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Developmental Biology

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.

Abstract

Senescência celular é uma resposta ao estresse que é caracterizada por uma detenção estável de crescimento celular, o que é importante para muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como câncer e envelhecimento. Recentemente, a senescência também tem sido implicada na regeneração e reparo tecidual. Portanto, tornou-se cada vez mais crítico para identificar células senescentes em vivo. Senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais utilizado para detectar células senescentes tanto na cultura e na vivo. Este ensaio é baseado no aumento conteúdo lisossomal nas células senescentes, que permite a detecção histochemical da atividade lisossomal β-galactosidase em pH suboptimum (6 ou 5.5). Em comparação com outros ensaios, tais como citometria de fluxo, isto permite a identificação de células senescentes em seu ambiente residente, que oferece informações valiosas, tais como a localização, relacionadas com a arquitectura do tecido, a morfologia e o possibilidade de acoplamento com outros marcadores através de imuno-histoquímica (IHC). A limitação principal do ensaio SA-β-Gal é a exigência de amostras frescas ou congeladas.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para entender como celular senescência promove celular plasticidade e tecido regeneração em vivo. Nós usamos SA-β-Gal para detectar células senescentes no músculo esquelético após a lesão, o que é um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração de tecidos. Além disso, usamos IHC para detectar Nanog, um marcador de células-tronco pluripotentes, em um modelo do rato transgénico. Este protocolo permite-nos analisar e quantificar a senescência celular no contexto da plasticidade celular induzida e na vivo reprogramação.

Introduction

Senescência celular é uma forma de reação de estresse, caracterizada por uma detenção do ciclo celular estável. Na última década, pesquisa estabeleceu-se firmemente que a senescência é associada com vários processos biológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, fibrose e organismo envelhecimento1,2. Senescência celular foi identificada em fibroblastos humanos no final de sua vida replicative desencadeada por telômero encurtamento3. Além do estresse replicative, existem muitos outros estímulos que podem induzir a senescência, incluindo danos, estresse oxidativo, oncogênicos sinais e alterações genômicas/epigenomic, que eventualmente pode ativar as vias p53/p21 e/ou pRB para DNA estabelecer e reforçar o crescimento permanente de prisão1. Uma das características mais importantes de células senescentes é que eles permanecem metabolicamente ativos e robustamente expressam um fenótipo secretor associada a senescência (SASP): secreção de citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e matriz extracelular muitos fatores4. Fatores SASP têm sido propostos para desempenhar um papel importante na mediação e amplificar o efeito de senescência, devido a seus potentes efeitos sobre atrair células imunes e alterando o tecido local e sistêmica www.UniEthos.org.br1. Curiosamente, senescência tem sido recentemente proposta para ser importante para tecido reparação e regeneração5,6. Além disso, dados de vários laboratórios, incluindo a nossa, tem sugerido que senescência induzida por danos do tecido pode aumentar a plasticidade celular, através do SASPs, para promover a regeneração79. Portanto, todos os dados emergentes destacam a importância de se estudar a senescência em vivo.

Na era pós (iPSC) células-tronco pluripotentes induzidas, plasticidade celular é a capacidade de uma célula para adquirir uma nova identidade e adotar um destino alternativo quando expostos a diferentes estímulos na cultura e na vivo10. É sabido que a reprogramação completa pode ser conseguida na vivo11,12, onde a expressão da fita contendo quatro fatores Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4e c-Myc de (OSKM) pode ser induzido na vivo para promover a formação de teratomas em múltiplos órgãos. Portanto, um modelo de mouse reprogramável (i4F) pode ser usado como um poderoso sistema para identificar os reguladores críticos e caminhos que são importantes para a plasticidade celular11.

Um sistema adequado e sensível na vivo é essencial para compreender a senescência celular como regula a plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. Aqui, apresentamos um sistema robusto e um protocolo detalhado para avaliar a ligação entre senescência e plasticidade celular no contexto da regeneração de tecidos. O dano muscular combinação de toxina (CTX) induzida no grupo de músculo tibial Anterior (TA), um sistema bem estabelecido para estudar a regeneração do tecido e o modelo do rato de i4F, permite a detecção de senescência celular e vivo em reprogramação durante a regeneração do músculo.

