med mulig Maksimumsavstanden mellom prøver, som gir bedre gjengivelse av SA-β-Gal kvantifisering gjennom hele TA muskelen.
    2. Kvantifisering av SA-β-Gal positiv celler ( figur 2).
      1. Fastslå graden av pikselstørrelse ved manuelt å velge den minste og største positive SA-β-Gal cellene.
        1. Åpner det digitale bildet skannede lysbildet ImageJ programmvre.
        2. i grensesnittet, klikk ' analyser ' > ' verktøy ' > ' avkastning Manager ' > ' analyser ' > ' satt måling ' > ' velge området '. Bruk markeringsverktøyet, og omgir den minste og største positive SA-β-Gal celle og legge den til Avkastningen manager ved å klikke på ' Legg til '. Måle størrelsen ved hjelp av ' mål ' knappen og lagre verdiene for senere bruk.
      2. Justere parameteren terskel for å sikre alle synlige positiv cellene er valgt.
        1. Konvertere bildet til gråtoner ved ' bilde ' > ' type ' > ' 8-biters ' ( figur 2A). Deretter går du til ' bilde ' > ' Juster ' > ' terskelen ', holder du andre markøren til alle positiv SA-β-Gal cellene er dekket i rødt ( figur 2B), og klikk ' bruk '.
        2. Analyser partikler ved ' analyser ' > ' analysere partikler ' > ' størrelse (piksel ^ 2) ', og bruker verdien som er definert i trinn 4.1.2.1, angi ' sirkularitet ': ' 0,00-1,00 ', klikk ' ok ', et sammendrag av alle de opptelte partikler vises i Avkastningen manager ( figur 2D).
      3. Overføre alle valgte partikler til originalbildet. Justere utvalget manuelt for å sikre nøyaktig kvantifisering. Legge til positiv celler (grønn pil, figur 2E) og/eller fjerne falske positive celler (rød pil, figur 2E). Til slutt, måle området av disposisjoner i delen ( figur 2D) ved hjelp av den ' verktøyet '. Klikk ' ROI manager ' > ' Legg til ' > ' mål '.
      4. Viktigere, normalisere antall positive celler av området delen.
  2. Nanog kvantifisering
    1. telle Nanog positive celler under microscope i lyse feltet manuelt på 20 X forstørrelse.
      Merk: Rask rød counterstaining gir god evaluering av morfologi av TA muskelen. Men den flekker er veldig lett og mangler en Fjern disposisjon i delen. Skanneren ofte klarer ikke å identifisere grensen delene og ikke fokusere riktig. Det er mulig å bruke markøren sirkel kantene av delene før skanning eller bruke en mer følsomme skanner for å oppdage delen. For den gjeldende protokollen, er det mest effektivt å telle Nanog positive celler manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oppdage muskel skader-indusert mobilnettet senescence

Det har nylig vist at muskel skader induserer forbigående mobilnettet senescence14. På 10 dager etter skade (PPT), fleste av de skadede myofibers er under gjenfødelse med sentralt kjerner, et kjennetegn på regenererer myofibers, og arkitektur muskel gjenopprettes. Den infiltrere inflammatoriske celler er dramatisk redusert mens resterende synlig i enkelte områder. 10 DPI er en god tid å oppdage senescent celler av SA-β-Gal, siden det er færre necrotic og inflammatoriske celler i muskler til å forstyrre den flekker. For å bestemme spesifisiteten av den flekker, er TA injisert med PBS fra samme musen (figur 1A) brukt som en kritisk negativ kontroll.

For å sikre en bedre og mer nøyaktig vurdering av SA-β-Gal positiv cellene, er deler fra ulike fly av TA muskelen plassert i det samme lysbildet (figur 1B). Counter farging med eosin er viktig for den automatiske kvantifiseringen av SA-β-Gal positiv cellene ImageJ programvare. Eosin counter flekker skisserer delen som lar digitale skanneren å oppdage delene med riktig fokus. Det er viktig å nøye definere området og terskelen for påvisning (figur 2A-D). I tillegg er en manuelt kuratert prosessen avgjørende for å tillate mer nøyaktig påvisning og kvantifisering (figur 2E).

Mobilnettet senescence forenkler i vivo omprogrammering i muskel

Kan programmeres om musemodell (i4F) gir et ideelt system for å evaluere virkningen av senescence på mobilnettet plastisitet og gjenfødelse. På muskel skader behandlet i4F mus med dox å indusere omprogrammering i vivo. 7 dager dox (1 mg/mL) behandling er tilstrekkelig til å indusere omprogrammering på cellenivå, mens du fremdeles er godt tolerert av mus (figur 3A). Derfor høster vi skadet muskler på 10 DPIs fra i4F mus behandlet med dox i 7 dager.

Selv om det er mulig å utføre co flekker av SA-β-Gal med Nanog, er det ikke anbefalt for kvantifisering på grunn av potensiell konflikt flekker. Som nevnt ovenfor, er counter flekker viktig for digital skanner gjenkjenning. Beste telleren flekker for SA-β-Gal med Nanog er rask røde orhematoxylin. Imidlertid kan counter flekker maskere over enten SA-β-Gal eller Nanog signal. Derfor for mer nøyaktig kvantifisering er det bedre å utføre dem separat i etterfølgende lysbilder (figur 3B). Av kvantifisere SA-β-Gal positive og Nanog positive celler fra tilstøtende lysbilder, etablerte vi en positiv korrelasjon mellom dem (Figur 3 c), antyder en potensiell involvering av senescence på mobilnettet plastisitet og gjenfødelse.