Para avaliar a relação entre a plasticidade celular e senescência, i4F ratos são feridos com CTX para induzir a lesão muscular aguda e tratados com doxiciclina (0,2 mg/mL) durante 7 dias para induzir no vivo reprogramação. Enquanto um CTX induzido por lesão muscular aguda e protocolo de regeneração tem sido recentemente publicado13, por razões éticas, este procedimento será omitido no protocolo atual. Amostras de músculo TA serão recolhidas às 10 dias pós lesão13, quando o pico de células senescentes anteriormente foram observados14. Aqui, este protocolo detalhado descreve todos os passos necessários para avaliar o nível de senescência (via SA-β-Gal) e reprogramação (através de coloração de IHC de Nanog).

Senescência-associado de beta-galactosidase (SA-β-Gal) ensaio é o ensaio mais comumente usado para detectar células senescentes na cultura e na vivo15. Em comparação com outros ensaios, o ensaio de SA-β-Gal permite a identificação das células senescentes em seu ambiente nativo com arquitetura de tecido intacto, que é particularmente importante para o estudo em vivo . Além disso, é possível acoplar o ensaio SA-β-Gal com outros marcadores usando IHC. No entanto, o ensaio de SA-β-Gal requer amostras frescas ou congeladas, que continua a ser uma grande limitação. Quando os tecidos frescos ou congelados são rotineiramente disponíveis, tais como amostras congeladas de músculo TA, SA-β-Gal é, obviamente, o ensaio mais adequado para detectar células senescentes. NANOG é o marcador usado para detectar células reprogramadas por dois motivos: 1) é um marcador essencial para pluripotência; 2) mais importante, sua expressão não é movido a doxiciclina (dox), portanto ele detecta pluripotência induzida ao invés da expressão forçada da fita Yamanaka.

É importante notar, os protocolos de coloração apresentados neste estudo podem ser realizados separadamente para simplificar o processo de quantificação, mas também podem ser feitos em um procedimento co coloração Visualizar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes na mesma seção.

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Protocol

os animais foram tratados conforme orientações da Comunidade Europeia e o Comité de ética dos protocolos Institut Pasteur (CETEA) aprovado.

1. preparações das soluções estoque

  1. preparar os materiais para fixação de amostra do músculo. Dissolver 0,5 g de adragante com 20 mL de água em RT tornar o meio de congelação-incorporação para fixação muscular.
  2. Preparar as soluções para a coloração de SA-β-Gal.
    1. Preparar as estoque soluções de K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M), dissolvendo os respectivos pós em água destilada.
    2. Prepare a solução-mãe de 0,2% C 20 H 6 Br 4 at 2 O 5 (eosina), diluir em água.
    3. Preparar a solução estoque de C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL), dissolvendo o pó de X-gal em C 3 H 7 não (dimetilformamida, DMF).
    4. Loja K 3 Fe(CN) 6 K 4 Fe(CN) 6 soluções e a 4 ° C e MgCl 2 no RT.
      Nota: X-galão pode ser armazenado em alíquota a-20 ° C, até a 6 meses. Solução de eosina pode ser mantida na RT e reutilizada após filtragem se necessário. K 3 Fe(CN) 6 e K 4 Fe(CN) 6 soluções são protectedfromthe luz. X-galão de solução não é estável em água e tem que ser protegido da luz.
  3. Preparação das soluções para Nanog coloração: a solução de permeabilização contém 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (citrato trissódico), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) em água destilada, que deve ser armazenado a 4 ° C. preparar a solução de bloqueio contendo 5% de soro fetal bovino (FBS) em tampão fosfato salino (PBS), que deve ser armazenado em RT.

2. Coloração de SA-β-Gal na secção de músculo TA congelado

  1. preparar o material de fixação para o músculo TA colocando uma pequena quantidade do tragacanth goma sobre uma fatia de cortiça.
  2. Ferido ratos de ambos os sexos (2 meses de idade, C57/B6) ficaram feridos 10 dias antes com a toxina (CDX) conforme descrito anteriormente, 13. Uso não-ferido (injeção de PBS) TA do mesmo mouse como controlo negativo. Se na vivo reprogramação é desejado, tratar cada rato com Dox (1 mg/mL) em água potável no mesmo dia (protegido da luz), logo após a lesão CTX.
    Nota: A solução de Dox precisa ser trocada a cada 3 dias para uma duração total de 7 dias.
    1. Isolar os dois músculos de TA (ferido e controle) dos ratos, conforme descrito anteriormente ( figura 1A) 13. Para garantir as seções transversais, inserir o tendão distal do músculo TA o adragante e deixar aproximadamente ¾ parte do músculo do lado de fora ( figura 1B) e congelar diretamente em nitrogênio líquido refrigerado isopentano para < 1 min.
      Nota: Certifique-se de que o músculo TA está em uma posição perpendicular e no centro da rolha. As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C, ou diretamente cryosectioned em 10 seções de µm.
  3. Processar os músculos TA conforme descrito na figura 1B.
    1. Distribuir o 1 st -10 th seções na ordem correta para dez slides diferentes na posição superior esquerda de cada slide. Colocar a seção 11 th adjacente à 1 seção st no primeiro slide; seção 12 th vai seguir a mesma ordem para ser colocado logo além da seção 2 nd no segundo slide. Repita este processo até 10 secções/slide são obtidos por dez slides (100 seções no total) para garantir a distância mínima de 1 mm entre a seção de primeira e a última seção.
  4. Corrigir as seções por 4 min em PBS contendo paraformaldeído 1% e 0,2% de glutaraldeído. Lave com PBS, 2 x 10 min. Em seguida, incubar as secções em PBS (pH = 5,5) por 30 min. executar todas as etapas no RT.
    Nota: A fixação tem que ser suave para manter a atividade enzimática. Execute esta etapa sob o capô. O pH do PBS é crítico e a solução de X-galão deve ser protegida da luz.
  5. Seções incubar a solução X-galão contendo: 4 mM K3Fe(CN) 6, K4Fe(CN) 6 de 4 mM, 2 mM MgCl2 e 400 µ g/mL X-Gal em PBS, pH = 5,5. Incubar no escuro a 37 ° C por um período mínimo de 24 h. lavagem a com PBS, 3 x 10 min, em RT.
    Nota: A incubação requer um mínimo de 24 horas e pode durar 48 horas para maximizar o sinal SA-β-Gal. A solução precisa ser alterado após 24 horas de incubação. As lâminas devem ser protegidas da luz. Se apenas SA-β-Gal coloração é desejado, continue com a etapa 2.5. Se co manchando com Nanog é desejada, por favor pular para o passo 3.1.
  6. Paraformaldeído
  7. fix slides em 1% em PBS durante 30 min. Lave os slides com PBS, 3 x 10 min. corante de contraste com 0,2% eosina. Imergir as lâminas na solução de eosina por 1 min e enxague com água destilada, brevemente. Finalmente, montar as lâminas com meio de montagem aquoso não fluoresce (ver Tabela de materiais).
    Nota: É essencial para realizar a pós-fixação. Execute esta etapa sob o capô. Todas as etapas são executadas no RT.

3. Imuno-histoquímica utilizando anticorpo Anti-Nanog

  1. corrigir os slides com PBS contendo paraformaldeído 4% por 10 min. lavagem com PBS, 2 x 10 min. Adicionar 200 µ l da solução de permeabilização diretamente sobre as guias e incubar durante 5 min.
    1. Lavagem desliza com PBS, 2 x 5 min e na última lavagem, uso 200 µ l PBS contendo 0,25% BSA directamente nos slides. Executar todos estes passos no RT.
      Cuidado: Executar a etapa de fixação sob o capô.
  2. Incubar slides com o anticorpo primário anti-Nanog (concentração final: 1.25 ug/mL) durante a noite a 4 ° C em PBS contendo 5% FBS. Lave os slides com PBS, 2 x 10 min e na última lavagem, uso 200 µ l PBS contendo BSA 0,25% por 5 min. realizar a lavagem todos os passos no RT.
    Nota: Incubar em uma caixa com papel-toalha para evitar a evaporação.
  3. Kit de
  4. incubar slides com 100 µ l de anticorpo secundário rAb-HRP de um pronto para usar (ver a Tabela de materiais) para lavagem de 45 min. desliza com PBS, 3 x 5 min, para remover o anticorpo secundário. Executar todas as etapas no RT com proteção da luz.
  5. Visualização
    1. primeiro, diluir o 3,3 '-diaminobenzidina (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) no buffer de substrato fornecido pelo pronto para utilizar o kit (20 µ l de DAB para 1 mL de solução-tampão de substrato). Adicione 100 µ l de solução DAB diretamente para cada slide e incubar durante um máximo de 10 min a RT.
      Nota: DAB solução diluída deve ser preparada na hora e pode ser armazenada por até uma semana, a 4 ° C. O tempo de incubação pode ser ajustado para minimizar o sinal de fundo, mas deve ser mantido a mesma para todos os slides.
    2. Remover a DAB solução enxaguando com água. Counterstain os slides com solução rápido vermelho (pronto para usar, consulte a Tabela de materiais) por 20 min. lavar os slides com água novamente brevemente.
    3. Eles desidratam com etanol a 95% para 5 mem seguida por 100% de etanol, 2 x 5 min. Finalmente, montar as lâminas com meio de montagem de endurecimento rápido (veja a Tabela de materiais).
    4. Observar os slides sob o microscópio de campo brilhante em 20 X para evitar fundo.
      Nota: Solução rápido vermelha pode ser mantida na RT e re-utilizada após filtragem.

4. Análise e quantificação

  1. quantificação SA-β-Gal
    1. digitalizar slides e escolher as melhores seções em cada slide com base nas imagens adquiridas. Use pelo menos 2 seções/TA para a quantificação. Julgar a seção ' s qualidade baseada na integridade do tecido, qualidade da coloração e counterstaining. Para a quantificação, escolha as duas seções de mais alta qualidade com a maior distância possível entre as amostras, que permite a melhor representação de quantificação de SA-β-Gal em todo o músculo TA inteiro.
    2. Quantificação de células positivas SA-β-Gal ( Figura 2).
      1. Determinar o rank do tamanho do pixel, manualmente, selecionando os menores e as maiores células positivas de SA-β-Gal.
        1. Abra a imagem digital do slide digitalizado usando software ImageJ.
        2. Na interface, clique ' Analyze ' > ' ferramentas ' > ' ROI Manager ' > ' Analyze ' > ' conjunto de medição ' > ' selecione a área '. Use a ferramenta seleção e cercam o menor e maior positivo SA-β-Gal da pilha e adicioná-lo ao gerente do ROI clicando no ' Add '. Medir os tamanhos usando o ' medida ' botão e salvar os valores para posterior utilização.
      2. Ajustar o parâmetro de limite para garantir que todas as células visíveis positivas são Selecionadodas.
        1. Converter a imagem para escala de cinza clicando ' imagem ' > ' tipo ' > ' 8-bit ' ( Figura 2A). Em seguida, vá para ' imagem ' > ' ajuste ' > ' limiar ', mova o cursor de segundo até todas as células de SA-β-Gal positivas são cobertas em vermelho ( Figura 2B) e, em seguida, clique em ' aplicar '.
        2. Analisar partículas clicando ' Analyze ' > ' analisar partículas ' > ' tamanho (pixel ^ 2) ' e aplicar o valor definido na etapa 4.1.2.1, digite ' circularidade ': ' 0.00-1.00 ', clique ' okey '; um resumo de todos os contagem de partículas é mostrado no Gerenciador de ROI ( Figura 2D).
      3. Transferir todas as partículas selecionadas para a imagem original. Ajuste a seleção manualmente para garantir a exata quantificação. Adicionar células positivas (seta verde, Figura 2E) e/ou remover células positivas falsas (seta vermelha, Figura 2E). Finalmente, medir a área delineando a seção ( Figura 2D) usando o ' ferramenta de seleção '. Clique ' Gerenciador de ROI ' > ' adicionar ' > ' medida '.
      4. Importante, normalizar o número de células positivas pela área da seção.
  2. Quantificação Nanog
    1. contar as Nanog positivas células sob o microscópio no campo brilhante manualmente na ampliação de 20 X.
      Nota: O counterstaining rápido vermelho permite boa avaliação da morfologia do músculo TA. No entanto, a coloração é muito leve e não possui um esquema claro de seção. O scanner muitas vezes não consegue identificar o limite das seções e não foco corretamente. É possível usar o marcador para as bordas das seções do círculo antes da digitalização ou usar um scanner mais sensível para detectar a seção. Para o protocolo atual, é mais eficiente para contar as células positivas Nanog manualmente.

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Representative Results

Detecção de senescência celular induzida por lesão de músculo

Foi recentemente demonstrado que a lesão muscular induz transitória senescência celular14. Em 10 dias pós-lesão (DPI), a maioria do myofibers danificado está em fase de regeneração com núcleos centralmente localizados, uma marca registrada de regeneração myofibers, e a arquitetura do músculo é restabelecida. As células inflamatórias infiltrante são reduzidas drasticamente enquanto permanece visível em determinadas regiões. DPI 10 é um ponto de tempo bom para detectar células senescentes por SA-β-Gal, uma vez que existem menos de células inflamatórias e necróticas presentes no músculo para interferir com a coloração. Para determinar a especificidade da coloração, TA injetado com PBS do mouse mesmo (figura 1A) é usado como um controle negativo crítico.

Para garantir uma avaliação melhor e mais precisa das células positivas SA-β-Gal, seções de diferentes planos do músculo TA são colocadas no mesmo slide (figura 1B). Contador de coloração com eosina é importante para a quantificação automática das células positivas pelo software ImageJ SA-β-Gal. Coloração de eosina contador descreve a seção, que permite que o scanner digital detectar as seções com o foco correto. É importante definir cuidadosamente o alcance e o limite de detecção (Fig. 2A-D). Além disso, um processo manualmente com curadoria é essencial para permitir a mais exata a deteção e a quantificação (Figura 2E).

Senescência celular facilita na vivo reprogramação no músculo

Modelo do mouse reprogramável (i4F) fornece um sistema ideal para avaliar o impacto da senescência celular plasticidade e regeneração. Após lesão muscular, i4F ratos são tratados com dox para induzir a reprogramação na vivo. 7 dias de tratamento dox (1 mg/mL) são suficiente para induzir a reprogramação a nível celular, enquanto ainda sendo bem tolerado pelos ratos (Figura 3A). Portanto, Nós colhemos músculos feridos em 10 DPIs de i4F ratos tratados com dox durante 7 dias.

Embora seja possível executar co coloração de SA-β-Gal com Nanog, não é recomendável para quantificação devido a potenciais interferindo coloração. Como mencionado acima, manchando o contador é essencial para a deteção de scanner digital. O melhor contador de coloração para o SA-β-Gal juntamente com Nanog é rápido vermelho orhematoxylin. No entanto, contador de coloração pode mascarar sobre o SA-β-Gal ou Nanog sinal. Portanto, para a quantificação mais precisa, é melhor para realizá-las separadamente em slides consecutivos (Figura 3B). Através da quantificação SA-β-Gal positivo e Nanog células positivas das laminas adjacentes, estabelecemos uma correlação positiva entre eles (Figura 3), sugerindo um envolvimento potencial da senescência celular plasticidade e regeneração.

Figure 1
Figura 1: avaliar o nível de senescência após lesão muscular. (A) representação esquemática da estratégia lesão muscular usada para induzir a senescência. (B) representação esquemática da preparação muscular seção. (C) imagens representativas de SAβGal coloração counterstained com eosina. As setas apontam para as células de SA-β-Gal+ . Barras de escala = 50 µm. (D) quantificação de SA-β-Gal+ em células TA-músculo lesionado e não-lesionado. Cada ponto corresponde a um animal individual. Significância estatística foi avaliada pelo bicaudal Student´s t-teste: * * * p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificação de células SA-β-Gal+ por software ImageJ. Capturas de tela (A-D) de uma seção de músculo na interface do software ImageJ. Captura de tela de converter uma imagem de seção do músculo para cinza escala (A); Selecionando todos o SA-β-Gal + pilhas na seção (B); Analisando as partículas selecionadas (C); Resumo de todos os particals contados no Gerenciador de ROI (D). (Alínea E) captura de tela do processo de curadoria manual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação de na vivo reprogramação após lesão muscular. (A) representação esquemática para avaliar na vivo reprogramação e senescência nível após lesão muscular. (B) imagens representativas de SA-β-Gal e Nanog manchas nas seções congeladas dos músculos esqueléticos danificados. SAβGal counterstained de coloração com eosina (à esquerda); Coloração imuno-histoquímica de Nanog counterstained com rápido vermelho (à direita). Non-ferido músculos são mostrados no músculo lesionado e superior abaixo. Barras de escala = 50 µm. (C) quantificação e correlação de SA-β-Gal + e células Nanog+ nas seções consecutivas (n = 9 ratos, valor representa a média de 2 seções por rato). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Volume para 50 mL
100 mM K3Fe(CN)6 solução 2 mL
100 mM K4Fe(CN)6 solução de ações 2 mL
1 M MgCl2 100 ΜL
50 mg/mL X-galão 400 ΜL
PBS (pH 5,5) 45,50 mL

Tabela 1: Composição de 50 mL de solução X-galão.

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Discussion

Aqui, apresentamos um método para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético de ratos reprogramáveis. Esse método pode ser usado para avaliar e quantificar os dois senescência e induzir plasticidade celular na vivoe examinar o papel da senescência em reparação de tecidos e regeneração.

No protocolo atual, o ensaio da senescência-associado β-galactosidase (SA-β-Gal) é usado para detectar células senescentes no vivo no músculo esquelético. Este teste detecta a atividade aumentada dos lisossomos β-galactosidase em pH suboptimum (6.0 ou 5.5), associado especificamente células senescentes, enquanto a atividade desta enzima é tipicamente medida em pH ácido 4,516,17. Portanto, é importante ajustar o pH (pH = 6 ou 5.5) para garantir uma detecção específica de atividade associada a senescência. Além disso, o contador de coloração com eosina é essencial para a quantificação automática de células SA-β-Gal+ , onde os sinais fracos e difusos não são contados. Para evitar a variabilidade potencial, é preferível que a mesma pessoa executa todo o procedimento de contagem.

Embora o ensaio de SA-β-Gal é o mais utilizado e aceitaram biomarcador para células senescentes, não é um marcador exclusivo para a senescência. Tem sido sugerido que o excesso confluente as células em cultura podem causar falsa positividade para SA-β-Gal18. A sensibilidade do ensaio pode ser o tipo de célula e tecido tipo dependente na vivo19. Portanto, é necessário usar outros marcadores canônicos independentes, tais como falta de proliferação e aumento da expressão de mediadores da senescência (p16, ARF, p53, p21 e p27) a secreção de vários fatores SASP, para mais confirmar e caracterizar senescência em vivo. Além disso, controles negativos adequados são indispensáveis para interpretar os resultados, especialmente para estudo na vivo .

Apesar do fato de que SA-β-Gal ensaio não é perfeito, ele fornece informações particularmente valiosas para estudo na vivo . Permite a detecção de células senescentes em seu ambiente residente com a arquitetura do tecido intacto, fornecendo informações críticas, facilitando a compreensão adicional da função das células senescentes em diferentes fisiológica e patológica contextos. Além disso, ele pode ser acoplado com a imunocoloração de outros marcadores, como marcadores de superfície celular para determinar a identidade do celular de células senescentes; ou marcadores stemness para examinar o envolvimento potencial da senescência em regeneração e tumorigênese. Anteriormente, foi realizado o ensaio de SA-β-Gal com coloração imuno-histoquímica de Nanog na mesma seção, ou na proximidade para investigar a potencial ligação entre senescência e na vivo reprogramação8. Enquanto este protocolo é focado em músculo esquelético, ele pode certamente ser estendido para outros tecidos.

Recentemente, senescência celular tem sido implicada na reparação de tecidos e regeneração, provavelmente via SASPs7,8,9. Compreender os mecanismos da como senescência contribui para a regeneração e reparação tecidual certamente terá um enorme impacto na medicina regenerativa. Este ensaio fornece uma ferramenta importante e valiosa para facilitar a identificação e quantificação de senescentes células na vivo.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Estamos em dívida com Clemire Cimper por seu excelente suporte técnico. Trabalho no laboratório de H.L. foi financiado pelo Instituto Pasteur, Centre National pour la Recherche científico e a Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire conquistou Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) e ARC Fondation (PJA 20161205028). C.C. e C.A. são financiados pelo doutorado e pós-doutorado bolsas do consórcio reviver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre
Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia do desenvolvimento questão 128 senescência celular na vivo reprogramação células-tronco pluripotentes modelo do rato reprogramável lesão muscular toxina regeneração β-galactosidase senescência associada a coloração
Avaliação da senescência induzida por lesão e <em>na Vivo</em> reprogramação no músculo esquelético
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Cazin, C., Chiche, A., Li, H.More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

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