Figure 1
Figur 1: vurdere senescence nivå etter muskel skader. (A) skjematisk fremstilling av muskel skader strategien brukes å indusere senescence. (B) skjematisk fremstilling av muskel delen utarbeidelse. (C) representant bilder av SAβGal flekker counterstained med eosin. Piler peker til SA-β-Gal+ cellene. Skalere barer = 50 µm. (D) kvantifisering av SA-β-Gal+ celler i skadet og ikke-skadde TA-muskel. Hvert punkt tilsvarer et individuelle dyr. Statistisk betydning ble vurdert av tosidige Student´s t-test: *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kvantifisering av SA-β-Gal+ celler av ImageJ programvare. (A-D) skjermbilder fra en muskel inndeling i ImageJ port. Skjermbilde av konverterer en muskel delen bilde å gråtoneskala (A); Velge alle SA-β-Gal + celler i delen (B); Analyserer valgte partikler (C); Sammendrag av alle de opptalte particals ROI Manager (D). (E) skjermdump av manuell konservering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Evaluering av i vivo omprogrammering etter muskel skader. (A) skjematisk fremstilling evaluere i vivo reprogramming og senescence nivå etter muskel skader. (B) representant bilder av SA-β-Gal og Nanog flekker på frosne deler av skadet skjelettmuskulatur. SAβGal farging counterstained med eosin (venstre); Immunohistochemical farging av Nanog counterstained med rask rød (høyre). Ikke-skadde muskler vises på toppen og skadet muskelen nedenfor. Skalere barer = 50 µm. (C) kvantifisering og sammenheng av SA-β-Gal + og Nanog+ celler i etterfølgende avsnittene (n = 9 mus, representerer gjennomsnittet av 2 seksjoner per musen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Volumet for 50 mL
100 mM lager K3Fe(CN)6 løsning 2 mL
100 lager mM K4Fe(CN)6 løsning 2 mL
1 M MgCl2 100 ΜL
50 mg/mL X-Gal 400 ΜL
PBS (pH 5.5) 45.50 mL

Tabell 1: Sammensetning av 50 mL X-gal løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en metode å oppdage både senescent og pluripotent stamceller i skjelettmuskulatur kan programmeres om mus. Denne metoden kan brukes til å evaluere og kvantifisere både senescence og indusere mobilnettet plastisitet i vivo, og undersøke rollen av senescence i reparasjon av vev og gjenfødelse.

I gjeldende protokollen brukes senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen til å oppdage i vivo senescent celler i skjelettmuskelen. Denne analysen oppdager økt lysosomale β-galactosidase aktiviteten ved suboptimum pH (6.0 eller 5.5), tilknyttet med senescent celler, mens denne enzymaktiviteten måles vanligvis i surt pH 4,516,17. Derfor er det viktig å justere pH (pH = 6 eller 5.5) å sikre bestemte gjenkjenning av senescence-assosiert aktivitet. I tillegg er telleren farging med eosin avgjørende for den automatiske kvantifiseringen av SA-β-Gal+ celler, hvor svak og diffus signalene ikke telles. For å unngå potensielle variasjon, er det best at samme person utfører den hele telling fremgangsmåten.

Selv om SA-β-Gal analysen er mest brukt og tillatt biomarkør for senescent celler, er det ikke en eksklusiv markør for senescence. Det har blitt foreslått at over confluent celler i kultur kan forårsake falske positivitet SA-β-Gal18. Følsomheten til analysen kan være celle type vev skriver avhengige i vivo19. Derfor er det nødvendig å bruke andre uavhengige kanoniske markører, som mangel på spredning, økt uttrykk for senescence meglere (p16, ARF, p53, p21 og p27) og utskillelsen av ulike SASP faktorer, å bekrefte og karakterisere senescence i vivo. Dessuten er riktig negative kontroller uunnværlig for å tolke resultatene, særlig for studier i vivo .

Tross for at SA-β-Gal analysen ikke er perfekt, det gir spesielt verdifull informasjon for i vivo studie. Det tillater påvisning av senescent celler i bosatt miljøet med intakt vev arkitektur, kritisk informasjon tilrettelegge ytterligere forståelsen av senescent cellene rolle i ulike fysiologiske og patologiske sammenhenger. Videre, det kan kombineres med immunostaining av andre markører, som cellen overflate markører å fastslå mobilnettet identiteten senescent celler. eller stemness indikatorer for å undersøke mulige involvering av senescence i regenerering og tumorigenesis. Tidligere utført vi SA-β-Gal analysen med immunohistochemical farging av Nanog i samme inndeling eller i nærhet å undersøke den potensielle koblingen mellom senescence og i vivo omprogrammering8. Mens denne protokollen er fokusert på skjelettmuskulatur, utvides det sikkert til andre vev.

Nylig har mobilnettet senescence vært involvert i reparasjon av vev og gjenfødelse, sannsynligvis via SASPs7,8,9. Forstå mekanismene av hvordan senescence bidrar til reparasjon av vev og regeneration vil sikkert ha en enorm innvirkning på regenerativ medisin. Denne analysen gir et viktig og nyttig verktøy for identifikasjon og kvantifisering av senescent celler i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi er gjeld til Clemire Cimper for hennes utmerket kundestøtte. Arbeid i laboratorium for H.L. ble finansiert av Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche vitenskapelig, og Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) og Fondation ARC (Pja jeg 20161205028). C.C. og AC er finansiert av doktorgrad og postdoktor stipend fra gjenopplive konsortiet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 128 mobilnettet senescence i vivo omprogrammering pluripotent stamceller kan programmeres om musemodell muskel skader cardiotoxin gjenfødelse senescence-assosiert β-galactosidase flekker
Vurdering av skaden-indusert Senescence og <em>i Vivo</em> omprogrammering i skjelettmuskelen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter